專利名稱：用于免疫抗分枝桿菌的組合物的制作方法
用于免疫抗分枝桿菌的組合物本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生宿主T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法。該方法包括施用載體疫苗的步驟，所述載體疫苗包含非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體，所述病毒載體表達(dá)分枝桿菌抗原85A基因(在本文還稱為“Ag85A”基因)的翻譯產(chǎn)物。本文引用的所有公布、專利和專利申請通過引用全部結(jié)合入本文。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由呼吸病原體結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis) 引起的，每年導(dǎo)致2百萬人死亡，主要在發(fā)展中世界(http://www. who. int/gtb/ publications/globrepOl/index, html)。唯一得到許可的抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗，即卡介苗(BCG) (Calmette, A.，C. Guerin. (1924)Ann. Inst. Pasteur. 38 :371)，是牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)的減毒株,其在發(fā)展中國家通常作為單次劑量皮內(nèi)施用于新生兒。許多研究的綜述表明，BCG免疫保護性抵抗兒童腦膜結(jié)核和系統(tǒng)形式的疾病。然而，針對全球主要的結(jié)核病死亡原因——成人肺部疾病的保護效力是可變的(范圍為0-80% ) (Colditz,G. A.等，(1994). JAMA 271 :698)，并隨時間而減弱(Sterne, J. A.等，(1998) Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2 :200)。變化的基礎(chǔ)是不確定的。即使如此，每年全球有80%的嬰兒接受 BCG(http://www. who. int/inf-fs/en/fact 104. html) 結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)病原體，對抗其的保護效力與以下因素有關(guān)保持強烈的細(xì)胞介導(dǎo)的對感染的反應(yīng)，所述反應(yīng)涉及CD4+和CD8+T細(xì)胞；和與Thl-型細(xì)胞因子 (特別是 IFN-Y )反應(yīng)的能力(Flynn, J. L. , J. Chan. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19 :93) 0BCG 免疫誘導(dǎo)分泌IFN-Y的T細(xì)胞，主要是CD4+T細(xì)胞表型，其與結(jié)核分枝桿菌蛋白交叉反應(yīng) (Launois P 等，(1994) Infection and Immunity 62(9) :3679-87)。近期研究表明，胃腸外給藥的BCG未能誘導(dǎo)可能是保護性抵抗肺部疾病的關(guān)鍵的肺粘膜T細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，需要開發(fā)其他的抵抗分枝桿菌疾病的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚訝的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)分枝桿菌抗原85A(Ag85A)的病毒載體在作為免疫原性組合物施用時，可以誘導(dǎo)人類患者的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)針對分枝桿菌抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法,該方法包括為患者施用免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物是載體疫苗。該新型疫苗方法顯著提高了所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)的強度和持續(xù)時間。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞反應(yīng)是記憶T細(xì)胞反應(yīng)。85A抗原(Ag85A)(登記號CAA17868和BX842584)是Ag 85復(fù)合體的成員。 Ag 85復(fù)合體是由結(jié)核分枝桿菌、BCG和許多其他種類的分枝桿菌分泌的蛋白質(zhì)家族， 包括 Ag85A、Ag85B 和 Ag85C(Harth, G.等，(1996) Infect. Immun. 64 :3038-3047)。抗原 85A(Ag85A)在所有分枝桿菌種類之中是高度保守的，并且在動物和人類研究中是免疫顯性的。Ag 85A(Ag85A)由fbpA基因編碼。來自結(jié)核分枝桿菌的85A抗原(Ag85A)在本文列于 SEQID NO I 和 SEQ ID NO 2)。
在結(jié)核疫苗研究中，誘導(dǎo)加強的T細(xì)胞反應(yīng)的近期策略已經(jīng)利用了使用質(zhì)粒、細(xì)菌或病毒載體的重組DNA技術(shù)和重組蛋白質(zhì)來表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原。已經(jīng)顯示，在結(jié)核分枝桿菌攻擊后，使用表達(dá)Ag85A的MVA載體加強的Ag85A DNA對小鼠的免疫提供了相當(dāng)于 BCG 的保護程度(McShane，H.等，(2002). Infect. Immun. 70 :1623-1626)。然而，單獨使用重組MVA載體單次或反復(fù)免疫所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是弱的。對于針對分枝桿菌疾病(例如結(jié)核病)的長期保護，認(rèn)為重要的是保持可持續(xù)刺激保護性免疫數(shù)十年的“記憶T細(xì)胞”。記憶免疫反應(yīng)經(jīng)典地歸因于長壽的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的再活化，所述T淋巴細(xì)胞直接產(chǎn)生于分化的效應(yīng)T細(xì)胞，并保持一致的休眠狀態(tài)。認(rèn)為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞分布至機體的所有組織，特別是病原體可能再次相遇的上皮表面(例如，皮膚和消化道)。記憶T細(xì)胞已經(jīng)顯示為異質(zhì)的，并包括至少兩種具有不同遷移能力和效應(yīng)功能的亞型(Reinhardt, R. L.等，(2001)Nature. 410,101-105)。第一亞型細(xì)胞類似于初次應(yīng)答中產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞，因為其缺乏淋巴結(jié)-歸巢受體L-選擇蛋白和CCR7，并表達(dá)用于遷移入發(fā)炎組織的受體。當(dāng)與抗原再次相遇后，這些“效應(yīng)記憶T細(xì)胞”(TEM)可以快速產(chǎn)生IFN-Y 或IL-4，或釋放預(yù)先存儲的穿孔蛋白。第二亞型細(xì)胞表達(dá)L-選擇蛋白和CCR7，并缺乏直接的效應(yīng)功能。這些“中央記憶T細(xì)胞”(TCM)具有低的活化閾值，并且在次級淋巴樣器官中再次刺激后，增殖并分化為效應(yīng)細(xì)胞(Iezzi,G.等，(2001). J. Exp. Med. 193，987-994)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單獨用于BCG首次健康志愿受試者時，復(fù)制受損的表達(dá)Ag 85A(Ag85A)的病毒載體(在這種情況下，示例為“MVA85A”)可以誘導(dǎo)高水平的抗原特異性分泌干擾素Y的記憶T細(xì)胞-效應(yīng)記憶T細(xì)胞和中心記憶T細(xì)胞兩者。在過去的10年，已經(jīng)建立了用于檢測和定量T細(xì)胞反應(yīng)的新的免疫測定法。本發(fā)明的發(fā)明人利用干擾素Y (IFN-Y)ELISP0T測定法作為使用MVA85A的臨床實驗的主要的免疫讀數(shù)，因為IFN- y從抗原特異性T細(xì)胞的分泌是保護性對抗結(jié)核分支桿菌的最佳的可利用的相關(guān)因素。而且，ELISP0T測定法是非?？芍噩F(xiàn)且靈敏的定量分泌IFN-Y的抗原特異性T細(xì)胞數(shù)目的方法。本發(fā)明的發(fā)明人利用了兩種ELISP0T測定法體外(新鮮)ELISP0T測定，其中使用抗原培養(yǎng)外周血液單核細(xì)胞(PBMC) 18小時，以測定CCR7-循環(huán)效應(yīng)T細(xì)胞的水平；和培養(yǎng)的ELISP0T測定，其中使用抗原培養(yǎng)PBMC 10至14天，以檢測CCR7+中央記憶T細(xì)胞的水平(Godkin 等，JI，2002)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用MVA85A的免疫誘導(dǎo)特異性針對抗原85A(Ag85A)的強烈的中央記憶T細(xì)胞反應(yīng)，在免疫3周后，當(dāng)循環(huán)效應(yīng)幾乎不可檢測到T細(xì)胞反應(yīng)時，依然可檢測到抗原85A。這首次證明可以通過施用表達(dá)分枝桿菌抗原的免疫原性組合物而顯著提高患者的長期中央記憶T細(xì)胞群。如本文使用的，術(shù)語“記憶T細(xì)胞”意于包括T細(xì)胞的兩個亞型一CCR7_(效應(yīng)記憶T細(xì)胞)和CCR7+(中央記憶T細(xì)胞)。該定義還包括II類限制的⑶4記憶T細(xì)胞和 I類限制的⑶8記憶T細(xì)胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明載體疫苗誘導(dǎo)的記憶T細(xì)胞的特征為CCR7+ 的細(xì)胞表面表達(dá)。這些細(xì)胞在本文被稱為中央記憶T細(xì)胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明免疫原性組合物誘導(dǎo)的記憶T細(xì)胞反應(yīng)是保護性T細(xì)胞反應(yīng)?？梢酝ㄟ^免疫測定IFN- y分泌，優(yōu)選抗原特異性T細(xì)胞的IFN- y分泌，來檢測保護性免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，所述記憶T細(xì)胞反應(yīng)是長期的，并持續(xù)至少1、2、5、10、15、20、25或更多年。最優(yōu)選地，所述保護性免疫反應(yīng)是終生的。優(yōu)選地，在病毒載體中表達(dá)Ag85A基因。優(yōu)選地，在非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體中表達(dá)Ag85A基因。術(shù)語“載體疫苗”是本領(lǐng)域公知的。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的載體是非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。如本文使用的術(shù)語“非復(fù)制的”或“復(fù)制受損的”意思是在多數(shù)正常人類細(xì)胞中不能復(fù)制至任何顯著的程度。非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒可以天然(即，其可以作為這樣的病毒從自然界分離)或人工(例如，通過體外培養(yǎng)或通過基因操作，例如刪除對復(fù)制關(guān)鍵的基因)變成。一般存在一種或幾種可以培養(yǎng)所述病毒的細(xì)胞類型，例如用于經(jīng)修飾的Ankara病毒(MVA)的CEF細(xì)胞。通常，所述病毒載體應(yīng)該能夠刺激T細(xì)胞反應(yīng)?？稍谶@里使用的病毒載體的實例是牛痘(vaccinia)病毒載體，例如MVA或NYVAC。 優(yōu)選的病毒載體是牛痘株MVA或從MVA衍生的毒株。牛痘載體的替代物包括其他痘病毒 (poxvirus)載體,包括禽痘(avipox)載體,例如雞痘(fowlpox)或金絲雀痘(canarypox) 載體。特別適合作為禽痘載體的是已知為ALVAC (可作為Kanapox商購獲得)的金絲雀痘株，和從ALVAC衍生的毒株，和已知為FP9的雞痘株。其他替代物是甲病毒屬載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、黃病毒屬載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和流感病毒載體。例如，所述載體可以是非人類腺病毒載體。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，腺病毒載體的使用除了誘導(dǎo)非常強的CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)外，還誘導(dǎo)了非常強的CD 8記憶T細(xì)胞反應(yīng)。同一疫苗誘導(dǎo)CD8和CD4兩種記憶T細(xì)胞反應(yīng)，可能在預(yù)防和治療分枝桿菌疾病中都是有益的。因此，本申請的范圍內(nèi)還包括使用腺病毒載體誘導(dǎo)針對抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的方法，所述腺病毒載體表達(dá)所述抗原或其免疫原性片段。由所述腺病毒載體表達(dá)的抗原優(yōu)選為上述分枝桿菌抗原，最優(yōu)選為Ag85A,但可選地,可以是任何其他適當(dāng)抗原。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括表達(dá)抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于誘導(dǎo)針對所述抗原的CD 8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的藥劑中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了表達(dá)分枝桿菌抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于治療或預(yù)防分枝桿菌疾病的藥劑中的用途。所述抗原優(yōu)選為上述分枝桿菌抗原，最優(yōu)選為Ag85A，但可選地，可以是任何其他適當(dāng)抗原。優(yōu)選的是，所述病毒載體不能在人類患者中導(dǎo)致嚴(yán)重的感染。一般通過兩種方法檢測病毒的復(fù)制1)DNA合成和2)病毒滴度(viral titre)。 更準(zhǔn)確地說，如本文使用的并當(dāng)用于痘病毒時，術(shù)語“非復(fù)制或復(fù)制受損的”表示滿足下述標(biāo)準(zhǔn)的任一或兩者的病毒I)與牛痘病毒Copenhagen株相比，表現(xiàn)出在MRC-5細(xì)胞(人類細(xì)胞系)中的DNA 合成減少IlogQO倍)；2)與牛痘病毒Copenhagen株相比，表現(xiàn)出在HELA細(xì)胞(人類細(xì)胞系)中的病毒滴度減少21og。落入該定義的痘病毒的實例為MVA、NYVAC和禽痘病毒，而在該定義之外的病毒是減毒的牛痘株M7。本發(fā)明還提供了免疫原性組合物在制備用于治療或預(yù)防人類患者分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體，該病毒載體表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因的翻譯產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物是載體疫苗。所述免疫原性組合物和載體疫苗通過在所述患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而起作用。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(S卩，防止感染)、暴露后的(即，在感染后但在疾病前治療)或治療性的(即，治療疾病)，但通常是預(yù)防性或暴露后的?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的載體疫苗治療或預(yù)防的分枝桿菌疾病包括結(jié)核病、麻風(fēng)病、 鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)感染、非結(jié)核分枝桿菌感染、布魯利(Buruli)潰瘍、牛分枝桿菌(Mycobacterium bows)感染或疾病、副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium paratuberculosis)感染或相關(guān)疾病。其他疾病(即，非分枝桿菌疾病)包括炎性腸病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌癥、膀胱癌、天花和猴痘?？梢允褂脤ｉT的病毒載體構(gòu)建體來幫助所述載體疫苗的制備和利用。本文描述的所有載體構(gòu)建體形成了本發(fā)明的方面。包含這些病毒構(gòu)建體的載體疫苗也作為本發(fā)明的方面被涵蓋。例如，一種或多種抗原基因可以在所述基因的羧基端或氨基端被截短。這可以具有促進克隆和構(gòu)建所述載體疫苗的作用，并且可選地或另外，可以導(dǎo)致效力提高。用于截短的方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實現(xiàn)這種截短的最簡單的方法是使用各種公知的基因工程技術(shù)，以選擇性刪除所述抗原基因任一端的編碼核酸序列，然后將所需的編碼序列插入所述病毒載體。例如，分別使用3'和/或5'核酸外切酶策略選擇性地侵蝕所述編碼核酸的3'和/或5'端，生成所述候選蛋白的截短。優(yōu)選地，野生型基因序列被截短，這樣所表達(dá)的抗原相對于母抗原被截短了 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20或更多個氨基酸。最優(yōu)選地，抗原基因是相對于野生型Ag85A抗原在羧基端被截短了 15個氨基酸的Ag85A(SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 4的表達(dá)產(chǎn)物)。適用于本發(fā)明的抗原還包括所述母抗原的片段，條件是那些片段具有與母抗原共同的抗原決定簇或表位，或者與母抗原是免疫可識別的。編碼這些片段的多核苷酸也適用于本發(fā)明的免疫原性組合物和載體疫苗。如本文使用的，術(shù)語“片段”指多肽，該多肽的氨基酸序列與衍生該多肽的母抗原或其一個功能等同物的氨基酸序列部分但非全部相同。所述片段應(yīng)該包括至少n個來自所述序列的連續(xù)氨基酸，并且根據(jù)特定的序列，n優(yōu)選為7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、 20或更多)。小的片段可以形成抗原決定簇。本發(fā)明的抗原基因還可以編碼所述母抗原的變異體或功能等同物。這種核酸分子可以是天然存在的變異體，例如天然存在的等位基因變異體，或者所述分子可以是未知天然存在的變異體。所述核酸分子的這種非天然存在的變異體可以通過誘變技術(shù)制備，包括應(yīng)用于核酸分子、細(xì)胞或有機體的那些技術(shù)。在這點上，所述變異體是通過核苷酸置換、缺失或插入而不同于前述抗原基因序列的變異體。所述置換、缺失或插入可以涉及一個或多個核苷酸。所述變異體可以在編碼區(qū)或非編碼區(qū)或同時兩者中變更。在編碼區(qū)中的變更可以生成保守或非保守的氨基酸置換、 缺失或插入?？蛇x地，或除了使用基因平截以外，編碼所述抗原的基因可以包括編碼標(biāo)簽多肽的核酸，這樣所述標(biāo)簽多肽在翻譯后共價連接至所述抗原。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽多肽選自PK標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、MYC標(biāo)簽、多組氨酸標(biāo)簽或任何可以被單克隆抗體檢測的標(biāo)簽組成的組。其他實例將對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的。如果被使用，所述PK標(biāo)簽優(yōu)選地具有 Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp序列。這種類型的標(biāo)簽可以有助于檢測抗原表達(dá)和表達(dá)所述抗原的克隆，并可選地或另外，可以導(dǎo)致效力的提高?？梢远ㄎ痪幋a所述標(biāo)簽多肽的核酸，這樣，在翻譯后，所述標(biāo)簽位于所表達(dá)的抗原的羧基端或氨基端，或者可以在所表達(dá)的抗原的內(nèi)部。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽位于所表達(dá)抗原的羧基端。編碼連接子序列的核苷酸可以插入編碼所述標(biāo)簽多肽的核酸與編碼所表達(dá)的抗原的核酸之間。優(yōu)選地，當(dāng)被表達(dá)時，所述連接子序列包含氨基酸Gly-Ser-Ile。更優(yōu)選地,氨基酸Gly-Ser-Ile插入抗原序列氨基端和所表達(dá)的抗原的標(biāo)簽之間。最優(yōu)選地，所表達(dá)的抗原是Ag85a (Ag85A)，且PK標(biāo)簽位于Ag85a (Ag85A)基因的羧基端。編碼抗原的基因還可以包括前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以影響初級轉(zhuǎn)錄物加工為 mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。優(yōu)選地，所述前導(dǎo)序列提高所述抗原的表達(dá)和/或免疫原性。提高的免疫原性可以通過例如培養(yǎng)和體外ELISP0T測定法測定。提高的表達(dá)水平可以通過例如使用單克隆抗體檢測所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量來測定。優(yōu)選地，當(dāng)與未使用所述前導(dǎo)序列表達(dá)的抗原相比較時，表達(dá)和/或免疫原性被提高了 2倍、3倍或更多。適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列的實例是t-PA(組織纖溶酶原激活物)(Malin A. S.等，(2000)Microbes Infect. 2000 Nov ；2(14) :1677-85)。優(yōu)選地，所述病毒載體構(gòu)建體包括與TPA前導(dǎo)序列融合的羧基端截短了的Ag85A 序列。而在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的病毒載體表達(dá)與TPA前導(dǎo)序列和與PK標(biāo)簽序列融合的羧基端截短的Ag85A序列。優(yōu)選地，所述前導(dǎo)序列與所述抗原的氨基端融合，且所述標(biāo)簽序列融合至所述蛋白質(zhì)的內(nèi)部或羧基端。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述病毒載體的構(gòu)建體包括編碼羧基端截短了 15個氨基酸的Ag85a(Ag85A)的多核苷酸，所述Ag85a 融合至TPA序列并帶有Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp序列的羧基端PK標(biāo)簽，其中氨基酸殘基Gly-Ser-Ile存在于所述Ag85A序列和所述PK標(biāo)簽之間(SEQ ID NO :5)。優(yōu)選地，病毒載體的表達(dá)產(chǎn)物具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人注意到的保護性T細(xì)胞的作用在之前已經(jīng)暴露于分枝桿菌抗原的人類患者中特別有效。異源初始-加強(prime-boost)免疫策略在動物和人類中誘導(dǎo)了比使用相同疫苗的同源性加強更高水平的效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)(Schneider, J.等， (1998) Nat. Med. 4，397-402，McShane, H.等，(2001) Infect. Immun. 69，681-686)。對BCG的效力在(新生接種的)個體年齡到達(dá)10至15歲時逐漸消失的潛在機制還了解甚少。一個可能的假設(shè)是，BCG產(chǎn)生的免疫性已經(jīng)消失，而所述個體變得等同于首次用于實驗的宿主，其可以使用設(shè)計成誘導(dǎo)初次免疫的新候選疫苗進行免疫。盡管使用BCG 重復(fù)免疫沒有表現(xiàn)出進一步提高對抗TB的保護(參考Rodrigues L等，Lancet 2005)， 但BCG結(jié)合入異源初次-加強方案將維持BCG的保護效應(yīng)。使用表達(dá)抗原85A(Ag85A) 的病毒載體加強的BCG在幾種動物模型中的免疫原性和保護效力之前已經(jīng)有記載 (Goonetilleke,N. P.等，(2003)J. TmmunoI 171,1602-1609 ；ffilliams A等，Infection and Immunity (73 (6) :3814-6),但沒有記載保護性記憶T細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明還提供了一種用于提高人類患者中T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，其包括聯(lián)合載體疫苗為患者施用至少一種分枝桿菌抗原的步驟，所述載體疫苗包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是記憶T細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了 (a)至少一種分枝桿菌抗原和(b)包含表達(dá)分枝桿菌 85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗，在制備用于施用至患者以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途?？梢酝瑫r、順序或分開施用包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗和分枝桿菌抗原。例如，可以在施用所述載體疫苗之前，施用所述分枝桿菌抗原以對患者進行預(yù)免疫，或者在施用所述載體疫苗之后，施用所述分枝桿菌抗原以加強患者對所述載體疫苗的免疫反應(yīng)。另外，本發(fā)明還提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，其包括給人類患者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包括表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體，其中所述患者已經(jīng)預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是記憶T細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物在制備用于治療或預(yù)防人類患者中分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述患者已經(jīng)預(yù)先暴露于分支桿菌抗原。分枝桿菌抗原可以來自結(jié)核分枝桿菌和/或可以來自一種或多種其他分枝桿菌， 例如鳥胞內(nèi)分枝桿菌(M. avium-intracelIulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、海分枝桿菌(M. marinum)和/或潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)。當(dāng)患者已經(jīng)預(yù)先暴露于僅一種抗原時，所述抗原可以是賦予針對分枝桿菌感染的保護性免疫反應(yīng)的抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中，預(yù)先暴露于患者的抗原不是Ag85A?？蛇x地或另外，患者可以預(yù)先暴露于一種或多種分枝桿菌本身。例如，患者預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原可以包括預(yù)先暴露于結(jié)核分枝桿菌?？蛇x地或另外，患者預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原可以包括預(yù)先暴露于環(huán)境分枝桿菌，例如鳥胞內(nèi)分枝桿菌 (M. avium-intracelIulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、海分枝桿菌(M. marinum)和 / 或潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)。優(yōu)選地,患者潛伏感染所述分枝桿菌。例如，患者可以預(yù)先暴露于結(jié)核分枝桿菌并潛伏感染結(jié)核。當(dāng)所述藥劑用于治療潛伏感染了所述分枝桿菌的患者時，所述治療優(yōu)選根除所述分枝桿菌感染?？蛇x地或另外，預(yù)先暴露可以包括使用BCG的新生期免疫或預(yù)免疫。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在先前使用BCG免疫和然后接受加強劑量的本發(fā)明載體疫苗的志愿者中， 誘導(dǎo)了顯著較高水平的抗原特異性的分泌干擾素Y的T細(xì)胞，并且在免疫后24周，所述水平比施用單獨BCG免疫的受免疫者中高5-30倍。因此，本發(fā)明的該方面提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法， 該方法包括以下步驟使所述患者暴露于至少一種分枝桿菌抗原，和通過施用包括免疫原性組合物的加強組合物加強所述免疫反應(yīng)，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌 85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。本發(fā)明的該方面還涉及一種用于在人類患者中產(chǎn)生T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟i)使所述患者暴露于至少一種分枝桿菌抗原；
ii)給所述患者施用至少一次劑量的包括載體疫苗的加強組合物，所述載體疫苗包含表達(dá)分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述患者在步驟i)中僅暴露于一種分枝桿菌抗原，所述抗原是賦予保護性免疫反應(yīng)的抗原，但不是Ag85A。步驟i)可以在任何年齡的患者中進行，例如，在新生期、嬰兒期、青春期或成人期過程中。優(yōu)選地，所述患者在新生期暴露于所述至少一種分枝桿菌抗原。免疫原性組合物的施用可以發(fā)生在預(yù)先暴露于至少一種分枝桿菌抗原之后的至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 或更多周或者 0. 25,0. 5,0. 75、1、5、10、15、20、25、30、35 或 40 或更多年。優(yōu)選地，當(dāng)步驟i)在患者處于嬰兒期時進行時，則步驟ii)在嬰兒期或青春期進行。當(dāng)步驟ii)包括給所述患者施用超過一次劑量的加強組合物時，所述超過一次的劑量可以以短時間周期或長時間周期施用。例如，所述加強組合物劑量可以以小時、天、周、 月或年的周期施用。例如，第二次加強劑量可以在下述時間施用在第一次加強劑量之后 0. 5小時和24小時之間，在第一次加強劑量之后I天和7天之間，在第一次加強劑量之后I 周和I個月之間，在第一次加強劑量之后的I個月和6個月之間，在第一次加強劑量之后的 6個月和I年之間，或者在第一次加強劑量之后的I至2年之間、2至5年之間、6至10年之間或超過10年。加上適當(dāng)?shù)男拚?mutatis mutandis),這些時間間隔優(yōu)選還應(yīng)用于任何隨后劑量之間的周期。在本發(fā)明的第二方面中，除了誘導(dǎo)的抗85a(Ag85A)抗原的免疫反應(yīng)以外，所述病毒載體刺激載體特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的該方面，本發(fā)明的載體疫苗的施用促進了抗病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，所述病毒載體從所述病毒衍生。例如，在本發(fā)明的載體疫苗中使用MVA載體促進抗牛痘病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，該T細(xì)胞反應(yīng)是保護性的T 細(xì)胞反應(yīng)。該類型的作用在之前已經(jīng)被報道并且是明顯有利的，因為所述載體疫苗在以下兩個方面具有雙重作用首先在保護性抵抗分枝桿菌疾病中，和第二在保護性抵抗所述載體相關(guān)病毒介導(dǎo)的疾病中。在MVA載體的情況中，這樣的疾病是天花?？梢酝ㄟ^本發(fā)明載體疫苗治療或預(yù)防的病毒衍生疾病對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的；實例包括天花、猴痘和播散性牛痘感染。因此，本發(fā)明的該方面提供了一種在人類患者中誘導(dǎo)抗分枝桿菌抗原和病毒的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，包括給所述人類患者施用包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是記憶T 細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明的該方面還提供了 包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物，在制備用于在人類患者中誘導(dǎo)抗分枝桿菌抗原和病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途。本發(fā)明的疫苗遞送免疫有效量的至少一種抗原至患者。對于“免疫有效量”，其意思是該量以單次劑量或作為一系列劑量的部分對個體的施用，對于治療或預(yù)防是有效的。 該量根據(jù)所述待治療個體的健康和身體狀況、年齡、所述個體免疫系統(tǒng)的能力、希望保護的程度、所述疫苗的組成、治療醫(yī)生對醫(yī)療情境的評價和其他相關(guān)因素而變化。預(yù)期所述量將處于可以通過常規(guī)試驗測定的相對寬的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的第三個方面，所述病毒載體可進一步表達(dá)一種或多種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物，所述抗原基因可用以誘導(dǎo)針對這類附加抗原的抗原特異性免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)可以是CD8+、CD4+和/或抗體反應(yīng)。優(yōu)選地，所述一種或多種附加抗原來源于結(jié)核分枝桿菌、痕原蟲(Plasmodium sp)、流感病毒、HIV、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、細(xì)胞巨化病毒(Cytomegalovirus)、人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus)、痕疾、利什曼寄生蟲(leishmania parasites),或優(yōu)選地,任何分枝桿菌亞種(mycobacteria spp)。優(yōu)選地， 所述一種或多種附加抗原基因編碼的抗原選自來自任何分枝桿菌的抗原85家族的抗原或任何由分枝桿菌亞種表達(dá)的抗原組成的組；更優(yōu)選地，一種或多種潛伏抗原，例如16kDa 抗原或肝素結(jié)合血細(xì)胞凝集素(haemagglutinin) (HBHA)或ESAT6或稱為72F的融合蛋白。還預(yù)期，所述附加抗原可以是內(nèi)源衍生的，這樣所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)定向抵抗腫瘤。適合本發(fā)明使用的內(nèi)源衍生抗原是人類熱激蛋白，和腫瘤相關(guān)抗原，例如CEA、PSA、 Muc—1、Her2neu。所述病毒載體可以被設(shè)計為表達(dá)作為表位串(epitope string)的Ag85A基因和一種或多種附加抗原基因。有利地，一串多個表位中的表位連接在一起而沒有間插序列，這樣避免不必要的核酸和/或氨基酸物質(zhì)。所述表位串的生成可優(yōu)選通過使用重組DNA構(gòu)建體來實現(xiàn)，所述重組DNA構(gòu)建體編碼所述表位串的氨基酸序列，且編碼Ag85A的DNA與編碼所述附加抗原的DNA在同一閱讀框?；蛘?，Ag85A和所述附加抗原可以作為分離的多肽被表達(dá)。本發(fā)明的該方面還提供了 包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗，在制備通過在所述患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)用于治療或預(yù)防人類患者中分枝桿菌疾病和至少一種其他疾病的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的該方面，所述載體疫苗可用以通過在人類患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)來保護性抵抗分枝桿菌疾病和一種或多種選自HIV、瘧疾和天花組成的組的疾病，所述T 細(xì)胞免疫反應(yīng)優(yōu)選記憶T細(xì)胞免疫反應(yīng)。 盡管本發(fā)明的載體疫苗可單獨使用，但其也可以與其他免疫或治療方案結(jié)合用于治療或預(yù)防其他疾病。因此，除提供上述載體疫苗之外，本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明載體疫苗和一種或多種衍生于致病因子的其他抗原或表位的組合物。適用于本發(fā)明的組合物的抗原和表位可以是細(xì)菌或病毒來源的。適當(dāng)?shù)目乖梢赃M一步被分類為蛋白質(zhì)抗原、糖類抗原或糖軛合物抗原。本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種其他抗原或表位。實例為-不同的分枝桿菌抗原或表位。-HIV抗原或表位；。-瘧原蟲抗原或表位。疾抗原或表位。-來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原。-來自肺炎鏈球菌(例如，來自PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、 Spl25、SplOl、Spl28、Sp130 和 Spl33)的蛋白質(zhì)抗原。-來自甲型肝炎病毒(例如滅活病毒)的抗原或表位。-來自乙型肝炎病毒(例如表面抗原和/或核心抗原)的抗原或表位。
-來自丙型肝炎病毒的抗原或表位。-來自b型流感嗜血桿菌的糖抗原。-脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原或表位(例如IPV中)。-白喉疫苗或其組成性表位或抗原或類毒素。-破傷風(fēng)疫苗或其組成性表位或抗原或類毒素。-麻疹、流行性腮腺炎和/或風(fēng)疹抗原或表位。-流感抗原或表位，例如血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。所述流感抗原可以選自廣泛流行的毒株，例如禽流感，例如H5N1株。-來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原或表位。-癌抗原或表位。當(dāng)使用糖抗原時，其優(yōu)選與載體軛合，以提高免疫原性。當(dāng)必要時，毒性蛋白抗原可以通過化學(xué)和/或遺傳方法脫毒。糖抗原優(yōu)選為軛合物形式。用于軛合物的優(yōu)選載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。當(dāng)為白喉類毒素時，白喉毒素的CRM 197突變體是特別優(yōu)選的載體。其他適當(dāng)?shù)妮d體蛋白包括腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)外膜蛋白、合成肽、 熱激蛋白、百日咳蛋白、細(xì)胞因子、淋巴因子、激素、生長因子、人工蛋白質(zhì)，所述人工蛋白質(zhì)包括多種來自各種病原體衍生抗原的人類CD4+T細(xì)胞表位，例如N19蛋白、來自流感嗜血桿菌(H. influenzae)的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、鐵吸收蛋白質(zhì)、來自艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B，等。所述組合物中的其他抗原通常每種以至少I U g/ml的濃度存在。一般而言，任何給定抗原的濃度足以弓I發(fā)針對該抗原的免疫反應(yīng)。作為在所述混合物中使用其他蛋白質(zhì)抗原的替代，可以使用編碼所述抗原的核酸。因此，所述混合物的蛋白質(zhì)組分可以由編碼所述蛋白質(zhì)的核酸(優(yōu)選DNA，例如，以質(zhì)粒形式)所取代。類似地，本發(fā)明的組合物可以包含模擬糖抗原的蛋白質(zhì)，例如模擬表位或抗獨特型抗體。另外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明載體疫苗和一種或多種抗微生物化合物的組合物。適用于本發(fā)明的組合物的抗微生物劑的實例是抗結(jié)核的化療劑，例如利福平、異煙肼、 乙胺丁醇、卩比嗪酰胺(pyrizinamide)等。因此，本發(fā)明提供了一種在人類患者中提高針對至少一種抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟結(jié)合至少一種其他抗原和/或抗微生物劑，給所述患者施用包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗。本發(fā)明還提供了 (a)包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗和(b)至少一種其他抗原和/或微生物，在制備用于施用至人類患者以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途?？梢酝瑫r、順序或分開施用包括表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗和其他抗原和/或抗微生物劑。例如，可以在施用所述抗原/抗微生物劑之前施用所述載體疫苗至以對患者進行預(yù)免疫，或施用所述抗原之后，施用所述載體疫苗以加強患者對所述抗原的免疫反應(yīng)。所述載體疫苗和抗原/抗微生物劑優(yōu)選混合施用。本發(fā)明還提供了至少一種抗原和/或抗微生物劑在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述藥劑與載體疫苗一起施用，所述載體疫苗包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。類似地，本發(fā)明提供了包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述藥劑與至少一種其他抗原和/或抗微生物劑一起施用。本發(fā)明還提供了至少一種抗原和/或抗微生物劑在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述患者已經(jīng)用包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗預(yù)處理。本發(fā)明還提供了包含表達(dá)分枝桿菌 Ag85A(Ag85A)基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗在制備用于誘導(dǎo)患者T細(xì)胞免疫反應(yīng)的藥劑中的用途，其中所述患者已經(jīng)用至少一種抗原和/或抗微生物劑預(yù)處理。如上所述，本發(fā)明可用以誘導(dǎo)或提高多種免疫反應(yīng)。特別地，本發(fā)明的目的是確定免疫抵抗涉及分枝桿菌的疾病的有效方法。所述疾病包括漢森氏病、結(jié)核病、骨髓炎、克隆氏病、麻風(fēng)病、淋巴腺炎、約尼氏病。本發(fā)明的上述方面適用于多種不同的患者，包括例如兒童；患有HIV、AIDS的患者，免疫妥協(xié)/免疫抑制的患者，或經(jīng)歷過器官移植、骨髓移植的患者，或患有遺傳免疫缺陷的患者。當(dāng)所述疫苗用于預(yù)防用途時，所述患者可以是兒童(例如新生兒或1-5歲的兒童)、年長的兒童或青少年；當(dāng)所述疫苗用于治療用途時，所述患者優(yōu)選為成年人。預(yù)期用于兒童的疫苗也可以施用至成年人，例如以評價安全性、劑量、免疫原性等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該組合物包含(I)本發(fā)明的免疫原性組合物和
(2)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明提供了一種制備藥物的方法，該方法包括以下步驟(i)制備本發(fā)明的載體疫苗；和(ii)將所述免疫原性組合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合。載體(2)可以是本身不誘導(dǎo)生成對接受所述組合物的患者有害的抗體并且其施用沒有異常毒性的任何物質(zhì)。適當(dāng)?shù)妮d體可以是大的緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和無活性的病毒顆粒。這樣的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。藥學(xué)上可接受載體可包括液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。這類載體中還可以存在輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。還可以存在穩(wěn)定劑 (例如海藻糖)或允許室溫下水溶性糖玻璃形成的物質(zhì)。后者包括使用混合的可溶性玻璃穩(wěn)定技術(shù)，以微球形式懸浮于全氟碳液體中。脂質(zhì)體也是適當(dāng)?shù)妮d體。藥物載體的全面討論可獲自Gennaro (2000) Remington The Science and Practice of Pharmacy.第20版， ISBN :0683306472。本發(fā)明的藥物組合物還可預(yù)防性應(yīng)用于例如下述情況希望與微生物接觸時和要防止建立感染時。例如，可在外科手術(shù)之前施用所述組合物。所述藥物組合物優(yōu)選是無菌的。其優(yōu)選是無熱原的。其優(yōu)選是緩沖的，例如介于 PH 6和pH 8之間，通常約pH 7。優(yōu)選地，所述組合物基本是與人類等滲的。本發(fā)明的組合物可通過多種不同的途徑施用。某些途徑對于某些組合物是更有利的，因為導(dǎo)致生成更有效的反應(yīng)，或者因為較少可能誘導(dǎo)副作用，或者因為更容易給藥。例如，本發(fā)明使用的組合物可以通過任何幾種途徑施用，包括但不限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮或經(jīng)皮膚應(yīng)用(transdermal or transcutaneous appIication)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸方式。 所述組合物可制備用于鼻內(nèi)給藥，作為鼻腔噴霧、滴鼻劑、凝膠或粉末，注射劑(液體溶液或懸浮劑)；也可制備成在適合于在注射前溶解于或懸浮于液體載體中的固體形式。所述組合物的直接給藥一般將通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射完成，或者遞送至組織的細(xì)胞間隙。劑量治療可以是單次劑量方案或多劑量方案。現(xiàn)在將通過參考下述附圖
以舉例方式更詳細(xì)描述本發(fā)明的各方面和實施方案附圖簡述圖I :各免疫組中免疫后的平均IFN-Y ELISP0T反應(yīng)單獨BCG ;單獨MVA85A ；BCG 預(yù)免疫-MVA85A加強。(a)各組中免疫的適當(dāng)時間(周)；(b)結(jié)核菌素純化蛋白衍生物 (PPD)反應(yīng)；(c)純化的抗原85 (Ag85A)蛋白反應(yīng)；(d)累加的池肽反應(yīng)；(e)對于三種受測蛋白的每一種，使用Mann-Whitney統(tǒng)計值比較各疫苗組在各時間點的反應(yīng)。表明了統(tǒng)計學(xué)上的顯著對照；(f)在BCG免疫的個體中MVA加強之后的T細(xì)胞表位展示。所有單個肽的反應(yīng)被CD4+T細(xì)胞清除所消除；圖2 :免疫之前，對于單獨MVA85A研究中的4名志愿者，篩查針對結(jié)核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PH)和重組抗原85A(Ag85A)的血液培養(yǎng)的ELISP0T反應(yīng)。通過代碼 TXXXXXX識別每個志愿者，其中前3個X相應(yīng)于試驗號，后3個X相應(yīng)于志愿者號，例如 T002022意思為T002是試驗號，022是志愿者號；圖3 5名志愿者(每個通過代碼TXXXX識別，其中XXXX是四位數(shù)，第I位相應(yīng)于試驗號，第2、3和4位相應(yīng)于志愿者號，例如T2003意思為T2是試驗號，而003是志愿者號 (T2與上述圖2中的T002相同))在單獨MVA85A免疫給藥3周后，針對多池Ag85A肽(使用大寫字母標(biāo)記)的培養(yǎng)的(標(biāo)記為“培養(yǎng)”)和體外ELISP0T反應(yīng)。免疫后的反應(yīng)非常高，并高于免疫前的反應(yīng)。志愿者之前沒有使用BCG免疫；圖4 :隨訪在第I周接受免疫的MVA-85A免疫的健康志愿者中針對MVA-Lac-z的T 細(xì)胞反應(yīng)，所述MVA-Lac-z用作體外ELISP0T測定中的抗原。志愿者之前沒有使用BCG免疫；圖5(a):在潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者中單獨使用MVA85A免疫后對PPD、重組抗原85A(Ag85A)和累加抗原85A(Ag85A)肽池的平均Elispot反應(yīng)；圖5(b):在BCG預(yù)免疫的受試者(T005，即實驗5 ;參見實施例I)和潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者(T007，即實驗7)中MVA85A誘導(dǎo)的累加抗原85A(Ag85A)池肽反應(yīng)的比較；圖5(c):在BCG預(yù)免疫的受試者(T005)和潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的受試者 (T007)中MVA85A誘導(dǎo)的重組抗原85A(Ag85A)反應(yīng)的比較；圖6(a):在預(yù)免疫(BCG)和加強(MVA85A)之間長(超過10年)間隔的受試者組免疫后至少I年的MVA85A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的持久性；圖6(b):在預(yù)免疫(BCG)和加強(MVA85A)之間短(一個月)間隔的受試者組免疫后至少I年的MVA85A誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的持久性；
圖7(a) :BCG和MVA85A免疫之間的間隔與MVA85A后I周針對抗原85A(Ag85A)累加肽池的T細(xì)胞反應(yīng)之間相關(guān)性的缺乏；圖7 (b) =BCG和MVA85A免疫之間的間隔與MVA85A后24周針對抗原85A (Ag85A) 累加肽池的T細(xì)胞反應(yīng)之間相關(guān)性的缺乏；
應(yīng)；和反應(yīng)。
圖8(a)顯示了免疫后IFN-Y的平均水平；
圖8(b)顯示了攻擊后IFN-Y的平均水平；
圖9(a)顯示了 BCG預(yù)免疫的英國志愿者中針對MVA85A的體外IFN-YElispot反圖9(b)顯示了 BCG預(yù)免疫的剛比亞志愿者中針對MVA85A的體外IFN-Y Elispot
實施例實施例IMVA85A 疫苗之前已經(jīng)描述了MVA85A 的構(gòu)建(McShane, H.等，(2002) Infect. Immun. 70， 1623-1626)。臨床級的MVA85由Impfstoffwerke Dessau-Tornau生產(chǎn)，達(dá)到良好操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。對于臨床試驗中使用MVA85A,藥物和保健產(chǎn)品監(jiān)管署(Medicines and Healthcare products Regulatory Agency, London)頒發(fā)了醫(yī)師和牙醫(yī)豁免證書(Doctors and Dentists Exemption Certificate)。臨床實驗在Oxfordshire Research Ethics Committee批準(zhǔn)的協(xié)議下招募志愿者用于免疫研究，并且只有在獲得書面知情同意之后才可以使志愿者加入。包括的年齡范圍是18-55， 并且所有受試志愿者在篩查中對HIV、HBV和HCV血清反應(yīng)陰性。在免疫之前進行常規(guī)的實驗室血液學(xué)和生物化學(xué)檢查，且所有值均在正常范圍之內(nèi)。隨訪全部志愿者6個月，并在規(guī)律時間點采取血樣。接受了 MVA85A免疫的那些志愿者完成日志卡，記錄了免疫后7天的局部和全身副作用以及體溫。免疫首先的兩項研究在BCG預(yù)免疫的健康志愿者中進行，所述BCG預(yù)免疫的志愿者使用Heaf試驗確定。Heaf試驗包括將結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(PPD)置于皮膚上,然后使用噴槍生成多個刺傷。在72小時在刺傷部位超過4個丘疹的為陽性反應(yīng)。陽性皮試表明活性結(jié)核感染或之前的BCG免疫。陰性(0級)Heaf試驗(相當(dāng)于結(jié)核菌素皮試為Omm)的志愿者使用BCG(使用BCG Glaxo株單次免疫，皮內(nèi)注射100 yl，n = 11)或MVA85A(皮內(nèi)注射5X 107pfu，相隔3周2次免疫，n = 14)免疫。在第三項研究中，招募了之前已經(jīng)用BCG 免疫的志愿者(n = 17)。BCG免疫和MVA85A免疫之間的平均時間為18年(范圍為0. 5-38 年)。Heaf 試驗強度不超過II級(相當(dāng)于結(jié)核菌素皮試< 15mm)的志愿者加入該研究，并使用單次劑量的5X IO7Pfu MVA85A皮內(nèi)注入BCG免疫的對側(cè)手臂的三角肌上的皮膚?？傆?，31名健康志愿者使用MVA85A免疫。14名首次接觸BCG的志愿者中有11名接受了 2次免疫，相隔3周進行。其他3名志愿者接受單次免疫。全部17名BCG預(yù)免疫的志愿者接受了單次MVA85A免疫。所有志愿者完成了 6個月的隨訪期，且在任何這些研究中沒有嚴(yán)重或劇烈的不良事件。免疫原性的測量用以確定疫苗免疫原性的主要免疫測量是體外IFN-Y ELISP0T測定法。其針對在下述時間點采取的血樣進行在結(jié)核菌素皮試之前的篩查時，和然后在免疫后的1、4、12 和24周。這些測量針對新鮮的PBMC進行，使用結(jié)核菌素PH) (20 u g/ml, SSI)、純化的抗原 85 (Ag85A)復(fù)合體(10 ii g/ml)和7個池的9_10條15_mer肽,所述肽有10個氨基酸重疊 (各肽在ELISP0T孔中的終濃度為IOii g/ml)。簡言之，300，000PBMC/孔的IOOiU RlO (RPMI 加10%胎兒小牛血清)直接鋪板于存在抗原的ELISP0T板(MAIP S4510，Millipore)，并培養(yǎng)18小時。所有測定中使用鏈激酶(250U/ml)/鏈道酶(12. 5U/ml)和植物血細(xì)胞凝集素 (10 u g/ml)作為陽性對照。測定進行兩次，結(jié)果取平均。表位作圖根據(jù)免疫后的首次樣品或隨后樣品測試針對單個肽的反應(yīng)。對單個肽的反應(yīng)進行磁珠清除(Dynal)。通過與軛合亞鐵珠的抗⑶4和⑶8的單克隆抗體一起培養(yǎng)30分鐘來進行⑶4+和⑶8+T細(xì)胞清除，所述珠與細(xì)胞的比例為5 I，所述培養(yǎng)使用M-450 (Dynal， Oslo, Norway)于200 ii I RlO中在冰上培養(yǎng)。使用磁體(Dynal)去除抗體包裹的細(xì)胞。根據(jù)未清除的、⑶4+清除的和⑶8+T細(xì)胞清除的組來分析樣品。細(xì)胞清除通過FACS掃描證實，并通常對于⑶8+T細(xì)胞> 90%，對⑶4+T細(xì)胞> 97% (數(shù)據(jù)未顯示)。免疫原性的分析ELISP0T數(shù)據(jù)的分析是通過從帶有抗原或肽池和細(xì)胞的孔中斑點的平均計數(shù)扣除介質(zhì)中平均數(shù)目的斑點和單獨對照孔的細(xì)胞。忽略小于5斑點/孔的計數(shù)。如果所述計數(shù)是陰性對照孔的至少兩倍并且比陰性對照孔多至少5個斑點，則認(rèn)為該孔是陽性的。對于肽池孔，累加各志愿者在各時間點的所有肽池的結(jié)果。例如，當(dāng)有7個肽池時，每個含有 9-10個肽，每個池測試兩次。計算每個池的兩次測試的平均值，然后減去陰性對照孔的平均值，以生成該池的結(jié)果。然后將7個單個池的結(jié)果加在一起。這將可能對于對任何10-mer 重疊區(qū)反應(yīng)的T細(xì)胞計數(shù)兩次，所述重疊區(qū)出現(xiàn)于具有相鄰肽的兩個池中。數(shù)據(jù)分析基于對數(shù)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)，使用篩查時的基線結(jié)果作為協(xié)變量進行重復(fù)測量的變量分析，以比較各組。然后使用Mann-Whitney檢驗用于組間的所有比較,使用Wilcoxon檢驗用于篩查和BCG預(yù)免疫-MVA85A加強組的24周樣品之間的配對比較。培養(yǎng)的ELISP0T方法對于培養(yǎng)的ELISP0T，使用20 U g/ml的結(jié)核分支桿菌PH) ( “PPD-T”)、鳥分枝桿菌PPD ( “PPD-A”)或10 ii g/ml重組抗原85A (Ag85A)在24孔板中刺激I X IO6冷藏保存的 PBMC。經(jīng)過+37°C、5% CO2大氣下的3天培養(yǎng)期之后，去除500 ill的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，并由 RlO 中 5IU/ml 的 Lymphocult-T(Biotest, Dreieich, Germany)取代。這在第 7 天重復(fù)。 在第9天，細(xì)胞經(jīng)三次洗滌，于+37°C、5% CO2大氣下RlO中靜置過夜。在第10天，細(xì)胞經(jīng)洗滌并懸浮于2ml的RlO中，將50iU經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞(2. 5X IO4最初鋪板的細(xì)胞)轉(zhuǎn)移至 ELISP0T 板的復(fù)孔，并用 PPD-T (20 u g/ml)、PPD-A (20 u g/ml)和 Ag85A(10 u g/ml)刺激 18 小時。然后如之前所描述的培養(yǎng)ELISP0T板。結(jié)果
使用MVA85A的免疫是安全并良好耐受的(表I)。比較了使用單獨BCG、單獨 MVA85A和BCG預(yù)免疫-MVA85A加強免疫所誘導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的動力學(xué)和強度。 在測定中使用PPD-T、抗原85(Ag85A)蛋白或來自抗原85 (Ag85A)的重疊肽作為抗原，全部三種免疫方案都誘導(dǎo)了顯著的免疫反應(yīng)(表2，圖I)。在PPD-T (F = 3.624 ;P = 0.037)、 抗原 85 (Ag85A) (F = 16. 605 ；P < 0. 001)和累加的池抗原 85A(Ag85A)肽組(F = 39. 982 ； P <0.001)中存在顯著的疫苗主要作用。使用BCG的免疫誘導(dǎo)了中等水平的抗原特異性 IFN- y分泌T細(xì)胞，其在免疫后4周達(dá)到峰值(表2，圖lb-d)。在BCG免疫后，針對池抗原 85A(Ag85A)肽的反應(yīng)是顯著弱的(圖Id)。11名志愿者中只有4名志愿者在體外ELISP0T 測定中對任何7肽池反應(yīng)。這些肽池反應(yīng)可全部歸因于肽12、13、27和28，并完全由⑶4+T 細(xì)胞清除所消除。表I :使用MVA85A免疫后訴求的不良事件在首次接觸BCG和BCG預(yù)免疫的組之間，所報道的不良事件的頻率和嚴(yán)重度沒有差異。
權(quán)利要求
1.一種在人類患者中誘導(dǎo)針對至少一種抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給所述患者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述免疫原性組合物是載體疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)是CCR7+反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項所述的方法，其中所述非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、皰疫病毒、甲病毒屬、黃病毒屬和流感病毒組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述非復(fù)制的病毒載體是MVA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述非復(fù)制的病毒載體是腺病毒載體。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)帶有PK羧基端標(biāo)簽的 Ag85A。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)帶有TPA前導(dǎo)序列的 Ag85A0
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)帶有截短的羧基端的 Ag85A0
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達(dá)SEQID N0:5的翻譯產(chǎn)物。
11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述病毒載體進一步表達(dá)來自分枝桿菌的至少一種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物。
12.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述免疫原性組合物與至少一種附加抗原和/或抗微生物劑一起施用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少一種附加抗原和/或抗微生物劑同時、 分開或順序施用。
14.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述反應(yīng)是抗原特異性免疫反應(yīng)。
15.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述反應(yīng)是治療性的或預(yù)防性的。
16.免疫原性組合物在制備用于通過在患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療或預(yù)防所述患者分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。
17.免疫原性組合物在制備用于通過在患者中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療或預(yù)防所述患者分枝桿菌疾病和至少一種其他疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體和至少一種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的用途，其中所述免疫原性組合物進一步誘導(dǎo)針對衍生所述病毒載體的病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。
19.包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物在制備用于通過誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療或預(yù)防患者至少一種疾病的藥劑中的用途，其中所述藥劑與至少一種附加抗原一起施用。
20.抗原在制備用于通過誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)而治療患者疾病的藥劑中的用途，其中所述藥劑與包含表達(dá)分枝桿菌Ag85A基因翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的免疫原性組合物一起施用。
21.根據(jù)權(quán)利要求I至15任一項所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項所述的用途， 其中所述T細(xì)胞反應(yīng)保護性抵抗疾病，所述疾病選自結(jié)核病、麻風(fēng)病、鳥分枝桿菌感染、 非結(jié)核分枝桿菌感染、布魯利潰瘍、牛分枝桿菌感染或疾病、天花、猴痘、副結(jié)核分枝桿菌感染、炎性腸病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌癥和膀胱癌組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求I至15任一項所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項所述的用途，其中所述患者選自兒童，患有HIV感染或AIDS的患者,免疫妥協(xié)的患者,或經(jīng)歷過器官移植的患者組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求I至15任一項所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項所述的用途，其中所述患者之前已經(jīng)暴露于分枝桿菌。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述患者之前已經(jīng)暴露于結(jié)核分枝桿菌。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述患者潛伏感染了所述分枝桿菌。
26.根據(jù)權(quán)利要求I至15任一項所述的方法或者權(quán)利要求16至20任一項所述的用途，其中所述患者已經(jīng)使用BCG預(yù)處理。
27.—種載體疫苗，其包含表達(dá)核苷酸序列SEQ ID NO :4的翻譯產(chǎn)物的非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達(dá)另外包括PK羧基端標(biāo)簽的核苷酸序列SEQ ID NO 4的翻譯產(chǎn)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達(dá)另外包括TPA前導(dǎo)序列的核苷酸序列SEQ ID NO 4的翻譯產(chǎn)物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達(dá)核苷酸序列SEQID NO: 5的翻譯產(chǎn)物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27至30任一項所述的載體疫苗，其中所述非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、甲病毒屬、黃病毒屬和流感病毒組成的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的載體疫苗，其中所述非復(fù)制的病毒載體是MVA。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的載體疫苗，其中所述非復(fù)制的病毒載體是腺病毒載體。
34.根據(jù)權(quán)利要求27至33任一項所述的載體疫苗，其中所述病毒載體還表達(dá)來自分枝桿菌的至少一種附加抗原基因的翻譯產(chǎn)物。
35.一種誘導(dǎo)針對抗原的⑶8和⑶4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的方法，其使用表達(dá)抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體。
36.表達(dá)抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于誘導(dǎo)針對所述抗原的CD8 和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的藥劑中的用途。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的用途，其中所述藥劑用于治療或預(yù)防分枝桿菌疾病。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的用途，其中所述抗原是 Ag85A。
全文摘要
一種用于產(chǎn)生宿主T細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括施用包含非復(fù)制或復(fù)制受損的病毒載體的載體疫苗，所述病毒載體表達(dá)分枝桿菌抗原85A基因的翻譯產(chǎn)物。還提供了載體疫苗及其用途。還提供了使用腺病毒載體誘導(dǎo)針對抗原的CD8和CD4記憶T細(xì)胞反應(yīng)的方法，所述腺病毒載體表達(dá)抗原或其免疫原性片段。
文檔編號A61P31/06GK102580070SQ201110302309
公開日2012年7月18日 申請日期2006年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者安薩·A·帕坦, 海倫·麥克什, 艾德里安·希爾, 莎拉·C·吉爾伯特 申請人:埃西斯創(chuàng)新有限公司