專利名稱：一種治療肝癌的中藥癌毒方及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥領(lǐng)域的細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)，具體地說(shuō)是涉及治療肝癌的中藥癌毒方及其在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病之一，是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一， 近年來(lái)死亡率增加了 41. 17%，其發(fā)病率和死亡率還正在逐年升高。肝癌具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展快、治療難、預(yù)后差等特點(diǎn)，被稱為“癌中之王”，由于其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，能手術(shù)切除者甚少，即使手術(shù)切除，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60%以上，小肝癌復(fù)發(fā)率也高達(dá)40%-50%。西醫(yī)治療肝癌以直接對(duì)抗某一病理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，而許多患者或?yàn)閺浡愿伟?或伴有腹水、腎功能不全，難以接受手術(shù)、肝動(dòng)脈栓塞化療、冷凍等治療。以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)治療肝癌則是對(duì)機(jī)體整體調(diào)節(jié)，發(fā)揮多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的綜合作用，無(wú)論是在抑制、 殺傷癌細(xì)胞，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，還是改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生命上都顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。長(zhǎng)期以來(lái)，中醫(yī)藥在治療肝癌方面取得了一定的臨床療效，尤其以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)形成的中藥復(fù)方治療肝癌更能充分發(fā)揮辨證論治和對(duì)機(jī)體整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)藥抗肝癌作用越來(lái)越得到國(guó)際社會(huì)的關(guān)注和承認(rèn)，但中醫(yī)藥治療肝癌存在的核心問(wèn)題是其作用機(jī)理不清，尤其是對(duì)創(chuàng)新性理論指導(dǎo)下形成的名老中醫(yī)抗肝癌效驗(yàn)方的現(xiàn)代機(jī)制研究還不夠。我國(guó)著名中醫(yī)藥專家周仲瑛教授根據(jù)近六十年的臨床實(shí)踐，提出了“癌毒”學(xué)說(shuō)， 他認(rèn)為癌毒是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，是在腫瘤發(fā)病過(guò)程中體內(nèi)產(chǎn)生的一種特殊的病理因素，癌毒是腫瘤患者在正虛的基礎(chǔ)上，因體內(nèi)邪盛而生毒，癌毒與痰濁、瘀血、濕濁、熱毒等病理因素同時(shí)膠結(jié)存在、互為因果，亦可兼夾轉(zhuǎn)化、共同為病。癌毒一旦形成，阻滯體內(nèi)，則病變乖戻，一方面大量耗傷人體氣血津液，一方面導(dǎo)致臟腑氣血功能失調(diào)，誘生痰濁、瘀血、 濕濁、熱毒等多種病理因素，并耗氣傷陰，發(fā)生各種復(fù)雜證候，表現(xiàn)出邪毒囂張、難以消除、 易于傳變、病情篤重、病勢(shì)兇險(xiǎn)、正氣虛敗、預(yù)后極差等證候特點(diǎn)。近年來(lái)，隨著Toll樣受體(TLRs)的發(fā)現(xiàn)及其豐富生物學(xué)功能的進(jìn)一步揭示，以及 Toll樣受體/核因子-κΒ (TLRs / NF-κΒ)信號(hào)通路的部分闡明，為探討中醫(yī)藥抗癌機(jī)制開啟了新的思路與方法。本研究以TLRs / NF-κ B通路為切入點(diǎn)進(jìn)行癌毒方抗癌機(jī)制研TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的存在于生物機(jī)體中的一大類非常重要的模式識(shí)別受體(PRR)， 可表達(dá)于多種免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞，機(jī)體多種免疫防御反應(yīng)(包括腫瘤免疫)均需要不同TLRs的參與。根據(jù)TLRs的信號(hào)傳遞是否包含髓樣分化因子88 (MyD88)，TLRs信號(hào)通路又分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性兩種途徑，再通過(guò)一系列反應(yīng)，激活核因子-K B(NF--k B)，激活的NF-K B進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控多種重要的細(xì)胞因子、粘附分子和趨化因子的表達(dá)，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化及凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮重要的作用。目前研究比較多的是TLRs / NF-K B通路對(duì)炎癥性疾病、自身免疫性疾病、肝臟疾病、哮喘、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等的影響。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞表面也表達(dá)TLRs， 它們可被存在于局部的配體激活，刺激腫瘤細(xì)胞分泌過(guò)量腫瘤相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子，這些因子可刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管和淋巴管生成、腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)致T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能失調(diào)等，即腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的TLRs可能與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫逃逸及化療耐藥相關(guān)。 如在人類部分黑色素瘤細(xì)胞中，透明質(zhì)烷碎片能夠通過(guò)TLR4誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和MMP，這些物質(zhì)恰能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而產(chǎn)生的MMP又能溶解細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生透明質(zhì)烷，這種正反饋調(diào)節(jié)形成惡性循環(huán)，加速腫瘤惡化；Kelly等研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌能通過(guò)TLR4-MyD88通路激活NF-κ B，誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)卵巢癌可能通過(guò) TLR4-MyD88-NF- κ B通路抵抗抗腫瘤藥物紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡。研究表明，TLRs / NF-κ B通路有雙重作用，既可能通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，又可能起保護(hù)腫瘤細(xì)胞，逃脫免疫監(jiān)視的作用。一些研究發(fā)現(xiàn)中藥可通過(guò)影響免疫細(xì)胞中TLRs / NF-K B通路而發(fā)揮抗腫瘤作用，而中藥直接對(duì)腫瘤細(xì)胞此通路影響的研究，目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療肝癌的中藥癌毒方及其在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
癌毒方是在我校著名中醫(yī)專家周仲瑛教授的“癌毒”理論指導(dǎo)下確立的中醫(yī)藥治療肝癌的處方。本方主要由白花蛇舌草、山慈菇、蜈蚣、八月扎等組成，全方共奏清熱化痰、祛瘀散結(jié)、消癌解毒之功效，在繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，如何將其有效驗(yàn)方進(jìn)一步總結(jié)與驗(yàn)證，是名老中醫(yī)傳承工作一項(xiàng)重要的課題。中藥癌毒方其特征在于它是由下列重量配比的原料藥所制成蛇舌草3-20g ；僵蠶3-10g ；蜈蚣l-3g ；八月扎3-12g ；太子參3-15g ；麥冬3_12g ；山慈菇3_10g。上述的中藥癌毒方在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。癌毒方的藥理實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明是以肝癌&移植瘤小鼠為材料，觀察癌毒方的抗肝癌作用機(jī)制，本研究以 TLRs / NF-K B通路作為新靶點(diǎn)，從細(xì)胞因子表達(dá)的源頭TLRs入手，觀察癌毒方對(duì)肝癌模型鼠細(xì)胞TLRs/NF- κ B通路關(guān)鍵環(huán)節(jié)TLR4、NF- κ B、髓樣分化因子88 (MyD88)的影響探討抗癌作用機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)如下 1材料與方法藥物配制
癌毒方按上述處方劑量比例配制而成，為周仲瑛教授原創(chuàng)組方，其中藥制劑購(gòu)自安徽省亳州市中西藥有限公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室煎制，濃縮成生藥量為2g/ml濾液，保存?zhèn)溆?。順鉬注射液購(gòu)自南京制藥廠有限公司(批號(hào)20091118)，注射用生理鹽水購(gòu)自南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司(批號(hào)2009090403)。VEGF-ELISA試劑盒購(gòu)買自美國(guó)Pierce 公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
清潔級(jí)ICR小鼠，雄性，體重18士2g，共72只。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，飼料均購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。H22肝癌種鼠由南京市鼓樓醫(yī)院動(dòng)物房提供，頸椎脫白法處死H22肝癌種鼠，用碘酒、酒精消毒腹部，抽取種鼠腹水5 ml，加入10 ml的生理鹽水稀釋，75%酒精消毒待接種的ICR小鼠右腋下皮膚，按每鼠0. 2 ml接種小鼠右腋皮下。整個(gè)操作在60 min內(nèi)完成，接種M h后稱重，隨機(jī)分為5組，每組10只，即對(duì)照組(生理鹽水灌胃)，順鉬組(順鉬腹腔注射，0.001 g/kg/d)，癌毒方高、中、低劑量組(癌毒方10、30、90 g/kg/d灌胃)，以上劑量依據(jù)成人臨床擬用量，通過(guò)體表面積換算得出，造模后第2 d小鼠每天給藥1次，連續(xù)10 d。觀測(cè)癌毒方對(duì)荷H22肝癌小鼠生長(zhǎng)的抑制
癌毒方給藥前、給藥期間用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠的右前肢直徑進(jìn)行記錄，以腫瘤大小的變化和給藥時(shí)間繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線，并在給藥期間觀察各給藥組小鼠體重的變化。給藥后第10天處死小鼠，隨機(jī)嚴(yán)格剝離干凈皮下腫瘤組織，使用電子秤稱量(精確到0.01 g)稱瘤重后，計(jì)算各組瘤體平均重量及腫瘤抑制率，按以下公式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(<%)=(對(duì)照組瘤重均數(shù)一癌毒方組瘤重均數(shù))/對(duì)照組瘤重均數(shù)X100%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H22移植瘤細(xì)胞周期及凋亡峰(亞二倍體峰)
取處死的小鼠H22移植瘤組織并剪碎研磨，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液，1000 r/ min離心5 min，快速棄去上清液，加入PBS 0.5 ml，在混懸儀上緩慢注入2 ml 4°C、75%的冷乙醇，細(xì)胞固定后在20°C保存，1800 r/min離心10 min去掉乙醇，加PBS 2 ml, 1000 r/ min離心棄上清液，加PBS調(diào)細(xì)胞密度為1 X 106個(gè)/ml，使終體積約為0. 5 ml，加PI染液混勻，30 min后上機(jī)檢測(cè)，分析各組H22移植瘤細(xì)胞亞二倍體凋亡峰，研究該方對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。法檢測(cè)癌毒方對(duì)TLR4、MyD88及NF- κ B蛋白表達(dá)的影響
取處死的小鼠Η22移植瘤組織，于冰PBS中充分洗滌，留取約200mg組織置于Iml冰預(yù)冷裂解緩沖液，勻漿后冰浴30min，充分裂解。離心4°C，10000Xg，10min。將上清分裝，存于_70°C備檢。用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為50ug， 并于95-100°C 5min后冰上冷卻上樣。電泳條件濃縮膠40V，分離膠80V，約濁溴酚蘭至底部。取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。平放底部電極(陽(yáng)極)，在上面分別放置濾紙、PVDF膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流 200mA通電，電轉(zhuǎn)移lh。PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(室溫，Ih)，棄去封閉液，不洗。按約O.lml/cm2的量加入封閉液和適量一抗(用封閉液稀釋，稀釋比1:400)。搖床搖蕩孵育G°C，過(guò)夜)。PBST漂洗濾膜4次，每次lOmin。將膜與HRP結(jié)合的二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，二抗用封閉液稀釋，稀釋比1:10000)室溫下?lián)u蕩孵育lh，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次lOmin。進(jìn)行顯影和圖像分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Jf 士 s表示，采用SPSSI7.0統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)方差齊性采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)比較各組間差異，以P<0. 05或P<0. 01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
癌毒方對(duì)H22肝癌移植瘤的抑制作用表1各組小鼠實(shí)體瘤重比較(jf 士s)
權(quán)利要求
1.一種治療肝癌的中藥癌毒方，其特征在于它是由下列重量配比的原料藥所制成 蛇舌草3-20g ；僵蠶3-10g ；蜈蚣l-3g ；八月扎3-12g ；太子參3_15g ；麥冬3_12g ；山慈S 3-10g。
2.權(quán)利要求1所述的中藥癌毒方在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療肝癌的中藥癌毒方及其在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用，癌毒方系根據(jù)國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授的癌毒理論由蛇舌草、僵蠶、蜈蚣、八月扎、太子參、麥冬、山慈菇按一定重量配比制成，全方驅(qū)邪消癌解毒為主，輔以扶正，本發(fā)明以肝癌H22移植瘤小鼠為材料，藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明癌毒方的抗癌作用結(jié)果低、中、高劑量組抑瘤率分別為24.5%、42.8%，21.1%，顯示出抑制H22瘤塊生長(zhǎng)作用；低、中、高劑量組瘤塊細(xì)胞凋亡率分別為47.16%、60.52%、57.59%，顯示出誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用；能阻斷TLR4高表達(dá)，阻斷TLR4胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MyD88依賴性途徑，抑制下游NF-кB蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明癌毒方可用于制備抗肝癌的藥物。
文檔編號(hào)A61K35/64GK102357202SQ20111031373
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者吳勉華, 周紅光, 王明艷, 程海波, 陳海彬 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)