專利名稱：假型淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒糖蛋白的慢病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種假型淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒糖蛋白的慢病毒載體，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在新技術(shù)中的應(yīng)用越來(lái)越多，例如基因工程中的基因轉(zhuǎn)移、醫(yī)學(xué)研究以及基因治療等領(lǐng)域(例如C. Baum等人1998年在Gerson & Lattime學(xué)術(shù)出版社出版的《腫瘤學(xué)術(shù)討論基因治療對(duì)于癌癥，翻譯方法從臨床前期研究到臨床實(shí)施》)。大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒是來(lái)源于小鼠白血病病毒(MLV)。他們含有保持病毒完整性必需的所有LTR區(qū)序列以及負(fù)責(zé)包裝功能的Ψ元件。而編碼病毒蛋白的區(qū)域則被替換為研究人員想要轉(zhuǎn)入人類細(xì)胞的外來(lái)基因以及控制序列。這些載體在輔助細(xì)胞系(也稱為包裝細(xì)胞系)中表達(dá)，這些細(xì)胞含有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的完整拷貝。上述細(xì)胞系能夠合成病毒復(fù)制和感染所需的所有蛋白，但是由于它們?nèi)狈Ζ吩?，所以不能將病毒的基因組RNA包裝到病毒蛋白顆粒中。如果逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入到輔助細(xì)胞基因組中并發(fā)生轉(zhuǎn)錄，含有Ψ元件的轉(zhuǎn)基因mRNA能夠形成并與輔助病毒蛋白作用,然后被包裝到病毒顆粒中。不含病毒任何遺傳信息的重組病毒顆粒通過(guò)它們的表面蛋白被細(xì)胞吸收。病毒衣殼在細(xì)胞質(zhì)中被分解，而轉(zhuǎn)基因RNA被轉(zhuǎn)換為雙鏈DNA并整合到宿主細(xì)胞基因組中。這一系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于基因的整合能夠通過(guò)細(xì)胞分裂穩(wěn)定地遺傳給下一代細(xì)胞。而它的劣勢(shì)在于整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體采用一種穩(wěn)定的共軛整合(比如說(shuō)不對(duì)載體基因組序列進(jìn)行重組和重排)，從而使轉(zhuǎn)入的基因能夠長(zhǎng)期表達(dá)。除上述方法外，目前能夠做到基因長(zhǎng)期表達(dá)的只有游離皰疹病毒載體和腺病毒載體(AAV載體)。而后者的包裝系統(tǒng)(包裝細(xì)胞系)還沒(méi)有得到優(yōu)化。此外，腺病毒載體包裝能力較弱(腺病毒載體大概能包裝5kb遺傳信息，而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能包裝10_12kb)。除了被轉(zhuǎn)移 的基因外，包裝系統(tǒng)還表達(dá)含有逆轉(zhuǎn)錄病毒順式元件的載體基因組。載體基因組的轉(zhuǎn)錄并不能編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白，而是在gag-、pol-和env-基因產(chǎn)物的幫助下形成一個(gè)有侵襲能力但不能自我復(fù)制的病毒，插入到包裝細(xì)胞系中。這一病毒能夠作為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將轉(zhuǎn)移整合到載體基因組中的基因至目標(biāo)細(xì)胞中，而不會(huì)在目標(biāo)細(xì)胞中出現(xiàn)新的載體復(fù)制現(xiàn)象。換句話說(shuō)，病毒載體只能感染目標(biāo)細(xì)胞但是不會(huì)在目標(biāo)細(xì)胞中進(jìn)一步復(fù)制。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)已經(jīng)有了很大成果并能在GMP條件下大量生產(chǎn)不具備病毒復(fù)制能力的載體上清?；谛∈蟀籽〔《镜妮d體(MLV vectors)已經(jīng)多次用于臨床試驗(yàn)(P. Chu et al.，J. Mol. Med. 76 (1998) 184-192) ·兩種基本的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝體系在之前的文獻(xiàn)中已經(jīng)有報(bào)道(J.M. Wilson，Clin.Exp.1mmunol. 107 Supp1.1(1997) 31-32 ；C. Baum et al. 1998)，Ioc cit.)。MLV包裝細(xì)胞系含有逆轉(zhuǎn)錄基因gag (圖1)，但是pol和env基因以及包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒 RNA 需要的序列被敲除了 (C. Baum et al.，(1998)，loc. cit.)。
另一種已知的包裝系統(tǒng)來(lái)源于慢病毒(R. Carroll et al.,J. Virol. 68 (1994) 6047-6051 ；P. Corbeau et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 (1996) 14070-14075 ；L. Naldini et al.，Science 272 (1996) 263-267 ；C. Parolinet al. , J. Virol. 68 (1994) 3888-3895 ；J. Reiser et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 (1996) 15266-15271 ；J. H. Richardson et al.，J. Gen. Virol. 76(1995)691-696 ；T. Shimada et al. , J. Clin.1nvest. 88 (1991) 1043-1047).慢病毒是一種復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，它除了表達(dá)gag，pol和env基因產(chǎn)物外還表達(dá)一系列調(diào)控基因?，F(xiàn)有慢病毒包裝系統(tǒng)主要來(lái)源于人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒包裝系統(tǒng)的組成與MLV載體大致相同。慢病毒載體的一大特點(diǎn)是它們能夠感染靜止期的細(xì)胞。而MLV載體基因組只有當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)才能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。不過(guò)，由于慢病毒基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，慢病毒來(lái)源的包裝系統(tǒng)滴度相對(duì)較低和穩(wěn)定性也較差。由于他的基因組結(jié)構(gòu)過(guò)于復(fù)雜，基因組中的順式和反式作用原件不能被清晰地區(qū)分開(kāi)。在表達(dá)慢病毒gag，pol和env基因的包裝結(jié)構(gòu)中，我們也能找到包含在載體基因組中的一些重要的順式調(diào)節(jié)序列(例如部分包裝信號(hào))。由于上述同源性，載體基因組和包裝結(jié)構(gòu)可能發(fā)生重組，從而使慢病毒具有復(fù)制能力(例如可能會(huì)出現(xiàn)野生型的HIV病毒)。所以這一包裝系統(tǒng)與MLV包裝系統(tǒng)不具備可比性。之前文獻(xiàn)中報(bào)道的所有載體系統(tǒng)都有一些嚴(yán)重的缺陷，從而使它們不能在基因治療中成功應(yīng)用。1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體·的滴度往往過(guò)低。由于囊膜蛋白的不穩(wěn)定性，它們也不能被進(jìn)一步濃縮。2.同樣由于囊膜蛋白的不穩(wěn)定性，病毒顆粒在純化時(shí)也會(huì)損失一部分侵襲性。由于含有病毒載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中污染了細(xì)胞組分，所以上述純化過(guò)程又是必需的。3.由于囊膜蛋白的特性，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體會(huì)被人血清組分滅活。4.經(jīng)典雙嗜性載體囊膜蛋白的受體幾乎在所有細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)。但是，多種原代人類細(xì)胞(例如肝細(xì)胞和造血干細(xì)胞等基因治療靶細(xì)胞)中缺少有功能的雙嗜性受體。因此這些細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染相對(duì)困難或者不能實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種假型淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒糖蛋白的慢病毒載體，而且這一載體沒(méi)有之前文獻(xiàn)報(bào)道的載體的缺點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的目的就是提供一種能將基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)。這種包裝系統(tǒng)既能使目的基因穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞基因組中，還能使目的基因穩(wěn)定地表達(dá)。上述目標(biāo)是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒與淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)假型包裝實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種含有一個(gè)或多個(gè)外源基因的重組病毒顆粒。它是通過(guò)病毒顆粒與LCMV病毒假型包裝得到的。病毒的向性以及穩(wěn)定性主要是由囊膜蛋白決定的。小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒不僅能夠整合MLV-env基因編碼的糖蛋白，還能夠?qū)⑵渌《镜哪夷さ鞍渍系讲《就鈿ぶ小Ｒ虼?，我們所說(shuō)的假型包裝就產(chǎn)生了。逆轉(zhuǎn)錄病毒假型包裝載體是通過(guò)在MLV包裝細(xì)胞系中表達(dá)外源病毒囊膜蛋白來(lái)獲得的。傳統(tǒng)的MLV包裝細(xì)胞系含有逆轉(zhuǎn)錄基因gag，pol和env。而包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA所需的序列被敲除了。向上述包裝細(xì)胞系中引入一個(gè)含有目的基因、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列以及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒順式原件(LTR，leader)的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA在gag、pol和env基因產(chǎn)物的幫助下插入病毒顆粒，形成一個(gè)具有侵襲性但是不能復(fù)制的病毒。這種病毒能夠在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中用作逆轉(zhuǎn)錄載體。假型包裝細(xì)胞系還含有一個(gè)外源病毒的囊膜蛋白。本發(fā)明中的假型包裝細(xì)胞系含有LCMV病毒的囊膜蛋白，并且能夠表達(dá)LCMV病毒的糖蛋白。本發(fā)明首次提供了一種高滴度、濃縮的載體系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明得到的載體能夠在不損失感染性的情況下被進(jìn)一步純化。此外，就目前發(fā)明來(lái)看，假型包裝過(guò)程對(duì)于包裝細(xì)胞系沒(méi)有毒性。因此，我們首次提供了一種能夠通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒向靶細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)移基因的包裝細(xì)胞系(包裝系統(tǒng))。這一包裝系統(tǒng)能夠使目標(biāo)基因穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞或者宿主細(xì)胞基因組中并穩(wěn)定地表達(dá)。本發(fā)明中的包裝細(xì)胞系能夠適用于跨物種的廣泛的宿主細(xì)胞(細(xì)胞嗜性)。本發(fā)明的一大優(yōu)勢(shì)在于LCMV病毒囊膜蛋白的個(gè)別突變能夠引起LCMV病毒細(xì)胞嗜性的改變。也就是說(shuō)，由于gp基因上的個(gè)別突變，本來(lái)傾向于感染神經(jīng)細(xì)胞的病毒可能變的傾向于感染淋巴細(xì)胞或者單核細(xì)胞。在本發(fā)明中，我們最初采用的是嗜神經(jīng)細(xì)胞的LCMV病毒株系A(chǔ)rmstrong，L(ARM)(L. Villarete et al. , J. Virol. 68 (1994)7490-7496)(region coding for SEQ ID NO 4 ；compare appendix to the sequence protocol,re SEQ ID NO 3)的 gp 基因，以及嗜肝細(xì)胞的病毒株系 WE (V. Romanowski et al. , Virus Res. 3. (1985) 101-114) (SEQ ID NO 1)的gp基因。本發(fā)明還包括上述兩種病毒株系由于gp基因產(chǎn)物中個(gè)別氨基酸變化而產(chǎn)生細(xì)胞嗜性變化的病毒變種。由于LCMV病毒是一種RNA病毒,它在傳播過(guò)程中沒(méi)有核相。因此,在該病毒的RNA序列中很可能存在一段“神秘 的接合區(qū)”。移除上述接合區(qū)(修正異常剪接)可用于提高表達(dá)。因此，上述“剪接修正”后的變種也包含在本發(fā)明中。通過(guò)優(yōu)化GP的表達(dá)就能夠改進(jìn)假型包裝，因此可能不需要其他LCMV蛋白的額外支持。我們推薦的一個(gè)變種是WE-HPI，它是根據(jù)本發(fā)明篩選出來(lái)的，它的gp基因序列(開(kāi)放閱讀框(ORF)見(jiàn)SEQ ID No. 25)與LCMV病毒W(wǎng)E株系相比在如下位置發(fā)生了突變281，329，385，397，463，521，543，631，793，1039，1363 和 1370。WE 株系(序列見(jiàn) SEQ IDNO. 26)與 SEQ ID NO. 2 中的序列相比，在 94，110，129，133，155，174，181，211，265，347，455和457位置的氨基酸發(fā)生了改變。這一 GP突變株系的優(yōu)勢(shì)在于即使沒(méi)有其他LCMV協(xié)助蛋白也很穩(wěn)定，而且與WE株系相比，能夠更好地假型化。本發(fā)明也包括一種LCMV病毒的變種，它含有完整的或者一部分gp基因(序列見(jiàn)SEQ ID NO. 25)，但是編碼的蛋白序列與SEQ ID NO. 26相同(或者是它的一部分)。本發(fā)明還包括一種病毒變種，它含有SEQ ID NO. 26中的氨基酸序列(或它的一部分)，但是編碼該蛋白的基因序列與SEQ ID NO. 25相同(或它的一部分)。最后提到的這種突變體的核苷酸和氨基酸序列是從WE株系通過(guò)常規(guī)手段得到的(例如引入點(diǎn)突變)?？偟膩?lái)說(shuō)，所有能夠在真核細(xì)胞中高效率穩(wěn)定表達(dá)的表達(dá)載體都能夠用于表達(dá)LCMV病毒。在載體的選擇對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒LCMV假型化非常重要，因?yàn)樗仨毐ＷC能夠高水平穩(wěn)定的表達(dá)(例如，表達(dá)水平足夠高，能夠使病毒假型化，同時(shí)表達(dá)又很穩(wěn)定，不會(huì)關(guān)閉啟動(dòng)子)。根據(jù)本發(fā)明，如下兩種表達(dá)體系是首選的(CMV啟動(dòng)子)——珠蛋白內(nèi)含子2)——(gp)——(SV40 polyA信號(hào))(EF-Lalpha 啟動(dòng)子)-(gp)-(G-CSF 基因 polyA 信號(hào))(S. Mizushima,
Nucleic Acids Res. 18(1990)5322，T. Uetsuki, J. Biol. Chem. 264(1989)5791-5798).上述兩種表達(dá)體系中的序列已經(jīng)在序列說(shuō)明中給出或者是被廣泛認(rèn)可的序列CMV 啟動(dòng)子(M. Boshart et al. , CelI 41 (1958) 521-530 ;F. Langle-Rouault et al.,Virol. 72(7)6181-5(1998))珠蛋白內(nèi)含子2:(Jeffreys, A. J. et al. , Cell 12(1997) 1097-1108)
SV40polyA 信號(hào)(M. Boshart et al. , Cell 41 (1958) 521-530 ；F. Langle-Rouault et al.,Virol. 72(7)6181-5(1998))EF-1alpha 啟動(dòng)子SEQ ID NO 9(S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322，T. Uetsuki，J. Biol.Chem. 264(1989)5791-5798) ·gp (LCMV)比較SEQ ID NO :1，3，部分編碼見(jiàn)SEQ ID NO :4(參見(jiàn)序列附錄)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也包括上述表達(dá)系統(tǒng)。相關(guān)核苷酸序列可能發(fā)生變化，只要表達(dá)系統(tǒng)的功能保持完整即可。例如，根據(jù)本發(fā)明使用上述表達(dá)系統(tǒng)能夠在包裝細(xì)胞中假型化，病毒顆粒能夠感染靶細(xì)胞并且轉(zhuǎn)入的基因與宿主基因組能夠整合。此外，Invitrogen公司提供的游離型EBV表達(dá)載體(Epstein-Barr-Virus ；cf. F. Langle-Rouault et al. , Virol. 72(7)6181-5(1998)) (pCep4)也表現(xiàn)出了很高的表達(dá)能力，因此也屬于本發(fā)明推薦的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種包裝細(xì)胞系，它含有逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因(SEQ ID No 12 ;附錄序列表 re SEQ ID NO: 11)，pol 基因(SEQ ID NO : 13 ;附錄序列表 re SEQ ID NO: 11)，有的還含有env基因(SEQ ID NO 14 ;附錄序列表re SEQ ID NO 11)和(或者)逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)基因(如果是慢病毒包裝系統(tǒng)，則含有編碼慢病毒Rev蛋白的基因，該蛋白可防止慢病毒基因組唄剪接)，還含有編碼LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因(或該基因的一部分)(SEQ ID NO :4;附錄序列表re SEQ ID NO :3)。本發(fā)明還包括核苷酸序列發(fā)生修飾或者改變(突變、缺失等)后的變種，只要包裝細(xì)胞的假型化能夠正常進(jìn)行，靶細(xì)胞能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并且轉(zhuǎn)入的基因能夠穩(wěn)定整合到宿主基因組中。上文提到的序列中的任意一部分也包含在本發(fā)明中。下文中提到這一類基因時(shí),也都包括這些衍生出的變種。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“GP”或者“GP蛋白”表示GP-C前體蛋白。GP-1和GP_2蛋白都是在該前體蛋白基礎(chǔ)上通過(guò)蛋白水解剪切得到的，它們?cè)谙挛闹斜硎緸椤癓CMV糖蛋白”。此外根據(jù)本發(fā)明，在假型包裝系統(tǒng)中，除了 gp基因產(chǎn)物(SEQ ID NO 4)外，LCMV病毒的其他一個(gè)或多個(gè)基因也有表達(dá)。例如編碼核蛋白(SEQ ID NO :5;附錄序列表re SEQID NO 3)的np基因，編碼一個(gè)功能未知蛋白(SEQ ID NO 8 ;附錄序列表re SEQ ID NO 6)的Z基因和編碼RNA聚合酶(SEQ ID NO :7;附錄序列表re SEQ ID NO 6)的I基因。由于本發(fā)明的體現(xiàn)形式比較特殊，上述基因可能分別來(lái)源于LCMV病毒的WE株系或者Armstixrng株系。在這方面，np、z和(或)1基因(SEQ ID Nos :見(jiàn)上文)的全部或者一部分序列都可能用到。本發(fā)明還包括核苷酸序列發(fā)生修飾或者改變(突變、缺失等)后的變種，只要包裝細(xì)胞的假型化能夠正常進(jìn)行，靶細(xì)胞能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并且轉(zhuǎn)入的基因能夠穩(wěn)定整合到宿主基因組中。上文提到的序列中的任意一部分也包含在本發(fā)明中。下文中提到這一類基因時(shí)，也都包括這些衍生出的變種。本發(fā)明提供的包裝細(xì)胞系除了還有LCMV病毒gp基因外，還含有下列基因中的至少一個(gè)編碼核蛋白的np基因，編碼RNA聚合酶的I基因以及編碼一個(gè)未知功能蛋白的z基因。根據(jù)本發(fā)明，包裝細(xì)胞系能夠產(chǎn)生MLV/LCMV假型包裝的載體，也就是外殼包被有LCMV糖蛋白的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)本發(fā)明，所有能夠產(chǎn)生高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞系都能夠用于生產(chǎn)重組病毒。本發(fā)明推薦的細(xì)胞系包括NIH3T3，Te671，293T，HT1080(F.L. Cosset etal.，J. Virol.69 (1995)7430-7436 ；D. Markowitz et al.，Virology 167(1988)400-406 ；ff. S. Pear et al.，PNAS 90(1993)8392-8396)。細(xì)胞系的選擇并不重要，這也是本發(fā)明的一項(xiàng)特殊優(yōu)勢(shì)。因?yàn)樵谒幸褱y(cè)試的細(xì)胞系中，GP蛋白對(duì)它們都沒(méi)有細(xì)胞毒性。如果未來(lái)發(fā)現(xiàn)其他細(xì)胞系能夠更高效地產(chǎn)生病毒載體(滴度至少要高于上文中提到的水平，> IO6/ml)，那么也可以使用新的細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明，MLV病毒Moloney株系的gag和pol基因時(shí)包裝細(xì)胞用于假型化的首選基因(gag SEQ ID NO 12, pol SEQ ID NO 11, Nukleotide 1970-5573 ;附錄序列表 reSEQ ID NO: 11)。不過(guò)依據(jù)本發(fā)明，其他MLV病毒株系的gag和pol基因只要能夠滿足上述優(yōu)點(diǎn)，也能夠用于載體制備。特別是上文中提到的衍生基因也包含在本發(fā)明中。

LCMV-GP蛋白能夠假型包裝慢病毒核衣殼也屬于本發(fā)明的范圍(見(jiàn)范例)。作為本發(fā)明的一種特殊表現(xiàn)形式，包裝系統(tǒng)也可能含有慢病毒gag和pol基因的產(chǎn)物，也就是說(shuō)慢病毒包裝系統(tǒng)(包裝細(xì)胞系)也可能應(yīng)用于本發(fā)明。包裝系統(tǒng)來(lái)源于哪種慢病毒無(wú)關(guān)緊要。根據(jù)本發(fā)明，合適的慢病毒包裝細(xì)胞系包括人免疫缺陷病毒(HIV)來(lái)源的，猴免疫缺陷病毒(SIV)來(lái)源的以及貓免疫缺陷病毒(FIV)來(lái)源的。在這方面，高效率地制備具有侵染能力的慢病毒可能還需要表達(dá)一些附屬基因，例如HIV載體中的rev基因(SEQ ID NO:21;附錄序列表re SEQ ID NO 15)或者tat基因(SEQ ID NO :20 ;附錄序列表re SEQ IDNO 15)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，LCMV病毒蛋白可能在所有慢病毒包裝系統(tǒng)中用于假型包裝。本發(fā)明還提供了一種病毒包裝細(xì)胞或者一個(gè)假型包裝的病毒，這種病毒是從逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中篩選出來(lái)的，特別是MLV相關(guān)的病毒和慢病毒。作為本發(fā)明的一種特殊表現(xiàn)形式，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞是選自以下幾種病毒的包裝細(xì)胞系MLV，HIV, SIV和FIV。此外，根據(jù)本發(fā)明，用LCMV病毒突變體L(ARM)假型包裝一個(gè)不表達(dá)ENV蛋白的MLV逆轉(zhuǎn)錄病毒株系，能夠得到一種假型包裝的病毒。同理，其他LCMV株系也可以這樣使用。本發(fā)明還提供了建立包裝細(xì)胞系的方法。這種包裝細(xì)胞系是用常規(guī)方法(Maniatis, Sambrook, Fritsch Molecular cloning, a laboratory manual ；Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1982)轉(zhuǎn)入了一個(gè)或多個(gè)外源基因，并且攜帶LCMV病毒的細(xì)胞系。外殼包被有LCMV糖蛋白的病毒就是有這些包裝細(xì)胞系表達(dá)的。作為本發(fā)明的一個(gè)特殊的表現(xiàn)形式，假型包裝細(xì)胞系是在逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入了一個(gè)含有LCMV病毒gp基因(或該基因的一部分)的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)入的基因還可以包括下述基因的一個(gè)或多個(gè)LCMV病毒np基因，I基因和z基因。本發(fā)明還包括逆轉(zhuǎn)錄病毒假型包裝載體在逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞中制備的過(guò)程。這些包裝細(xì)胞至少含有LCMV病毒gp基因或者該基因的一部分(如上文所述)，在合適的條件下能夠產(chǎn)生病毒載體。在現(xiàn)在發(fā)明的序列中，使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系是MLV(鼠白血病病毒)包裝細(xì)胞系。這個(gè)細(xì)胞系不會(huì)表達(dá)功能性的ENV(包膜蛋白基因)，并且被用來(lái)做假性模型的LCMV (淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)是被刪除了突變的L(ARM)。被von Laer et al. (J.Virol. 72(1998) 1424-1430)描述的細(xì)胞系也可以被用來(lái)作為ENV陰性的包裝細(xì)胞系。這項(xiàng)發(fā)明的病毒體或者包裝細(xì)胞系可以方便的被用來(lái)制作假性病毒載體，這種病毒載體可以方便的用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系或者低等的真核細(xì)胞用在體外試驗(yàn)研究，或用在基因治療上。用病毒體或者包裝細(xì)胞系進(jìn)行基因治療也在這項(xiàng)發(fā)明的考慮范圍之內(nèi)。在這一點(diǎn)上，基因治療可以被用來(lái)治療傳染性疾病比如艾滋病，腫瘤比如乳腺癌，或者黑色素瘤等其它疾病。這項(xiàng)發(fā)明也考慮到將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)中。本發(fā)明中的重組病毒體或重組包裝細(xì)胞系是由一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因構(gòu)成。轉(zhuǎn)基因是從一些基因中篩選出來(lái)的，這些基因包括標(biāo)志性基因，例如neo，IacZ或EGFP(綠色熒光增強(qiáng)蛋白)；或者是被用來(lái)進(jìn)行基因治療的基因，例如單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)，胞嘧啶脫氨酶(CD);或者一些具有抗病毒作用的序列，例如核酶，反義核酸序列轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢(shì)陰性的基因；或者是用來(lái)進(jìn)行腫瘤治療的基因，例如被用來(lái)保護(hù)化療過(guò)程中的造血功能的多藥耐藥-l(mrd-l)或細(xì)胞 因子基因。除此之外，所有與靶基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因或體外細(xì)胞中表達(dá)且與基因治療相關(guān)的轉(zhuǎn)基因都可以被應(yīng)用。本發(fā)明還包括基因治療的一個(gè)制藥學(xué)的準(zhǔn)備，使得本發(fā)明的假膜性病毒載體或是逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞可以找到具有兼容性的藥物賦形劑或是載體?；蛑委煴仨氃隗w內(nèi)使靶細(xì)胞得到基因的改變，而其它的細(xì)胞不發(fā)生變化。比如說(shuō)，自殺基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞而不是健康的細(xì)胞，化療耐受基因應(yīng)該進(jìn)入正常的血液干細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞。更多的靶基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)入特定細(xì)胞已經(jīng)合并配體進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的表面或者脂質(zhì)體。盡管如此，一個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)運(yùn)，不可能只是利用那些配體結(jié)合靶基因的方法，也不是載體基因進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(F.L.Cosset et al.，J. Virol. 69 (1995) 6314-6322)，且沒(méi)有與溶酶體膜的融合。這個(gè)問(wèn)題可以用病毒外膜或者是外膜蛋白來(lái)解決，病毒外膜蛋白可以作為融合蛋白越過(guò)溶酶體膜。LCMV GP的利用是本項(xiàng)目的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@種病毒包膜蛋白在低PH時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化，在靶細(xì)胞的核內(nèi)占優(yōu)勢(shì)。構(gòu)象的改變可以激活融合作用，盡管沒(méi)有必需的LCMV GP的受體結(jié)合。由于相對(duì)于其他融合蛋白，LCMV GP沒(méi)有介導(dǎo)細(xì)胞膜的融合，它也沒(méi)有細(xì)胞毒性且不會(huì)誘發(fā)巨細(xì)胞的構(gòu)型(cf. C. di Simone et al. , Virology198(1994)455-465)。根據(jù)本發(fā)明，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，它包括逆轉(zhuǎn)錄基因gag，pol, env和/或調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄基因，LCMC或它一部分編碼糖蛋白GP-1，GP-2的gp基因。其中env基因被修飾來(lái)編碼Env蛋白，Env蛋白介導(dǎo)與靶細(xì)胞之間的特定結(jié)合，即所謂的env靶向；gp是一種變異，編碼的GP蛋白具有融合活性，被稱為融合輔助。進(jìn)一步的相關(guān)的方法對(duì)于準(zhǔn)備那些包裝細(xì)胞，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒基因env，被修飾后編碼Env蛋白，Env蛋白介導(dǎo)與靶細(xì)胞之間的特定的結(jié)合；gp基因是一個(gè)變異基因，編碼具有融合活性的GP蛋白。在這種情況下，為了阻止或減少GP和其細(xì)胞受體的結(jié)合，有必要改變編碼LCMV GP受體結(jié)合位點(diǎn)的序列(沒(méi)有損害融合活性)。作為另一種方法，考慮用中和抗體對(duì)抗GP，可以中和受體結(jié)合而不用通過(guò)GP來(lái)抑制PH依賴性的融合。根據(jù)本發(fā)明第一次提供的穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系，現(xiàn)在有可能通過(guò)GP-1的靶向變異來(lái)確定受體結(jié)合位點(diǎn)。專業(yè)人士對(duì)這種方法提到的中和抗體隔離是非常熟悉的。本發(fā)明第一次提出可以在高滴定度和高濃度條件下制造載體系統(tǒng)。載體顆?？梢栽跊](méi)有任何傳染性物質(zhì)損失的情況下被純化。本專利的細(xì)胞系具有寬且跨種系的宿主細(xì)胞譜(細(xì)胞趨性)。令人驚奇的是，本發(fā)明中的假性模型對(duì)于包裝細(xì)胞系來(lái)說(shuō)沒(méi)有細(xì)胞毒性。第一次出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞系，可以使逆轉(zhuǎn)錄病毒將目的轉(zhuǎn)錄基因穩(wěn)定的向靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。這將是轉(zhuǎn)移的靶基因與宿主細(xì)胞穩(wěn)定的整合，從而使該基因穩(wěn)定的表達(dá)。


圖1、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因gag，pol及env穩(wěn)定的融入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的示意圖；其中①載體基因組和轉(zhuǎn)基因、調(diào)控順式元件一同表達(dá)，該載體的基因組RNA包括一個(gè)包裝信號(hào)，這個(gè)信號(hào)已在gag、pol及env基因上刪除；②逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白選擇性的包裹載體基因組—個(gè)完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒核衣殼形式—個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒以出芽的方式從細(xì)胞膜釋放；⑤通過(guò)蛋白裂解核衣殼上的逆轉(zhuǎn)錄病毒前體蛋白病毒在細(xì)胞外成熟。

圖2、LCM病毒的基因組RNA不意圖；LCM病毒的基因組由2個(gè)雙義RNA分子組成，每個(gè)分子包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框架。圖3、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系不產(chǎn)生病毒包膜蛋白但仍釋放無(wú)感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體示意圖；如果無(wú)env基因的細(xì)胞系被LVM病毒感染，則逆轉(zhuǎn)錄病毒能將LCMV的糖蛋白插入到他們的包膜中，另外，LCM野生型病毒能在LCMV復(fù)制過(guò)程中釋放。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。舉例材料和方法細(xì)胞和病毒由 F.-L. Cosset (F. L. Cosset et al. J. Virol. 69 (1995) 7430-7436)提供的env陰性包裝細(xì)胞系TELCeB。Env陰性的細(xì)胞系293gp2被(D. Von Laer et al.,J. Virol. 72 (1997) 1424-1430) ·小鼠的成纖維細(xì)胞系Sc-1在最小量的必需培養(yǎng)液中培育(Sigma, Deisenhofen, Germany),培養(yǎng)液中含有 10% 的胎牛血清(FCS, PAN Systems,Aidenbach，Germany).人腎細(xì)胞系293，人肝癌細(xì)胞系HUH-7，人類成纖維細(xì)胞系Te671和TELCeB和小鼠的成纖維細(xì)胞系L-929在含10%胎牛血清的杜爾貝科培養(yǎng)液(DMEM，Gibco，Paisley, Great Britain).人類造血前細(xì)胞系TF-1在含有10%胎牛血清和IL-3的伊斯科夫杜爾貝科培養(yǎng)液(Gibco，Paisley，Great Britain)。一個(gè)含有IL-3基因的BPV載體轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞，作為溶液中IL-3的來(lái)源，它是TF-1 (H. Karasuyama et al.，Eur.J.1mmunol 18(1988)97-104).最快生長(zhǎng)所必須的。人前體細(xì)胞系K562在含有10%胎牛血清的RPMI (Gibco)中培養(yǎng)。LCMV是放置在10. 11. 1998的歐洲細(xì)胞培育中心(ECACC)，斯堡，威爾特郡，SP40JG，英國(guó)。根據(jù)布達(dá)佩斯條約獲取號(hào)碼為V98111005. MESV類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，攜帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(MPLN)已經(jīng)被報(bào)道(H.-G. Eckert，Blood 88(1996)3407-3415).轉(zhuǎn)染輔助因子是重組的莫羅尼氏MLV，它能夠復(fù)制一部分的pol基因和大部分的env基因，這種莫羅尼氏 MLV 已經(jīng)被 MLV strain 4070A 取代[Mo-Ampho-MP，R320 (C. Munk, Proc.Natl. Acad. Sci, USA 94 (1997) 5837-5842)]，作為一個(gè) SailI 至 ClaI 的片段。這種病毒在Sc-1中增殖。純化的WE序列的LCM病毒在L-929細(xì)胞中增殖。(Τ. M. Rivers, Virology26 (1965) 270-282).連續(xù)的流式細(xì)胞技術(shù)分析LCMV-GP表達(dá)。為了分析LCMV糖蛋白的表達(dá)，3xl05到IO6細(xì)胞獲取后壓縮再懸浮于50μ I I 40稀釋的小鼠腹水中，腹水中包含一種小鼠的單克隆抗體對(duì)抗LCMV GP-1 (Μ. Bruns et al.，Virology 130 (1983) 247-251).在冰上孵育20分鐘后，細(xì)胞用PBS磷酸鹽緩沖液洗3遍，接著在1: 80稀釋的FITC的羊抗鼠抗體(Dako, Glostrup, Denmark)中孵育20分鐘。最后再PBS中洗三遍，細(xì)胞用FACScalibur裝置進(jìn)行分析。病毒滴定法為了確定載體的滴度，5x104Sc-1細(xì)胞被5倍稀釋后，其上清接種在24孔培養(yǎng)板上。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄neo載體的選擇是加入400 μ g G418/ml (dry weight GIBCO)開(kāi)始后24小時(shí)。培養(yǎng)液每4天更換一次。10天后評(píng)估克隆量。滴度是用每毫升中G418抑制轉(zhuǎn)移的單位數(shù)來(lái)表示。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒MFGnlsLacZ載體,按照先前文獻(xiàn)的方法(G. R. McGregor,Methods Mol. Biol. 7 (1989) 1-19)在接種后 2 天用 X-ral (5-bromo-4-chloro-3-1ndolyl-β -D-galactopyranoside)進(jìn)行染色。滴度用每ml LacZ轉(zhuǎn)移單位(LTU)進(jìn)行表示。LCMV的板形單位按照以前文獻(xiàn)的方法在L-929細(xì)胞上進(jìn)行分析(F. Lehmann-Grube, J. Gen.Virol. 37(1997)85-92)。MLV(LCMV)假型病毒通過(guò)等量病毒陽(yáng)性上清的預(yù)孵化被中和，這種病毒陽(yáng)性上清米用一個(gè) ant1-LCMV gp44_ 中和1: 100 滴度的單克隆抗體。(M. Bruns et al. ,Virology130 (1983) 247-251).滴度采用前述的LTU/ml來(lái)確定。DNA 分析采用早期文獻(xiàn)(C.Stocking et al. , Cell 53 (1988) 869-879)的 DNA 定量和Southern blot分析的方法。基因組DNA可以用HINDIII進(jìn)行消化，HINDIII可以把MPlN載體的neo基因的3’端進(jìn)行單一切除。一個(gè)包含完整neo基因的片段被用作探針。病毒的制造和提純病毒體采用文獻(xiàn)中用到的梯 度加速離心法進(jìn)行提純(L. Martinez-Peralta etal.，J.Gen. Virol. 55(1981)475-479).總之，就是感染細(xì)胞培育的上清采取低速和高速離心法進(jìn)行純化。采用超速離心法病毒被壓縮，進(jìn)而采用0-40%的二乙酰氨基三碘苯甲酸甲基葡胺梯度純化(Schering AG, Berlin, Germany)。實(shí)施例1感染含有LCMV-LacZ基因的TeLCeb向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移，通過(guò)Ant1-GP Mab和載體的濃度梯度來(lái)中和載體用LCMV來(lái)營(yíng)救包膜蛋白陰性的鼠白血病病毒載體為了證明LCMV是否能營(yíng)救包膜蛋白陰性的鼠白血病病毒載體，env陰性的包裝細(xì)胞系TELCeB被感染多樣性(m. ο.1.:表明細(xì)胞被感染后病毒體的數(shù)量)為O. 01的LCMV WE系感染。TELCeB來(lái)自于人成纖維細(xì)胞系Te671,并且包含gag, pol和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MFGnlsLacZ (G. M. Crooks etal.，Blood 82(1993)3290-3297).在LCMV感染后，LTU的滴度和LCMV多類型病毒被鼠的成纖維靶細(xì)胞X-gal染色和培養(yǎng)板測(cè)定(在板形單位，PFU)。除此之外，在感染TELCeB中LCMV糖蛋白的表達(dá)可以用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在。LTU在6天當(dāng)中，第3天最大，為5x104LTU/ml.第2天為L(zhǎng)CMV野生型病毒的最高滴度3xl08.在第3天時(shí)PFU的產(chǎn)生已經(jīng)下降，而此時(shí)LTU的產(chǎn)生量最大，LCMV糖蛋白的表達(dá)量也達(dá)到最高。這種矛盾產(chǎn)生的原因可能是產(chǎn)生的缺陷干擾LCMV顆粒抑制了 LCMV野生型病毒的復(fù)制，所有的可能性都不會(huì)是感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的釋放。在包裝細(xì)胞系中LCMV的復(fù)制沒(méi)有觀察到明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，盡管高水平的LCMV糖蛋白表達(dá)。接下來(lái)，用一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)是否LCMV感染TELCe產(chǎn)生的病毒通過(guò)LCMV糖蛋白特異性的介導(dǎo)LacZ基因?qū)搿Ｓ弥行缘摹nt1-LCMV gp44單克隆抗體孵育上清I個(gè)小時(shí)。這將引起LTU滴度下降超過(guò)3倍。轉(zhuǎn)染的相同逆轉(zhuǎn)錄病毒的假性模型沒(méi)有被ant1-LCMV抗體中和(表I)。這些數(shù)據(jù)表明，MLV/LCMV病毒體在它們的表面實(shí)際上攜帶有LCMV糖蛋白這些糖蛋白在缺少逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的情況下通過(guò)LCMV受體來(lái)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入。表1. LCMV感染的包裝細(xì)胞系產(chǎn)生的感染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒能夠被ant1-LCMV糖蛋白單克隆抗體所中和。表I
權(quán)利要求
1.一種假型淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒糖蛋白的慢病毒載體，它含有逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因，pol基因，env基因，逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)基因，編碼LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述pol基因核苷酸序列如SEQID N0:5所
3.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體中的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞是選自如下病毒的包裝細(xì)胞系之一 MLV，HIV, SIV和FIV。
5.權(quán)利要求1所述載體在制備基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假型淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒糖蛋白的慢病毒載體，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。它含有逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因，pol基因，env基因，逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)基因，編碼LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因。本發(fā)明第一次提出可以在高滴定度和高濃度條件下制造載體系統(tǒng)。載體顆?？梢栽跊](méi)有任何傳染性物質(zhì)損失的情況下被純化。本發(fā)明的細(xì)胞系具有寬且跨種系的宿主細(xì)胞譜。
文檔編號(hào)A61P31/14GK103060377SQ20111031685
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者王劍 申請(qǐng)人:王劍