專利名稱：一種聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，屬于藥物制劑領域。
背景技術：
早在1957年，lssacs等人發(fā)現(xiàn)病毒感染的細胞產(chǎn)生一種因子，可抵抗病毒的感染，干擾病毒的復制，因而命名為干擾素(interferon，IFN)。干擾素是由滅活的或活的病毒作用于易感細胞后，由易感細胞基因組編碼而產(chǎn)生的一組糖蛋白。其活性及抗原性皆取決于分子中的蛋白質(zhì)，而與其糖基無關。根據(jù)其來源和結構，可將IFN分為IFN-α、IFN-β、 IFN-Y，它們分別由白細胞、纖維母細胞和活化T細胞產(chǎn)生。IFN-α為多基因產(chǎn)物，有十余種不同亞型，但它們的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，還有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、 控制細胞增殖及引起發(fā)熱等作用。目前臨床上使用的干擾素大多是通過基因重組技術得到的。IFN是慢性病毒性肝炎經(jīng)臨床驗證有效的一線治療藥物。臨床使用較多的是天然結構的IFN α - 和IFN α _2b。二者均屬于短效干擾素，半衰期短G 16 h)，血清濃度在注射M h后已經(jīng)很低。其在體內(nèi)的藥代動力學過程影響了其抗病毒治療的遠期療效。按照目前:T6MU/kg，每周3次的用藥方法，在體內(nèi)干擾素水平呈現(xiàn)出典型的“峰-谷曲線”。干擾素血清水平大幅度波動容易使病毒水平反跳，產(chǎn)生耐藥性，降低治療效果。同時，短效干擾素存在毒副反應大，人長期使用耐受性差，免疫原性強等不足。因此，對短效干擾素進行修飾，延長其在體內(nèi)的半衰期，維持體內(nèi)血藥濃度的穩(wěn)定，將有助于提高其治療病毒性肝炎的有效性，并減輕毒副作用。為提高天然干擾素的活性，美國Amgen公司首次合成了一種非天然的干擾素 (Consensus interferon,集成干擾素，商品名為干復津)。干復津是一種經(jīng)計算機優(yōu)化組合的非天然的重組α-干擾素，其序列由20種天然α-干擾素亞型序列優(yōu)化組合而成，其抗病毒活性比天然干擾素提高了 5 10倍。1997年，F(xiàn)DA批準干復津應用于丙型肝炎的治療， 研究結果顯示療效明顯優(yōu)于普通干擾素。美國專利US4695623、US4897471、US537^08公開了復合干擾素具有廣譜的干擾素活性，有較強的抗病毒和抗腫瘤以及激活NK細胞的活性。 但是干復津和天然α干擾素相同，具有穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短、免疫原性強等缺點。同時 N端第一位的半胱氨酸需與99位半胱氨酸形成二硫鍵，不能有效的進行N末端修飾。雖然 Amgen公司的美國專利US005985^5 A公開了和干復津蛋白的N端修飾的方法，但無論在修飾率和修飾后保留的生物活性均明顯低于其它蛋白的N末端修飾(重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF和重組人生長激素GH等)。在干復津基礎上，根據(jù)同源序列最高原則，發(fā)明人設計了全新的集成干擾素序列， 命名為集成干擾素變異體(super antiviral interferon,簡稱IFN-SA)，現(xiàn)根據(jù)干擾素的命名原則改為重組集成干擾素變異體(或稱重組復合干擾素變異蛋白)。由171氨基酸組成， 在N末端專門設計引入Gly Ser Gly Gly Gly五個氨基酸序列，可實現(xiàn)N末端的專一位點 PEG修飾。該結構與干復津結構不同，同時體外抗病毒活性提高了 50%。本新型結構及其重組制備和在抗病毒性疾病中的應用，已獲中國發(fā)明專利授權，專利號ZL01102915. 3。然而，與其它蛋白質(zhì)一樣，使用集成干擾素變異體作為藥物通常也會受到一些缺點的限制，包括免疫原性和半衰期短，其免疫原性導致中和抗體的形成以及臨床治療效果的損失，半衰期短則意味著需要對患者頻繁給藥以維持蛋白的有效治療濃度。聚乙二醇(polyetnylene glycol，PEG)是一種安全無毒、無活性的聚合物，常用于蛋白質(zhì)藥物修飾。修飾后的蛋白抗酶解、水溶性增加、半衰期延長、免疫原性和毒性降低(Inadajet al.，J. Bioact . And Compatible Polymers, 5343(1990). Delgalojet al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems, 9:249 (1992) katre，Advanced Drug Delivery Systems, 10:91(1993))。然而，盡管干擾素-聚合物綴合物在臨床上有效，但是該類綴合物在臨床實踐中的廣泛使用，需要能夠在生產(chǎn)和分發(fā)給醫(yī)療機構期間的一段延長期內(nèi)儲存的制劑。干燥是保持物質(zhì)不致腐敗變質(zhì)的方法之一，然而一些干燥方法是在0°c以上或更高的溫度下進行。 干燥后產(chǎn)品的理論和生物學性質(zhì)會發(fā)生很大的變化，而冷凍干燥是發(fā)生在o°c以下，是指通過升華從凍結的物料中除水分或其它溶劑的過程。升華指的是溶劑，比如水，象干冰一樣， 不經(jīng)過液態(tài)，從固態(tài)直接變?yōu)闅鈶B(tài)的過程，冷凍干燥得到的產(chǎn)物稱作凍干物，該過程稱作凍干。在冷凍干燥過程中樣品的結構不會被破壞，因為固體成分被在其位置上的堅冰支持著， 在冰升華是，它會留下孔隙在干燥的剩余物質(zhì)里，這樣就保留了產(chǎn)品的生物和化學結構及其活性的完整性。目前，冷凍干燥法常用于許多生物活性材料(包括多肽、蛋白質(zhì)等)的保存，但是， 凍干法也有其自身的局限性，如在冷凍和除水過程中，蛋白過濃，可能會導致產(chǎn)物的不穩(wěn)定。因此，除了在凍干狀態(tài)以及液態(tài)都可以發(fā)生的脫酰胺作用以及氧化反應外，凍干法可能導致交聯(lián)(生成共價寡聚物)以及非共價聚合物比例的升高，為了增強生物活性材料的穩(wěn)定性，經(jīng)常需要一些保護劑。目前，大多數(shù)注射用蛋白類生物品的保護劑通常選用人血白蛋白，而人血白蛋白價格昂貴，致使該凍干產(chǎn)品成本高，另外人血白蛋白具有攜帶病毒的危險。為了解決這個問題，許多人正致力于蛋白類凍干制劑的研究，嘗試以其它物質(zhì)代替人血白蛋白作為凍干保護劑，如中國專利CN1260171A中選用右旋糖酐作為重組干擾素的凍干保護劑，也有用甘露醇作為凍干保護劑，在用甘露醇作為凍干保護劑時，往往會出現(xiàn)復溶性差、影響蛋白效應的問題，而單用右旋糖酐，對于有些蛋白，不利于其長時間保存，制劑穩(wěn)定性相對較差。已知在某些狀態(tài)下氨基酸可以作為凍干蛋白產(chǎn)品的保護劑，據(jù)報道，谷氨酸鈉和賴氨酸鹽，對一種蛋白，乳酸脫氫酶的冷凍變性具有防凍作用(Seguro，et al.
，Cryobiology 27:70-79(1990))等其它種類的分子，包括單糖和二糖，比如乳糖和海藻糖， 以及聚合物比如PVP，也有報道作為凍干蛋白的保護劑，但對于這些二糖(乳糖和海藻糖)， 其價格昂貴，用其做低溫保護劑時成本較高。但是，由于不同蛋白質(zhì)本身理化性質(zhì)的差異， 對任一給定的蛋白產(chǎn)品，他們的效用是無法預測的。目前，上市的聚乙二醇集成干擾素變異體制劑仍然沒有，因此，需要提供一種穩(wěn)定的、可供臨床方便使用、并且適宜儲存的制劑
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定的并適合長期儲存的聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，本發(fā)明制劑復溶性好，性能更穩(wěn)定，適于長期保存。本發(fā)明所述聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，以及包含保持PH在4. 5-7. 5的緩沖體系、一定量的低溫保護劑，其中，所述的集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121突變?yōu)長ys121、Asp166突變?yōu)镚lu1fi6。本發(fā)明中，所述的保持pH值在4. 5-7. 5的緩沖體系可以是醋酸鹽緩沖體系、碳酸鹽緩沖體系、枸櫞酸鹽緩沖體系或磷酸鹽緩沖體系。本發(fā)明中，優(yōu)選的緩沖體系為磷酸鹽緩沖體系，優(yōu)選的pH值范圍為6. 5-7. 5。所述的低溫保護劑，包括甘露醇、右旋糖酐或海藻糖中的任意一種或兩種組合，優(yōu)選為右旋糖酐與海藻糖的組合，右旋糖酐與海藻糖的比值為廣4。本發(fā)明的研究人員發(fā)現(xiàn)，將右旋糖酐與海藻糖以一定比例混合后，作為凍干產(chǎn)品的低溫保護劑，可以獲得較單用右旋糖苷更為穩(wěn)定的聚乙二醇干擾素變異體凍干制劑，保存時間更長。本發(fā)明中，所述聚乙二醇集成干擾素變異體凍干制劑，還可進一步包括穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑可以是堿性氨基酸或聚山梨酯中的任意一種或多種，堿性氨基酸可以是，比如精氨酸或賴氨酸，或鹽酸精氨酸或鹽酸賴氨酸，堿性氨基酸的用量為25-40mg/ml ；所述聚山梨酯為聚山梨酯80，用量為0. 05-0. 20mg/ml。在凍干制劑中，加入一定量的穩(wěn)定劑后，制劑穩(wěn)定性可相應地得到提高。作為聚乙二醇-集成干擾素變異體綴合蛋白，所用的聚乙二醇，可以是直鏈聚乙二醇，也可以是支鏈聚乙二醇，優(yōu)選為直鏈聚乙二醇，更為具體地，偶聯(lián)本發(fā)明集成干擾素變異體的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)醛，如可以是單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛，以實現(xiàn)對集成干擾素N末端的定點修飾，所用的mPEG的分子量范圍可以選自是5000-50000，優(yōu)選為10000-20000的范圍，如可以是 mPEG12000，mPEG20000O本發(fā)明中，在作為一種凍干原液時，在用水配制后，它含有下列組分
50至500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，其中所述集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121 突變?yōu)?Lys121、Asp166 突變?yōu)?Glulfi6;
保持 PH 為 6. 5-7. 5 的 NaH2PO4. 2H20-Na2HP04. 12H20 緩沖體系3%-6%的右旋糖酐(w/v)；
重量比為1%_4%的海藻糖(w/v)；
其中，右旋糖苷與海藻糖的重量比為廣3 ；
25-35mg/ml的鹽酸賴氨酸，以及，
0. 05-0. 15mg/ml 的聚山梨酯 80 ；
注射用水。注射液中，聚乙二醇-集成干擾素為在N末端GlySerGlyGlyGly上進行單一修飾的單甲氧基聚乙二醇-集成干擾素變異體。修飾集成干擾素的聚乙二醇，為分子量為12kDa或20kDa的mPEG。
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當將所得的穩(wěn)定的凍干前液進行凍干后，可以得到更利于儲存是凍干粉針型注射劑。本發(fā)明的一個實施例中，研究了不同比例的右旋糖酐-海藻糖低溫保護劑系統(tǒng)， 在制成凍干制劑后所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性，結果表明，當海藻糖在低溫保護系統(tǒng)中比例達到25% 左右時，所得凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性明顯較不使用海藻糖的右旋糖酐強，但當達到50%左右時， 其穩(wěn)定性提高不明顯。本發(fā)明的再一實施例中，給出了具體制備本發(fā)明所述聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑的處方組成，三個處方制成的聚乙二醇-集成干擾素變異體凍干制劑，在4°C條件下保存M個月，以水復溶后檢測，聚乙二醇-集成干擾素變異體的活性保留率以及單聚乙二醇-集成干擾素變異體含量變化不大，所得制劑穩(wěn)定。本發(fā)明的還一實施例中，在給定的右旋糖酐-海藻糖體系中，加入一定比例的穩(wěn)定劑堿性氨基酸，比如鹽酸賴氨酸，得到的凍干制劑，穩(wěn)定性有一定提高。
實施例本發(fā)明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領域技術人員可以對本發(fā)明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1 制備 mPE&_a-IFN-SA
IFN-SA溶液(3. 5mg/ml)溶于磷酸鈉濃度為100mM，pH6. 0內(nèi)含20mM NaCNBH3的溶液中， 4°C冷卻后充分混勻，加入超出4倍摩爾量的甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-丙醛，平均分子量為 20kDa)。在反應過程中蛋白質(zhì)的修飾程度用反相HPLC來監(jiān)測，10小時后，反相HPLC分析結果表明，80%的N-末端具有未封閉的α氨基的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成mPEG-IFN-SA衍生物。
在10小時時間點，反應混合物用水稀釋5倍，mPEG-IFN-SA衍生物的純化用離子交換層析來完成，其所用的柱為Hiload 16/10 S Sepharose HP柱，以20mM的醋酸鈉緩沖液pH5. 5加以平衡，反應混合物以lml/min的流速裝入柱內(nèi)，未反應的mPEG醛以3倍于柱體積的相同緩沖液加以洗脫，然后在4°C條件下進行蛋白質(zhì)-聚合物連接分子的洗脫，以 0%-75%的20mM醋酸鈉緩沖液進行線性洗脫420min，緩沖液pH為5. 5，含有IM NaCl，合并 mPEG-IFN-SA衍生物的流份，經(jīng)濃縮后再過濾。 實施例2配置下列比例的凍干原液，并凍干成成品 Na2HPO4. 12Η20，2· 58mg/ml, NaH2PO4. 2Η20，0· 44mg/ml ；
(1)3.5%的右旋糖酐(w/v)+3.5%海藻糖(w/v)；
(2)3. 5%的右旋糖酐(w/v)+l· 1%海藻糖(w/v)；
(3)3. 5%的右旋糖酐(W/v)+L7%海藻糖(w/v)；
(4)4%的右旋糖酐(w/v)+l%海藻糖(w/v)；
(5)4%的右旋糖酐(w/v)+0. 5%的海藻糖(w/v)；
(6)5. 的右旋糖酐。
按比例，取右旋糖酐、或不同比例的右旋糖酐-海藻糖，以PH為6. 5-7. 5的磷酸鹽緩沖液配制，過濾除菌，制備含不同比例的右旋糖酐或右旋糖酐-海藻糖低溫保護劑的 mPEG20kDa-IFN-SA 溶液，每毫升溶液中含有 mPE(i2(lkDa-IFN-SA 50-160 μ g/ml，充分混勻，分裝為Iml/瓶，進行冷凍干燥，制備得到凍干制劑，保存。將樣品以水再溶解，同時測定HiPEGZOklla-IFN-SA生物活性(IU/ml)、單個 mPEG20kDa-IFN-SA的純度，結果見表1，表1為不同保護劑對mPEG20kDa-IFN_SA在4°C保存的穩(wěn)定性。在4°C條件下，放置M個月，測定其活性下降以及單聚乙二醇含量變化情況，結果見表1。表1加入不同凍干保護劑對mPEG-IFN-SA在4°C放置穩(wěn)定性比較
從上表結果可以看出，mPEG-IFN-SA在右旋糖酐-海藻糖低溫保護劑中，4°C放置2年后，干擾素的活性保留率在起始活性的80%以上，單mPEG-IFN-SA也都在90%左右，而當僅用甘露醇時，4°C放置2年后，其活性保存率僅為起始活性的70%左右，下降明顯比甘露醇-海藻糖低溫保護系統(tǒng)要快，且其單mPEG-IFN-SA含量也僅為約82%，低于甘露醇-海藻糖約90%的純度水平，在各不同比例的右旋糖糖-海藻糖低溫保護劑中，其比例在4:1-1:1 的范圍內(nèi)，活性保留率相差不大，升高海藻糖的比例，此時也不能明顯提升mPEG-IFN-SA的穩(wěn)定性。
實施例權利要求
1.一種聚乙二醇集成干擾素變異體凍干制劑，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，以及包含保持PH在4. 5-7. 5的緩沖體系、凍干保護劑的混合物，其中所述集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121突變?yōu)長ys121、Asp166突變?yōu)镚lulfi6。
2.根據(jù)權利要求1所述的凍干制劑，其中所述凍干保護劑為右旋糖酐-海藻糖混合體系，所述右旋糖酐-海藻糖的質(zhì)量比為4:1-1:1。
3.權利要求1所述的凍干制劑，其中所述保持pH在4.5-7. 5的緩沖體系為磷酸鹽緩沖體系、醋酸鹽緩沖體系或枸櫞酸鹽緩沖體系。
4.權利要求3所述的凍干制劑，其中所述緩沖體系的pH值為6.5-7. 5。
5.根據(jù)權利要求1-4中任意一權利要求所述的凍干制劑，其中所述制劑還進一步包括穩(wěn)定劑。
6.根據(jù)權利要求5所述的凍干制劑，其中所述穩(wěn)定劑為堿性氨基酸或聚山梨酯中的任意一種或多種。
7.根據(jù)權利要求6所述的凍干制劑，其中所述堿性氨基酸為精氨酸或賴氨酸中的任意一種，所述堿性氨基酸的用量為25、0mg/ml。
8.根據(jù)權利要求6所述凍干制劑，其中所述聚山梨酯為聚山梨酯80，所述聚山梨酯80 的用量為 0. 05-0. 2mg/ml。
9.一種聚乙二醇集成干擾素凍干制劑，在用水配制成凍干前液時，它含有下列組分 80至200微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體，其中所述集成干擾素變異體是在N末端設計引入GlySerGlyGlyGly五個氨基酸序列，并在集成干擾素成熟氨基酸序列的Arg121 突變?yōu)?Lys121、Asp166 突變?yōu)?Glulfi6;保持 PH 為 6. 5-7. 5 的 NaH2PO4. 2H20-Na2HP04. 12H20 緩沖體系；3%-6%的右旋糖酐(w/v)；1%-4%的海藻糖(w/v)；25-35mg/ml的鹽酸精氨酸；·0. 05-0. 15mg/ml 的聚山梨酯 80 ；注射用水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇-集成干擾素變異體注射劑，所述注射劑包括每毫升50-500微克的聚乙二醇-集成干擾素變異體蛋白，以及包括保持pH在4.5-7.5的緩沖體系、稀釋劑和穩(wěn)定劑，本發(fā)明聚乙二醇-集成干擾素注射劑穩(wěn)定，適合長期儲存。
文檔編號A61P31/12GK102327241SQ20111031971
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權日2011年10月20日
發(fā)明者侯建華, 張晴妮, 韓智沖 申請人:北京凱因科技股份有限公司