專利名稱：一種眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素的提純方法、提取物及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素的提純方法、提取物及其制劑。
背景技術(shù)：
蛇毒是毒蛇從毒腺中分泌出來(lái)的一種液體，主要成份是毒性蛋白質(zhì)，約占干重的 90%至95%。酶類和毒素約含二十多種。此外，還含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、 脂類、核苷、生物胺類及金屬離子等。蛇毒成分十分復(fù)雜，不同蛇毒的毒性、藥理及毒理作用各具特點(diǎn)。就眼鏡蛇蛇毒而言，含有細(xì)胞毒素(Cytotoxin，CTX)、神經(jīng)毒素(neurotoxin， NT)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor, NGF)和多種酶類等。神經(jīng)毒素(neurotoxin, NT)在蛇毒中含量較高，一般在20% 50%之間，毒性極強(qiáng)，是該類毒蛇咬傷致死的主要成分之一。蛇毒神經(jīng)毒素種類多、活性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，因此一直備受人們的關(guān)注。近年來(lái)隨著生化技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)方法的應(yīng)用，已經(jīng)從不同的蛇毒中分離純化出許多的神經(jīng)毒素。其中僅突觸后神經(jīng)毒素就有100多種。蛇毒神經(jīng)毒素根據(jù)作用機(jī)制可分為四類突觸前神經(jīng)毒素(presynaptically-acting neurotoxin或 β α 一 neurotoxin)、突角蟲后神經(jīng)毒素(postsy-naptically-acting neurotoxin 或 a-neurotoxin)、抗膽喊酉旨Bl類神經(jīng)毒素(anticholinesterase neurotoxin)禾口離子通道型神經(jīng)毒素(ion-charmel neurotoxin)。目前發(fā)現(xiàn)的鎮(zhèn)痛成分幾乎都是突觸后神經(jīng)毒素?？茖W(xué)研究表明，突觸后神經(jīng)毒素是一條由60 80個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，氨基酸殘基的組成及相對(duì)位置具有很大的同源性，分子量約為6000 8000道爾頓。突觸后神經(jīng)毒索有長(zhǎng)鏈和短鏈之分，短鏈含60 62個(gè)氨基酸，四個(gè)二硫鍵.長(zhǎng)鏈含66 74個(gè)氨基酸，五個(gè)二硫鍵。分子中的二硫鍵聚集在一起形成一個(gè)致密的內(nèi)核，由此核心伸展出三個(gè)肽鏈環(huán)就象三個(gè)手指，故其又被形象地稱為三指蛋白(three-ringer protein) 0突觸后神經(jīng)毒素幾乎全部是堿性蛋白，等電點(diǎn)在9 10之間。由于分子量很小但二硫鍵很多，這類毒素的理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，對(duì)熱及化學(xué)試劑都有抗性。1936年Macht提出肌肉注射微量眼鏡蛇毒具有類似嗎啡的中樞鎮(zhèn)痛作用。美國(guó) Hynson,ffestcott&Dunning公司對(duì)眼鏡蛇粗毒進(jìn)行初步分離，制成Cobroxin和Nyloxin兩種神經(jīng)毒素制劑，用于治療頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關(guān)節(jié)痛，這兩種藥物已列入美國(guó)藥物局方中。我國(guó)自1952年起開展對(duì)蛇毒神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用研究，開發(fā)了一些制劑用于臨床治療疼痛，其中中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所研制的“克痛靈”注射劑(現(xiàn)名為科博肽注射液)，用于治療坐骨神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、神經(jīng)血管性頭痛以及風(fēng)濕痛等頑固性疼痛，療效顯著且副作用少。NT的鎮(zhèn)痛作用有別于阿片類藥物，表現(xiàn)為作用效價(jià)高，維持時(shí)間久，無(wú)耐受性和成癮性，是一種很有潛力的新型鎮(zhèn)痛藥。同時(shí)，NT還能戒除嗎啡毒癮，在戒毒方面有獨(dú)特的治療作用。目前，獲取眼鏡蛇蛇毒中的神經(jīng)毒素主要是通過(guò)捕蛇或養(yǎng)蛇取毒，對(duì)粗毒進(jìn)一步純化提取而得到，主要利用離子交換層析和凝膠層析。現(xiàn)有技術(shù)中，中國(guó)專利申請(qǐng) CN101845089A(
公開日期2010年9月四日)公開了“一種適合規(guī)?；a(chǎn)眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素并降低神經(jīng)毒性的方法”，該方法將蛇毒層析洗脫后再過(guò)分子量為3K的超濾膜最后采用過(guò)氧化氫修飾神經(jīng)毒素，步驟較繁瑣，容易引入雜質(zhì)，在實(shí)際生產(chǎn)中，蛇毒神經(jīng)毒素在層析洗脫后仍存在一部分分子量大于神經(jīng)毒素的至敏物質(zhì)，且采用過(guò)氧化氫修飾神經(jīng)毒素后對(duì)眼鏡蛇神經(jīng)毒素的長(zhǎng)期穩(wěn)定性并未作考察，規(guī)模化生產(chǎn)出的成品距離產(chǎn)品實(shí)際運(yùn)用中仍然需要一定的考察時(shí)間。李范珠等在文獻(xiàn)“浙江眼鏡蛇蛇毒中神經(jīng)毒素的分離純化及其鎮(zhèn)痛作用研究”(中國(guó)藥師，2004年09期，P659 661)中公開的浙江眼鏡蛇蛇毒中神經(jīng)毒素的分離純化方法為將蛇毒直接進(jìn)行三次柱層析，耗時(shí)長(zhǎng)，提取成本高，神經(jīng)毒素的收率較低。龔潮梁等在“一種分離提純眼鏡蛇經(jīng)毒素的簡(jiǎn)便方法”(動(dòng)物學(xué)研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)一文中公開了采用CM-纖維柱層析分離神經(jīng)毒素， 70°C保溫?zé)嶙冃蕴幚黼s質(zhì)，低溫冷丙酮提純，然后用kphadex G-IO脫鹽的方法獲得純化的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素，但是高溫保溫容易引起神經(jīng)毒素大量變性沉淀，導(dǎo)致產(chǎn)物的生物活性降低，另外，由于鹽在目標(biāo)產(chǎn)物中的量較少且不會(huì)影響其活性，脫鹽會(huì)導(dǎo)致有效成分損失， 且操作繁瑣，實(shí)際生產(chǎn)中耗費(fèi)人力物力，使生產(chǎn)周期變長(zhǎng)。以上幾種工藝獲得NT的成本高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，質(zhì)量難以控制，收率較低，獲得純品技術(shù)難度較大，并且由于天然蛇毒含有理化性質(zhì)與神經(jīng)毒素較為接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，會(huì)干擾神經(jīng)毒素的生物活性，應(yīng)用于臨床會(huì)出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，在使用過(guò)程中容易產(chǎn)生安全隱患。因此，對(duì)眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素的提取方法作進(jìn)一步的深入研究，以期獲得含量高、 純度高、性質(zhì)穩(wěn)定且藥效良好的科博肽產(chǎn)品，是對(duì)科博肽的又一開發(fā)，也是我們研究人員的職責(zé)所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素的提取方法中存在的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，質(zhì)量難以控制，純度較低等缺點(diǎn)，提供一種工藝簡(jiǎn)單、安全、質(zhì)量可控的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取方法。本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種由上述方法制備得到的具有含量高、 療效好的更適合于工業(yè)化大生產(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物及其制劑。為解決上述問(wèn)題，提供的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素提取方法為1)將眼鏡蛇粗毒溶于磷酸鹽緩沖液中，離心，上清液過(guò)微孔濾膜；2)對(duì)濾液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進(jìn)行；3)所得到的蛇毒液采用陽(yáng)離子柱進(jìn)行純化，用含Nacl的磷酸鹽緩沖液線性洗脫， 收集神經(jīng)毒素粗品，冷凍，加丙酮沉淀，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素即科博肽。具體的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案1)將眼鏡蛇粗毒溶于pH7. 8-8. 0,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中，離心，取上清液，將上清液過(guò)0. 22 μ m濾膜；
2)對(duì)濾液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進(jìn)行；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7. 8-8. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為30-50ml/h，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液， 用紫外分光光度計(jì)在^Onm處進(jìn)行檢測(cè)。4)洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 03-0. 05M Nacl的磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08-0. 09M Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至 0. 2以下后，取最強(qiáng)吸收部分進(jìn)行收集，量收集液體積，測(cè)吸光值；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經(jīng)過(guò)預(yù)冷至5°C的丙酮，沉淀，過(guò)濾，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素即科博肽。優(yōu)選的，前述步驟4)中洗脫流速為30_50ml/h，最強(qiáng)吸收部分為在^Onm處測(cè)吸光值大于0. 1的最大部分；步驟5)中丙酮用量為收集液體積的2. 5-3倍，沉淀時(shí)間為 80-120min。在本發(fā)明的提取方法中，采用微孔濾膜對(duì)離心后的蛇毒上清液進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中的細(xì)菌和顆粒。由于天然蛇毒含有理化性質(zhì)與神經(jīng)毒素較為接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜，可以濾除分子量大于神經(jīng)毒素的至敏物質(zhì)，在后續(xù)的陽(yáng)離子純化中，節(jié)約時(shí)間和成本，極大地簡(jiǎn)化了提取工藝，增加產(chǎn)品的安全性。 針對(duì)眼鏡蛇毒含堿性蛋白質(zhì)較多的特點(diǎn)，采用陽(yáng)離子交換劑CM-纖維素作固定相，采用較高的PH和離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液平衡CM-纖維素，既可以使等電點(diǎn)較高的毒性多肽吸附在交換劑上，同時(shí)使許多等電點(diǎn)偏低的組分不經(jīng)吸附而流出，改善了神經(jīng)毒蛋白的分離。最后采用丙酮直接從溶液中沉淀眼鏡蛇神經(jīng)毒素，除去最終產(chǎn)品中的雜質(zhì)，提高產(chǎn)品收率。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種由上述提取方法制備而得的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素，該物質(zhì)的純度大于95%，純神經(jīng)毒素的含量大于70%。本發(fā)明還提供了包含上述眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素加入輔料，按常規(guī)制劑工藝制成藥物學(xué)意義上的各種制劑，包括注射制劑、口服液制劑，如小容量注射劑、凍干粉針劑、普通片、 口腔崩解片及分散片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、舌下片劑等。優(yōu)選為小容量注射劑和凍干粉針劑。本發(fā)明所稱的常規(guī)制劑工藝以及輔料等是指在教科書、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)上已經(jīng)公開的方法、技術(shù)及輔料。其中小容量注射劑和凍干粉針劑的制備方法如下取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80%的注射用水，使其溶解，加入氯化鈉， 加入配制藥液總量0. 06 %的針用活性炭，充分?jǐn)嚢瑁^(guò)濾，調(diào)節(jié)PH值至5-8，再加注射用水至全量2000ml，垂熔濾球過(guò)濾，灌封，115°C熱壓滅菌30分鐘，制備成小容量注射制劑1000 支，每支規(guī)格2ml: 70 μ g。取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80 %的注射用水溶解，再加入甘露醇，攪拌均勻，加注射用水至全量2000ml，攪勻，調(diào)節(jié)pH值至5_8，無(wú)菌濾過(guò)，濾液分裝于滅菌西林瓶中，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000瓶，每瓶規(guī)格70 μ g。本發(fā)明的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素及其制劑，主要用于治療各種慢性疼痛、血管性頭痛、 三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、晚期癌疼痛、關(guān)節(jié)痛及麻風(fēng)反應(yīng)神經(jīng)痛。
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為了使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明，本申請(qǐng)人進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)研究，以證明本發(fā)明的效果實(shí)驗(yàn)例1、工藝研究在眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素提取過(guò)程中，本發(fā)明人對(duì)提取工藝進(jìn)行了設(shè)計(jì)和選擇，以最終提取物的性狀、水分、有效成分含量、純度以及純神經(jīng)毒素收率(IOOg蛇毒中純神經(jīng)毒素重量)為考察指標(biāo)，進(jìn)行了一系列的選擇試驗(yàn)。樣品A 按照文獻(xiàn)“一種分離提純眼鏡蛇_(dá)Na jana jaatra_神經(jīng)毒素的簡(jiǎn)便方法”(龔潮梁等，動(dòng)物學(xué)研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素提取純化方法制備；樣品B 按照中國(guó)專利申請(qǐng)“一種適合規(guī)?；a(chǎn)眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素并降低神經(jīng)毒性的方法”CN101845089A(
公開日期2010年9月四日)中實(shí)施例的方法制備；樣品C:按照文獻(xiàn)“浙江眼鏡蛇蛇毒中神經(jīng)毒素的分離純化及其鎮(zhèn)痛作用研究”(李范珠等，中國(guó)藥師，2004年09期，P659 661)中公開的浙江眼鏡蛇蛇毒中神經(jīng)毒素的分離純化方法制備；樣品D 按照本發(fā)明實(shí)施例1方法制備；樣品E 按照本發(fā)明實(shí)施例1方法，去除超濾步驟2)制備；樣品F 按照本發(fā)明實(shí)施例1方法，增加脫鹽步驟6)，具體如下6)將按照實(shí)施例1中步驟1) -5)方法得到的目的物用葡聚糖G-IO凝膠柱層析進(jìn)行脫鹽和純化，溶液凍干即得純化的眼鏡蛇神經(jīng)毒素。樣品G 按照本發(fā)明實(shí)施例1方法，增加70°C保溫步驟，具體如下5)將按照實(shí)施例1中步驟1)-4)方法得到的收集液集中，調(diào)PH到6. 5，在70°C恒溫水浴中保溫半小時(shí)，進(jìn)行選擇性熱變性處理。冷卻后離心除去變性蛋白的沉淀，清液冷卻到4°C，加入經(jīng)過(guò)預(yù)冷至5°C的丙酮，丙酮用量為收集液體積的2. 8倍，沉淀lOOmin，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇神經(jīng)毒素。上述方法得到的目的產(chǎn)物的考察結(jié)果，見(jiàn)表1。表1工藝選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果
性狀水分(%)有效成分含量(％)收率(g/100g 蛇毒)純度(％)樣品A白色粉末4.057.66. 3595. 1樣品B白色粉末4. 362. 35. 1091.5樣品C白色粉末4.254. 76. 5493.2樣品D白色粉末3.880. 19. 4297.4樣品E白色粉末4.670.48. 1390.2樣品F白色粉末4.472. 15. 429.^3· 2樣品G白色粉末4. 163.67.7193.0 以上數(shù)據(jù)表明，按照上述方法提取的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素性狀一致，均為白色粉末， 水分均未超過(guò)5. O%，滿足法定標(biāo)準(zhǔn)的要求。有效成分含量方面，樣品B、D、E、F、G的含量均較理想，但是樣品D、F、G的純度較高，綜合收率來(lái)看，樣品F的收率較低，可能是因?yàn)樘峒冞^(guò)
7程中增加了脫鹽步驟，造成一定量有效成分的損失。故選擇樣品D和G進(jìn)一步考察神經(jīng)毒素活性。實(shí)驗(yàn)例2、神經(jīng)毒素活性考察方法參照Bulbring法制備大鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本，置入盛有Kreb液25ml，恒溫 30°C浴槽中，通氧氣，標(biāo)本肋骨端固定于浴槽底部，中心腱接于張力換能器。用0.5ms超強(qiáng)方波，每15秒交替刺激神經(jīng)和肌肉，待標(biāo)本收縮穩(wěn)定后，向浴槽中加入受試樣品D和G，每份樣品量不超過(guò)Kreb液容量的5%，觀察樣品對(duì)標(biāo)本收縮的影響。結(jié)果在電刺激誘發(fā)大鼠離體膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本收縮實(shí)驗(yàn)中，上述兩種樣品均能抑制間接刺激引起的膈肌收縮，但不影響直接刺激膈肌引起的肌肉收縮，說(shuō)明能抑制神經(jīng)-肌肉接頭的傳遞，對(duì)肌肉組織無(wú)影響，但樣品D抑制作用強(qiáng)于樣品G，這可能與在大生產(chǎn)的純化過(guò)程中，增加了保溫步驟，使得神經(jīng)毒素變性沉淀，降低了神經(jīng)毒素的生物活性。故選擇樣品D的提取方法，進(jìn)一步考察各參數(shù)對(duì)產(chǎn)品的含量等的影響。實(shí)驗(yàn)例3、工藝參數(shù)選擇超濾膜的大小，柱層析過(guò)程中洗脫液的濃度和流速，沉淀過(guò)程中丙酮的用量和沉淀時(shí)間等均是影響提取物質(zhì)量的關(guān)鍵因素，本發(fā)明人對(duì)提取工藝進(jìn)行了參數(shù)的設(shè)計(jì)和選擇，以最終提取物的性狀、水分、有效成分含量、純度和收率為考察指標(biāo)進(jìn)行考察。3.1超濾選擇藥物1 按照本發(fā)明實(shí)施例1的方法制備，其中步驟幻中超濾膜更換為截留分子量為6KDa的超濾膜；藥物2 按照本發(fā)明實(shí)施例1的方法制備；結(jié)果表2超濾膜大小對(duì)產(chǎn)物的影響
權(quán)利要求
1.一種眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物，由眼鏡蛇蛇毒提取純化制備而成，其特征在于 提純方法為1)將眼鏡蛇粗毒溶于磷酸鹽緩沖液中，離心，上清液過(guò)微孔濾膜；2)對(duì)濾液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進(jìn)行；3)所得到的蛇毒液采用陽(yáng)離子柱進(jìn)行純化，用含Nacl的磷酸鹽緩沖液線性洗脫，收集神經(jīng)毒素粗品，冷凍，加丙酮沉淀，濾去丙酮，真空干燥，即得目的產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物，其特征在于提純方法為1)將眼鏡蛇粗毒溶于PH7.8-8. 0,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中，離心，取上清液，將上清液過(guò)0. 22 μ m濾膜；2)對(duì)濾液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進(jìn)行；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7.8-8. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為30-50ml/h，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)在^Onm處進(jìn)行檢測(cè)；4)洗脫液吸光度降至0.2以下，用含0. 03-0. 05M Nacl的磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08-0. 09M Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至0. 2 以下后，取最強(qiáng)吸收部分進(jìn)行收集，量收集液體積，測(cè)吸光值；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經(jīng)過(guò)預(yù)冷至5°C的丙酮， 沉淀，過(guò)濾，真空干燥，即得目的產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求2所述的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物，其特征在于前述步驟4)中洗脫流速為30-50ml/h，最強(qiáng)吸收部分為在^Onm處測(cè)吸光值大于0. 1的最大部分；步驟5)中丙酮用量為收集液體積的2. 5-3倍，沉淀時(shí)間為80-120min。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物，其特征在于提取物的含量大于70%、純度大于95%。
5.一種包含權(quán)利要求4所述眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物以及藥學(xué)上可接受的輔料的制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的制劑，其特征在于所述制劑為注射制劑、口服制劑，具體為小容量注射劑、凍干粉針劑、普通片、口腔崩解片及分散片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、舌下片劑。
7.如權(quán)利要求6所述的制劑，其特征在于所述制劑為小容量注射劑和凍干粉針劑。
8.如權(quán)利要求7所述的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物制劑，其特征在于1)將眼鏡蛇粗毒粉IOOg溶于pH7.9,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中至^Oml,攪拌下溶解， 以3000r/min的速度離心lOmin，取上清液，將上清液過(guò)0. 22 μ m濾膜；2)所得到的上清液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7.9,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱， 用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為40ml/h，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)在^Onm處進(jìn)行檢測(cè)；4)洗脫液吸光度降至0.2以下，用含0. 04mol/L的Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08mol/LNacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至0. 2以下后，取吸光度大于0. 1的最強(qiáng)吸收部分進(jìn)行收集，量收集液體積，測(cè)吸光值；洗脫流速為 40ml/h,收集液取280nm處吸光值大于0. 1的最大部分；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經(jīng)過(guò)預(yù)冷至5°C的丙酮， 丙酮用量為收集液體積的2. 8倍，沉淀lOOmin，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素即科博肽；6)取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80%的注射用水，使其溶解，加入氯化鈉，加入配制藥液總量0. 06 %的針用活性炭，充分?jǐn)嚢?，過(guò)濾，調(diào)節(jié)PH值至5-8，再加注射用水至全量200Gml，垂熔濾球過(guò)濾，灌封，115°C熱壓滅菌30分鐘，制備成小容量注射制劑1000支， 每支規(guī)格:2ml: 70 μ g0
9.如權(quán)利要求7所述的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物制劑，其特征在于1)將眼鏡蛇粗毒粉IOOg溶于pH7.9,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中至^Oml,攪拌下溶解， 以3000r/min的速度離心lOmin，取上清液，將上清液過(guò)0. 22 μ m濾膜；2)所得到的上清液進(jìn)行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7.9,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱， 用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為40ml/h，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)在^Onm處進(jìn)行檢測(cè)；4)洗脫液吸光度降至0.2以下，用含0. 04mol/L的Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08mol/LNacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至0. 2以下后，取吸光度大于0. 1的最強(qiáng)吸收部分進(jìn)行收集，量收集液體積，測(cè)吸光值；洗脫流速為 40ml/h,收集液取^Onm處吸光值大于0. 1的最大部分；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經(jīng)過(guò)預(yù)冷至5°C的丙酮， 丙酮用量為收集液體積的2. 8倍，沉淀lOOmin，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素即科博肽；6)取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80%的注射用水溶解，再加入甘露醇，攪拌均勻，加注射用水至全量2000ml，攪勻，調(diào)節(jié)pH值至5_8，無(wú)菌濾過(guò)，濾液分裝于滅菌西林瓶中，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000瓶或500瓶，每瓶規(guī)格70 μ g、140 μ g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素的提純方法、提取物及其制劑，該眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物由眼鏡蛇粗毒提取純化制得。本發(fā)明首先采用濾膜過(guò)濾的方法，去除溶液中的細(xì)菌、顆粒及大分子的至敏物質(zhì)，為后續(xù)工藝節(jié)約時(shí)間和成本，增加產(chǎn)品的安全性；采用離子交換的方法洗脫分離神經(jīng)毒素，改善了神經(jīng)毒蛋白的分離；最后采用丙酮直接沉淀眼鏡蛇神經(jīng)毒素，除去最終產(chǎn)品中的雜質(zhì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明得到的眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素提取物及制劑，產(chǎn)品收率、含量和純度得到提高，同時(shí)有效降低了藥物的不良反應(yīng)，提高了療效，從而保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102351951SQ20111032479
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者竇啟玲, 蘇凱 申請(qǐng)人:貴州益佰制藥股份有限公司