專利名稱：靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向性人造油體，其涉及一種通過(guò)CalZH2蛋白質(zhì)中Zlte2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，并與脂質(zhì)、脂溶性藥物和/或已知熒光信號(hào)分子制成CalZH2藥物油體和/或CalZH2檢測(cè)油體，而達(dá)到能夠?qū)Ｒ恍缘刈R(shí)別癌化部位并能自行組裝藥物蛋白進(jìn)行癌化部位檢測(cè)、抑制及藥物治療的靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體。本發(fā)明由不同可以合成出藥物的類似物的肽或是對(duì)病癥有治療效果的肽，經(jīng)過(guò)基因工程連接上油體I丐蛋白后加上脂質(zhì)組合成CalZH2油體,該CalZH2油體可以包覆已知熒光信號(hào)分子并組裝成靶向CalZH2檢測(cè)油體，此CalZH2檢測(cè)油體能夠?qū)Ｒ恍缘刈R(shí)別癌化部位并進(jìn)行癌化部位檢測(cè)、抑制及藥物治療。
背景技術(shù)：
根據(jù)統(tǒng)計(jì)，癌癥是全世界死亡率最高的疾病的一。癌癥，也稱為惡性腫瘤，定義為有不明原因抑或是由多重病因所引起，而發(fā)生在人類身上的惡性腫瘤。癌癥可生長(zhǎng)在身體任何組織和器官內(nèi)，并且有分化潛能、無(wú)法控制生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞的能力，使得細(xì)胞無(wú)法正常調(diào)節(jié)控制生長(zhǎng)，導(dǎo)致生理功能異常，且無(wú)法正常治愈。對(duì)女性而言，乳癌和子宮頸癌的致死率名列前茅。傳統(tǒng)的癌癥治療方法大致分成下列幾種，即外科手術(shù)療法、放射療法、化學(xué)療法及免疫(基因)療法。外科手術(shù)療法主要可以直接、快速地移除惡性腫瘤，是最古老、傳統(tǒng)且最常用的癌癥治療方式，對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)在身體局部一處時(shí)，直接切除方式有很好的治療效果。若癌細(xì)胞擴(kuò)散，外科手術(shù)后遺癥是常需要切除腫瘤鄰近組織及淋巴組織，常常因?yàn)榍谐^(guò)多的組織會(huì)造成病人局部功能缺損、障礙，還有手術(shù)猝死或弓I起并發(fā)癥而致死等。放射療法又稱電療，主要是使用放射線破壞癌細(xì)胞，針對(duì)癌細(xì)胞的方法有兩種外在放射療法及內(nèi)在放射療法。外在放射療法是利用儀器將X光或Y射線釋放于腫瘤上而殺死癌細(xì)胞。內(nèi)在放射療法是將放射物質(zhì)以顆?；蚰z囊方式置入癌癥病人體內(nèi)，對(duì)于不適合開(kāi)刀或不宜切除的組織治療常會(huì)選用此種放射療法，有時(shí)放射療法也會(huì)和外科療法或化學(xué)療法合并使用，此種方法的后遺癥是惡心、嘔吐、咳嗽或呼吸困難、吞咽困難、疲倦、掉頭發(fā)和引發(fā)內(nèi)臟破裂等?；瘜W(xué)療法化學(xué)療法是利用化學(xué)物質(zhì)或激素殺死癌細(xì)胞，此方法可以通過(guò)口服或注射方式進(jìn)行治療，化學(xué)療法可廣泛使用在各式腫瘤上。對(duì)難以控制及大范圍轉(zhuǎn)移或全身性的癌細(xì)胞殺死，化學(xué)療法是唯一的、最后的選擇，后遺癥是全身細(xì)胞受到破壞，特別是對(duì)免疫淋巴球，治療時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)引起全身細(xì)胞的抗藥性。免疫療法免疫療法是利用病人身體不同的免疫機(jī)制作用物質(zhì)如白介素、腫瘤壞死因子、單克隆抗體及疫苗等來(lái)對(duì)抗、破壞癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。免疫療法也可以和上述三種常用的癌癥治療方法合并使用并能大幅降低副作用如疲倦、食欲不振、掉發(fā)、口腔或皮膚潰爛、惡心及牙齒掉落等大幅降低，并且可在治療間隔期協(xié)助正常細(xì)胞慢慢修復(fù)，緩慢提升免疫力，并提升癌癥的治療效果，但是治療時(shí)間長(zhǎng)，效果也很有限。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的觀察發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞表面通常會(huì)帶有某些特殊分子生物標(biāo)記在于之前描述特性，這些年來(lái)已經(jīng)發(fā)展出靶向治療方法用于癌癥的治療。靶向治療方法就是利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一種可以專一性地識(shí)別此類生物標(biāo)記的藥物方法，靶向治療方法可以有效地阻斷癌細(xì)胞的活化并且能使癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，而達(dá)到治療目的。靶向治療藥物可以直接且精準(zhǔn)地命中目標(biāo)癌細(xì)胞，抑制癌細(xì)胞，對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞的影響較小，相比于上述治療方法，靶向治療具有低毒性、低副作用 、高效率、及施行方便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起大家的關(guān)注。目前靶向治療的方法甚多，其一是利用載體組裝、包覆、連結(jié)或鑲嵌而成的治療活性的藥物分子，并運(yùn)用各種機(jī)制將具有專一性的活性藥物分子遞送到目標(biāo)癌細(xì)胞進(jìn)行作用，此種遞送體系稱為“藥物遞送體系”。通常會(huì)將載體與可專一性地識(shí)別癌細(xì)胞表面生物標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合，而使此載體具有靶向功能，所述物質(zhì)可為蛋白質(zhì)、類固醇、糖類、化合物或抗體等。載體目前有高分子聚合物顆粒、微胞(micell)、脂質(zhì)體、及病毒載體等，這些載體也存在不同缺點(diǎn)，如載體粒徑過(guò)大而不容易被人體吸收、載體容易聚集而不容易被人體吸收、具有毒性而無(wú)法排出體外、在血液或體液中不會(huì)穩(wěn)定存在等，在實(shí)際運(yùn)用中也很有限。而且在上述可識(shí)別癌細(xì)胞的物質(zhì)與載體結(jié)合時(shí)，常常需要非常復(fù)雜耗時(shí)的化學(xué)合成步驟，往往會(huì)增加制造成本，更會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。所以，在藥物遞送體系中，也需要非常大的改良空間并改善成粒徑微小、無(wú)毒性、在血液或體液中穩(wěn)定、容易結(jié)合可識(shí)別癌細(xì)胞的藥物載體體系。本發(fā)明是利用油體作為載體并連接目標(biāo)蛋白而組裝形成CalZH2油體，本發(fā)明試圖利用CalZH2油體包覆脂溶性藥物(以下簡(jiǎn)稱為包覆藥物)而組成靶向人造納米油體藥物遞送體系。本發(fā)明經(jīng)過(guò)活體內(nèi)(in vivo)及活體外(in vitro)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)此體系毒性低、副作用低、效率高、穩(wěn)定、制備過(guò)程方便及對(duì)環(huán)境造成污染甚低或是可以忽略。本發(fā)明利用靶向人造納米油體給藥體系，可以有效地運(yùn)用于靶向治療或是癌癥檢測(cè)，且具有高度的專一性。本發(fā)明是由不同可以合成出藥物的類似物的肽或是對(duì)病癥有治療效果的肽，經(jīng)過(guò)基因工程組成藥物或是對(duì)病癥有治療效果的合成物或合成多蛋白，并接上油體蛋白再接上Zlto2肽，該油體可以包覆已知熒光信號(hào)分子并組裝成自組裝靶向藥物蛋白，此蛋白能夠?qū)Ｒ恍缘刈R(shí)別癌化部位并能自行組裝藥物蛋白而進(jìn)行癌化部位檢測(cè)、抑制及藥物治療。純化方式非常多，如沉淀法、分子篩層析法、電泳、親和層析法和共價(jià)層析法是已知技術(shù)且用于細(xì)胞提取物中純化蛋白質(zhì)。而且需要表達(dá)有關(guān)蛋白酶抑制劑當(dāng)作一種融合蛋白或嵌合蛋白。融合蛋白技術(shù)經(jīng)常用在蛋白質(zhì)的純化過(guò)程中，提供一種"標(biāo)記"或"操作"。一般而言，以這些體系表達(dá)的融合蛋白里面包含親和標(biāo)記，例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、聚組氨酸、聚半胱氨酸，蛋白A及鏈霉親和素等等，所述標(biāo)記共價(jià)結(jié)合于CalZH2蛋白質(zhì)的N-端或C-端。為方便親和純化,對(duì)此標(biāo)記具有專一性的配體被固定于一個(gè)管柱的固態(tài)相上。融合蛋白結(jié)合至親和柱，需要加入過(guò)量調(diào)整緩沖液(pH值)而沖提出高純度的融合蛋白。CalZH2蛋白從標(biāo)記分子上的分離，以蛋白水解切割于其專一性接頭序列。在所使用親和柱的準(zhǔn)備與操作上，雖然比較簡(jiǎn)便，但是價(jià)格非常昂貴，不符合經(jīng)濟(jì)效益?？贵w固定化免疫親和技術(shù)是利用一種表達(dá)的融合蛋白的結(jié)合方式，里面含有抗原性的寡肽標(biāo)記，該標(biāo)記有運(yùn)用抗原性前端(antigenic head)部分及連接尾端(linkingtail)部分。該抗原性部分組成是用一些可以快速引發(fā)抗原性反應(yīng)的親水性氨基酸。而連接區(qū)域可以標(biāo)記在融合蛋白，從細(xì)胞分離后再融合蛋白上被切割，而得到該蛋白。使用抗體固定化免疫親和技術(shù)對(duì)于純化技術(shù)也很有限。本發(fā)明是利用AOB系統(tǒng)進(jìn)行純化，能更快速且更經(jīng)濟(jì)地得到融合蛋白。利用CalZH2有專一性接頭的油體，再利用專一性蛋白酶水解切割專一性接頭，可純化出純度高的Zlte2蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種融合蛋白質(zhì)(下文簡(jiǎn)稱為CalZH2蛋白質(zhì))，此蛋白包含Zlte2肽與 油體鈣蛋白的組合。本發(fā)明也提供一種油體鈣蛋白載體，其包含油體鈣蛋白結(jié)合Zlte2肽及任何油脂，而形成專一性的納米油體，其中該CalZH2蛋白質(zhì)與該脂質(zhì)的重量/體積比值(微克/微升)為至少約1/25，且該CalZH2油體的平均粒徑為納米等級(jí)。本發(fā)明又利用CalZH2蛋白質(zhì)包覆已知熒光分子，可以用于識(shí)別專一性癌細(xì)胞的檢測(cè)使用。本發(fā)明又利用CalZH2蛋白質(zhì)包覆藥物，可以用于識(shí)別專一性癌細(xì)胞的靶向治療使用。本發(fā)明又利用CalZH2蛋白質(zhì)包覆已知熒光分子和包覆藥物，可以用于識(shí)別專一性癌細(xì)胞的檢測(cè)及祀向治療使用。本發(fā)明又利用類似CalZH2藥物油體，可以用于識(shí)別專一性癌細(xì)胞的靶向治療使用。本發(fā)明又利用CalZH2有專一'丨生接頭的油體,再利用專一丨丨生蛋白酶水解切割專一丨I"生接頭，可純化出純度高的Zlte2蛋白質(zhì)的應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I、油體的構(gòu)造。圖2、CalZH2油體的制備過(guò)程。圖3、Zaer2蛋白純化制備程。圖4、CalZH2藥物油體的制備過(guò)程。圖5、CalZH2蛋白質(zhì)組成及自主裝CalZH2油體實(shí)驗(yàn)觀察。圖6、CalZH2油體包覆GGK黃和尼羅紅的油體顯熒光微鏡觀察。圖7、CalZH2油體進(jìn)行原子力顯微鏡測(cè)試。圖8、CalZH2油體的不同條件組成進(jìn)行熒光顯微鏡觀察(圖示標(biāo)尺為2 ii m)。圖9、CalZH2油體的不同條件組成進(jìn)行穩(wěn)定度測(cè)試。

圖10、CalZH2油體的不同條件組成進(jìn)行粒徑測(cè)試。圖11、CalZH2油體對(duì)細(xì)胞的體外測(cè)試熒光顯微鏡觀察_(固定)細(xì)胞。圖12、CalZH2油體對(duì)細(xì)胞的體外測(cè)試熒光顯微鏡觀察_ (活)。
圖13、CalZH2油體對(duì)SK0V3細(xì)胞測(cè)試熒光顯微鏡觀察-不同(濃度)。圖14、CalZH2油體對(duì)SK0V3細(xì)胞測(cè)試熒光顯微鏡觀察-不同(時(shí)間)。圖15、CalZH2油體作用細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)試-不同(濃度)。圖16、CalZH2油體作用細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)試-不同(時(shí)間)。圖17、CalZH2油體作用SK0V3細(xì)胞利用共軛熒光顯微鏡XY軸平面觀察及Z軸切面觀察。圖18、CalZH2油體包覆藥物的穩(wěn)定度測(cè)試。圖19、calZH2油體包覆不同濃度喜樹(shù)堿的毒性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)(第72小時(shí))_茄紅
素、姜黃素和喜樹(shù)堿。 圖20、CalZH2油體包覆喜樹(shù)堿藥物在細(xì)胞毒殺實(shí)驗(yàn)(4天)。圖21、CalZH2油體包覆藥物對(duì)血球血溶性實(shí)驗(yàn)-茄紅素、姜黃素和喜樹(shù)堿。圖22、CalZH2油體進(jìn)行油體融血實(shí)驗(yàn)(血球)。圖23、CalZH2油體在血清隨時(shí)間粒徑變化測(cè)試。圖24、CalZH2油體在小鼠體內(nèi)腫瘤注射后隨不同時(shí)間IVSI觀察測(cè)試。圖25、CalZH2油體在小鼠注射24小時(shí)后臟器隨不同時(shí)間IVSI觀察測(cè)試。圖26、鼠取腫瘤組織冷凍切片的熒光顯微鏡觀察。圖27、小鼠腫瘤檢測(cè)組織切片利用CalZH2油體檢測(cè)觀察。圖28、CalZH2油體靶向型油體治療的腫瘤負(fù)荷鼠_腫瘤變化(尺寸cm3)。圖29、CalZH2油體靶向型油體治療的腫瘤負(fù)荷鼠_重量變化(重量千克)。
具體實(shí)施例方式除非文中另有說(shuō)明，否則本說(shuō)明書中(尤其是在權(quán)利要求書中)所使用的“一”、“該”及類似用語(yǔ)應(yīng)理解為包含單數(shù)及復(fù)數(shù)形式。本發(fā)明提供靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其組成包含一CalZH2蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)包含一油體I丐蛋白及一 ZjferiJt ;—脂質(zhì),該脂質(zhì)加入所述CalZH2蛋白質(zhì)后制成CalZH2油體；以及一脂質(zhì)可包覆藥物，稱為CalZH2藥物油體。本發(fā)明利用Zlte2肽與油體鈣蛋白(caleosin)結(jié)合分子生物技術(shù)之后進(jìn)行簡(jiǎn)易的制備過(guò)程來(lái)提供一種人造油體的載體(下文簡(jiǎn)稱為CalZH2油體)。此人造油體可以包覆或鑲嵌大量的已知突光信號(hào)分子并且能作為生物體內(nèi)移動(dòng)的實(shí)時(shí)(real-time)信號(hào)放大器來(lái)追蹤并確認(rèn)病灶，或者，用于包覆藥物，以作為藥物遞送體系，再者也能區(qū)分油溶性藥物的功能。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)將Zlte2肽與油體鈣蛋白插入宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)出CalZH2蛋白質(zhì)，該油體鈣蛋白可以選自以下群組的植物種子的油體蛋白芝麻、橄欖、大豆、花生、麻種子、油菜、葵花、芥花、紅花中的一部分或其組合；宿主細(xì)胞可以為真核宿主細(xì)胞及原核宿主細(xì)胞，真核宿主細(xì)胞選自以下群組單細(xì)胞生物體如酵母細(xì)胞、源自高等生物體如植物，昆蟲或哺乳動(dòng)物的不死細(xì)胞或其組合，原核宿主細(xì)胞選自以下群組桿菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其組合，最佳為大腸桿菌，大腸桿菌當(dāng)宿主細(xì)胞可為E. coli.DH5a、E. coli.BL21(DE3)、E. coli nissle(AG2)或其組合。植物油體是一種中性脂肪分子，主要有三個(gè)重要的成分，甘油三酯(TAG)、磷脂質(zhì)(PL)及油體蛋白，并能夠穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)。而油體蛋白主要有油體膜蛋白(oleosin)及微量的油體I丐蛋白(caleosin)與油體固醇蛋白(steroleosin),如圖I所示。本發(fā)明是利用CalZH2油體中的CalZH2蛋白質(zhì)，所包含的油體蛋白為植物種子油體蛋白，但不限于此，植物種子若有油體蛋白都能進(jìn)行組合，例如芝麻、橄欖、大豆、花生、油菜、油菜、葵花、芥花、亞麻、紅花(safflower)、及其它植物油體蛋白的組合。而本發(fā)明利用芝麻種子的油體蛋白構(gòu)建CalZH2蛋白質(zhì)，而油體鈣蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQNO 1所示。對(duì)于油體鈣蛋白平均大小為50至200納米。本發(fā)明作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，可再包括脂質(zhì)包覆已知熒光信號(hào)分子，以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2熒光油體；或CalZH2蛋白質(zhì)可再包括脂質(zhì)包覆藥物，加入所述CalZH2蛋白質(zhì)后以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2藥物油體，該藥物可以選自以下群組的藥物茄紅素、姜黃素、喜樹(shù)堿、抗生素、葫蘆素、溫諾平(商品名為Navelbin)、紫杉醇(Paclitaxel)、西藥、中草藥或其組合；或CalZH2蛋白質(zhì)可再包括脂質(zhì)包覆藥物和脂質(zhì)包覆已知熒光信號(hào)分子，加入所述CalZH2蛋白質(zhì)后以分子生物學(xué)技術(shù)并組裝成CalZH2熒光藥物油體，該藥物可以選自以下群組的藥物茄紅素、姜黃素、喜樹(shù) 堿、抗生素、葫蘆素、溫諾平(商品名為Navelbin)、紫杉醇(Paclitaxel)、西藥、中草藥或其組合；以及，該已知熒光信號(hào)分子可以選自以下群組銫化鎘量子點(diǎn)(quantum dot)、異硫氰酸熒光素(FITC)、茜素黃(Alizarine Yellow R)、尼羅紅(Nile Red)或其組合；上述其一，如圖2所示。本發(fā)明CalZH2油體的CalZH2蛋白質(zhì)，包含Zlte2肽，使CalZH2油體成為具有專一性的傳遞載體，又稱靶向載體，而且CalZH2油體也能包覆脂溶性藥物組成主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)(下文簡(jiǎn)稱為CalZH2藥物油體)。而Zlte2肽能精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，由此可知，油體鈣蛋白結(jié)合Zlto2肽并且包覆藥物的人造油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，會(huì)大大的提升癌變部位或癌細(xì)胞區(qū)域的給藥的濃度，而不會(huì)影響到正常細(xì)胞。也可以刺激癌細(xì)胞對(duì)CalZH2油體進(jìn)行吞噬作用與融合作用，使抗癌藥物快速進(jìn)入癌細(xì)胞，能夠達(dá)到治療及避免產(chǎn)生藥物的抗藥性。在治療乳癌或卵巢癌時(shí)，可以用HER2/neu蛋白質(zhì)受體的配體肽。而HER2/neu蛋白質(zhì)受體是表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，存在于許多癌細(xì)胞表面，作為癌細(xì)胞表面的生物標(biāo)記。Nord等人已研發(fā)出一種可專一丨丨生地和HER2/neu蛋白質(zhì)受體鍵結(jié)的肽,稱為ZHot2。Zlto2肽包含58個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，分子量約為7至15千道爾頓，比單克隆抗體的分子量(150千道爾頓)還小，由此可知Zlto2肽容易穿透細(xì)胞膜。本發(fā)明的CalZH2油體可作為一種被動(dòng)祀向藥物遞送體系(passive targetingdrug delivery system),即，不具專一丨I"生的藥物遞送體系。其中，經(jīng)由結(jié)合油體蛋白與上述細(xì)胞配體肽來(lái)提供一 CalZH2蛋白質(zhì)，并利用細(xì)胞配體肽可攜帶多種物質(zhì)，而且可以直接穿過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞，使CalZH2油體不需經(jīng)由受體而進(jìn)入細(xì)胞,達(dá)成被動(dòng)祀向給藥,如圖2所示。本發(fā)明的CalZH2油體可以下述制備方式(但不以此為限)利用基因重組技術(shù)在表達(dá)載體上結(jié)合油體蛋白的Zlto2肽，再將CalZH2油體送入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，并制備含有油體I丐蛋白及Zlte2妝的CalZH2蛋白質(zhì)。然后加入緩沖液混合該CalZH2蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，再利用超音波處理器震蕩混合物，就可以制造出人造CalZH2油體，如圖2所示。
本發(fā)明CalZH2油體所包含的脂質(zhì)并無(wú)限制，舉例說(shuō)明，脂質(zhì)可以利用甘油三酯、橄欖油、芝麻油、大豆油、花生油、礦物油、亞麻油、紅花油、及其它植物種子脂質(zhì)的組合；作用比較穩(wěn)定的是甘油三酯、芝麻油或大豆油的組合，最佳為芝麻油的組合。本發(fā)明利用調(diào)整CalZH2蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比例，并能制備出大小不同平均粒徑的CalZH2油體。CalZH2油體的平均粒徑與CalZH2蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比例成反比，CalZH2油體量固定，脂質(zhì)成分愈少，CalZH2油體的平均粒徑愈小。于本發(fā)明CalZH2油體中，CalZH2蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的重量/體積比值(微克/微升)通常為至少約1/25，較佳至少約1/1。本發(fā)明作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2蛋白質(zhì)可再包括脂質(zhì)包覆藥物，以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2藥物油體；或CalZH2蛋白質(zhì)可再包括脂質(zhì)包覆的藥物和脂質(zhì)包覆已的熒光信號(hào)分子，以分子生物學(xué)技術(shù)并組裝成CalZH2熒光藥物油體；上述其一，如圖2所示。本發(fā)明利用含有油體鈣蛋白及Zlto2肽的CalZH2蛋白質(zhì)，然后加入不同pH值緩沖液混合該CalZH2蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，再利用超聲處理器振蕩混合物，緩沖液的pH值會(huì)影響制造的CalZH2油體的平均粒徑與穩(wěn)定性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，緩沖液的pH值較佳在7. 5以上，更佳為 約7. 5至約9. O。在本發(fā)明的較佳結(jié)果中，采用以下條件組合以制備CalZH2油體(1)使用芝麻種子的油體鈣蛋白及Zlto2肽來(lái)構(gòu)建CalZH2蛋白質(zhì)；(2)以橄欖油作為脂質(zhì)；(3)采用CalZH2蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的重量/體積比值(微克/微升)為約20/1 ;及⑷緩沖液的pH值為約7.5。本發(fā)明比先前技術(shù)更方便的穩(wěn)定且調(diào)整CalZH2油體的粒徑大小，并可以提供適用于各種脂溶性藥物和不同脂質(zhì)的CalZH2油體。本發(fā)明CalZH2油體平均粒徑非常穩(wěn)定，大小可達(dá)數(shù)十納米至次微米的尺寸，較易于為人體吸收。制備具注射劑型的CalZH2油體時(shí)，并能控制其平均粒徑為約20納米至約300納米的粒徑。本發(fā)明是提供一種具優(yōu)異遞送特性，并且用于疾病的靶向治療或檢測(cè)的組合，本發(fā)明的使用CalZH2油體檢測(cè)HER2/neu信號(hào)分子，結(jié)合不同藥物及不同脂質(zhì)的組合，而形成CalZH2藥物油體。本發(fā)明組合可以包含任何藥物，并不限于抗癌藥物，最佳是含有脂溶性藥物。組合藥物例如茄紅素、姜黃素、喜樹(shù)堿、抗生素、葫蘆素、溫諾平、紫杉醇、西藥、中草藥及其它不同藥物的組合，也能加入復(fù)合式藥物或其它藥物的組合。本發(fā)明是利用茄紅素、姜黃素及喜樹(shù)堿進(jìn)行組裝OIeEGFR油體,如圖2所示。本發(fā)明的組裝CalZH2油體也可結(jié)合任何已知的信號(hào)分子(下文簡(jiǎn)稱為CalZH2信號(hào)油體)，并能達(dá)成檢測(cè)目的。信號(hào)分子可選自以下群組銫化鎘量子點(diǎn)、異硫氰酸熒光素、茜素黃、尼羅紅及其它已知能發(fā)出不同波長(zhǎng)熒光信號(hào)知信號(hào)分子。例如銫化鎘量子點(diǎn)在應(yīng)用上，利用不同波長(zhǎng)的光來(lái)激發(fā)不同尺寸的銫化鎘量子點(diǎn)時(shí)，會(huì)散射出不同波長(zhǎng)的熒光，所以可以利用特性銫化鎘量子點(diǎn)來(lái)制備發(fā)射不同熒光顏色的CalZH2油體。因此，組裝人造油體也結(jié)合任何已知的信號(hào)分子，并能達(dá)到在活體內(nèi)及活體外檢測(cè)目的，在使本發(fā)明組合具有靶向檢測(cè)的功能，以用于標(biāo)定癌細(xì)胞或病灶的位置，如圖2所示。本發(fā)明靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，油體鈣蛋白可先接上一個(gè)切割單一序列的專一丨I"生接頭(linker)再接上Zhot2肽至宿主細(xì)胞,并且組裝形成有專一丨I"生接頭的CalZH2蛋白，加入脂質(zhì)并組裝成有專一丨丨生接頭的CalZH2油體,經(jīng)過(guò)離心有專一性接頭的CalZH2油體會(huì)懸浮再溶液表面，可以很輕易地回收，利用專一性蛋白酶水解切割讓專一性接頭斷裂，使Zlto2蛋白從油體鈣蛋白分離，經(jīng)離心并回收，得到Zlto2蛋白(能識(shí)別HER2/neu過(guò)表達(dá)的蛋白)，制備方式如圖3所不。本發(fā)明靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，油體鈣蛋白接上Zlto2肽至宿主細(xì)胞，并且組裝形成CalZH2蛋白，加入包覆藥物的脂質(zhì)和包覆已知熒光信號(hào)分子的脂質(zhì)，并組裝成CalZH2檢測(cè)和藥物油體，將包覆有抗癌藥物的CalZH2檢測(cè)和藥物油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，可以利用不同激發(fā)波長(zhǎng)檢測(cè)CalZH2檢測(cè)和藥物油體結(jié)合癌化部位，能清楚對(duì)癌化部位的識(shí)別，還能提高區(qū)域性的藥物濃度，而不致影響正常細(xì)胞。此外，通過(guò)上述機(jī)制，亦可刺激癌細(xì)胞對(duì)Cal ZH2藥物油體的吞噬作用與融合作用，使抗癌藥物進(jìn)入癌細(xì)胞，以達(dá)到治療及避免產(chǎn)生抗藥性的目的。本發(fā)明靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，由不同的可以合成出藥物的類似物的肽或是對(duì)病癥有治療效果的肽(以上肽稱為藥物肽)，經(jīng)過(guò)基因工程，此合成蛋白為例如姜黃素、艾利諾得甘、茄紅素、3胡蘿卜素、腳黃素、蝦紅素、玉米黃質(zhì)素、水蛭素、胰島素、抑制病癥的蛋白質(zhì)、使病癥細(xì)胞自我凋亡的肽或/和用分子生物學(xué)組成的抗病癥藥物肽、抗病癥藥的肽或其組合)并接上油體蛋白再接上Zlte2肽至宿主細(xì)胞并且組裝形成類似CalZH2藥物蛋白，加入脂質(zhì)并組裝成自組裝成類似CalZH2藥物油體。該油體能夠?qū)Ｒ恍缘刈R(shí)別癌化部位并能自行組裝藥物蛋白，可在活體內(nèi)及活體外檢測(cè)癌化部位，進(jìn)行癌化部位抑制及藥物治療，制備過(guò)程如圖4所示。本發(fā)明組裝CalZH2油體可以精準(zhǔn)地標(biāo)定癌細(xì)胞，能夠?qū)崟r(shí)性地用在活體內(nèi)癌化部位的檢測(cè)，也可以包覆藥物組裝成CalZH2藥物油體，并能準(zhǔn)確地遞送藥物，以達(dá)到精準(zhǔn)殺死癌細(xì)胞而減少正常細(xì)胞被殺死的副作用，因此本發(fā)明具有實(shí)時(shí)性的檢測(cè)監(jiān)控與治療的功效。本發(fā)明組裝CalZH2藥物油體及CalZH2熒光藥物油體的藥物或藥物肽不局限于上述的藥物，能具有抑制病癥細(xì)胞、毒殺病癥細(xì)胞、插入/改變/去除一個(gè)或多個(gè)基因使病癥細(xì)胞基因突變而無(wú)法正常或快速分裂引發(fā)病癥細(xì)胞萎縮或自我凋亡、使病癥細(xì)胞制成步驟中斷而無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞周期的分裂、在病癥細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抑制或破壞病癥細(xì)胞生長(zhǎng)條件的物質(zhì)而無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞周期的分裂及使病癥細(xì)胞無(wú)法感染正常細(xì)胞的物質(zhì)都能與該油體進(jìn)行組裝或結(jié)合，具有專一性識(shí)別癌化部位抑制及藥物治療的效果。本發(fā)明作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2蛋白質(zhì)利用基因工程技術(shù)接上專一丨I"生接頭，并組裝成CalZH2專一'丨生接頭油體，CalZH2專一'丨生接頭油體能利用專一性蛋白酶水解切割，可純化出純度高的Zlto2蛋白質(zhì)的應(yīng)用，該法簡(jiǎn)單又方便并不會(huì)影響蛋白的性質(zhì)。本發(fā)明作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，該油體鈣蛋白為包含由SEQ ID NO: I所列的氨基酸序列及SEQ ID N0:5所列的DNA序列的油體鈣蛋白；ZHct肽為包含由SEQ ID NO 2所列的氨基酸序列及Zlte2序列SEQ ID NO 6所列的DNA序列的油體鈣蛋白。而組裝CalZH2藥物油體及CalZH2熒光藥物油體的藥物或藥物肽的藥物，能具有抑制病癥細(xì)胞、毒殺病癥細(xì)胞、插入/改變/去除一個(gè)或多個(gè)基因使病癥細(xì)胞基因突變而無(wú)法正?；蚩焖俜至岩l(fā)病癥細(xì)胞萎縮或自我凋亡、使病癥細(xì)胞制成步驟中斷而無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞周期的分裂、在病癥細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抑制或破壞病癥細(xì)胞生長(zhǎng)條件的物質(zhì)而無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞周期的分裂及使病癥細(xì)胞無(wú)法感染正常細(xì)胞的物質(zhì)都能與該油體進(jìn)行組裝或結(jié)合，具有專一性識(shí)別癌化部位抑制及藥物治療的效果。值得一提的是，本發(fā)明作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，作為宿主細(xì)胞的E. coli nissle(AG2)為一種益生菌的大腸桿菌，并對(duì)糖尿病、胃部疾病、心臟病或其疾病有治療效果。本發(fā)明使用CalZH2油體具有簡(jiǎn)易操作性及優(yōu)異的載體特性，因此可以廣泛應(yīng)用在蛋白純化、植物組培、中草藥、西藥、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生物醫(yī)學(xué)材料、動(dòng)物疫苗、生物科技等產(chǎn)業(yè)。以下列具體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，進(jìn)一步地?cái)⑹霰景l(fā)明。實(shí)施例I制備CalZH2油體 依造圖2所示的制備流程構(gòu)建本發(fā)明的CalZH2油體?！床襟E一、構(gòu)建表達(dá)載體〉利用基因重組技術(shù)將以下三種基因構(gòu)建于表達(dá)載體上油體鈣蛋白(N端)-ZHer2肽(C端)CalZH2蛋白質(zhì)的基因以一含SEQ ID NO 3所列的核苷酸序列的接頭(包含SEQ ID NO :4所列的氨基酸序列)基因結(jié)合芝麻種子的油體鈣蛋白基因(包含SEQ ID N0:5所列的核苷酸序列)及HER2/neu蛋白質(zhì)的配體肽(即Zlte2肽)的基因(包含SEQ ID NO :6所列的核苷酸序列)。詳細(xì)的操作步驟如下。首先，利用芝麻種子進(jìn)行基因重組，純化及提取，并得到油體鈣蛋白肽)，以組裝成PET-油體鈣蛋白肽，純化pET-油體鈣蛋白肽，以作為模板DNA，再利用引物經(jīng)由PCR來(lái)獲得一油體鈣蛋白基因片段，其大小為748bp。接著，以Nde I限制酶酶切該基因片段，并將其接至一 pET_29a(+)載體(購(gòu)自Novagen公司)上，再將所制得的重組載體轉(zhuǎn)化至E. coli.DH5a (購(gòu)自財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI))宿主細(xì)胞中。于卡那霉素(購(gòu)自Sigma公司)的LB(Luria-Bertani)固態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞,并進(jìn)行篩選，以獲得一包含pET-29a-油體鈣蛋白基因的重組載體的轉(zhuǎn)化株。Nord等人研發(fā)出一種可專一丨I"生地與HER2/neu蛋白質(zhì)受體鍵結(jié)的ZHer2肽，以作為該受體的配體,參見(jiàn)Nord etal., Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a -helicalbacterial receptor domain. Nat Biotechnol. 1997，15:772-777,該文獻(xiàn)全文引用于此以供參考，以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成PET-Zlto2載體，再純化PET-Zlte2載體以當(dāng)作模板DNA，利用引物經(jīng)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得Zlte2基因片段，其大小為507bp。接著，以Nco I及HindIII限制酶酶切Zaer2基因，并將其連接至一 pBluescript II (SK+)(購(gòu)自Novagen公司)載體上，再將制得的重組載體轉(zhuǎn)化至E. coli. DH5 a宿主細(xì)胞中。于一含有青霉素及X-gal (購(gòu)自Sigma公司)的LB固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，并進(jìn)行篩選，其中，挑選白色菌株以獲得pBluescript II-Zhot2重組載體的轉(zhuǎn)化株。再來(lái)，以Eco RV及HindIII限制酶酶切pBluescript II-Zaer2重組載體上的Zlto2基因片段，并將其連接至該包含pET-29a-油體鈣蛋白基因的重組載體上，即可制得pET-29a-cale0Sin-ZHer2的表達(dá)載體，稱為pET-29a-calZH2。接著，以HindIII及Nde I限制酶酶切并連接上pET20bI_MA(購(gòu)自Novagen公司)基因的重組載體上，即可制得PET20bI_calZH2 (簡(jiǎn)稱CalZH2, 2011年6月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，CGMCC No. :4958，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichiacoli))。
完成上述表達(dá)載體的構(gòu)建后，分別將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主細(xì)胞(E. coliBL21(DE3)(購(gòu)自Novagen公司)，與E. coli nissle(AG2))(購(gòu)自財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI))內(nèi)，組成E. coli BL21(DE3)/pET20bI-calZH2、E.coli.DH5a/pET20bI-calZH2 及 E. coli nissle (入 G2)/pET20bI_calZH2，提取質(zhì)粒以確認(rèn)表達(dá)載體的核苷酸序列。上述實(shí)驗(yàn)方法可參見(jiàn)Sambrook et al. , The Condensed Protocols FromMolecular Cloning A Laboratory Manual 2006,該文獻(xiàn)全文并入本文以供參考。<步驟二、表達(dá)CalZH2蛋白〉以異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG，0. 05毫摩爾濃度(購(gòu)自USB公司))誘導(dǎo)步驟一中所制得的宿主細(xì)胞，使其大量表達(dá)CalZH2蛋白，并收集菌液。以6，500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心菌液10分鐘，再以約1/10倍的菌液體積的TE緩沖液(TE (Tris-EDTA) buffer (購(gòu)自Sigma公司))懸浮經(jīng)離心沉淀的宿主細(xì)胞，接著，將其加入至十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品緩沖液(SDS-PAGE 4X sample buffer(購(gòu)自Sigma公司))中并混合 均勻，最后95°C加熱約10分鐘后，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。結(jié)果如圖5所示。<步驟三、添加脂質(zhì)及信號(hào)分子>將步驟二中所制得的CalZH2蛋白質(zhì)(50毫克)加入至一試管中，并添加50毫克甘油三酯、150微克的磷脂質(zhì)及2. 5微克熒光染劑(茜素黃(購(gòu)自懷德生物科技公司)或是尼羅紅(購(gòu)自Sigma公司))，再利用超聲樣品處理器(型號(hào)=Sonics VCX130)以數(shù)分鐘的間隔振蕩五次(條件為10秒，20ampIitude, 0. 5pulser),以進(jìn)行油體重組并組裝出CalZH2突光油體，使該油體通過(guò)0. 22毫米的濾膜，利用熒光顯微鏡(型號(hào)=Nikon 104)觀察制備結(jié)果，結(jié)果如圖6所不?？衫靡话闵瘷z驗(yàn)分析方法測(cè)定CalZH2油體中的三種基本成分。于此，經(jīng)由檢測(cè)酯鍵及計(jì)算而獲得甘油三酯含量；使用BioRad公司的檢測(cè)試劑(BCA protein assay)計(jì)算獲得蛋白質(zhì)含量。實(shí)施例2CalZH2油體的原子力顯微鏡測(cè)試將云母片(購(gòu)自佑鴻企業(yè)股份有限公司)用水清洗三次，每次三分鐘，再用0. 02M的MgCl泡制2-3分鐘，并用清水清洗一次。將步驟二中所制得的CalZH2蛋白質(zhì)(50毫克)加入至一試管中，并添加50毫克甘油三酯及150微克的磷脂質(zhì)并組裝成CalZH2油體，使該油體經(jīng)過(guò)0. 22毫米的濾膜(購(gòu)自Sigma公司)，再將過(guò)濾后的油體加入至云母片上靜置2小時(shí)，使靶向型人造油體吸附在云母片上，之后用雙蒸水清洗兩次，放置于37°C烘箱中干燥，最后用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope, AFM)(型號(hào)NS4/D3100CL/MultiMode)觀察油體型態(tài)和大小，結(jié)果如圖7所示。實(shí)施例3脂質(zhì)與CalZH2蛋白質(zhì)的比例的影響在100微克calZH2\蛋白質(zhì)(pET20bI_calZH2)中添加950微升的磷酸鈉緩沖液(0. 01摩爾濃度，pH 7. 5)(購(gòu)自Sigma公司)及50微升的橄欖油(購(gòu)自Sigma公司)，得到含有CalZH2蛋白質(zhì)/脂質(zhì)(橄欖油)的重量/體積比值(微克/微升)為2/1的混合物。然后，以超聲振蕩混合物(混合物置于冰上，功率15%，時(shí)間20秒，run :0. 5秒，rest :0. 5秒，振蕩三次)，得到所要的CalZH2油體。重復(fù)前述操作，但分別使用400、200、100及100微克CalZH2蛋白質(zhì)，且對(duì)應(yīng)使用20、20、100及500微升橄欖油，以得到CalZH2蛋白質(zhì)/脂質(zhì)(橄欖油)的重量/體積比值(微克/微升)分別為20/1、10/1、1/1、及1/5的CalZH2油體。利用Nikon 104型光學(xué)顯微鏡觀察不同條件CalZH2油體的形態(tài)(如第圖8所示)及濁度(如圖9所示，計(jì)算方法如以下實(shí)施例6所述)，并使用粒徑分析儀(BeckmanCoulter,N4Plus)以分析CalZH2油體的粒徑。其中，將離子強(qiáng)度固定為0. 1，并于25°C下以粒徑分析儀的動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scanning, DLS) (Il激光束633納米；散射角90° ;分析方法Contin)分析粒徑大小及粒徑分布,結(jié)果如圖10所示。實(shí)施例4pH值的影響將CalZH2蛋白質(zhì)(100微克CalZH2)加入至950微升的不同pH值(pH 6. 5,pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、或pH 9. 0)的磷酸鈉緩沖液(0. 01摩爾濃度)中，再添加50微升的橄欖油，超聲振蕩混合物(混合物置于冰上，功率15%，時(shí)間20秒，run :0. 5秒，rest :0. 5秒，振蕩三次)，以制備CalZH2油體。利用Nikon 104型光學(xué)顯微鏡觀察CalZH2油體的形態(tài)(如圖 8所示)及池度(如圖9所示)；以粒徑分析儀分析CalZH2油體的粒徑(如圖10所示)。實(shí)施例5脂質(zhì)種類的影響將CalZH2蛋白質(zhì)(100微克pET20bI_calZH2)加入至950微升的磷酸鈉緩沖液(0.01摩爾濃度，pH 7. 5)中，再添加50微升的不同脂質(zhì)(芝麻油(購(gòu)自Sigma公司)、橄欖油、大豆油(購(gòu)自Sigma公司)、花生油(購(gòu)自Sigma公司)、或礦物油(購(gòu)自Sigma公司)),超聲振蕩混合物(混合物置于冰上，功率15%，時(shí)間20秒，run :0. 5秒，rest :0. 5秒，震蕩三次)，以制備CalZH2油體。利用Nikon 104型光學(xué)顯微鏡觀察CalZH2油體的形態(tài)(如圖8所示)及池度(如圖9所示);以粒徑分析儀(型號(hào)Zetasizer Nano,Malvern#ZS90)分析CalZH2油體的粒徑(如圖10所示)。圖8及圖10所示，所制得CalZH2油體的平均粒徑介于10至2，000納米的間，且隨著脂質(zhì)與CalZH2蛋白質(zhì)的比例降低而變小。因此，可調(diào)整脂質(zhì)與CalZH2蛋白質(zhì)的比例以制備出不同平均粒徑的CalZH2油體。此外，CalZH2油體的平均粒徑于堿性環(huán)境下相對(duì)較小。實(shí)施例6測(cè)定CalZH2油體的穩(wěn)定度以下列三種方式測(cè)定CalZH2油體的穩(wěn)定度A、觀察負(fù)電斥力可通過(guò)觀察CalZH2油體表面的負(fù)電斥力或蛋白質(zhì)覆蓋的立體屏障效應(yīng)而測(cè)得其穩(wěn)定度，其中，可通過(guò)降低溶液的PH值來(lái)觀察負(fù)電斥力逐漸消失所導(dǎo)致的油體聚集。因此，將CalZH2油體放置于不同pH值的磷酸緩沖液中，并于室溫下靜置12小時(shí)，再以光學(xué)顯微鏡觀察其變化。由圖8可看出，于pH 7. 5下放置12小時(shí)后，皆仍保持完整性。B、測(cè)量濁度如果CalZH2油體是完整的，則表面為親水性，而且能有效地與水互溶而呈懸浮狀態(tài)。若CalZH2油體是不完整的，則其表面上的蛋白質(zhì)會(huì)因無(wú)法正確折疊導(dǎo)致CalZH2油體間彼此聚合，使CalZH2油體浮在溶液表面。因此，可以由測(cè)定溶液底層的濁度可間接地了解CalZH2油體的完整性。因此，首先將I毫升的CalZH2油體置于一次性測(cè)量管內(nèi)，并將管口密封且避免震動(dòng)，靜置于室溫下140分鐘后，以吸收波長(zhǎng)600納米測(cè)量濁度。相對(duì)濁度表示為T/T0 = IOA/10A0 = 10A/102. 0，其中 AO 為 2. O。由圖 9 可看出，經(jīng) 140 分鐘后，CalZH2油體仍然保持完整性，此說(shuō)明CalZH2油體具有極佳的穩(wěn)定性。C、測(cè)量zeta電位將CalZH2油體分散于不同環(huán)境(不同脂質(zhì)與CalZH2蛋白質(zhì)的重量/體積比例、pH值、或脂質(zhì)種類)的下，并利用表面電位分析儀(Zetasizer Nano,Malvern#ZS90)測(cè)量人造CalZH2油體的表面zeta電位的變化，測(cè)量結(jié)果如表I所示，CalZH2油體的穩(wěn)定度隨著脂質(zhì)與CalZH2蛋白質(zhì)的比例降低而提升，且于堿性環(huán)境下相對(duì)較為穩(wěn)定。表I、CalZH2油體在不同條件表面電位分析儀測(cè)試
權(quán)利要求
1.一種作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其組成包括 CalZH2蛋白質(zhì)，其是利用基因重組技術(shù)將Zlte2肽與油體鈣蛋白插入宿主細(xì)胞所誘導(dǎo)出，該油體鈣蛋白可以選自以下群組的植物的種子的油體蛋白芝麻、橄欖、大豆、花生、麻種子、油菜、葵花、芥花、紅花的一部分或其組合；所述宿主細(xì)胞可以為真核宿主細(xì)胞及原核宿主細(xì)胞，真核宿主細(xì)胞選自以下群組單細(xì)胞生物體如酵母細(xì)胞、源自高等生物體如植物，昆蟲或哺乳動(dòng)物的不死細(xì)胞或其組合，原核宿主細(xì)胞選自以下群組桿菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其組合，最佳為大腸桿菌，大腸桿菌當(dāng)宿主細(xì)胞可為E. coli.DH5a、E. coli.BL21 (DE3)、E. coli nissle (入 G2)或其組合； 脂質(zhì)，其加入所述CalZH2蛋白質(zhì)后制成CalZH2油體；該脂質(zhì)可以選自以下群組甘油三酯、橄欖油、芝麻油、大豆油、花生油、礦物油、亞麻油、紅花油、或其組合；其中，CalZH2蛋白質(zhì)與該脂質(zhì)的重量/體積比值(微克/微升)為至少約1/25，且該CalZH2油體的平均粒徑為納米等級(jí)； 通過(guò)上述組成，成為具有專一性的傳遞載體，以提供一主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)，由于CalZH2蛋白質(zhì)中的Zlte2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體。
2.如權(quán)利要求I所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，可進(jìn)一步包括脂質(zhì)包覆已知熒光信號(hào)分子，以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2熒光油體，該已知熒光信號(hào)分子可以選自以下群組銫化鎘量子點(diǎn)、異硫氰酸熒光素、茜素黃、尼羅紅或其組合； 通過(guò)上述組成，成為具有專一性的遞送載體，以提供一主動(dòng)靶向藥物遞送體系，由于CalZH2蛋白質(zhì)中的Zlte2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，因此透過(guò)CalZH2檢測(cè)油體，將包覆有已知熒光信號(hào)分子的CalZH2檢測(cè)油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，并能專一性地檢測(cè)及識(shí)別病變部位，而不致影響正常細(xì)胞；此外，亦可刺激癌細(xì)胞對(duì)CalZH2熒光油體的吞噬作用與融合作用，使熒光分子進(jìn)入癌細(xì)胞，以達(dá)到靶向?qū)Ｒ恍詸z測(cè)癌細(xì)胞的目的。
3.如權(quán)利要求I所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包括脂質(zhì)包覆藥物，加入所述CalZH2蛋白質(zhì)后以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2藥物油體，該藥物可以選自以下群組的藥物茄紅素、姜黃素、喜樹(shù)堿、抗生素、葫蘆素、溫諾平、紫杉醇、西藥、中草藥或其組合； 通過(guò)上述組成，成為具有專一性的傳遞載體，以提供一主動(dòng)靶向藥物遞送體系，由于CalZH2蛋白質(zhì)中的Zlte2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，因此透過(guò)CalZH2藥物油體，將包覆有抗病癥藥物的CalZH2藥物油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，提高區(qū)域性的藥物濃度，而不致影響正常細(xì)胞；此外，亦可刺激病癥細(xì)胞對(duì)CalZH2藥物油體的吞噬作用與融合作用，使抗癌藥物進(jìn)入癌細(xì)胞，以達(dá)到檢測(cè)治療及避免產(chǎn)生抗藥性的目的。
4.如權(quán)利要求I所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包括脂質(zhì)包覆藥物和脂質(zhì)包覆已的已知熒光信號(hào)分子，加入所述CalZH2蛋白質(zhì)后以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2熒光藥物油體，該藥物可以選自以下群組的藥物茄紅素、姜黃素、喜樹(shù)堿、抗生素、葫蘆素、溫諾平、紫杉醇、西藥、中草藥或其組合；以及，該已知熒光信號(hào)分子可以選自以下群組銫化鎘量子點(diǎn)、異硫氰酸熒光素、茜素黃、尼羅紅或其組合； 通過(guò)上述組成，成為具有專一性的傳遞載體，以提供一主動(dòng)靶向藥物遞送體系，由于CalZH2蛋白質(zhì)中的Zlto2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，因此透過(guò)CalZH2熒光藥物油體，將包覆有抗病癥藥物的CalZH2熒光藥物油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，提高區(qū)域性的藥物濃度，而不致影響正常細(xì)胞；此外，亦可刺激病癥細(xì)胞對(duì)CalZH2熒光藥物油體的吞噬作用與融合作用，使抗癌藥物進(jìn)入癌細(xì)胞，以達(dá)到檢測(cè)治療及避免產(chǎn)生抗藥性的目的。
5.如權(quán)利要求I所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2蛋白質(zhì)利用基因工程技術(shù)接上藥物肽，并組裝成CalZH2藥物蛋白質(zhì)，加入所述CalZH2藥物蛋白質(zhì)后以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2藥物油體，該藥物肽并無(wú)任何限制可以選自以下群組姜黃素、艾利諾得甘、茄紅素、3胡蘿卜素、腳黃素、蝦紅素、玉米黃質(zhì)素、水蛭素、胰島素、抑制病癥的蛋白質(zhì)、使病癥細(xì)胞自我凋亡的肽或/和用分子生物學(xué)組成的抗病癥藥物肽、抗病癥藥的肽或其組合； 通過(guò)上述組成，成為具有專一性的傳遞載體，以提供一主動(dòng)靶向藥物遞送體系，由于 CalZH2蛋白質(zhì)中的Zlte2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，因此透過(guò)CalZH2藥物油體，將包覆有抗病癥藥物的CalZH2藥物油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，提高區(qū)域性的藥物濃度，而不致影響正常細(xì)胞；此外，亦可刺激病癥細(xì)胞對(duì)CalZH2藥物油體的吞噬作用與融合作用，使抗癌藥物進(jìn)入癌細(xì)胞，以達(dá)到檢測(cè)治療及避免產(chǎn)生抗藥性的目的。
6.如權(quán)利要求5所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2藥物蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包括脂質(zhì)包覆已知熒光信號(hào)分子，加入所述CalZH2R蛋白質(zhì)后以分子生物學(xué)技術(shù)組裝成CalZH2熒光藥物油體，該已知熒光信號(hào)分子可以選自以下群組銫化鎘量子點(diǎn)、異硫氰酸熒光素、茜素黃、尼羅紅或其組合； 通過(guò)上述組成，成為具有專一性的傳遞載體，以提供一主動(dòng)靶向藥物遞送體系，由于CalZH2藥物蛋白質(zhì)中的Zlte2肽可精準(zhǔn)地識(shí)別癌細(xì)胞表面的受體，因此透過(guò)CalZH2熒光藥物油體，將包覆有抗病癥藥物的CalZH2熒光藥物油體直接投遞至癌變部位或作用于癌細(xì)胞，提高區(qū)域性的藥物濃度，而不致影響正常細(xì)胞；此外，亦可刺激病癥細(xì)胞對(duì)CalZH2-光藥物油體的吞噬作用與融合作用，使抗癌藥物進(jìn)入癌細(xì)胞，以達(dá)到檢測(cè)治療及避免產(chǎn)生抗藥性的目的。
7.如權(quán)利要求I所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，CalZH2蛋白質(zhì)利用基因工程技術(shù)接上專一性接頭，并組裝成CalZH2專一性接頭油體，CalZH2專一性接頭油體能利用專一性蛋白酶水解切割，可純化出純度高的Zlte2蛋白質(zhì)的應(yīng)用，該法簡(jiǎn)單又方便并不會(huì)影響蛋白的性質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6及7所述的作為靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其中，該油體鈣蛋白為包含由SEQ ID NO: I所示氨基酸序列及SEQ ID NO :5所示DNA序列的油體鈣蛋白；ZHOT肽為包含由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列及Zlto2序列SEQ IDNO 6所示DNA序列的油體鈣蛋白，而組裝CalZH2藥物油體及CalZH2熒光藥物油體的藥物或藥物肽的藥物，能具有抑制病癥細(xì)胞、毒殺病癥細(xì)胞、插入/改變/去除一個(gè)或多個(gè)基因使病癥細(xì)胞基因突變而無(wú)法正?；蚩焖俜至岩l(fā)病癥細(xì)胞萎縮或自我凋亡、使病癥細(xì)胞制成步驟中斷而無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞周期的分裂、在病癥細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抑制或破壞病癥細(xì)胞生長(zhǎng)條件 的物質(zhì)而無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞周期的分裂及使病癥細(xì)胞無(wú)法感染正常細(xì)胞的物質(zhì)都能與該油體進(jìn)行組裝或結(jié)合，具有專一性識(shí)別癌化部位抑制及藥物治療的效果。
全文摘要
本發(fā)明靶向藥物遞送體系檢測(cè)及治療的納米級(jí)人造油體，其組成包含一calZH2蛋白質(zhì)，該calZH2蛋白質(zhì)包含一油體鈣蛋白及一ZHer2肽；一脂質(zhì)、一脂質(zhì)包覆脂溶性藥物及一脂質(zhì)包覆已知熒光分子，并制成calZH2油體、calZH2藥物油體及calZH2熒光油體，以提供一主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)及檢測(cè)系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102743324SQ20111032704
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者朱寶美, 陳順基 申請(qǐng)人:陳致融