專利名稱：具有蒜氨酸酶活性的駱駝單域抗體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種制備催化抗體或抗體酶的通用方法及所獲得的具有蒜氨酸酶活性的駱駝來源的單域抗體，及這些抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗體酶(abzyme)，也稱催化抗體，兼具酶的專一催化作用和抗體的靶向作用，在研究和應(yīng)用中具有重要價值。然而，由于抗體酶制備過程復(fù)雜、制備難度大，盡管1986年就得到了第一個人工合成的抗體酶，然而到目前為止，有實際應(yīng)用價值的抗體酶報道的并不多 [1]。當(dāng)前，制備抗體酶的方法主要有兩種一種是采用酶底物過渡態(tài)中間類似物作為抗原[2]，免疫動物后篩選能結(jié)合過渡態(tài)中間類似物的抗體，該抗體可能具有酶的活性。這種方法一方面需要合成大量過渡態(tài)中間類似物，并且需要與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)后免疫動物，過程復(fù)雜，結(jié)果不易控制；另一方面，免疫動物可能不易激發(fā)針對過渡態(tài)中間類似物的抗體。所以，采用該方法篩選抗體酶成功的幾率并不高。第二種方法是采用抗獨特型抗體模擬抗原作為抗原內(nèi)影像[3-5]。該學(xué)說認(rèn)為能與抗體(稱為Abl)中的抗原互補結(jié)合區(qū) (complementarity-determining regions, CDR)結(jié)合的抗體(稱為 Ab2，也叫抗獨特型抗體，anti-idiotypic antibody)，可以模擬抗原的性質(zhì)，即相當(dāng)于抗原的內(nèi)影像(其原理見示意圖1)。因此，可以通過篩選結(jié)合圖中Abl的抗獨特型抗體來獲得抗體酶。但該方法成功的關(guān)鍵是首先需要獲得能與作為抗原的酶活性中心結(jié)合的抗體(AblK6]。這對于由兩條重鏈(heavy chain, H)和兩條輕鏈(light chain, L)組成的常規(guī)抗體來說，是比較困難的。因為常規(guī)抗體的抗原互補結(jié)合區(qū)(⑶Rs)是由重鏈可變區(qū)(variabledomains of the heavychain, VH)和輕鏈可變區(qū)(variable domains of the light chain, VL)共同組成， 在空間結(jié)構(gòu)上呈扁平或凹陷的結(jié)合槽[7-8]。這種結(jié)構(gòu)不利于結(jié)合位于蛋白裂隙中的抗原表位，像酶的活性中心就是這樣的表位。事實上，目前得到的具有酶抑制作用的常規(guī)抗體很少。所以從常規(guī)抗體庫中篩選得到具有酶活性的抗獨特型抗體也比較困難。因此，抗體酶盡管具有獨特的優(yōu)點，在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域有著誘人的應(yīng)用前景，但由于沒有可靠和可行的制備手段，限制了其廣泛應(yīng)用。近年來，在對駱駝科動物的研究中發(fā)現(xiàn)[9]，雙峰駝、單峰駝、羊駝和美洲駝中存在一種天然缺少輕鏈，僅由重鏈組成、但具有完整功能的抗體，稱為重鏈抗體(heavy chain antibody, HCAb)(其結(jié)構(gòu)見示意圖2)，其可變區(qū)仍具有很好的抗原識別和結(jié)合能力，與抗原結(jié)合的親和力和常規(guī)抗體相當(dāng)。重鏈抗體的可變區(qū)(variable domains of the HCAb，簡稱為VHH)，分子量為15kDa，僅為常規(guī)抗體的1/10，是目前可以得到的具有完整抗體功能的最小分子片段，稱為單域抗體(single domain antibody, sdAb) 0更為獨特的是，駱駝單域抗體的抗原結(jié)合區(qū)僅由VHH的三個超變區(qū)(H1-H3)組成，在空間上形成了與常規(guī)抗體典型結(jié)構(gòu)不同的抗原結(jié)合域[8，10]。其中H3的平均長度比常規(guī)抗體長，在空間上可呈突出的指狀結(jié)構(gòu)[8，10]。因此單域抗體可以結(jié)合一些常規(guī)抗體無法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心結(jié)構(gòu)。最近多項研究均表明[11-17]，從經(jīng)過酶免疫的駱駝VHH抗體文庫中篩選得到了很高比例的酶抑制性單域抗體。另外，由于在框架區(qū)FR2中有四個位點被親水性氨基酸替換(V37 — F或Y ；G44 — E ；L45 — R或C ；W47 — G) [19]，重組的VHH在大腸桿菌中可以獲得高表達(dá)(5-10mg/L)，并且具有水溶性好，穩(wěn)定性強，免疫原性弱，組織穿透性強等優(yōu)點，使得該抗體作為一種小型化的基因工程抗體在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[18-19]。單域抗體優(yōu)先識別酶活性中心的特性，使得它們非常適合作為酶的分子模擬以及作為抗獨特型抗體疫苗。Zarebski LM[20]從特異結(jié)合DNA寡核苷酸的單抗ED84免疫的美洲駝VHH抗體庫中，篩選得到了兩個抗獨特型抗體，都能競爭抑制ED84與雙鏈DNA寡核苷酸的結(jié)合，表現(xiàn)出對該DNA功能上的模擬。但迄今未見采用駱駝抗獨特型抗體獲得抗體酶的報道。本發(fā)明根據(jù)抗體獨特型網(wǎng)絡(luò)學(xué)說，采用與酶活性中心特異結(jié)合的單域抗體，從經(jīng)過酶免疫的駱駝VHH抗體庫中篩選得到具有酶活性的抗獨特型抗體。1. 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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用重組的駱駝重鏈抗體可變區(qū)(variable part of the heavy chain of heavy-chain antibodies,簡稱VHH)優(yōu)先識別酶活性中心并具有凸出的指狀CDR3結(jié)構(gòu)的特點，根據(jù)抗獨特型抗體模擬抗原的網(wǎng)路調(diào)控理論，采用來源于大蒜中的蒜氨酸酶免疫駱駝構(gòu)建的VHH噬菌體展示文庫中篩選獲得具有蒜氨酸酶活性的抗獨特型抗體。本發(fā)明克服了現(xiàn)有抗體酶制備方法中存在的制備過程復(fù)雜、制備難度大，獲得兒率和酶活性偏低等缺點，為廣泛獲得模擬天然酶的抗體酶提供了一種高效簡便的制備方法。本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是構(gòu)建基于駱駝VHH基因序列的單域抗體噬菌體展示文庫。采用自大蒜中純化的蒜氨酸酶免疫新疆雙峰駝，通過VHH特異的引物從淋巴細(xì)胞中采用RT-PCR方法克隆得到了 VHH基因序列，連接到pCANTAB 5E載體中建立了 VHH 噬菌體展示文庫。本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是建立基于抗獨特型駱駝單域抗體的抗體酶篩選方法。根據(jù)抗體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控學(xué)說，本發(fā)明設(shè)計了一種簡便的抗體酶篩選方法。具體為采用從文庫第一輪篩選獲得的具有酶抑制活性的Abl抗體直接對同一個文庫進(jìn)行第二輪篩選， 可快速獲得抗獨特型單域抗體，再根據(jù)酶活性的測定選擇目標(biāo)催化抗體。
本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供了編碼上述重組抗體的基因。其中，編碼抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1 NO. 5所示。本發(fā)明要解決的第四個技術(shù)問題是提供了上述重組抗體的在腫瘤治療中的應(yīng)用價值。本發(fā)明可通過以下步驟實現(xiàn)1.純化酶抗原，免疫新疆雙峰駝2.設(shè)計適當(dāng)?shù)囊镉糜跀U增VHH基因片段3.分離免疫動物淋巴細(xì)胞，擴增建VHH特異片段，連接到pCANTAB 5E載體構(gòu)噬菌體展示文庫4.親和篩選與蒜酶抗原特異結(jié)合的VHH克隆(Abl)5. VHH陽性克隆重組蛋白表達(dá)、純化和鑒定6.蒜氨酸酶活性抑制實驗選擇抑制性VHH抗體(Abl)7.親和篩選與抑制性VHH抗體(Abl)特異結(jié)合的VHH克隆(Ab2)8. VHH陽性克隆(Ab2)重組蛋白表達(dá)、純化和鑒定9.蒜氨酸酶活性實驗選擇具有催化活性的VHH抗體(Ab2)10.催化抗體VHH的酶活性和代謝動力學(xué)分析11.催化抗體VHH體外轉(zhuǎn)化底物蒜氨酸對B16腫瘤細(xì)胞的殺傷作用


圖1. pCANTAB 5E噬菌粒載體2.用于擴增新疆雙峰駝重鏈抗體可變區(qū)VHH的弓I物序列圖3.大蒜中純化得到的蒜氨酸酶的SDS-PAGE電泳4.蒜氨酸酶免疫后的新疆雙峰駝血清抗體滴度的ELISA測定圖5.原位PCR鑒定VHH噬菌體展示文庫的插入片段的陽性率圖6.表達(dá)質(zhì)粒pET30a_VHH物理7.單域抗體VHHA4的誘導(dǎo)、表達(dá)、純化和鑒定的SDS-PAGE電泳8.單域抗體VHHA4對蒜氨酸酶活性抑制曲線，以殘余酶活力的百分?jǐn)?shù)作為抑制率。IC50為 0. 2umol/L圖9.單域抗體VHHA4結(jié)合蒜酶活性中心的競爭ELISA實驗。圖10.單域抗體VHHClO的表達(dá)、純化和鑒定的SDS-PAGE電泳11.底物蒜氨酸濃度對催化抗體VHHClO蒜酶活性影響的Michaelis-Menten曲線圖12.單域抗體VHHClO酶活性動力學(xué)測定的Lineweaver-Burk曲線圖13.單域抗體VHHClO轉(zhuǎn)化蒜氨酸在體外對B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用圖14.抗體酶制備流程示意圖
具體實施例方式以下結(jié)合實施方式詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明實例
一、大蒜中蒜氨酸酶抗原的分離純化和酶活性測定從新鮮大蒜蒜瓣中采用硫酸銨沉淀(60%飽和度)方法提取蒜氨酸酶粗酶，經(jīng)過葡聚糖G-20凝膠脫鹽后，采用ConA-S印harose親和層析純化.獲得純度約90%的蒜氨酸酶。保存在20°C 1-3個月內(nèi)酶活性沒有明顯降低。酶活性測定采用丙酮酸法和4-吡啶硫醇法G-mer-capt0pyridine，4-MP)分別測定丙酮酸和大蒜素的生成量。丙酮酸測定方法如下反應(yīng)混合液包括0. IM NaH2P04, Iml的VHH C4或蒜酶溶液(lmg/mL)，ImL蒜氨酸Omg/mL)，在;35°C孵育5min。加入2mL三氯乙酸終止反應(yīng)。然后加入ImL 2，4_ 二硝基苯胼，并且繼續(xù)孵育5min，隨后加入5mL 2. 5M NaOH并孵育lOmin，在分光光度計上測定 520nm的吸收值。。4-MP測定法步驟如下在Iml反應(yīng)液中混合以下成分lmM 4_MP，50mM Na-phosphate (pH 7. 2), 2mM EDTA，0. 02mM磷酸吡哆醛，IOmM蒜氨。酶活測定起始于加入催化劑，活力測定根據(jù)324nm處吸收值的降低計算。1個活力單位定義為，在反應(yīng)條件下每分鐘催化生成ΙμΜ丙酮酸所需的酶量。為了排除樣品中殘存的大蒜素的影響，測定前先將 Alliinase 或 VHH C4 與 IOmM 4-ΜΡ 在冰上預(yù)孵育 30min。二、新疆雙峰駝的免疫和VHH基因噬菌體展示文庫的構(gòu)建將純化的蒜氨酸酶先與佛氏完全佐劑等體積充分乳化后，對新疆雙峰駝進(jìn)行頸部皮下多點注射(共注射0. 2ml)，免疫劑量為500 μ g/次，每2周加強一次，共進(jìn)行5次免疫.除第一次免疫采用佛氏完全佐劑外，加強免疫均采用不完全佛氏佐劑。每次免疫前和終免14天后，頸靜脈采血，分離血清，ELISA測定血清抗體滴度。雙峰駝經(jīng)蒜氨酸酶免疫后， 體內(nèi)抗原特異抗體滴度逐漸增加，尤其在第4次免疫后(免疫56天)抗體水平增加顯著，而在第5次免疫后(免疫70天)雙峰駝體內(nèi)抗體滴度不再發(fā)生顯著變化，維持在1 12，800 水平。采用淋巴細(xì)胞分離液從200mL雙峰駝外周血中，共收集獲得約1.9X108個淋巴細(xì)胞，分裝并取出IO7個細(xì)胞，以TRIzol Reagent試劑進(jìn)行一步法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成 eDNA。以雙峰駝外周血淋巴細(xì)胞eDNA為模板，采用駱駝VHH的前導(dǎo)肽保守序列VHH-Pl及 HCAb鉸鏈區(qū)特異序列VHH-P2-IgGOa，;3)為上下游引物，擴增獲得雙峰駝兩種亞型重鏈抗體IgGh及IgG3的VHH片段，大小約為400bp-600bp之間，其中來自IgGh亞型的VHH片段略大于來自IgG3的VHH片段。引物如下VHH-Pl-Sfi I:CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG ；VHH-P2-IgG2-Sfi I :CATGCCATGACTCGCGGCCTCGGGGGCCCGTGCATTCTGGTTCAGGTTTTG GTTGTGG ；VHH-P2-IgG3-Sfi I :CATGCCATGACTCGCGGCCTCGGGGGCCCTTGCATACTTCATTCGTTCC將擴增獲得的VHH抗體片段連接至噬菌粒pCANTAB 5E載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，并取出1 μ L轉(zhuǎn)化液涂布，隔日計數(shù)生長的陽性克隆子為620個克隆，由此可計算20cmX 20cm 培養(yǎng)板上的所有陽性克隆子大約為3. IX 105個。從中隨機挑取50個克隆進(jìn)行菌液擴繁，結(jié)果有4個克隆在添加氨芐青霉素的培養(yǎng)基中不能生長，其余46個克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定， 結(jié)果有42個克隆顯示為陽性，可判斷VHH重組片段插入率約為84%，因此VHH抗體庫庫容約為3. 1X 105X84%= 2.6X105cfu。另外，選取的10個陽性克隆測序結(jié)果顯示3個克隆 VHH序列的鉸鏈區(qū)為IgGh亞型抗體的特異序列，其余7個克隆的VHH序列的鉸鏈區(qū)為IgG3 亞型抗體的特異序列，因此10個克隆VHH均來自重鏈抗體；而且10個克隆除VHH12外，其序列FR2區(qū)37，44，45，47位點均含有重鏈抗體VHH的親水性特征氨基酸；10個克隆的序列均不同，說明該抗體庫多樣性較好。擴繁的M1I07輔助噬菌體滴度測定結(jié)果為1014pfu/mL， 抗體庫經(jīng)輔助噬菌體感染后，分離獲得重組噬菌體表達(dá)庫。取分離的噬菌體文庫IOltl倍稀釋液100 μ L，感染宿主菌TGl后，取感染液100 μ L于2 X YTAG培養(yǎng)板上涂布培養(yǎng)過夜計數(shù)， 共有33個阻性克隆集落，計算得出噬菌體抗體庫滴度約為3. 3X1013pfu/mL。同時僅含噬菌體和TGl宿主菌的陰性對照板上均無陽性克隆集落生長三、具有蒜氨酸酶抑制活性的Abl抗體的篩選和制備1.親和淘洗技術(shù)篩選VHH抗體庫中蒜氨酸酶結(jié)合的抗體(1)以Syg/mL蒜氨酸酶包被酶標(biāo)板，4 °C過夜，0.05% PBST洗滌酶標(biāo)板5次； (2) 3 % BSA 封閉，37 0C 孵育 2h，PBST 洗板 5 次；(3)加入噬菌體VHH抗體庫IOlOpfu/孔，37°C孵育2h，PBST洗板15次；(4)以洗脫緩沖液(0. lmol/L甘氨酸，pH 2. 0)室溫孵育IOmin后洗脫，洗脫液立即以中和緩沖液(lmol/L Tris-HCl, pH 9. 0)中和至pH 7. 0 ；(5)洗脫液感染對數(shù)生長期的TGl菌液30min，分別取10 μ L，1 μ L，0. 1 μ L感染液涂布于含50μ g/mL氨芐青霉素和2%葡萄糖的LB固體培養(yǎng)板上，30°C過夜培養(yǎng)，測定洗脫的重組噬菌體滴度；(6)剩余感染液用于擴增，重復(fù)上述吸附-淘洗-洗脫過程，共進(jìn)行三輪富集篩選， 第二輪和第三輪篩選的蒜氨酸酶抗原包被濃度分別遞減為2 μ g/mL和1 μ g/mL,計算每一輪的富集指數(shù)(Output phages/Input phages)；(7)于末次篩選后，選取40個單克隆，經(jīng)菌落PCR初步鑒定后送測序，進(jìn)行序列分析。經(jīng)三輪親和淘洗篩選后，抗體庫的陽性克隆富集指數(shù)逐漸升高，說明隨著每輪篩選的進(jìn)行，抗體庫中抗原特異的陽性克隆得到了有效的富集。富集指數(shù)結(jié)果見表1表1經(jīng)過三輪親和篩選后蒜氨酸酶結(jié)合的噬菌體克隆的富集指數(shù)
權(quán)利要求
1.一種制備催化抗體或抗體酶的通用方法及這些抗體的應(yīng)用，該方法基于重組的駱駝 SlilifCf^PT^IK (variable part of the heavy chain of heavy-chain antibodies, M 稱VHH)優(yōu)先識別酶活性中心并具有凸出的指狀CDR3結(jié)構(gòu)的特點，根據(jù)抗獨特型抗體模擬抗原的網(wǎng)路調(diào)控理論，采用來源于大蒜中的蒜氨酸酶免疫駱駝構(gòu)建的VHH噬菌體展示文庫中篩選獲得具有蒜氨酸酶活性的抗獨特型抗體，這種制備抗體酶的方法除采用噬菌體展示文庫技術(shù)外，還可以采用以下方法但不限于這些方法獲得，非免疫的VHH噬菌體展示文庫， 核糖體展示技術(shù)，酵母展示技術(shù)，小鼠雜交瘤技術(shù)等。
2.按照權(quán)利要求1所屬的方法，采用其他天然酶作為抗原獲得的抗體酶。
3.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶抑制活性的抗體，其特征在于SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列和核酸序列。
4.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶活性的抗體，其特征在于SEQID NO. 2所示的氨基酸序列和核酸序列。
5.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶活性的抗體，其特征在于SEQID NO. 3所示的氨基酸序列和核酸序列。
6.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶活性的抗體，其特征在于SEQID NO. 4所示的氨基酸序列和核酸序列。
7.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶活性的抗體，其特征在于SEQID NO. 5所示的氨基酸序列和核酸序列。
8.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶活性的抗體，與靶細(xì)胞或組織表面分子或配體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)或基因融合制備得到的衍生抗體。
9.按照權(quán)利要求1所屬的方法，獲得的具有蒜氨酸酶活性的抗體，進(jìn)行人源化改造或定點突變得到的突變型抗體。
10.權(quán)利要求4，5，6，7，8，9所屬抗體或組合物或修飾物，在治療包括但不限于下述疾病中的應(yīng)用各種腫瘤包括實體瘤、淋巴瘤、骨肉瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，感染性疾病、高血脂、動脈粥樣硬化、糖尿病以及過敏性疾病。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及到一種制備催化抗體或抗體酶的通用方法及所獲得的具有蒜氨酸酶活性的駱駝來源的單域抗體，及這些抗體的應(yīng)用。本發(fā)明利用重組的駱駝重鏈抗體可變區(qū)(簡稱VHH)優(yōu)先識別酶活性中心的特點，從蒜氨酸酶免疫的VHH噬菌體展示文庫中，篩選獲得具有蒜氨酸酶活性的抗獨特型抗體。該發(fā)明克服了現(xiàn)有抗體酶制備中存在的制備效率低、制備難度大和酶活性偏低等缺點，為獲得模擬天然酶活性的催化抗體提供了一種高效簡便的制備方法。該發(fā)明獲得的抗體酶可在腫瘤，感染性疾病、高血脂、動脈粥樣硬化、糖尿病以及過敏等疾病的治療中得到應(yīng)用。
文檔編號A61P37/08GK102372779SQ201110327419
公開日2012年3月14日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者李江偉 申請人:李江偉