專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低過(guò)敏原性重組免疫毒素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的免疫毒素是由靶向分子和毒性分子構(gòu)成的具有特異性殺傷靶細(xì)胞能力的復(fù)合分子。尤其是，本發(fā)明涉及的優(yōu)化的免疫毒素與未改造的免疫毒素相比，具有相對(duì)較低的過(guò)敏原性。本發(fā)明的免疫毒素具有在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位置進(jìn)行了有目的的改變使其在保持原有生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上過(guò)敏原性得到了降低。
背景技術(shù)：
免疫毒素是由靶向分子和毒素分子構(gòu)建的具有特異性殺傷靶細(xì)胞能力的雜合分子。靶向分子包括單克隆抗體以及具有重要生物功能的受體或配體；毒素分子通常是蛋白毒素，包括白喉毒素和綠膿桿菌外毒素等。以往的研究表明免疫毒素在治療免疫性疾病和腫瘤方面的具有較大的應(yīng)用潛能，但是仍存在較多問(wèn)題，比如在使用多個(gè)療程后會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該免疫毒素的抗體，從而降低了免疫毒素的有效治療濃度，甚至完全阻斷了免疫毒素的治療；同時(shí)還會(huì)發(fā)生一些非預(yù)期的免疫反應(yīng)造成對(duì)機(jī)體的損害。這些反應(yīng)大多與免疫毒素的外源性蛋白質(zhì)特性以及過(guò)敏原性有關(guān)，改變免疫毒素的過(guò)敏原性可以從一定程度上阻止這些反應(yīng)的發(fā)生，從而延長(zhǎng)免疫毒素的使用療程，提供免疫毒素治療的安全性。本發(fā)明旨在通過(guò)突變一個(gè)或多個(gè)能夠降低過(guò)敏原性的氨基酸而并不明顯降低其生物學(xué)活性，獲得具有更高安全性和更有效的免疫毒素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種低過(guò)敏原性的重組突變
免疫毒素。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
低過(guò)敏原性的重組突變免疫毒素，其特征在于它是由靶向分子和毒素分子構(gòu)成，其中抗原性表位的至少一個(gè)氨基酸被同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的另一氨基酸取代，同時(shí)B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位上至少一個(gè)區(qū)段中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被取代。 該突變的免疫毒素與未發(fā)生突變的相比，具有低過(guò)敏原性(allergenicity)或者無(wú)過(guò)敏原性。本發(fā)明低過(guò)敏原性的重組突變免疫毒素的一種獲得方法是鑒定免疫毒素上可能的B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位；設(shè)計(jì)人工改造的免疫毒素，使其B細(xì)胞表位或/和T細(xì)胞表位減少；產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)突變體衍生物；測(cè)試突變體衍生物的生物學(xué)活性和過(guò)敏原性；選擇生物學(xué)活性保留、過(guò)敏原性減少方面具有最佳均衡的突變體衍生物。根據(jù)如上所述的方法，制備過(guò)敏原性降低的免疫毒素的方法，包括以下步驟 (i)確定親本免疫毒素的氨基酸序列；
( )用任一方法鑒定免疫毒素氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞或B細(xì)胞表位，包括使用體外或/和計(jì)算機(jī)技術(shù)或/和生物學(xué)方法鑒定；
(iii)通過(guò)最初鑒定的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位中改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列構(gòu)建新的序列突變體，新突變體實(shí)質(zhì)上過(guò)敏原性得到了降低。
3
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明提供免疫毒素過(guò)敏原性得到了降低，將會(huì)提高免疫毒素治療的療效和安全性。


圖1為PEA過(guò)敏原性改造比較圖，上圖為改造前，下圖為改造后；
圖2為嵌合毒素的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果示意圖，顯示目的蛋白得到誘導(dǎo)表達(dá)；其中，泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道2來(lái)自未誘導(dǎo)宿主，泳道3飛來(lái)自誘導(dǎo)表達(dá)宿主；
圖3為突變蛋白1的誘導(dǎo)表達(dá)，顯示目的蛋白得到誘導(dǎo)表達(dá)，其中，泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)， 泳道2來(lái)自未誘導(dǎo)宿主，泳道3飛來(lái)自誘導(dǎo)表達(dá)宿主；
圖4為突變蛋白1的誘導(dǎo)表達(dá)，其中，泳道1為marker，泳道10為未誘導(dǎo)菌，泳道2、 為誘導(dǎo)表達(dá)宿主，顯示突變免疫毒素2的蛋白得到誘導(dǎo)表達(dá)，泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道2來(lái)自未誘導(dǎo)宿主，泳道3飛來(lái)自誘導(dǎo)表達(dá)宿主；
圖5為野生型和突變型免疫毒素的western blotting鑒定結(jié)果，顯示目的蛋白得到正確表達(dá)，能被特異的抗體所識(shí)別。泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；泳道2來(lái)自野生型免疫毒素；泳道 3、4分別來(lái)自突變免疫毒素蛋白1和2;
圖6為肥大細(xì)胞激發(fā)后組胺測(cè)定結(jié)果，以確定突變型的重組免疫毒素之過(guò)敏原性得到顯著降低。以PHA組胺釋放率為100% ；免疫毒素過(guò)敏原性突變體1和突變體2的組胺釋放率與未突變免疫毒素蛋白相比顯著降低，說(shuō)明其過(guò)敏原性得到顯著降低。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1過(guò)敏原性弱化的綠膿桿菌外毒素(PEA)
本發(fā)明提供了去除了一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位的PEA的突變形式。PEA是目前用于構(gòu)建免疫毒素的毒素部分應(yīng)用最多的分子。PEA由3個(gè)功能區(qū)構(gòu)成，功能區(qū)III可使延長(zhǎng)因子-2(EF-2)發(fā)生ADP核糖基化，使其不可逆失活，抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，PEA具有對(duì)多種培養(yǎng)細(xì)胞的毒性及動(dòng)物致死作用；最近的研究結(jié)果認(rèn)為PEA可以通過(guò)激活caspase級(jí)連反應(yīng)途徑使靶細(xì)胞凋亡。改構(gòu)的PE38失去非特異結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的功能，但被內(nèi)化后保留有完整的細(xì)胞毒性。由于PEA具有明確的毒理學(xué)機(jī)制，利用它構(gòu)建的免疫毒素在腫瘤和免疫性疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。另一方面，PEA過(guò)敏原性較強(qiáng)，在治療過(guò)程中易于產(chǎn)生中和抗體以及非預(yù)期的免疫反應(yīng)。本發(fā)明旨在降低PEA的過(guò)敏原性，從而增加使用周期，減少非預(yù)期反應(yīng)。1.確定在線(xiàn)分析軟件
使用在線(xiàn)軟件平臺(tái)包括 SYFPEITHI，MHCPred，BIMAS，MHC-THREAD，EpiPredict，HLA-DR4 binding, ProPred, RankPep, SVMHC, PREDEP, NetMHC, PREDICT, LpPep 等對(duì)氨基酸序列的過(guò)敏原性進(jìn)行分析。進(jìn)入在線(xiàn)分析平臺(tái)，確定HLA類(lèi)型及滑動(dòng)肽的長(zhǎng)度。輸入研究的目的序列，即可得到該氨基酸序列的過(guò)敏原性指數(shù)。2.對(duì)PEA過(guò)敏原性有重要貢獻(xiàn)的位點(diǎn)的確定過(guò)敏原性分析結(jié)果顯示，212-232、136-156、234-254、185-205、72-92、290-325 等區(qū)域的抗原性過(guò)敏原性值最高，過(guò)敏原性指數(shù)都在1000分以上，最高達(dá)到5760。因此，這些區(qū)域位點(diǎn)是下一步改造的重點(diǎn)。實(shí)施例2 PEA過(guò)敏原性改造
以過(guò)敏原性弱的氨基酸，置換過(guò)敏原性高的氨基酸。將置換后的氨基酸序列進(jìn)行過(guò)敏原性分析，使得新置換的序列過(guò)敏原性極顯著地降低。如此，逐步分析并得到新的PEA蛋白，篩選得到過(guò)敏原性顯著降低的PEA蛋白，其總的過(guò)敏原性較改造前蛋白極顯著地降低 (見(jiàn)圖1)。實(shí)施例3 PEA與靶向分子IgE的嵌合蛋白的表達(dá)與純化 1.構(gòu)建PEA與靶向分子IgE的嵌合基因
在基因水平將過(guò)敏原性已經(jīng)改造的PEA與IgE特異區(qū)段進(jìn)行嵌合，并優(yōu)化其序列，進(jìn)行序列合成。取合成質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)抗生素抗性篩選，PCR (Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))鑒別陽(yáng)性克隆，送生物公司進(jìn)行測(cè)序得到陽(yáng)性克隆。.嵌合基因的蛋白表達(dá)與純化
挑取帶有重組質(zhì)粒的表達(dá)宿主分別接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)2-12小時(shí)，然后加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并收集表達(dá)宿主細(xì)胞，加入上樣緩沖液處理后通過(guò)聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白，由圖2、可以看出，兩個(gè)突變的免疫毒素和未突變的免疫毒素蛋白均得到正確表達(dá)，表達(dá)量具有可采收性。采用超聲、裂解酶、化學(xué)藥劑等方法裂解宿主細(xì)胞，經(jīng)色譜柱法等方法進(jìn)行蛋白純化，之后經(jīng)透析、凍干、去內(nèi)毒素等等步驟后在低溫下保存目的蛋白。實(shí)施例4 純化產(chǎn)物的免疫印跡(Western blot)分析
純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移等方法將凝膠上的蛋白質(zhì)原位移電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯PVDF膜上，用含脫脂奶粉的PBS等的封閉T緩沖液室溫封閉后，加入兔抗PEA抗體，4°C孵育過(guò)夜；然后用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次；再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)，室溫孵育后，分別用PBST和PBS洗膜后2次，； 用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物液顯色，觀察結(jié)果見(jiàn)附圖3。由圖可以看出，目的蛋白在預(yù)期位置出現(xiàn)條帶，說(shuō)明我們的目的蛋白得到正確表達(dá)，能被相應(yīng)的抗體所識(shí)別(圖5)。實(shí)施例5 毒素蛋白突變前后的過(guò)敏原性比較
在含肥大細(xì)胞的培養(yǎng)皿中分別加入相應(yīng)濃度的陽(yáng)性對(duì)照(PHA)、陰性對(duì)照(PBS)和目的蛋白(未改造蛋白，突變體1，突變體2)各50-100微升，4 一 38°C反應(yīng)完后加入50-200微升冷的減式HBSS，沸水中煮10-30分鐘后終止反應(yīng)。取上清液測(cè)定其組胺含量。結(jié)果表明， 以PHA組胺釋放率為100%，突變蛋白突變體1的組胺釋放率為38. 6% ；突變體2的組胺釋放率為28. 7% ；未突變蛋白組胺釋放率為65. 9%。即兩個(gè)突變蛋白的組胺釋放率明顯降低，說(shuō)明二者的過(guò)敏原性得到明顯降低(圖6)。
權(quán)利要求
1.低過(guò)敏原性的重組突變免疫毒素，其特征在于它是由靶向分子和毒素分子構(gòu)成，其中抗原性表位的至少一個(gè)氨基酸被同源蛋白質(zhì)氨基酸序列中的相同位置不出現(xiàn)的另一氨基酸取代，同時(shí)B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位上至少一個(gè)區(qū)段中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被取代。
2.該突變的免疫毒素與未發(fā)生突變的相比，具有低過(guò)敏原性(allergenicity)或者無(wú)過(guò)敏原性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組突變免疫毒素，其特征在于它由以下步驟獲得a)鑒定重組免疫毒素中，與已知具有原性過(guò)敏原性的肽段比較或通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證，分析其可能的抗原性表位，即這些氨基酸區(qū)段包含至少一個(gè)B細(xì)胞表位或者一個(gè)T細(xì)胞表位；b)所述的至少一個(gè)區(qū)段中的至少一個(gè)氨基酸殘基被在所述天然存在的靶向分子或毒素分子的分類(lèi)學(xué)目?jī)?nèi)任何已知同源蛋白質(zhì)的相同位置不出現(xiàn)的另一氨基酸取代，而其基本生物學(xué)特性不發(fā)生明顯改變，其中突變的免疫毒素的過(guò)敏原性降低。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的重組免疫毒素，其特征在于通過(guò)細(xì)胞水平和/或動(dòng)物水平的鑒定， 突變的免疫毒素的過(guò)敏原性減少甚至不存在，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組免疫毒素，其特征在于其B細(xì)胞表位或者/和 T細(xì)胞表位無(wú)或減少。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組免疫毒素，其特征在于它的毒素分子具有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及其他對(duì)靶向細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組免疫毒素，其特征在于靶向分子是能與特定細(xì)胞或分子進(jìn)行特異性結(jié)合的分子、抗體片段或配體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組免疫毒素，其特征在于用作藥物或藥物組合物，并增強(qiáng)腫瘤、血液病、自身免疫性疾病疾病的治療效果，同時(shí)其毒副作用減少或無(wú)。
9.權(quán)利要求7中所述的藥物或藥物組合物，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組免疫毒素，任選與藥用或者藥物組合物中可接受的賦形劑和/或載體，并且與任選佐劑和/或偶聯(lián)劑組合。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了新的重組免疫毒素。該免疫毒素是由靶向分子和毒素分子構(gòu)成。在此基礎(chǔ)上分析了免疫毒素的抗原性位點(diǎn)，并通過(guò)突變等方法獲得抗原性降低的免疫毒素。其既保留了特異性導(dǎo)致特定細(xì)胞凋亡或抑制其生長(zhǎng)的能力，同時(shí)具有更低的過(guò)敏原性和副作用，增強(qiáng)了免疫毒素在治療等方面的療效與安全性。本發(fā)明確定了免疫毒素高免疫原性的T/B細(xì)胞表位，對(duì)高抗原性的T/B細(xì)胞表位進(jìn)行置換以降低免疫毒素的過(guò)敏原性；而且本方法為降低免疫毒素的過(guò)敏原性以及副作用提供了基礎(chǔ)，延長(zhǎng)了免疫毒素的使用周期，增強(qiáng)了免疫毒素在抗腫瘤、抗自身免疫和過(guò)敏性疾病等方面的療效和應(yīng)用前景，特別地降低了免疫毒素的毒副作用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102382192SQ20111032757
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者劉昌文, 鄒澤紅, 陶愛(ài)林 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院