專利名稱：重組膠原蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組膠原蛋白及其用途。
背景技術：
膠原蛋白又稱膠原，是支持和保護機體的結締組織的重要蛋白質組分，也是很多脊椎和無脊椎動物體內含量最豐富的結構蛋白質，它使骨、腱、軟骨和皮膚具有機械強度。 膠原蛋白是哺乳動物體內含量最多的蛋白質之一，約占機體總蛋白的20% -30%，主要存在于皮膚、骨骼、肌腱、軟組織等中。其中，皮膚細胞外基質中約70%-80%為膠原蛋白。膠原蛋白具有良好的生物相容性，因此，能夠應用于醫(yī)療或美容領域。傳統(tǒng)上，用牛、豬、羊等動物的骨或皮制成明膠(膠原蛋白)，作為食品、化妝品及其他輕工業(yè)產品的原材料。對于明膠等傳統(tǒng)的膠原蛋白而言，雖然其生物相容性好，但由于其透皮吸收性能不好，因此，一般認為膠原蛋白的美容效果還有待提高，特別是其對真皮層的滋養(yǎng)效果十分有限。

發(fā)明內容
本發(fā)明人針對上述問題進行了深入研究，發(fā)現由SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的重組膠原蛋白具有顯著優(yōu)于傳統(tǒng)膠原蛋白的透皮吸收性能，從而包含該重組膠原蛋白的敷料具有顯著優(yōu)異的醫(yī)療或美容效果。本發(fā)明人基于上述認識完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供1. 一種重組膠原蛋白(簡稱本發(fā)明的重組膠原蛋白)，其由SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列組成。2.編碼項1所述的重組膠原蛋白的核酸。3.導入了項2所述的核酸的載體。4.用項3的載體轉化宿主細胞而得到的轉化體。 5. 一種敷料，其包含膠原蛋白，優(yōu)選包含醫(yī)療或美容有效量的膠原蛋白。6.根據項5所述的敷料，其中，所述膠原蛋白是重組膠原蛋白。7.根據項6所述的敷料，其中，所述重組膠原蛋白由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。8.根據項5所述的敷料，其中，該敷料是膠原蛋白液。9.根據項8所述的敷料，其中，所述膠原蛋白液中包含防腐劑或具有防腐作用的非防腐劑類物質；優(yōu)選地，所述防腐劑為選自咪唑烷基脲、雙咪唑烷基脲、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯或尼泊金丁酯中的一種或幾種，重量優(yōu)選為所述膠原蛋白液總重量的十萬分之一至萬分之五；優(yōu)選地，所述非防腐劑類物質為選自丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇或辛二醇中的一種或幾種，重量優(yōu)選為所述膠原蛋白液總重量的千分之一至百分之八。10.根據項5 9中任一項所述的敷料，其用于醫(yī)療或美容。11. 一種面膜巾，其包含基體材料和浸漬于該基體材料中的敷料，其中，所述敷料是項5 10中任一項所述的敷料。12. —種面膜巾套件，其包含包裝容器，和基體材料，該基體材料置于所述包裝容器中，且其中浸漬有項5 10中任一項所述的敷料。13. 一種面膜巾套件，其包含包裝容器，和基體材料；其中，所述包裝容器中裝有項5 10中任一項所述的敷料，而所述基體材料的至少一部分或全部浸泡在所述敷料中。14.膠原蛋白在制備敷料中的用途。15.根據項14所述的用途，其中，所述膠原蛋白是重組膠原蛋白。16.根據項15所述的用途，其中，所述重組膠原蛋白由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。17.根據項14所述的用途，其中，該敷料是膠原蛋白液。18.根據項14 17中任一項所述的用途，其中，所述敷料用于醫(yī)療或美容。使用包含本發(fā)明的重組膠原蛋白的敷料能夠實現顯著優(yōu)于任何傳統(tǒng)膠原蛋白的醫(yī)療或美容效果。


圖1小鼠皮膚涂抹熒光標記明膠溶液4h后冰凍切片熒光顯微鏡觀察照片。圖2小鼠皮膚涂抹熒光標記明膠溶液后冰凍切片熒光顯微鏡觀察照片。圖3小鼠皮膚涂抹熒光標記類人膠原蛋白溶液4h后冰凍切片熒光顯微鏡觀察照片。圖4小鼠皮膚涂抹熒光標記類人膠原蛋白溶液他后冰凍切片熒光顯微鏡觀察照片。發(fā)明的
具體實施例方式本說明書中提及的科技術語具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義， 如有沖突以本說明書中的定義為準。本發(fā)日月^mm^icsa.M.mmwmm本發(fā)明的一個方面涉及一種重組膠原蛋白(簡稱本發(fā)明的重組膠原蛋白)，其由 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。SEQID NO1
HDPVVLQRRDffENPGVTQLNRHLAHAHPPFASD
HPMGAPGPAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAHGPA GAL GAH GPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPAGPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPLGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS AGA THGLVT CGL本發(fā)明的重組膠原蛋白是中國專利申請公開CN1371919A的權利要求1所述的類人膠原蛋白，其具有三鏈、三螺旋結構，其可以采用例如該中國專利申請公開CN1371919A 中公開的基因工程表達方法來制備。本發(fā)明的重組膠原蛋白是由中國西北大學的范代娣教授發(fā)明的，因此又稱作范氏重組膠原蛋白或范氏類人膠原蛋白(Fan's Human-like Collagen，FHLC)。此外，本發(fā)明還涉及編碼上述本發(fā)明的重組膠原蛋白的核酸。此外，本發(fā)明還涉及導入了上述核酸的載體。此外，本發(fā)明還涉及用上述載體轉化宿主細胞而得到的轉化體。上述核酸、載體、轉化體可以基于本發(fā)明的重組膠原蛋白的氨基酸序列來制造，其制造方法是本技術領域公知的，例如可以參見分子克隆實驗指南第三版[美]J.莎姆布魯克著黃培堂等譯科學出版社2002年9月。本發(fā)明的敷料在其他方面中，本發(fā)明涉及一種敷料(本發(fā)明的敷料)，其包含醫(yī)療或美容有效量的膠原蛋白。所述膠原蛋白優(yōu)選是重組膠原蛋白，更優(yōu)選是本發(fā)明的重組膠原蛋白(由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成)。此外，所述膠原蛋白還可以是中國專利申請公開號 CN1793177中的重組膠原蛋白、中國專利申請公開號CNlOl 148479中的重組類人膠原蛋白、 中國專利申請公開號CN101200718中的類人膠原蛋白、中國專利申請公開號CN102020712A 中的類人膠原蛋白、中國專利申請公開號CN102020716A中的基因重組人膠原蛋白融合肽、 中國專利申請公開號CN10206U96A中的溶水性VI人膠原蛋白多肽、中國專利申請公開號 CN102146135A中的重組類人膠原蛋白、中國專利申請公開號CN102146426A中的重組類人膠原蛋白等等。對本發(fā)明的敷料的類型沒有特殊限制，可以是各種類型的敷料，例如可以是一期敷料、二期敷料、吸收敷料、不沾敷料、封閉敷料、半封閉敷料、親水性敷料、疏水性敷料、可吸收性敷料、含藥敷料、液體敷料(例如溶液)、半液體敷料(例如糊)、固體敷料(例如粉) 等形式。關于敷料的類型、設計敷料的基本原則及各種敷料的制備方法可以參見《創(chuàng)傷修復基礎》付小兵等編著人民軍醫(yī)出版社1997年1月。而且，本發(fā)明的敷料中包含膠原蛋白，優(yōu)選包含醫(yī)療或美容有效量的膠原蛋白。所述醫(yī)療或美容有效量可以由本領域技術人員依據施用對象的體質、施用部位的面積、施用部位的表面狀況等適宜確定。作為包含的膠原蛋白的量(優(yōu)選醫(yī)療或美容有效量)，相對于敷料總量100重量份，膠原蛋白含量的下限可以是0. 0001重量份，優(yōu)選0. 001重量份，更優(yōu)選0. 01重量份，，更優(yōu)選0. 1重量份，更優(yōu)選1重量份，更優(yōu)選2重量份，更優(yōu)選3重量份， 更優(yōu)選4重量份，更優(yōu)選5重量份，更優(yōu)選10重量份；膠原蛋白含量的上限可以是100重量份，優(yōu)選99. 99重量份，更優(yōu)選99. 95重量份，，更優(yōu)選99. 9重量份，更優(yōu)選99. 5重量份，更優(yōu)選99重量份，更優(yōu)選95重量份，更優(yōu)選90重量份，更優(yōu)選80重量份，更優(yōu)選70重量份， 更優(yōu)選60重量份，更優(yōu)選50重量份，更優(yōu)選40重量份，更優(yōu)選30重量份，更優(yōu)選20重量份。這里，所述下限值與上限值之間可以任意組合。本發(fā)明的敷料的一個優(yōu)選形式為膠原蛋白液(本發(fā)明的膠原蛋白液)。所述膠原蛋白液是將膠原蛋白分散于分散介質中而得到。該膠原蛋白液可以是均質的，也可以是非均質的，但優(yōu)選是均質的。更優(yōu)選地，該膠原蛋白液是溶液或溶膠。作為分散介質，可以列舉出無機溶劑(例如水)、有機溶劑(例如乙醇)、無機-有機混合溶劑(例如水-乙醇混合溶劑)等，優(yōu)選可以使用用于溶解蛋白質的緩沖液，這些緩沖液及其配制方法是本領域技術人員公知的。優(yōu)選地，所述膠原蛋白液中包含防腐劑或具有防腐作用的非防腐類物質，所述具有防腐作用的非防腐劑類物質是指具有抑制微生物的生長、繁殖作用的非防腐劑類物質。 優(yōu)選地，所述防腐劑為選自咪唑烷基脲、雙咪唑烷基脲、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯、 尼泊金乙酯、尼泊金丙酯或尼泊金丁酯中的一種或幾種，其含量優(yōu)選為所述膠原蛋白液總重量的十萬分之一至萬分之五。優(yōu)選地，所述具有防腐作用的非防腐劑類物質為選自丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇或辛二醇中的一種或幾種，其含量優(yōu)選為所述膠原蛋白液總重量的千分之一至百分之八。此外，所述膠原蛋白液中使用的膠原蛋白優(yōu)選為本發(fā)明的重組膠原蛋白(由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成)，當所使用的膠原蛋白為本發(fā)明的重組膠原蛋白(由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成)時，所述膠原蛋白液也稱作范氏類人膠原蛋白液(Fan's Human-like Collagen Solution，FHLCS)。本發(fā)明的敷料優(yōu)選用于醫(yī)療或美容。當用于醫(yī)療或美容時，本發(fā)明的敷料中還可以包含常規(guī)的醫(yī)療或美容材料中可包含的各種輔助成分。此外，本發(fā)明還提供膠原蛋白、優(yōu)選重組膠原蛋白、更優(yōu)選本發(fā)明的重組膠原蛋白在制備用于醫(yī)療或美容的敷料中的用途。此外，本發(fā)明還提供一種面膜巾(本發(fā)明的面膜巾)，其包含基體材料和浸漬于該基體材料中的敷料。面膜巾又稱濕布型面膜，其是在基體材料中浸漬敷料而得到的。本發(fā)明中，所述敷料優(yōu)選為本發(fā)明的敷料，更優(yōu)選為所述膠原蛋白液?；w材料是指用于保持所述敷料的承載體。本發(fā)明中對基體材料沒有特殊限制，本領域技術人員可以根據需要適宜選擇。作為基體材料，可以列舉出紙、無紡布、人造絲巾、真絲巾等。對于基體材料中敷料的浸漬量沒有特殊限制，優(yōu)選為飽和量(浸透)。此外，可以將本發(fā)明的面膜巾裝入容器內而制成面膜巾套件。因此，本發(fā)明還提供一種面膜巾套件，其包含包裝容器和基體材料，所述基體材料置于所述包裝容器中，且其中浸漬有本發(fā)明的敷料。作為另一實施方式，本發(fā)明還提供一種面膜巾套件，其包含包裝容器和基體材料，其中，所述包裝容器中本發(fā)明的敷料，而所述基體材料的至少一部分或全部浸泡在所述敷料中。對所述包裝容器沒有特殊限制，可以使用本領域常規(guī)使用的任何包裝容器。作為所述包裝容器，可以列舉出例如鋁箔、聚乙烯膜、聚丙烯膜等。此外，優(yōu)選所述包裝容器是密封的。本發(fā)明的面膜巾或面膜巾套件優(yōu)選用于醫(yī)療或美容。當用于醫(yī)療或美容時，本發(fā)明的面膜巾或面膜巾套件中還可以包含常規(guī)的醫(yī)療或美容器械中可包含的各種輔助成分。 此外，本發(fā)明還提供膠原蛋白、優(yōu)選重組膠原蛋白、更優(yōu)選本發(fā)明的重組膠原蛋白在制備用于醫(yī)療或美容的面膜巾或面膜巾套件中的用途。
實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。實施例1重組膠原蛋白的制備按中國專利申請公開CN1371919A所述方法制備了類人膠原蛋白(由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成)，確認其分子量為約90kD。實施例2重組膠原蛋白的透皮吸收行為研究實驗動物及分組8周齡昆明小白鼠(體重20 30g) 20只，雌雄不限。將實驗用小鼠隨機分為兩組，范氏類人膠原蛋白組10只，明膠組10只。試劑配制
準確稱取0. 3g范氏類人膠原蛋白于燒杯中，向其中加入超純水直至30ml，并用玻璃棒充分攪拌使蛋白完全溶解。再準確稱取15mgFITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)，溶于30ml的pH9. 0碳酸緩沖液中，用玻璃棒攪拌使其充分溶解(濃度為 0. 5mg/ml)。將30ml溶解好的FITC溶液加入到上述的30ml溶解好的范氏類人膠原蛋白溶液中，使其充分混勻，4°C避光反應Mh。反應結束后倒入截留分子量為8000-10000的透析袋中，將透析袋固定于大燒杯中，在大燒杯中加入PBS緩沖液直至浸沒透析袋內的溶液。將大燒杯放在磁力攪拌器上開始攪拌透析，透析開始后每隔30min更換一次緩沖液，透析直至液相色譜檢測未交聯上的FITC全部去除。將透析好的溶液裝入玻璃瓶中低溫避光保存?zhèn)溆茫藭r被標記的范氏類人膠原蛋白的濃度以范氏類人膠原蛋白計為約5g/100ml。另一方面，準確稱取0. 3g明膠于燒杯中，向其中加入超純水30ml。將燒杯用保鮮膜封口放入微波爐中低火加熱4分鐘使明膠充分溶解。同范氏類人膠原蛋白的標記方法配制0. 5mg/ml的FITC溶液30ml，將該30ml FITC溶液加入到上述的30ml明膠溶液中使其充分混勻，4°C避光反應Mh。反應結束后倒入截留分子量為8000-10000的透析袋中，透析方法同范氏類人膠原蛋白。將透析好的溶液裝入玻璃瓶中低溫避光保存?zhèn)溆?。此被標記的明膠的濃度以明膠計為約5g/100ml。實驗方法將已經在實驗室適應飼養(yǎng)環(huán)境的小鼠提前一天用脫毛劑脫毛備皮。實驗前使用沐浴露或洗面奶對備皮處進行皮膚清潔并用毛巾擦干，將上述的標記完成的類人膠原蛋白溶液和明膠溶液作為敷料，分別用醫(yī)用棉簽涂抹在備皮處，涂抹完成以后正常飼養(yǎng)，于4h、8h 時將各組小鼠5只用清水將備皮處皮膚清洗干凈，清洗完畢后處死，將涂抹類人膠原蛋白溶液和明膠溶液的皮膚迅速用手術剪剪下，包埋劑低溫包埋進行冰凍切片，冰凍切片完成以后使用熒光顯微鏡在紫外光激發(fā)下進行觀察，并拍照做實驗記錄。實驗結果分別如圖1、 2、3、4所示。由上述實驗結果可知，傳統(tǒng)的膠原蛋白基本上不能進入真皮層；與此相對，本發(fā)明的重組膠原蛋白具有良好的透皮吸收性能，涂抹他后其大部分(約80%以上)進入真皮層。實施例3膠原蛋白敷料制備例膠原蛋白敷料1 取無紡布一片04cm*21cm)，外觀要求無污漬、無破洞、無撕裂。 取未封口的醫(yī)用鋁箔包裝袋一個，將上述無紡布對折兩次，然后裝入該醫(yī)用鋁箔包裝袋中。 再向其中灌入適當量的5g/100ml的范氏類人膠原蛋白液，使得該無紡布浸透該范氏類人膠原蛋白液，并有少量剩余，使得膠原蛋白液層在無紡布層的邊緣處互相連通。然后，將所述醫(yī)用鋁箔包裝袋封口，即得到膠原蛋白面膜巾。膠原蛋白敷料2 將5g/100ml的前述類人膠原蛋白液(溶劑為高純水)分裝于小瓶，或將上述膠原蛋白液與常規(guī)量的透明質酸(鈉)、甘油、丁二醇、戊二醇等復配后分裝， 用于涂敷、導入、按摩美容等。膠原蛋白敷料3 將5g/100ml的前述膠原蛋白液(溶劑為高純水)與常規(guī)量的硬脂酸單甘脂、失水山梨醇月桂酸酯、鯨蠟硬脂醇聚醚等乳化劑類物質，辛葵酸三甘油酯、異構十六烷烴、肉豆蔻酸異丙酯等油脂類物質混合，并采用乳化機或均質機進行乳化，得到穩(wěn)定的膏霜或乳液，用于涂敷、導入、按摩美容等。
8
還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用于其它技術方案；并且，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術方案的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合，來構成其它技術方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案，并且這些技術方案相當于記載在本說明書中。以上通過具體實施方式
和實施例對本發(fā)明進行了說明，但本領域技術人員應該理解的是，這些并非意圖對本發(fā)明的范圍進行限定，本發(fā)明的范圍應由權利要求書確定。工業(yè)實用性本發(fā)明的重組膠原蛋白敷料能夠提供具有顯著優(yōu)于傳統(tǒng)膠原蛋白敷料的醫(yī)療或美容效果的醫(yī)療或美容產品。
權利要求
1.一種重組膠原蛋白，其由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。1
2.編碼權利要求1所述的重組膠原蛋白的核酸。
3.導入了權利要求2所述的核酸的載體。
4.用權利要求3的載體轉化宿主細胞而得到的轉化體。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組膠原蛋白，其由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明還涉及包含該重組膠原蛋白的敷料，特別是面膜巾。
文檔編號A61K8/65GK102351954SQ20111032787
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權日2011年10月26日
發(fā)明者嚴建亞, 張兵, 范代娣, 馬曉軒 申請人:陜西巨子生物技術有限公司