專利名稱：一種用于治療或預防豬感染性疾病的疫苗佐劑組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，特別是指一種含有黃芪多糖及其聚合物的用于治療或預防豬感染性疾病的疫苗佐劑組合物。
背景技術：
疫苗佐劑被用于達成二個目的:其減緩抗原從注射部位釋出，且其刺激免疫系統(tǒng)。傳統(tǒng)疫苗通常由滅活或被殺死或經(jīng)修飾的活致病微生物的粗制備物組成。與這些致病微生物的培養(yǎng)物相關的雜質(zhì)可作為增強免疫應答的佐劑。然而加入佐劑可容許使用較小劑量的抗原來刺激類似的免疫應答，從而減少疫苗的制造成本。因此，當將疫苗與佐劑組合時可顯著增加某些可注射疫苗的效力。在選擇疫苗佐劑時必須考慮許多因素。疫苗佐劑應該以有效方式使抗原的釋出和吸收速率緩慢，且對宿主的毒性、變應原性、刺激及其它不想要的作用最小。為了使人滿意，佐劑應為非殺病毒性、可生物降解、可持續(xù)產(chǎn)生高水平的免疫力、能刺激交叉保護作用、可與多種抗原兼容、在多種物種中有效、對宿主無毒且安全(如:無注射部位反應)。其它期望的佐劑特征為可微量給藥、劑量節(jié)省、具有優(yōu)良的貨架穩(wěn)定性、可承受干燥、可制成不含油、可作為固體或液體存在、為等張性、容易制造且其制造并不昂貴。最后，高度期望能夠根據(jù)疫苗接種方案的需要而將佐 劑配置成誘導體液或細胞免疫應答或二者兼有。然而，可符合上述條件的佐劑的數(shù)量有限。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于治療或預防豬感染性疾病的疫苗佐劑組合物，其特征在于，含有以下組分:黃芪提取物、聚合物和抗原成分。優(yōu)選地,本發(fā)明所述黃芪提取物含有大于70% Wt的黃芪多糖；更優(yōu)選地,含有大于90% wt的黃芪多糖優(yōu)選地，本發(fā)明所述黃芪提取物中黃芪多糖量為0.1 100mg/ml ;更優(yōu)選地，所述黃芪提取物中黃芪多糖量為I 10mg/ml ;最優(yōu)選地，所述黃芪提取物中黃芪多糖量為3 4mg/mlο優(yōu)選地，本發(fā)明所述聚合物為聚丙烯酸；更優(yōu)選地，所述聚合物為商品名為卡波姆(Carbomer)的聚丙烯酸；更優(yōu)選為 Carbomer940、Carbomer974P、Carbomer934P 和Carbomer971P,最優(yōu)選為 Carbomer934P。本發(fā)明所述聚合物的量通常為0.001mg/ml 50mg/ml,優(yōu)選0.1 10mg/ml,更優(yōu)選 0.1 5mg/ml,最優(yōu)選 lmg/ml 3mg/ml。本發(fā)明的所述疫苗佐劑與以下疫苗抗原配合使用:細菌性抗原或病毒性抗原；優(yōu)選抗原豬細菌性抗原和病毒性抗原；最優(yōu)選豬圓環(huán)病毒抗原或支原體抗原。本發(fā)明的另一方面為提供上述疫苗佐劑組合物的制備方法，包括如下步驟:A)在緩沖液中制備抗原成分的組合物；
B)將所述的黃芪多糖黃芪提取物加入步驟A的組合物中；C)將所述的聚合物加入步驟B的組合物中。本發(fā)明的另一目的在于提供一種疫苗佐劑組合物，其特征在于，還包括環(huán)糊精衍生物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的環(huán)糊精衍生物為公開于CN 1175264A的環(huán)糊精衍生物SL-O),其含量為0.1 10mg/ml,更優(yōu)選0.1 5mg/ml,最優(yōu)選2mg/ml。同樣地，上述含環(huán)糊精衍生物的疫苗佐劑可以與以下疫苗抗原配合使用:細菌性抗原或病毒性抗原；優(yōu)選抗原豬細菌性抗原和病毒性抗原，最優(yōu)選豬圓環(huán)病毒抗原或支原體抗原。本發(fā)明的另一方面為提供上述環(huán)糊精衍生物如SL-CD的疫苗佐劑組合物的制備方法，包括如下步驟:A)在緩沖液中制備抗原成分的組合物；B)將所述的黃芪提取物加入步驟A的組合物中；C)將所述聚合物加入步驟B的組合物中； D)將所述的環(huán)糊精衍生物加入步驟C的組合物中。由上可以看出，本發(fā)明的用于治療或預防豬感染性疾病的疫苗佐劑組合物至少有以下優(yōu)點:1.可以提高疫 苗免疫保護力，沒有副作用:通過本發(fā)明后續(xù)實施例可以看出，本發(fā)明的疫苗佐劑可以大幅度提高疫苗的免疫效力，如至少可以降低到原抗原一般的用量即可達到原有免疫效力；另一方面，通過多種劑量的疫苗佐劑的試驗證明，本發(fā)明的疫苗佐劑沒有明顯的副作用，特別是相對于常用的油相佐劑，副作用明顯減少。2.本發(fā)明的疫苗佐劑配制簡單，直接混勻即可；3.通過使用本發(fā)明的疫苗佐劑，可以大大降低疫苗中抗原的使用量，從而降低成本。
具體實施例方式術語:黃芪提取物:豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的提取物，主要成分為黃芪甲苷和黃芪多糖。SL-⑶:按照中國專利公開號CN1175264A實施例6制備的環(huán)糊精衍生物，被至少一個但不多于N-1個至少有8個碳原子的線性烴鏈基團和至少一個但不多于N-1個硫酸鹽基團所取代，其中所述的線性烴鏈基團選自烷基酰基和烯基?；渲兴龅木€性烴鏈基團和硫酸鹽基團的合并總數(shù)不超過N，進一步的是其中N是從中得到環(huán)糊精衍生物的環(huán)糊精
的輕基數(shù)?！翱乖被颉懊庖咴笔侵溉魏未碳っ庖邞鸬奈镔|(zhì)。此名詞包括被殺死的、滅活的、減毒的或經(jīng)修飾的活細菌、病毒或寄生蟲。術語抗原亦包括個別的或其任何組合的多核苷酸、多肽、重組蛋白質(zhì)、合成的肽、蛋白質(zhì)提取物、細胞(包括腫瘤細胞)、組織、多糖、或脂質(zhì)、或其片段。術語抗原亦包括抗體，諸如抗受試者遺傳型抗體或其片段，以及可模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽模擬位
“菌苗”是指可作為疫苗或免疫原性組合物的組分使用的一種或多種被殺死的細菌的懸浮液。佐劑通常被用于達到兩種目的:減緩抗原從注射部位的釋放以及刺激免疫系統(tǒng)?！熬彌_液”是指防止另一種化學物質(zhì)的濃度變化的化學系統(tǒng)是指防止另一種化學物質(zhì)的濃度變化的化學系統(tǒng)，如:質(zhì)子供體及受體系統(tǒng)可作為防止氫離子濃度(PH)明顯改變的緩沖液。另一緩沖液例子為含有弱酸及其鹽(共軛堿)或弱堿及其鹽(共軛酸)的混合物的溶液“抗體”是指可因為對抗原的免疫應答而與特異抗原結合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”及“可變”區(qū)的“輕”及“重”多肽鏈所組成的血清蛋白質(zhì)，且根據(jù)該恒定區(qū)的組成而區(qū)分為數(shù)類(如:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)“TCID50”是指“組織培養(yǎng)感染劑量”且定義為感染50%指定批次的經(jīng)接種的細胞培養(yǎng)物時所需要的病毒稀釋量?？墒褂枚喾N方法來計算TCID50，包括本說明書全文中所使用的斯皮爾曼--伯法(Spearman-Karber method)。本發(fā)明實施例中所選用的豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)毒株為PCV2b毒株SH株，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏號為CGMCC N0.23890。此毒株在中國專利公開CN101240264公開。本發(fā)明的滅活劑為甲醛溶液，其使用的終濃度為0.1 0.3% (v/v)，滅活時間為24 48h。優(yōu)選地，本發(fā)明實施例中使用了終濃度0.2%體積的甲醛滅活PCV2 SH株，滅活時間為18小時。本發(fā)明實施例 中使用了密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量為300Kda)作3倍濃縮，如后續(xù)實施例證明，該方法和濃度可以使最后獲得二聯(lián)疫苗獲得較佳的疫苗效果；本發(fā)明還可以使用其他的超濾方法，如纖維素超濾法和多次超濾等方法。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1、含豬圓環(huán)病毒抗原的疫苗佐劑組合物及其疫苗1.豬圓環(huán)病毒抗原的制備1.1生產(chǎn)用菌(毒)種的制備豬圓環(huán)病毒2型SH的制備:將毒種用MEM培養(yǎng)基(GibcO ，Invitrogen公司)作10倍稀釋，按5%體積接種于PK15 (ATCC，保藏號為CCL-33)細胞培養(yǎng)，37°C吸附30分鐘，加入含4%犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細胞維持液，37°C培養(yǎng)4日，凍融2 3次，收獲病毒，病毒滴度為106_ 5TCID5(l/ml。1.2病毒液或菌液的培養(yǎng)制備豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的制備:用轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)法。將長滿單層的PK15細胞(購自ATCC)，倒去細胞培養(yǎng)液，將毒種液按0.1 0.2TCID50/個細胞的接種量接種于PK15細胞上，輕輕旋轉(zhuǎn)細胞瓶2周，37°C吸附30分鐘，加入細胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)(10 12轉(zhuǎn)/小時)培養(yǎng)。每日觀察I 2次，細胞生長良好，37°C培養(yǎng)4日收獲細胞和細胞液，凍融3次，置-20°C以下保存收獲病毒，病毒滴度為106_5TCID5tlAiL
1.3病毒液或菌液的處理豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的處理:將病毒液用中空纖維濾柱(孔徑ΙΟμπι與
0.45 μ m)過濾，除去細胞碎片。1.4病毒液或菌液的滅活豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的滅活:將檢驗合格的步驟1.3處理的病毒液加入甲醛溶液。滅活，使甲醛溶液的終濃度為0.2% (V/V)，隨即充分搖勻升溫，當溫度升至37°C時開始計時，保持18小時滅活完畢，加入0.2% (w/v)的焦亞硫酸鈉終止滅活，置2 8°C保存2.黃芪提取物的制備將黃芪藥材粉碎成最粗粉，加10倍量水浸泡I小時后，回流提取3次，加水量依次為10倍、8倍、6倍，提取時間依次為2小時、1.5小時、1.5小時，合并3次提取液，冷卻至室溫，高速離心機離心，8000轉(zhuǎn)每分鐘離心20分鐘，上清液濃縮至相對密度為1.15
1.20，加無水乙醇至含醇量為70%，4°C靜置12小時，棄去上清液，沉淀加水溶解，使?jié)舛瘸蒊g生藥/ml的溶液，加無水乙醇至含醇量為35%，高速離心機離心，8000轉(zhuǎn)每分鐘離心20分鐘，取上清液，加無水乙醇至含醇量為70%，4°C靜置12小時，棄去上清液，沉淀依次用80%、95%、無水乙醇洗滌 脫水后，80°C真空干燥12小時，即得黃芪提取物，用硫酸-苯酚比色法測得黃芪多糖的含量以葡萄糖計為90% wt，用高效液相色譜法測定其含黃芪甲苷為0.01 % Wt03.免疫佐劑組合物的制備3.1配制儲備液3.1.UPBS 緩沖溶液的配制；0.0lM pH = 7.2 PBS 2000mla:先配制甲液:0.2M 的 Na2HPO4 緩沖溶液 IOOOmlNa2HPO4.12H20 71.625g，注射用水1000ml，于IOOOml容量瓶中定容b:再配制乙液:0.2M 的 NaH2PO4 緩沖溶液 IOOOmlNaH2PO4.2H20 31.202g,注射用水1000ml，在IOOOml容量瓶中定容c:甲液:乙液=72: 28 (體積);d:甲液和乙液混合，并用注射用水將其20倍體積稀釋后，按終濃度0.85%加入NaCL即得0.0lM pH = 7.2的PBS。分裝后，121 °C 30min高壓滅菌。室溫放置。3.1.2黃芪提取物溶液的制備將步驟2制備黃芪提取物溶解在去離子水中，制成250mg/ml (質(zhì)量/體積)的儲備溶液112°C 30min高壓滅菌，4°C保存3.1.3卡波姆溶液的制備將卡波姆Carbomer 934P (青島天力源生物科技有限公司)溶解在去離子水中，制成25mg/ml的儲備溶液12°C 30min高壓滅菌，4°C保存3.1.4 SL-CD 溶液的制備按照中國專利公開號CN1175264實施例6制備SL-⑶，用去離子水，制成濃度為0.75%的儲備溶液12°C 30min高壓滅菌，4°C保存。3.2含本發(fā)明的疫苗佐劑的豬圓環(huán)病毒疫苗組合物的制備:使用上述配制的黃芪提取物溶液、卡波姆溶液、SL-CD溶液，按照下面的方法配制豬圓環(huán)病毒疫苗組合物:A)在IOmlPBS液中加入上述豬圓環(huán)病毒抗原液；B)將黃芪提取物溶液加入A步驟溶液中；C)將卡波姆溶液加入B步驟溶液中；D)將SL-⑶溶液加入到C步驟溶液中；E)補加PBS液至最終體積50ml。其中，可按下表省略加入SL-⑶溶液等步驟，即省略步驟D，按下述方法配置豬圓環(huán)病毒疫苗組合物:A)在IOmlPBS液中加入上述豬圓環(huán)病毒抗原液；B)將黃芪提取物溶液加入A步驟溶液中；
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C)將卡波姆溶液加入B步驟溶液中；D)補加PBS液至最終體積50ml?；虬聪卤砼浞绞÷云渌煞?，配置豬圓環(huán)病毒疫苗組合物:按下面表I的配方制備試驗例1-9的含本發(fā)明疫苗佐劑的豬圓環(huán)病毒疫苗，其中含有上述實施例1中所述的疫苗佐劑組合物:表1、豬圓環(huán)病毒疫苗組合物配方組成
權利要求
1.種用于治療或預防豬感染性疾病的疫苗佐劑組合物，其特征在于，含有以下組分:黃芪提取物、聚合物和抗原成分。
2.據(jù)權利要求1的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述黃芪提取物含有大于70%wt的黃芪多糖。
3.據(jù)權利要求1的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述黃芪提取物含有大于90%wt的黃芪多糖。
4.據(jù)權利要求1的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述黃芪多糖量為0.1 IOOmg/ml ο
5.據(jù)權利要求1的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述聚丙烯酸為Carbomer934P。
6.據(jù)權利要求1的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述聚合物的量為0.001mg/ml 50mg/ml。
7.據(jù)權利要求1-6任意一項所述的的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述組合物還含有環(huán)糊精衍生物，所述環(huán)糊精為SL-⑶，含量為0.1 10mg/ml。
8.種如權利要求1-6任意一項所述的疫苗佐劑組合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: A)在緩沖液中制備抗原成分的組合物； B)將所述的黃芪提取物加入步驟A的組合物中； C)將所述聚合物加入步驟B的組合物中。
9.種如權利要求7所述的疫苗佐劑組合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: A)在緩沖液中制備抗原成分的組合物； B)將所述的黃芪提取物加入步驟A的組合物中； C)將所述聚合物加入步驟B的組合物中； D)將所述的環(huán)糊精衍生物加入步驟C的組合物中。
10.據(jù)權利要求1-7任意一項的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述疫苗佐劑與以下疫苗抗原配合使用:細菌性抗原或病毒性抗原。
11.據(jù)權利要求1-7任意一項的疫苗佐劑組合物，其特征在于，所述疫苗佐劑與以下疫苗抗原配合使用:豬圓環(huán)病毒抗原或豬肺炎支原體抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療或預防豬感染性疾病的疫苗佐劑組合物，含有以下組分黃芪提取物、聚合物和抗原成分；或含有黃芪提取物、聚合物、環(huán)糊精和抗原成分。本發(fā)明的所述疫苗佐劑可以與豬圓環(huán)病毒抗原或豬肺炎支原體抗原聯(lián)合使用，可以大幅度提高疫苗的免疫效力，如至少可以降低到原抗原一般的用量即可達到原有免疫效力；另一方面，通過多種劑量的疫苗佐劑的試驗證明，本發(fā)明的疫苗佐劑沒有明顯的副作用，特別是相對于常用的油相佐劑，副作用明顯減少。
文檔編號A61P31/04GK103083658SQ20111033263
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權日2011年10月27日
發(fā)明者張許科, 孫進忠 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司