專利名稱：一種寡肽a及其抗菌應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽及其應(yīng)用，尤其涉及一種寡肽A及其抗菌應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，因抗菌藥物的泛濫使用，產(chǎn)生了一些新的問題，如出現(xiàn)的相應(yīng)耐藥性致病株，即產(chǎn)生了細(xì)菌的耐藥性，而致病菌的耐藥性已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人類的健康和疾病臨床治療。因此，尋找全新類型的抗菌藥物已成為解決耐藥性問題又一對(duì)策。抗菌肽是指分布于生物體內(nèi)具有抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子多肽，根據(jù)肽中氨基酸的數(shù)量的不同，一般將由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽等，一直到九肽；也有文獻(xiàn)把由2 10個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽；或稱為短肽。與抗生素不同，抗菌肽是特定基因編碼的產(chǎn)物，它通過破壞細(xì)胞膜通透性使細(xì)胞內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此它不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性， 因而避免了超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生。近年來，肽在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視。隨著醫(yī)學(xué)及生化技術(shù)的發(fā)展，多肽類藥物將成為21世紀(jì)重要的診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)防和治療藥。因此，針對(duì)日益突出的細(xì)菌的耐藥性問題，開發(fā)具有顯著抑菌活性的寡肽即多肽藥物，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種寡肽A及其抗菌應(yīng)用。本發(fā)明所述的寡肽A，其特征在于寡肽A是SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，具體是:Gly Lys Ala Phe Val Lys Lys0本發(fā)明所述寡肽A在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的寡肽A具有顯著的抑菌功能，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無毒性。功能實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明所述寡肽A抗菌譜廣，無論是對(duì)革蘭氏陽性菌、還是對(duì)革蘭氏陰性菌，都具有明顯地抑制作用，而且對(duì)真菌的抑制作用也很顯著。提示其在抗細(xì)菌藥物開發(fā)和應(yīng)用方面有重要價(jià)值。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明的寡肽A對(duì)細(xì)菌的抑制作用在IOmin之內(nèi)就開始發(fā)揮，20min后抑制率即可達(dá)75%以上，40min后就可達(dá)到90%以上。本發(fā)明的寡肽A不僅抗菌作用強(qiáng)，而且穩(wěn)定性好，在100°C煮沸IOmin后，不僅活性還能保持80%，而且在酸、堿的環(huán)境中還能發(fā)揮其良好的抑菌作用。本發(fā)明提供的寡肽A合成方便，且不需任何修飾連接即具有抑菌功能，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無毒性，為抗細(xì)菌藥物的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。鑒于上述寡肽A的性質(zhì)和功能，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以利用分子生物學(xué)技術(shù)， 根據(jù)氨基酸與密碼子的對(duì)應(yīng)關(guān)系反推出核酸序列作為功能基因，用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物以表達(dá)功能蛋白，以進(jìn)一步用于藥物的開發(fā)和臨床治療。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明所述寡肽A的設(shè)計(jì)與合成1、依據(jù)目前國際主要抗菌肽數(shù)據(jù)庫(http //www. imtech. res. in/raghava/ antibp/ ；http//aps.unmc. edu/AP/main. php ；http//www. bbcm. univ. trieste. it/ ； http://penbase. immunaqua. com/)中登陸的抗菌肽的序列，分析其一級(jí)結(jié)構(gòu)與活性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，設(shè)計(jì)人工寡肽序列。2、利用蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫http://WWW. expasy. org/分析已知活性的多肽序列與設(shè)計(jì)的寡肽序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似度，結(jié)合其它物理化學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)進(jìn)行設(shè)計(jì)序列的修正。3、將設(shè)計(jì)的人工寡肽序列送至生物公司合成或利用自動(dòng)多肽合成儀合成序列。 HPLC檢測(cè)純度要大于96%，同時(shí)通過質(zhì)譜檢測(cè)確定多肽合成質(zhì)量。樣品以凍干狀態(tài)保存。4、對(duì)合成后的寡肽進(jìn)行抑菌功能檢測(cè)篩選。5、通過功能檢測(cè)，最終獲得具有抑菌功能的寡肽序列，命名為寡肽A，其氨基酸序列具體是:61y Lys Ala Phe Val Lys Lys0實(shí)施例2利用液體生長抑制法檢測(cè)本發(fā)明所述寡肽A的抑菌活性2. 1材料、試劑1)本發(fā)明所述寡肽A由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，氨芐青霉素 (Amp)為solarbio公司產(chǎn)品，一次性濾器，為美國PALL公司產(chǎn)品，其它藥品試劑為國產(chǎn)分析純。2)選用革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subti lis (Ehrenberg) Cohn)、 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、藤求菌(Sarcina ureae)、蘇云金芽子包桿菌(Bacillus thuringiensis) > 巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)；革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)、 弧菌(Vibrio)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、變形桿菌(Proteus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)；真菌
病鐮刀菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜類炭疽病菌 (Colietetrichum lagenarium)、蘋果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)進(jìn)行測(cè)試。
上述菌株均購自生物公司。3)封閉液0. 4% BSA(w/v),0. 02%冰醋酸，配制后過濾除菌。4) PB 液體培養(yǎng)基(PH7. 4-7. 6)胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化鈉(NaCl)5g/L。2. 2 實(shí)驗(yàn)1)向無菌96孔酶標(biāo)板的孔中加入200 μ L封閉液，室溫封閉24h。2)用PB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)上述各種細(xì)菌，轉(zhuǎn)培養(yǎng)使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期，然后用PB培養(yǎng)基調(diào)整菌液0D_約為0. 002 ；備用。
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3)酶標(biāo)板棄去封閉液，每孔加90 μ L步驟幻所述菌液，再加入用10 μ L無菌水配好的各種濃度梯度(濃度范圍lmg/mL 80mg/mL)的本發(fā)明所述寡肽Α。陰性對(duì)照為90 μ L 菌液+10 μ L無菌水；陽性對(duì)照為90 μ 1菌液+10 μ L濃度為0. 25mg/mL氨芐青霉素溶液(終濃度為 0. 025mg/mL,約 62 μ M)。4)將加好菌液和藥品的酶標(biāo)板置于搖床，IOOrpm恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后 0h、3h、12h、15h、Mh、36h，用 BIOTEK ELX800 酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的 630nm 吸光值(OD63tl)。5)利用SigmaplotlO和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，本發(fā)明的寡肽A對(duì)無論是對(duì)G+菌、還是對(duì)G_菌都能被它很好地抑制，而且對(duì)真菌的抑制作用也不錯(cuò)；15mg/mL 60mg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度越大抑菌效果越明顯。 提示其在抗細(xì)菌藥物開發(fā)和應(yīng)用方面有重要價(jià)值。實(shí)施例3以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。質(zhì)量濃度為40mg/mL的本發(fā)明寡肽A，分別在作用大腸桿菌(Escherichia coli) IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min 禾口 90min 后涂板。大腸桿菌抑制曲線顯示本發(fā)明的寡肽A對(duì)細(xì)菌的抑制作用在IOmin之內(nèi)就開始發(fā)揮，20min后抑制率即可達(dá)75%以上，40min后就可達(dá)到90%以上。實(shí)施例4以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。將本發(fā)明的寡肽A溶液(40mg/mL)分成8份，分別于100°C加熱Omin，lmin，^iin, 4min,8min, 15min, 20min, 40min后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加熱時(shí)間做3個(gè)平行組，同時(shí)做空白
對(duì)照組。結(jié)果顯示本發(fā)明的寡肽A在100°C加熱Smin后，其抑菌活性基本上沒有變；但隨著加熱時(shí)間的延長，抑菌活性有所降低，到15min時(shí)活性降低了約50% ；接近20min時(shí)，本發(fā)明的寡肽A活性幾乎全部喪失；不過加熱時(shí)間在IOmin以內(nèi)，抑菌活性保持80%以上。
權(quán)利要求
1.一種寡肽A，其特征在于所述寡肽A是SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述寡肽A在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具抑菌活性的寡肽A，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了所述寡肽A在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的寡肽A抗菌譜廣，無論是G+菌、還是G-菌，都具有明顯地抑制作用，而且對(duì)真菌的抑制作用也很顯著，提示其在抗細(xì)菌藥物開發(fā)和應(yīng)用方面有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/08GK102363627SQ201110358310
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月12日
發(fā)明者常宏文, 張尚立, 張恒, 王麗, 王萍 申請(qǐng)人:山東大學(xué)