專利名稱：一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法。
背景技術：
細菌毒素可分為兩類，一類為外毒素(Exotoxin)，它是一種毒性蛋白質，是細菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質，產(chǎn)生外毒素的細菌主要是革蘭氏陽性菌，如白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù)革蘭氏陰性菌；另一類為內(nèi)毒素 (Endotoxin)，它是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖(Lipoply Saccharide, LPS)和微量蛋白的復合物，它的特殊性不是細菌的代謝產(chǎn)物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質，其化學成份主要是由0-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。許多生物工程制品由革蘭氏陰性細菌如E. coli表達，細菌破碎后，樣品中會含有大量的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對哺乳類動物有顯著的致熱性，當內(nèi)毒素含量超過一定標準時，可能導致較嚴重的發(fā)熱及過敏性紫癜等副反應，因此各國藥審部門均對生物制品中的內(nèi)毒素含量有嚴格的規(guī)定。由于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素是一種脂多糖，與細菌莢膜多糖結構很相似，因此從細菌性疫苗特別是革蘭氏陰性菌為基礎的莢膜多糖疫苗制品生產(chǎn)中去除內(nèi)毒素十分困難， 目前，常用的分離細菌莢膜多糖和內(nèi)毒素的方法包括親和層析法、活性炭吸附法、微孔膜分離法，這些方法都難以達到分離細菌莢膜多糖和內(nèi)毒素的目的，世界衛(wèi)生組織推薦的在革蘭氏陰性細菌多糖產(chǎn)品中的內(nèi)毒素的去除工藝為在IOOOOOg離心力的條件下超速離心4到 6個小時，但該工藝不但需要價格昂貴的超速冷凍離心機，而且一次處理的樣品量受到限制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用莢膜多糖的親水性和內(nèi)毒素的疏水性，采用TritonX-114作為萃取劑，對b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素進行進行一次或多次萃取，較好地去除莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素，采用TritonX-114萃取法，一次萃取使b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素含量下降90%，莢膜多糖回收率在85%以上，可有效、簡便地降低細菌莢膜多糖產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量的一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為8 12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為0. 8 1. 2%v/v，攪拌混合25 35分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于50 60°C條件下，5 15分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動離心裝置內(nèi)進行自動離心，自動離心裝置的轉速為3000 5000轉/分，離心時間為8 12分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃取；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時間20 觀小時，透析去除殘余的 TritonX-114。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，利用莢膜多糖的親水性和內(nèi)毒素的疏水性，采用TritonX-114作為萃取劑，對b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素進行一次或多次萃取，較好地去除莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素，采用TritonX-114萃取法，一次萃取使b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素含量下降 90%，莢膜多糖回收率在85%以上，可有效、簡便地降低細菌莢膜多糖產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。實施例1
一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為8%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為1. 2%v/v，攪拌混合35分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于50°C條件下，15分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動離心裝置內(nèi)進行自動離心，自動離心裝置的轉速為3000 轉/分，離心時間為12分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃??；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時間20小時，透析去除殘余的 TritonX-114。實施例2:
一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為0. 8%v/v，攪拌混合25分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于60°C條件下，5分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動離心裝置內(nèi)進行自動離心，自動離心裝置的轉速為5000 轉/分，離心時間為8分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃??；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時間觀小時，透析去除殘余的 TritonX-114。實施例3:
一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為10%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為1. 0%ν/ν，攪拌混合30分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于55°C條件下，10分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動離心裝置內(nèi)進行自動離心，自動離心裝置的轉速為4000 轉/分，離心時間為10分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃??；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時間M小時，透析去除殘余的 TritonX-114。
權利要求
1. 一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)在細菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為8 12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為0. 8 1. 2%v/v，攪拌混合25 35分鐘；(2)攪拌混合均勻后，置于50 60°C條件下，5 15分鐘后觀察分層情況；(3)待溶液分層后，置于自動離心裝置內(nèi)進行自動離心，自動離心裝置的轉速為 3000 5000轉/分，離心時間為8 12分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃取；(4)用凝膠法檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時間20 28小時，透析去除殘余的 TritonX-114。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟(1)在細菌莢膜多糖溶液中加入濃度為8～12%v/v的TritonX-114，直到終濃度為0.8～1.2%v/v；(2)混合后置于50～60℃下5～15分鐘；(3)溶液分層后，在轉速為3000～5000轉/分的裝置內(nèi)離心，收集上清液，完成一次萃??；(4)用凝膠法檢測上清液中內(nèi)毒素含量，重復萃取，直至內(nèi)毒素含量小于50EU/μg；(5)透析去除殘余的TritonX-114。本發(fā)明提供一種去除細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，采用TritonX-114，具有萃取后細菌莢膜多糖中內(nèi)毒素含量下降90%，莢膜多糖回收率在85%以上等優(yōu)點。
文檔編號A61P31/04GK102504042SQ201110365650
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權日2011年11月17日
發(fā)明者關曉峰, 吳強, 張麗鶯, 李靖, 王子龍, 羅力心, 趙丹, 陳庚, 韓煉, 魏新 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司