專利名稱：A型禽流感重組噬菌體疫苗及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及T7噬菌體展A型禽流感病毒M2蛋白膜外區(qū)23肽的重組噬菌體構建及應用，屬于分子生物技術領域。
背景技術：
禽流感(Avian Inlfuenza, Al)是由A型流感病毒引起的禽類(家禽和野禽)的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴重全身性敗血癥等的多種疾病綜合癥。該病被世界衛(wèi)生組織規(guī)定為A 類傳染病，也被我國列為一類動物疾病。一般來說，不同的流感病毒有著不同的宿主特異性，即禽流感病毒很難感染人類，人流感病毒也很難感染禽類。然而1997年香港從18個病人體內(nèi)分離出高致病性H5W禽流感，第一次明確禽類流感病毒未經(jīng)過中間宿主就跨越物種屏障直接傳染給人。禽流感病毒(Jvi.an infuenza virus, AIV)為正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，病毒顆粒呈球形或多形態(tài)。其基因組是長約13. 6Kb的8個分節(jié)段的單股負鏈RNA，共編碼10個多肽，分別為血凝素HA，神經(jīng)氨酸酶NA，核蛋白NP，RNA多聚酶的復合物PBl、PB2、 PA，基質(zhì)蛋白M1、M2以及非結構蛋白NSl和NS2。病毒RNA片段通過與核蛋白相結合進行病毒的復制。病毒聚合酶PA、PB1和PB2聚合形成核蛋白復合體(RNP)，負責RNA的復制和轉(zhuǎn)錄。病毒的包膜來自宿主細胞的雙層類脂膜，膜上鑲嵌著3種膜蛋白，分別為HA、NA和M2 蛋白。HA在病毒與宿主細胞膜結合時與受體結合，是重要的中和抗原；NA在新復制的子代病毒釋放上起重要作用，也是重要的抗原；M2蛋白具有離子通道活性，可調(diào)節(jié)膜內(nèi)pH，它的作用能被一些抗病毒藥所抑制，如金剛烷胺(Amantadine)和金剛乙胺(Rimantadine)，其中金剛烷胺是通過阻斷M2的離子通道作用來抑制病毒復制，從而有助于阻止病情發(fā)展，減輕病情。M2基因包含14 39和7 995兩個部分，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在剪切40 727位的內(nèi)含子后，拼接成成熟的mRNA后翻譯成M2蛋白。M2蛋白是97個氨基酸的完整膜蛋白， 大量表達于感染細胞表面[6]，包括細胞外氨基端(23個氨基酸殘基)、跨膜區(qū)(25 43氨基酸殘基)以及位于細胞內(nèi)的羧基端( 個氨基酸殘基)。膜表面的M2蛋白是以四聚體形式存在的，首先兩個M2蛋白單體通過N端17位和19位的Cys之間形成的二硫鍵形成二聚體，然后兩個二聚體再通過非共價鍵作用而形成四聚體，它們的跨膜區(qū)形成一個跨膜螺旋， 作為離子通道。其中的37位His為質(zhì)子結合位點，對離子通道的功能是至關重要的，而W41 則作為粒子通道的大門，對離子通道的功能同樣重要。目前使用的禽流感疫苗主要是直接誘導針對病毒膜蛋白HA產(chǎn)生中和抗體。雖然這些疫苗的應用在對防控流感的過程中起到很好的作用，但是由于流感病毒HA和NA亞型眾多，經(jīng)常發(fā)生抗原轉(zhuǎn)變和抗原漂移，使其抗原性表現(xiàn)出很大的變異。雖然近年來對流感病毒表面抗原HA和NA氨基酸序列甚至三維結構進行了測定，但流感病毒表面抗原的變異規(guī)律及其抗原決定簇出現(xiàn)的規(guī)律仍無法預測，因此每年都必需針對當年的流感病毒流行株來開發(fā)新疫苗，給流感疫苗的生產(chǎn)供應和免疫實施都帶來很大困難。與HA、NA不同，流感病毒M2的氨基酸序列高度保守，從1933年首次分離到人A型流感病毒株A/WS/33 (HlNl)以來， 盡管經(jīng)歷了 4次世界性大流行，M2胞外區(qū)都未發(fā)現(xiàn)明顯差異。對1918年西班牙的流感毒株測序結果也是如此。雖然流感患者中只有少部分能查到M2抗體，但M2的抗血清確實有抑制流感病毒復制的功能。因此，人們認為M2也是流感病毒的保護性抗原，有可能發(fā)展成為具有交叉保護能力的“通用流感疫苗”的候選抗原，可以解決上述HA、NA變異和疫苗更換毒株問題，因此，目前世界各國都正在進行M2相關疫苗的研制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有禽流感疫苗缺少交叉保護的缺點，提供一種免疫效率高、通用性好的A型禽流感重組噬菌體疫苗。本發(fā)明的A型禽流感重組噬菌體疫苗，以重組噬T7菌體為抗原，所說的重組T7噬菌體表面表達有氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的H5亞型A禽流感病毒M2蛋白膜外區(qū) 23肽(Mk)，所說的H5亞型禽流感病毒是比對NCBI發(fā)表的H5亞型禽流感病毒基因序列后選取的優(yōu)勢流行毒株，所說的M2e基因由兩拷貝的優(yōu)勢流行毒株的M2e基因插入T7噬菌體 PlOB基因下游表達獲得。所述的兩拷貝的11加基因選自以下序列的核苷酸
1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；
2)具有SEQID NO :1所示序列經(jīng)增加或減少拷貝數(shù)的核苷酸序列；
3)具有SEQID NO :1所示序列經(jīng)改變、缺失或增加一個或幾個核苷酸但仍表達具有 GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。所說的疫苗中還包含用于乳化重組T7噬菌體的白油佐劑。本發(fā)明的A型禽流感重組噬菌體疫苗的構建方法，包括下列步驟
A、構建重組噬菌體
(1)合成一段DNA序列，該DNA序列克隆至pUC-19載體多克隆位點中，DNA序列的5， 端有酶切位點EcoR I，3，端含有酶切位點Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；
(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、Hind III將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7 噬菌體多克隆位點的EcoR I和Hind III之間，構建重組噬菌體；
(3)用T7噬菌體包裝蛋白組裝重組噬菌體，包裝產(chǎn)物通過瓊脂糖夾心法擴增，用PCR 方法篩選陽性重組噬菌體，重組噬菌體展示兩拷貝的M2e，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；
B、重組噬菌體的制備
甘油凍存的E. coli BL21菌株在LB體培養(yǎng)基平面上劃線接種，37°C過夜培養(yǎng)； 從平皿上挑取單菌落，接種5mL LB培養(yǎng)液，37°C、200轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)過夜，取3mL過夜培養(yǎng)物接種300mL LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的單個噬菌斑，接種到培養(yǎng)好的BL21宿主菌中，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)2-3小時，直至菌液由渾濁變?yōu)槌吻?，?PEG沉淀的方法回收噬菌體，并按常規(guī)的方法測定噬菌體滴度，將回收的噬菌體調(diào)整濃度為 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩滅活過夜；
C、制備重組噬菌體油乳劑疫苗
1)疫苗油相的制備4mL司本80，2mL司本85，94mL 10號礦物油，2g硬脂酸鋁，充分混勻，121°C高壓20分鐘；疫苗水相的制備94mL滴度為2X 1013pfu/mL的滅活噬菌體，4mL高壓滅菌吐溫-80，3000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌均勻；
2)按照水相油相比1:3的比例在高速乳化器上乳化至穩(wěn)定的油包水結構，即為制備的重組噬菌體油乳劑疫苗；
所述的公豬去異味重組噬菌體疫苗的構建方法中，重組T7噬菌體的載體為T7 Select 415-lb。本發(fā)明具有如下技術效果
(1)本發(fā)明利用噬菌體具有的病毒樣顆粒的佐劑的特性，用T7噬菌體載體制備的重組噬菌體疫苗能夠克服M2e自身免疫原性較弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激機體產(chǎn)生更高水平的抗體。(》M2蛋白在禽流感病毒不同亞型之間具有保守型，該重組噬菌體疫苗有望成為 “通用型”禽流感疫苗的情景。(3)由于T7噬菌體易于培養(yǎng)、便于純化，用于生產(chǎn)基因工程疫苗具有多種優(yōu)勢，本發(fā)明制備的A型禽流感重組噬菌體味疫苗便于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低廉。


圖1為重組T7噬菌體的基因鑒定。泳道1為DL2000 DNA Marker ；泳道2為T7噬菌體載體對照；泳道3為重組T7噬菌體。圖2為重組噬菌體SDS-PAGE鑒定。泳道1為Blue Plus Protein Marker ；泳道2 為 T7 Select 415-lb ；泳道 3 為 T7-FMD-VP1。圖 3 為重組噬菌體 Western-blot 鑒定。泳道 1 為 Blue Plus Protein Marker ； 泳道 2 為 T7 Select 415-lb ；泳道 3 為 T7-FMD-VP1。圖4為A型禽流感疫重組噬菌體疫苗免疫ELISA抗體水平圖。
具體實施例方式實施例中，
編碼如SEQ ID NO :3所示基因，是Mk主要抗原表位，為常規(guī)技術。限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III購自大連寶生物生物工程公司。T7噬菌體載體、T7包裝蛋白、E. coli BL21購自Novagen公司。T7噬菌體的提取為常規(guī)技術。T7噬菌體滴度的測定為常規(guī)技術。實施例1 構建重組噬菌體
由商業(yè)公司合成一段DNA序列，該DNA序列已克隆至pUC-19載體多克隆位點中，DNA序列的5，端有酶切位點EcoR I，3，端含有酶切位點Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示
用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7噬菌體多克隆位點的EcoR I和Hind III之間，構建重組噬菌體。重組pUC-19載體雙酶切體系
IddH2O|16. 0μ~
權利要求
1.A型禽流感重組噬菌體疫苗，其特征在于，以重組T7噬菌體為抗原，所說的重組T7噬菌體表面表達有氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的H5亞型A禽流感病毒M2蛋白膜外區(qū)23 肽，即Mk肽，所說的H5亞型禽流感病毒是比對NCBI發(fā)表的H5亞型禽流感病毒基因序列后選取的優(yōu)勢流行毒株，所說的M2e基因由兩拷貝的優(yōu)勢流行毒株的M2e基因插入T7噬菌體PlOB基因下游表達獲得。
2.根據(jù)權利要求1所述的A型禽流感重組噬菌體疫苗，其特征在于，所述的兩拷貝的 M2e基因選自以下序列的核苷酸1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；2)具有SEQID NO 1所示序列經(jīng)增加或減少拷貝數(shù)的核苷酸序列；2)具有SEQ ID NO :1所示序列經(jīng)改變、缺失或增加一個或幾個核苷酸但仍表達具有 M2e主要抗原活性多肽的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的A型禽流感重組噬菌體疫苗，其特征在于，所說的疫苗中還包含用于乳化重組T7噬菌體的白油佐劑。
4.權利要求1-3中任意一種A型禽流感重組噬菌體疫苗的構建方法，其特征在于，包括下列步驟A、構建重組噬菌體(1)合成一段DNA序列，該DNA序列克隆至pUC-19載體多克隆位點中，DNA序列的5， 端有酶切位點EcoR I，3，端含有酶切位點Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI、Hind III將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7 噬菌體多克隆位點的EcoR I和Hind III之間，構建重組噬菌體；(3)用T7噬菌體包裝蛋白組裝重組噬菌體，包裝產(chǎn)物通過瓊脂糖夾心法擴增，用PCR 方法篩選陽性重組噬菌體，重組噬菌體展示兩拷貝的M2e，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；B、重組噬菌體的制備甘油凍存的E. coli BL21菌株在LB體培養(yǎng)基平面上劃線接種，37°C過夜培養(yǎng)； 從平皿上挑取單菌落，接種5mL LB培養(yǎng)液，37°C、200轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)過夜，取3mL過夜培養(yǎng)物接種300mL LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的單個噬菌斑，接種到培養(yǎng)好的BL21宿主菌中，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)2_3小時，直至菌液由渾濁變?yōu)槌吻澹?PEG沉淀的方法回收噬菌體，并按常規(guī)的方法測定噬菌體滴度，將回收的噬菌體調(diào)整濃度為 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100轉(zhuǎn)/分震蕩滅活過夜；C、制備重組噬菌體油乳劑疫苗。
5.根據(jù)權利要求4所述的A型禽流感重組噬菌體疫苗的構建方法，其特征在于，所述的重組T7噬菌體的載體為T7 Select 415_lb。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種A型禽流感重組噬菌體疫苗及其構建方法，所說的疫苗以重組噬T7菌體為抗原，所說的重組T7噬菌體表面表達有氨基酸序列如SEQIDNO2所示的H5亞型禽流感病毒M2蛋白膜外區(qū)23肽(M2e)，所說的M2e由兩拷貝的M2e基因插入T7噬菌體P10B基因下游表達獲得。本發(fā)明具有如下技術效果(1)用T7噬菌體載體制備的重組噬菌體疫苗能夠克服M2e自身免疫原性較弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激機體產(chǎn)生更高水平的抗體。(2)M2蛋白在禽流感病毒不同亞型之間具有保守型，該重組噬菌體疫苗有望成為“通用型”禽流感疫苗的情景。(3)由于T7噬菌體易于培養(yǎng)、便于純化，用于生產(chǎn)基因工程疫苗具有多種優(yōu)勢，本發(fā)明制備的A型禽流感重組噬菌體味疫苗便于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低廉。
文檔編號A61K39/145GK102397540SQ201110373859
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權日2011年11月23日
發(fā)明者侯繼波, 徐海, 王義偉 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院