專利名稱：遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245在制備疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245在作為遲鈍愛德華菌抗原、制備遲鈍愛德華病疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遲緩愛德華菌(FdwairkidJa是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害極大的病原菌之一， 能夠侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，在宿主內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的裂解，引起魚類產(chǎn)生遲緩愛德華菌病(我國(guó)的三類水生動(dòng)物疫病)。這種胞內(nèi)寄生特性對(duì)其致病性具有重要作用，可引起魚類腹部積水腫脹、體表出血、腸內(nèi)出現(xiàn)黏液，造成魚類的大量死亡，嚴(yán)重危害了魚類的養(yǎng)殖，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)這類致病菌的防治主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治?？股仉m然在最初的使用中取得了巨大的進(jìn)展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出現(xiàn)了一系列的相關(guān)問(wèn)題，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐藥菌的產(chǎn)生，細(xì)菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地加大劑量，加劇耐藥性的產(chǎn)生。因此，研制以具有免疫保護(hù)作用的高效中和抗原為成分的疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。在各種動(dòng)物疾病的防治中，疫苗的使用是一個(gè)具有低成本、高效的方法，并且已經(jīng)有部分疫苗得到大規(guī)模使用并取得了不錯(cuò)的防治效果。疫苗種類很多，以細(xì)菌為例，包括全菌疫苗、亞單位疫苗以及DNA疫菌等。從實(shí)際應(yīng)用的情況來(lái)看，全菌疫苗雖然具有制作相對(duì)簡(jiǎn)單而且成本也較低的優(yōu)點(diǎn)，但它也存在不少由于使用全菌體而固有的一些缺點(diǎn)，如減毒全菌疫苗可能出現(xiàn)菌株突變而導(dǎo)致的毒性恢復(fù)等不良后果；滅活全菌疫苗則往往由于對(duì)細(xì)菌的滅活過(guò)程而導(dǎo)致一些免疫保護(hù)基團(tuán)活性的改變，影響免疫保護(hù)的效果。而且對(duì)全菌疫苗來(lái)說(shuō)，由于細(xì)菌成分的復(fù)雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)。并且常規(guī)制得的全菌疫苗免疫保護(hù)效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目前最為主要的疫苗種類。其原因可能與高效中和抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定困難有關(guān)?；蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄分布圖技術(shù)的發(fā)展為細(xì)菌疫苗提供了新的契機(jī)。基因工程疫苗由于高效，且擺脫了傳統(tǒng)疫苗的種種缺點(diǎn)等特征，成為疫苗研究的重點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用與開發(fā)前景。外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面對(duì)宿主的體液及組織，細(xì)菌利用外膜蛋白進(jìn)行黏附、侵入和炎癥等生理活動(dòng)，更容易被宿主識(shí)別作為攻擊目標(biāo)，使得革蘭氏陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以刺激體液免疫，而且對(duì)細(xì)胞免疫亦有刺激作用。近年來(lái)，細(xì)菌的一些外膜蛋白已經(jīng)被證實(shí)具有良好的免疫原性，用其制備基因工程疫苗具有良好的前景。如已發(fā)現(xiàn)遲鈍愛德華菌外膜蛋白的P33k、3^、3^、^k可能為保護(hù)性抗原，可作為疫苗的候選成分；外膜蛋白S2和OmpA具有免疫原性，研究者多集中于上述兩種外膜蛋白的研究。如張亞寧等(遲緩愛德華菌HBOl 外膜蛋白0mpS_2基因的克隆表達(dá)及其免疫原性研究，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011年10 期)構(gòu)建了重組菌株BL21(DE3) (pET-28a-0mpS2)，制備防治魚類愛德華氏菌病的基因工程疫苗。雖然該基因工程疫苗具有一定的免疫作用，但是由于基因長(zhǎng)度過(guò)大，制備上不是太方便。關(guān)于遲鈍愛德華氏菌外膜蛋白0245的功能還未見報(bào)道，也未見任何關(guān)于其具有免疫調(diào)節(jié)功能的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種遲鈍愛德華菌外膜蛋白 0245在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245具有較強(qiáng)的免疫原性，可以作為遲鈍愛德華菌的抗原應(yīng)用。更進(jìn)一步，該遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245可以制備成防治遲鈍愛德華菌病的疫苗使用。所述遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的制備方法如下
(1)以遲鈍愛德華菌EIB202全基因組為模板，SEQID NO:廣2為引物，擴(kuò)增遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的基因；
(2)用限制性內(nèi)切酶feoTPI和損ol分別酶切擴(kuò)增的遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的基因和pET-3h表達(dá)載體后連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，表達(dá)蛋白、純化。所述遲鈍愛德華病菌疫苗制備方法如下將純化的遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245 水溶液與弗氏佐劑等體積混合均勻形成油包水乳劑，遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的濃度可根據(jù)需要任意選擇，只要能夠滿足最終注射劑量在250(Γ10000微克蛋白/千克體重的使用范圍內(nèi)即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
對(duì)遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的主動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明ΕΤΑΕ_0245免疫小鼠后還可以提高小鼠對(duì)遲鈍愛德華菌的抵抗力。由此可見，ΕΤΑΕ_0245具有明顯的免疫保護(hù)作用，可用作疫苗組分。


圖1為ΕΤΑΕ_0245、ΕΤΑΕ_2675和ETAEJ9!35基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析(M =DNA Marker ；泳道 1. ETAE_2935 PCR 產(chǎn)物；泳道 2. ETAE_2675 PCR 產(chǎn)物；泳道 3. ETAE_0245 PCR 產(chǎn)物。圖 2 為 ETAE_0245、ETAE_2675 和 ETAEJ9!35 基因重組子雙酶切鑒定(Μ :DNA Marker,泳道1、2和3分別為ETAEJ9!35、ETAEJ675和ETAE_0245重組子質(zhì)粒的雙酶切)。圖3為聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)ETAE_0245、ETAEJ675和ETAEJ935基因表達(dá)產(chǎn)物(泳道1、2和3分別為ETAE_2935、ETAE_2675和ETAE_0245 ；BSA為牛血清白蛋白對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)QOOl by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245基因、2675基因和四35基因克隆的制備和鑒定
在該實(shí)施例中，將全長(zhǎng)的遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245基因(ETAE_0M5)、ETAEJ675和 ETAE_2935的編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體中，以達(dá)到表達(dá)和提純目的蛋白。1.遲鈍愛德華菌外膜蛋白0M5J675和四35基因的擴(kuò)增
根據(jù)NCBI公布的遲鈍愛德華菌EIB202的全基因組序列(Genbank登錄號(hào)NC_013508) 設(shè)計(jì)了 3對(duì)引物，引物序列見表1。為便于克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)酶位點(diǎn)i^o/PI和損ol Γ劃線部分)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 PCR反應(yīng)條件的確立以熱變性法獲得的遲鈍愛德華菌ΕΙΒ202全基因組為模板，在25ml反應(yīng)體系中加PCR反應(yīng)緩沖液2. 5ml, 10mmol/L dNTPlml，5，和3，引物各10mmol/L，模板DNA l-2ml，補(bǔ)水至25ml。PCR循環(huán)參數(shù)為-MV, 2 min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)(94°C變性60s， 60°C退火60s，72°C延伸60s)后繼續(xù)在72°C延伸10 min，4°C保存。用0. 7%瓊脂糖膠電泳后，擴(kuò)增的DNA片斷長(zhǎng)度與預(yù)測(cè)的片段大小類似，ETAE_0245約63;3bp，ETAEJ675約57!3bp， ETAEJ9!35 約 873bp (圖 1)?；厥?DNA 片斷。表1 3個(gè)遲緩愛德華氏菌外膜蛋白基因克隆信息表
權(quán)利要求
1.遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245在作為遲鈍愛德華菌抗原中的應(yīng)用。
2.遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245在制備遲鈍愛德華病菌疫苗中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的制備方法如下(1)以遲鈍愛德華菌EIB202全基因組為模板，SEQID NO:廣2為引物，擴(kuò)增遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的基因；(2)用限制性內(nèi)切酶feoTPI和損ol分別酶切擴(kuò)增的遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的基因和pET-3h表達(dá)載體后連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，表達(dá)蛋白、純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述遲鈍愛德華病菌疫苗制備方法如下 將純化的遲鈍愛德華菌外膜蛋白OM水溶液與福氏佐劑等體積混合均勻形成油包水乳劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述遲鈍愛德華病菌疫苗的注射劑量為 2500^10000微克蛋白/千克體重。
全文摘要
本發(fā)明公開了遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245在制備疫苗中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245具有明顯的免疫保護(hù)作用，能夠有效抵抗遲鈍愛德華菌的感染，可作為亞單位疫苗的候選靶位。本發(fā)明還公開了遲鈍愛德華菌外膜蛋白0245的表達(dá)及疫苗的制備方法，制備得到的疫苗對(duì)控制遲鈍愛德華菌感染的免疫學(xué)防治具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102397537SQ20111038715
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者劉洋, 張海麗, 彭宣憲, 李惠 申請(qǐng)人:中山大學(xué)