專利名稱：組織蛋白酶l抑制劑在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，具體涉及組織蛋白酶L抑制劑用于制備放療增敏藥物的新用途。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，放射治療是目前腦膠質(zhì)瘤綜合治療最重要的治療手段之一。但是膠質(zhì)瘤對(duì)放療的抵抗性不斷增加，相當(dāng)一部分患者經(jīng)過(guò)放射治療后，腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐輻射的機(jī)制仍然沒(méi)有搞清楚。輻射對(duì)生物大分子的破壞主要是引起細(xì)胞凋亡，對(duì)于細(xì)胞凋亡分子機(jī)制，尤其是電離輻射等因素通過(guò)DNA損傷而誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究，已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展。然而，在過(guò)去十年中的研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%惡性膠質(zhì)瘤中p53發(fā)生突變，抗凋亡蛋白如 Bcl-2等的過(guò)渡表達(dá)，從而對(duì)以誘導(dǎo)凋亡為手段的療法產(chǎn)生了抵抗。隨著研究的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)到電離輻射可以激活多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因的表達(dá)，其中許多基因和信號(hào)通路參與了細(xì)胞DNA的損傷、細(xì)胞周期改變和細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力及周期調(diào)控這兩方面是細(xì)胞輻射敏感性的主要決定因素。Cathepsin L是一種普遍存在的溶酶體的半胱氨酸蛋白酶，最初被認(rèn)為與其它 Cathepsins 一起共同參與蛋白的終末降解。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及細(xì)胞外基質(zhì)均存在Cath印sin L，當(dāng)細(xì)胞在某些化學(xué)和物理因素刺激的情況下，Cathepsin L 可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，并且可能剪切Bid成為tBid，通過(guò)線粒體途徑引起Cyt-c的釋放和激活Caspase-3，理論上這一過(guò)程能高效率的誘導(dǎo)凋亡途徑，然而，結(jié)果卻是相反的 在高水平的cath印sin L活性下，體內(nèi)和體外研究均證實(shí)cath印sin L具有抗凋亡的作用。惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)Cath印sin L，它的含量可作為惡性腦膠質(zhì)瘤的可靠標(biāo)識(shí)，而且Cath印sin L還具有水解ECM的成分的能力，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)了惡性腦膠質(zhì)瘤的局部侵襲性，表明Cathepsin L不但具有抗凋亡作用，而且能促進(jìn)惡性腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移，近幾年還有研究證實(shí)，Cath印sin L通過(guò)對(duì)自噬及老化的調(diào)節(jié)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，表明Cath印sin L活性已經(jīng)涉及到惡性腫瘤的各種特征。因此，已有較多實(shí)驗(yàn)室開始研究靶向于Cathepsin L的藥物，表明該藥物分子作為抗腫瘤新藥具有很好的前途?，F(xiàn)有技術(shù)中，專利號(hào)為98810768. 6的發(fā)明專利公開了一種用作半胱氨酸組織蛋白酶如組織蛋白酶B、K、L和S的抑制劑的N-末端取代二肽腈，這種物質(zhì)可用于治療半胱氨酸組織蛋白酶依賴性疾病和病癥，包括發(fā)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、腫瘤 (特別是腫瘤侵入和腫瘤轉(zhuǎn)移)、冠狀疾病、動(dòng)脈粥樣硬化(包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和去穩(wěn)定作用)。但是現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)關(guān)于組織蛋白酶L抑制劑具有放療增敏作用，并且可以用于制備放療增敏藥物的用途
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種組織蛋白酶L抑制劑的新應(yīng)用，即組織蛋白酶L抑制劑用于制備放療增敏藥物的應(yīng)用。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是組織蛋白酶L抑制劑在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用。上述技術(shù)方案中，所述放療增敏藥物適用于膠質(zhì)瘤。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述組織蛋白酶L抑制劑為Z-苯丙氨酸-叔丁基酪氨酸-二氮甲酮(Z-FY-DMK)、組織蛋白酶 siRNA (Cathepsin L siRNA)。上述技術(shù)方案中，Z-苯丙氨酸-叔丁基酪氨酸-二氮甲酮是III型組織蛋白酶L 抑制劑(Z-Phe-Tyr (t-Bu)-diazomethyIketone，Z-FY-DMK)，分子量為 M2. 6，德國(guó)默克公司生產(chǎn)；Z-FY-DMK是一種不可逆轉(zhuǎn)的組織蛋白酶抑制劑，作用于組織蛋白酶L和組織蛋白酶S，對(duì)組織蛋白L的抑制作用更為明顯。siRNA (Small interfering RNA)是一種小 RNA 分子，siRNA 與同源的靶 RNA 互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，目的在于從基因水平抑制、下調(diào)基因表達(dá)。是現(xiàn)有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效的方法。優(yōu)選地，所述組織蛋白酶siRNA選自具有以下序列的siRNA
SEQ ID No. 1 :A5 ‘ -CACCGCGATGCACAACAGATTATACTTCAAGAGAGTATA ATCTGTTGTGCATCGCTTTTTTG-3，；或者，
SEQ ID No. 2 :A5' -GATCCAAAAAAGCGATGCACAACAGATTATACTCTCTTGA AGTATAATCTGTTGTGCATCGC-3‘。將上述蛋白酶siRNA序列轉(zhuǎn)染SU-2細(xì)胞再挑取單克隆細(xì)胞株，篩選出一株 Cathesin L低表達(dá)的細(xì)胞株，命名為SU-2-450。發(fā)明人應(yīng)用Cath印sin L特異性抑制劑Z-FY-DMK或者Cath印sin L siRNA處理人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系和裸小鼠原位移植瘤模型，再給予不同劑量的X線照射， 發(fā)現(xiàn)
(1 )x射線處理膠質(zhì)細(xì)胞后Cath印sin L發(fā)生核轉(zhuǎn)位，該作用機(jī)制在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞輻射抗性中的所扮演的角色與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)；
(2)正常人腦細(xì)胞幾乎不表達(dá)Cath印sinL，而惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)Cath印sin
L ；
(3)CathepsinL在細(xì)胞凋亡和自噬性死亡中有重要的調(diào)節(jié)作用，提出Cathepsin L可作為腦膠質(zhì)瘤輻射增敏的作用靶點(diǎn)，為藥物開發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Cathepsin L活性與腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞輻射抗性的機(jī)制有關(guān)；
(4)Cathepsin L活性與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞耐放射的機(jī)制有關(guān)，在輻射對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)及周期調(diào)控機(jī)制中Cath印sin L活性是重要的調(diào)節(jié)分子，Cathepsin L抑制劑能有效克服腫瘤細(xì)胞耐放射現(xiàn)象。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明首次證明Cathepsin L活性與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞耐放射的機(jī)制有關(guān)，在輻射對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及周期調(diào)控機(jī)制中Cathepsin L活性是重要的調(diào)節(jié)分子， Cathepsin L抑制劑能有效克服腫瘤細(xì)胞耐放射現(xiàn)象；從而提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)證明Cath印sin L是放射治療膠質(zhì)瘤中一個(gè)新的作用靶位，為開發(fā)一種新的對(duì)輻射敏感的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


圖1為實(shí)施例一中X射線處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后用免疫熒光法觀察Cath印sin L的表達(dá)情況；
圖2為實(shí)施例一中Cathepsin L在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)定量檢測(cè)結(jié)果圖； 圖3為實(shí)施例一中X射線處理SU-2細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成曲線； 圖4為實(shí)施例一中Z-FY-DMK單獨(dú)處理和X射線，Z-FY-DMK聯(lián)合處理時(shí)SU-2細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成曲線；
圖5為實(shí)施例一中X射線單獨(dú)處理組和Z-FY-DMK預(yù)處理再聯(lián)合輻照處理組的細(xì)胞克隆形成曲線；
圖6為實(shí)施例一中X射線單獨(dú)處理、Z-FY-DMK和X射線聯(lián)合處理SU-2細(xì)胞以及X射線處理SU-2-450細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成曲線；
圖7為實(shí)施例一中Cathepsin L在組織中的表達(dá)結(jié)果圖8為實(shí)施例一中單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)SU-2細(xì)胞的核酸損傷結(jié)果圖9為實(shí)施例一中流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期圖10為實(shí)施例一中SU-2細(xì)胞的p-CHKl蛋白的表達(dá)結(jié)果圖11為實(shí)施例一中SU-2細(xì)胞的cyclin Bl蛋白的表達(dá)結(jié)果圖12為實(shí)施例中SU-2細(xì)胞的p21蛋白的表達(dá)圖13為實(shí)施例中SU-2注射入裸鼠皮下腫瘤體積變化圖14為實(shí)施例中MDC染色法檢測(cè)SU-2細(xì)胞和SU-2-450細(xì)胞的自噬水平結(jié)果圖； 圖15為實(shí)施例中SU-2細(xì)胞和SU-2-450細(xì)胞的Beclin 1蛋白的表達(dá)圖； 圖16為實(shí)施例中電鏡技術(shù)檢測(cè)SU-2細(xì)胞和SU-2-450細(xì)胞的自噬水平結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一
(1)建立人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系和裸小鼠原位移植瘤模型。裸小鼠原位移植瘤模型為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)技術(shù)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞備用，取5周齡裸小鼠麻醉，切開頭部皮膚，用骨鉆在裸小鼠顱骨上鉆孔，用小鼠立體定位儀將裸小鼠固定，用微量注射泵將細(xì)胞緩慢注入裸小鼠顱內(nèi)，細(xì)胞量為1 X IO6,緩慢拔出針頭，縫合傷口。(2)免疫熒光法及Wfestern blot觀察X射線處理后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Cath印sin L表達(dá)的變化
免疫熒光法處理步驟取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并給予 6Gy X射線處理，另設(shè)空白對(duì)照組；培養(yǎng)中止后，吸取各組培養(yǎng)基；用-20 °C預(yù)冷的甲醇固定10 min ； PBS中洗滌3次，室溫吹干；滴加Cath印sin L (1 200稀釋)一抗孵育，4 °C 過(guò)夜；PBS中洗滌3次，室溫吹干；滴加FITC-DAR 二抗避光孵育，室溫，Ih ；PBS中洗滌3次， 暗處晾干；滴加熒光封裱液封片；熒光顯微鏡下觀察、攝片。免疫印跡法處理步驟取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并給予6Gy X射線處理，另設(shè)空白對(duì)照組；經(jīng)過(guò)藥物以及X射線處理后12，對(duì)小時(shí)收集細(xì)胞， 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。BCA法測(cè)蛋白濃度后，取50 μ g蛋白樣品進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后加入1 1000的抗Cath印sin L抗體孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜后加入熒光二抗，室溫?fù)u晃1小時(shí)， TBST洗膜3次。攝片，分析結(jié)果。所用內(nèi)參為β-actin。結(jié)果參見(jiàn)圖1，圖1為X射線處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后用免疫熒光法觀察Cath印sin L 的表達(dá)情況。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在經(jīng)過(guò)X射線處理后培養(yǎng)一段時(shí)間，用抗Cath印sin L的抗體標(biāo)記細(xì)胞并顯色。用細(xì)胞熒光共聚焦顯微鏡觀察拍攝。放大倍數(shù)X400。圖2為Cath印sin L在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)定量檢測(cè)。8Gy的X射線處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞12，24小時(shí)之后用免疫印跡法來(lái)定量檢測(cè)Cath印sin L的表達(dá)。(與對(duì)照組相比P<0. 05)
由圖1、2可知細(xì)胞在經(jīng)過(guò)X射線處理后，Cathepsin L表達(dá)量增多，大量聚集在細(xì)胞核內(nèi)，X射線處理后誘發(fā)Cath印sin L明顯的核轉(zhuǎn)位。(3) X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞克隆形成的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞為200個(gè)，設(shè)空白對(duì)照組，給藥組，X射線組和給藥X射線聯(lián)合組，分為三部分，第一部分選用不同劑量的X射線處理(2，4，6Gy)，第二部分選用不同的濃度的Z-FY-DMK處理(1. 25，2. 5,5,10ymol/L), X射線劑量為6Gy ；第三部分Z-FY-DMK預(yù)處理選用不同時(shí)間點(diǎn)(X射線處理前，提前1，3，6，12小時(shí)加入Z-FY-DMK 培養(yǎng)細(xì)胞)，X射線計(jì)量為6Gy ；經(jīng)過(guò)X射線處理后培養(yǎng)14天，用濃度為0. 5%的結(jié)晶紫染色 15分鐘，對(duì)細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)。所得結(jié)果參見(jiàn)圖3 6，圖3 6為SU_2細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)。X射線處理組將細(xì)胞進(jìn)行X射線輻照處理。Z-FY-DMK組細(xì)胞用Z-FY-DMK處理。X射線加Z-FY-DMK處理組 細(xì)胞在X射線處理之提前12小時(shí)用Z-FY-DMK處理。圖3為X射線處理SU-2細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成曲線，X射線的劑量為2，4，6Gy。圖4為Z-FY-DMK單獨(dú)處理和X射線，Z-FY-DMK 聯(lián)合處理時(shí)SU-2細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成曲線，Z-FY-DMK的劑量分別為1. 25，2. 5，5，10 μ mol/ L0圖5為X射線單獨(dú)處理組和Z-FY-DMK預(yù)處理再聯(lián)合輻照處理組，聯(lián)合處理組的預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)為1,3,6,12小時(shí)。圖6為X射線單獨(dú)處理，劑量為6Gy，Z-FY-DMK和X射線聯(lián)合處理SU-2細(xì)胞以及X射線處理SU-2-450細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成曲線X射線劑量為6Gy。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。其中，SU-2-450細(xì)胞的制備方法為采用具有以下序列的組織蛋白酶siRNA SEQ ID No. 1 :A5’-CACCGCGATGCACAACAGATTATACTTCAAGAGAGTATAATCTGTTGTGCATCGCTT
TTTTG-3，；或者，
SEQ ID No. 2 :A5’-GATCCAAAAAAGCGATGCACAACAGATTATACTCTCTTGAAGTATAATCTGTTGTGC ATCGC-3’ ；轉(zhuǎn)染SU-2細(xì)胞再挑取單克隆細(xì)胞株，篩選出一株Cathesin L低表達(dá)的細(xì)胞株， 命名為SU-2-450
由圖3 6可知隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，集落形成數(shù)逐漸減少，聯(lián)合處理(IR+Z-FY-DMK)組的細(xì)胞克隆形成率與單獨(dú)加藥組相比明顯降低，在Cath印sin L低表達(dá)的SU-2-450細(xì)胞中有同樣的結(jié)果。(4)免疫組化法檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤內(nèi)Cath印sin L的表達(dá)將所需組織石蠟包埋后切片(5μπι)，將組織片置于烘箱，60°C，40分鐘。二甲苯浸泡40分鐘，再分別置于濃度為
6100%，95%，85%，75%的乙醇溶液；蒸餾水浸泡3次每次4分鐘，再放入PBS 3次每次4分鐘； 將組織片浸泡入酸性修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，100°C水浴，20分鐘，冷卻后用PBS洗滌；滴加雙氧水(4%) 37°C, 30分鐘，PBS洗滌；血清封閉20分鐘后滴加Cath印sin L (1 200稀釋) 孵育一抗4 °C過(guò)夜；PBS中洗滌，室溫吹干；滴加ABC 二抗孵育，37°C，Ih ；PBS中洗滌；滴加 DAB染液，37°C，30分鐘，PBS中洗滌；滴加蘇木素染核，雙蒸水洗滌沖性樹膠封片，顯微鏡下觀察、攝片。所得結(jié)果參見(jiàn)圖7，圖7為Cath印sin L在組織中的表達(dá)。A圖為正常人腦組織； B圖為人腦膠質(zhì)瘤組織；圖片為使用抗Cath印sin L的抗體(稀釋比例1 :200)標(biāo)記蛋白，用免疫組織化學(xué)方法染色。由圖7可知正常人腦細(xì)胞幾乎不表達(dá)Cath印sin L ；而惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá) Cathepsin L0(5)單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞DNA損傷修復(fù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并給予6Gy X射線處理，另設(shè)空白對(duì)照組；經(jīng)過(guò)藥物以及X射線處理后1，3小時(shí)收集細(xì)胞，胰酶消化，吹打成單細(xì)胞置4°C備用；提前將預(yù)熱到501的11(^1^，1(%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(用不含Ca2+、Mg2+的PBS配制)均勻鋪在預(yù)熱到50°C的干凈磨砂載玻片上，4°C放置10分鐘；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)為每毫升IX IO6個(gè)，吸取75 μ L，在37°C下與65 μ L 0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖(用不含Ca2+、Mg2+的PBS 配制)均勻混合，將其均勻鋪在正常熔點(diǎn)凝膠上，4°C放置10分鐘；在37°C下，再在其上鋪一層0. 8%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，4°C放置10分鐘。將載玻片浸泡在新鮮配制的4°C預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中1. 5小時(shí)；吸盡裂解液加入新鮮配制的4°C預(yù)冷的堿性電泳液解旋30分鐘，然后將載玻片取出并置于盛有堿性電泳液的水平電泳槽中，4°C下電泳05 V, 300 mA)30分鐘； 中和(0. 4 mol/L Tris-HCl, pH值為7. 5)15分鐘后，用GelRed (稀釋比例1 :200)染色5 分鐘；熒光顯微鏡鏡下觀察，攝片。所得結(jié)果參見(jiàn)圖8，圖8為單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)SU-2細(xì)胞的核酸損傷。C 對(duì)照組；Z-FY-DMK組Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；6Gy+Z_FY_DMK ； 細(xì)胞在X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；圖片為SU-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的處理， 在1和3小時(shí)收集SU-2細(xì)胞，用單細(xì)胞凝膠電泳法分析核酸損傷。由圖8可知與對(duì)照組和相比，單獨(dú)加藥組細(xì)胞在處理3小時(shí)之后出現(xiàn)核酸拖尾， 單獨(dú)放射組和聯(lián)合處理組的細(xì)胞在1小時(shí)后出現(xiàn)核酸拖尾，聯(lián)合處理組核酸損傷最為嚴(yán)重。(6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞周期的變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并給予6Gy X射線處理，另設(shè)空白對(duì)照組；分別與M，48，72小時(shí)后收集細(xì)胞，用IXBuffer洗滌細(xì)胞一次(離心2000rpm，5分鐘)加適量 Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1 X 106/mL ；細(xì)胞加9倍體積的70%乙醇，于_20°C固定至少12小時(shí)；離心收集細(xì)胞，用IXBufTer洗滌細(xì)胞，重懸于500 μ L Buffer中，加入RNA 酶，終濃度0. 25mg/ml，反應(yīng)30分鐘；加入5 μ L PI染液，輕輕混勻；室溫避光放置30分鐘； 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。所得結(jié)果參見(jiàn)圖9，圖9為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。Con 對(duì)照組；Z_FY_DMK Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；6Gy+Z_FY_DMK ；細(xì)胞在X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值(mean)并計(jì)算方差(sd)， *，與對(duì)照組相比Ρ<0· 05 ；**，與對(duì)照組相比ρ<0· 01 ·’##，與X射線單獨(dú)處理組相比ρ<0· 05 ； ###，與X射線單獨(dú)處理組相比ρ<0. 01。由圖9可知與陰性對(duì)照組相比，單獨(dú)加藥組細(xì)胞周期阻滯在Gl期，單獨(dú)放射組細(xì)胞周期阻滯在G2期，聯(lián)合處理組G2期阻滯去除。(7)ffestern-blot檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)p_CHKl蛋白表達(dá)水平的變化處理步驟同免疫印跡法，使用的抗體為抗P-CHKl抗體，稀釋比例1 :500。所得結(jié)果參見(jiàn)圖10，圖10為SU-2細(xì)胞的p-CHKl蛋白的表達(dá)。Con:對(duì)照組； Z-FY-DMK =Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；6Gy+Z_FY_DMK ；細(xì)胞在 X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值(mean)并計(jì)算方差(sd)，*，與對(duì)照組相比ρ<0· 05 ；**，與對(duì)照組相比ρ<0· 01。由圖10可知與陰性對(duì)照組相比，單獨(dú)處理組P-CHKl表達(dá)逐漸增高，而聯(lián)合處理組p-CHKl表達(dá)降低且成時(shí)間依賴性。(8) Western-blot檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)cyclin Bl蛋白表達(dá)水平的變化處理步驟同免疫印跡法，使用的抗體為抗cyclin Bl抗體，稀釋比例1 :500。所得結(jié)果參見(jiàn)圖11，圖11為SU-2細(xì)胞的cyclin Bl蛋白的表達(dá)。Con 對(duì)照組； Z-FY-DMK =Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；6Gy+Z_FY_DMK ；細(xì)胞在 X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值(mean)并計(jì)算方差(sd)，*，與對(duì)照組相比ρ<0· 05 ；**，與對(duì)照組相比ρ<0· 01。由圖11可知與陰性對(duì)照組相比，單獨(dú)放射組cyclin Bl表達(dá)降低，而聯(lián)合處理組 cyclin Bl的表達(dá)升高且成時(shí)間依賴性。(9) Western-blot檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)p21蛋白表達(dá)水平的變化處理步驟同免疫印跡法，使用的抗體為抗P21抗體，稀釋比例1 :500。所得結(jié)果參見(jiàn)圖12，圖12為SU-2細(xì)胞的p21蛋白的表達(dá)。Con 對(duì)照組；Z_FY_DMK Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；6Gy+Z_FY_DMK ；細(xì)胞在X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值(mean)并計(jì)算方差(sd)，*， 與對(duì)照組相比Ρ<0· 05 ；**，與對(duì)照組相比ρ<0· 01。由圖12可知與陰性對(duì)照組相比，單獨(dú)處理組p21表達(dá)增加，而聯(lián)合處理組p21的表達(dá)降低且成時(shí)間依賴性。(10)建立人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。測(cè)量移植瘤的體積并做圖。圖13為SU-2注射入裸鼠皮下，測(cè)量腫瘤體積。C 對(duì)照組；IR 每周X射線處理一次，持續(xù)兩周；Z-FY-DMK 皮下注射Z-FY-DMK ；Z-FY-DMK+IR:皮下注射Z-FY-DMK，每周X射線處理一次，持續(xù)兩周。由圖13可知，與對(duì)照組和單獨(dú)給藥或者單獨(dú)X射線處理組相比，Z-FY-DMK+IR組的腫瘤增長(zhǎng)最慢，抑制率最高。(11)將SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所述蛋白酶siRNA序列轉(zhuǎn)染SU-2細(xì)胞再挑取單克隆細(xì)胞株，篩選出一株Cathesin L低表達(dá)的細(xì)胞株，命名為SU-2-450。MDC染色法檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自噬水平的變化給藥及X射線處理后收集細(xì)胞，細(xì)胞中加入MDC，置于37°C 1小時(shí)，PBS洗滌，將細(xì)胞均勻涂抹于載玻片
8上，于熒光顯微鏡下攝片。圖14為MDC染色法檢測(cè)SU_2細(xì)胞和SU_2_450細(xì)胞的自噬水平。Con 對(duì)照組； Z-FY-DMK =Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；Z-FY-DMK+IR ；細(xì)胞在X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；SU-2-450 所用細(xì)胞為SU-2-450 ； SU-2-450+IR 劑量為 6Gy 的 X 射線處理 SU-2-450。由圖14可知與陰性對(duì)照組相比，Z-FY-DMK+頂組和SU-2-450+IR組自噬小體增加，自噬水平增高。(12) flfestern-blot檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)Beclin 1蛋白表達(dá)水平的變化處理步驟同免疫印跡法，使用的抗體為抗Beclin 1抗體，稀釋比例1 :500。圖15為SU-2細(xì)胞和SU-2-450細(xì)胞的Beclin 1蛋白的表達(dá)。Con 對(duì)照組； Z-FY-DMK =Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；Z-FY-DMK+IR ；細(xì)胞在X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；SU-2-450 所用細(xì)胞為SU-2-450 ； SU-2-450+IR 劑量為6Gy的X射線處理SU-2-450。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值(mean)并計(jì)算方差(sd)，*，與對(duì)照組相比ρ<0· 05 ；**，與對(duì)照組相比ρ<0· 01。由圖15可知與陰性對(duì)照組相比，Z-FY-DMK+IR組和SU_2_450+IR組的Beclin 1 蛋白表達(dá)量明顯增加。(13)電鏡技術(shù)檢測(cè)X射線和Z-FY-DMK對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自噬水平的變化給藥及 X射線處理后收集細(xì)胞，加入2. 5%戊二醛固定細(xì)胞，送至上海醫(yī)學(xué)院電鏡室制備樣本，并攝片。圖16為電鏡技術(shù)檢測(cè)SU-2細(xì)胞和SU-2-450細(xì)胞的自噬水平。Con 對(duì)照組； Z-FY-DMK =Z-FY-DMK處理細(xì)胞；6Gy 劑量為6Gy的X射線處理細(xì)胞；Z-FY-DMK+IR ；細(xì)胞在X射線處理之前提前12小時(shí)用Z-FY-DM預(yù)處理；SU-2-450 所用細(xì)胞為SU-2-450 ； SU-2-450+IR 劑量為 6Gy 的 X 射線處理 SU-2-450。由圖16可知與陰性對(duì)照組相比，Z-FY-DMK處理SU_2細(xì)胞再輻照處理，自噬小體增加；SU-2-450細(xì)胞在X射線處理后，自噬小體也相應(yīng)增加；Z-FY-DMK+IR組和 SU-2-450+IR組的自噬水平增高。
權(quán)利要求
1.組織蛋白酶L抑制劑在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織蛋白酶L抑制劑在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述組織蛋白酶L抑制劑選自Z-苯丙氨酸-叔丁基酪氨酸-二氮甲酮或組織蛋白酶 SiRNA0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述組織蛋白酶L抑制劑在制備放療增敏藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白酶siRNA選自具有以下序列的siRNA SEQ ID No. 1 :A5 ‘ -CACCGCGATGCACAACAGATTATACTTCAAGAGAGTATA ATCTGTTGTGCATCGCTTTTTTG-3，；或者SEQ ID No. 2 :A5' -GATCCAAAAAAGCGATGCACAACAGATTATACTCTCTTGA AGTATAATCTGTTGTGCATCGC-3‘。
全文摘要
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，具體公開了組織蛋白酶L抑制劑用于制備放療增敏藥物的新用途。本發(fā)明首次證明CathepsinL活性與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞耐放射的機(jī)制有關(guān)，在輻射對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及周期調(diào)控機(jī)制中CathepsinL活性是重要的調(diào)節(jié)分子，CathepsinL抑制劑能有效克服腫瘤細(xì)胞耐放射現(xiàn)象；從而提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)證明CathepsinL是放射治療膠質(zhì)瘤中一個(gè)新的作用靶位；本發(fā)明同時(shí)提供了組織蛋白酶L抑制劑用于制備放療增敏藥物的新用途，所述組織蛋白酶L抑制劑選自Z-苯丙氨酸-叔丁基酪氨酸-二氮甲酮或組織蛋白酶siRNA。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102423489SQ20111039035
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者李君 , 梁中琴, 鄭冰心, 龍林梅 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)