專利名稱：一種微囊藻毒素mc-lr促二乙基亞硝胺den誘發(fā)大鼠肝癌模型建立的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺DEN 誘發(fā)大鼠肝癌模型建立的方法。
背景技術：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，有“癌王”之稱。因此需要選擇一種合適的肝癌動物模型來模擬人體肝癌的病變過程幫助肝癌的研究。誘發(fā)性肝癌模型是指用化學、物理或生物的致癌因素作用于動物而形成的肝癌模型。其中，二乙基亞硝胺(DEN)是動物肝癌是一種廣泛應用的誘發(fā)劑，它誘發(fā)的肝癌過程與人體癌癥演變過程非常相似。目前DEN已被國際腫瘤研究中心機構確定的致癌物質。微囊藻毒素MC是一種肝毒素，生物毒性作用的靶器官為肝臟?？蓮难褐修D移到肝臟，主要表現(xiàn)為使肝臟充血腫大，嚴重時可導致肝出血和壞死。大鼠肝癌模型的建立方法分為移植型和原發(fā)性兩種，移植型肝癌模型通常是將肝癌細胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水后分離成細胞懸液，再打開小鼠腹腔并將細胞懸液注射到小鼠肝臟建立模型。該模型成瘤時間較短，但無法觀察到肝癌發(fā)生的過程。原發(fā)性肝癌模型是利用化學致癌物質誘發(fā)大鼠肝癌緩慢發(fā)生，這種模型雖然時間較長，但可以觀察到肝癌發(fā)生發(fā)展的主要階段，有利于肝癌早期瘤前病變的檢測。目前國內外有很多用DEN誘發(fā)原發(fā)性大鼠肝癌的模型，一般采用0. 25% DEN水溶液灌胃或自由飲水的方法建立大鼠肝癌模型。該模型主要存在的問題是染毒劑量不準確，時間較長，如李笑巖等人用含二乙基亞硝胺(DEN，80X10_6)飲水建立大鼠肝癌模型，其模型1-8周為肝細胞損傷期，9-16周為增生-硬化期，17-25周為癌變期。而趙金明等以二乙基亞硝胺為啟動劑，藻毒素為促進劑， 構建大鼠腫瘤促進模型，觀察肝臟病理形態(tài)改變，分別運用免疫組化法、原位雜交法檢測肝細胞中GST-Pi蛋白和GST-Pi mRNA表達情況。結果顯示實驗組動物肝臟產(chǎn)生結節(jié)性增生灶，藻毒素單獨作用不能誘導GST-Pi蛋白和GST-Pi mRNA表達，但能夠促進DEN誘導產(chǎn)生的GST-Pi mRNA及蛋白表達。提示藻毒素具有促癌活性，但所用的藻毒素是從水華藍藻中的初提物，并沒有藻毒素純度及類別鑒定的數(shù)據(jù)，而藻毒素有60多種，不同時間、地點所收集的水體藻樣所中藻毒素的含量及類別是有差異的，這些增加了實驗結果的不確定性。另夕卜，所用的藻毒素劑量為20mg/kg. bw(高劑量)、5mg/kg. bw(低劑量)(相當于干藻細胞質量)，并沒有進行系列濃度實驗。藻毒素專一性地作用于肝臟，主要抑制蛋白磷酸酶PP1、PP2的活性，具有明顯的劑量-效應關系低劑量的藻毒素有促細胞生長作用，而高劑量可以誘導細胞凋亡，抑制細胞生長。因此，確定藻毒素類型及作用濃度范圍對于促癌模型的建立顯得尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是通過慢性毒理實驗，在低濃度下建立藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型，在這個過程中可以通過形態(tài)學、組織病理學和蛋白表達水平觀察到肝癌形成的主要階段，包括肝細胞損傷期，肝細胞增生-肝硬化期以及肝細胞癌變期。本發(fā)明的技術方案如下
一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立方法，步驟為
1.大鼠肝癌模型的建立
A、選取體重為150士5g的SD雄性大鼠15只，給予一周的適應時間，飼養(yǎng)期間給予充足的食物，并做好各項消毒措施；
B、用純水將DEN配成濃度為0.25%的溶液；
C、用無水甲醇將藻毒素純品粉末溶解，配制成lmg/ml的藻毒素溶液；
D、將0.25%的DEN溶液和lmg/ml的藻毒素溶液注射到大鼠腹腔內，使DEN終濃度為 10mg/kg,藻毒素終濃度為lOPg/kg ；
E、上述過程每五天進行一次，共處理4個月；
F、模型建立過程中始終觀察大鼠的食欲，飲水，皮毛，精神等情況；
2.形態(tài)學檢測
在每個月末以頸椎脫白法處死大鼠，打開腹腔，完整地取出肝臟后用PBS緩沖液清洗， 記錄體重、肝重并計算肝重體重比及觀察肝臟的顏色和質地，并拍照；
3.組織病理學檢測
取部分肝葉經(jīng)10%中性甲醛溶液固定Mh，石蠟包埋，切片后經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察細胞的變化；
4.GST-Pi蛋白表達含量檢測
將凍存于_80°C冰箱的肝組織取0. 5g于5ml PBS緩沖液中并加入IOOmM的酶抑制劑PMSF后進行超聲裂解，超聲一次時間為2S，停6S，共Hmin。超聲結束后4°C條件下 12000rpm/min離心10分鐘，取上清，用^festern Blot法檢測GST-Pi的表達含量。由附圖1可見模型組的大鼠肝重體重比隨藻毒素MC-LR處理時間的延長呈明顯遞增趨勢，其中，(DEN+MC-LR)處理組較DEN處理組肝重體重比增長較快，說明藻毒素lOPg/kg MC-LR具有明顯的促進肝細胞增生的作用。由圖2可見模型組在誘癌至1個月時，肝臟未見明顯異常，但無血色；誘癌至2個月時，肝臟質地由軟變硬，表面逐漸粗糙；至3個月時，肝臟質地較硬，出現(xiàn)肝硬化現(xiàn)象，并呈現(xiàn)出數(shù)量不等、大小不一的灰白色圓形病灶；至4個月時，肝臟表面粗糙，多個大小不一的灰白色癌結節(jié)，可見出血和壞死，解剖時腹水現(xiàn)象嚴重。HE病理形態(tài)學觀察結果
由圖3可見大鼠肝臟病理學改變大致分為三期(1)誘癌至1個月時為肝細胞損傷期， 細胞排列比較紊亂，胞漿疏松，炎癥細胞散在性分布于小葉中。(2)誘癌2個月至3個月時為肝細胞增生-硬化期，其中在2個月末肝細胞開始變性水腫，體積明顯變大，小葉內可見炎癥細胞侵潤嚴重；3個月末時肝組織肝硬化小膽管增生現(xiàn)象嚴重，由纖維組織包繞形成假小葉結構并出現(xiàn)癌細胞增生現(xiàn)象。(3)至4個月為肝細胞癌變期，細胞核明顯增大，胞核比例增大，核分裂相增多，尚可見多核和巨核細胞。由圖4不同時期GST-Pi蛋白表達含量檢測結果圖可以看到正常組織幾乎不表達GST-Pi, DEN聯(lián)合藻毒素MC-LR (lOPg/kg)處理組在1個月時GST-Pi開始表達，但表達量很少，約為正常組的1. 5倍；這與形態(tài)學和病理學上檢測為肝細胞損傷期結果一致。在2個月時，GST-Pi表達增強，表達量約為正常組的3倍；這與形態(tài)學和病理學檢測為肝細胞增生期的結果一致。在3個月時GST-Pi表達明顯增強，表達量約為正常組的4倍；這與形態(tài)學和病理學檢測為肝硬化期結果一致。4個月時GST-Pi表達量與正常組相比最高，這與形態(tài)學和病理學檢測為肝細胞癌變期結果一致。本發(fā)明的有益效果
1.成功建立藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)的大鼠肝癌模型；
2.大鼠肝臟外觀及病理學切片清晰地觀察到大鼠肝臟癌變的一系列過程，即肝細胞損傷期(1個月)，肝細胞增生-硬化期(2-3個月)和肝細胞癌變期(4個月)的組織水平及細胞水平的變化過程。3. GST-Pi蛋白檢測結果顯示，模型組中的肝癌發(fā)生的各個時期，GST-Pi的表達水平隨時間延長呈明顯遞增趨勢。本成果是利用微囊藻毒素MC-LR作為一種促癌劑，真正意義上快速誘發(fā)原發(fā)性肝癌模型。本項技術不僅可以用來研究原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的機制，同時也適用于腫瘤形成過程中各種指標檢測、肝癌診斷、治療和藥物的開發(fā)。因此，無論是對于人類健康，還是在經(jīng)濟、社會效益方面都具有良好的推廣應用前景。


圖1為模型組大鼠在不同時間段肝重體重比值變化圖； 圖2為模型組不同時間段大鼠肝臟表觀圖3模型組肝臟細胞不同時期的組織切片圖； 圖4模型組肝臟組織不同時期GST-Pi蛋白表達含量變化圖。
具體實施例方式1.選用雄性體重為150士5g左右的SD大鼠15只，并給予1周的適應時間，在大鼠飼養(yǎng)期間定期用0.01%的笨扎溴銨溶液擦拭浸泡消毒鼠籠，并及時更換墊料。飼養(yǎng)溫度控制在25 °C左右，并給予充分的食物。2.將DEN溶液稀釋成濃度為0. 25%的DEN溶液。3.用甲醇溶解藻毒素純品粉末，避光條件下震蕩5min，配制成lmg/ml的藻毒素母液。4.將0. 25%的DEN溶液和藻毒素溶液注射到大鼠腹腔內，使DEN終濃度為IOmg/ kg,藻毒素終濃度為lOPg/kg。5.上述過程每5天進行一次，共處理4個月。6.模型建立過程中始終觀察大鼠的食欲，飲水，皮毛，精神等情況。7.解剖大鼠，取肝臟，稱量體重、肝重和拍照等一系列形態(tài)學的觀察。8.取部分肝葉經(jīng)10%中性甲醛固定Mh，石蠟包埋，切片后經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察細胞的變化。9.將凍存于_80°C冰箱的肝組織取0. 5g于5ml PBS緩沖液中并加入IOOmM的酶抑制劑PMSF后進行超聲裂解，超聲一次時間為2S，停6S，共Hmin。超聲結束后4°C條件下12000rpm/min離心10分鐘，取上清進行電泳，利用GST-Pi的抗體檢測GST-Pi的表達含量。
權利要求
1.一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型建立的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)DEN聯(lián)合微囊藻毒素MC-LR建立大鼠肝癌模型；(2)形態(tài)學檢測；(3)病理學檢測；(4)GST-Pi蛋白表達含量檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于所述步驟(1)更為具體的步驟為A、選取體重為150士5gSD雄性大鼠15只，給予一周的適應時間，在大鼠飼養(yǎng)期間定期用0.01%的笨扎溴銨溶液擦拭浸泡消毒鼠籠，及時更換墊料，飼養(yǎng)溫度控制在25°C左右， 并給予充分的食物和水源；B、配制0.25%的DEN溶液和lmg/ml的藻毒素MC-LR甲醇溶液；C、模型組為腹腔注射0.25% DEN溶液和lmg/ml的藻毒素MC-LR甲醇溶液，使DEN終濃度為10mg/kg，藻毒素終濃度為10 μ g/kg ；D、以上實驗每五天給藥一次，共處理4個月；E、在不同時期，注意觀察大鼠食欲，飲水，皮毛，精神等情況。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于所述步驟( 更為具體的步驟為在每個月末以頸椎脫臼法處死大鼠，打開腹腔，完整地取出肝臟后用PBS緩沖液清洗，記錄體重，肝重并計算肝重與體重之比，同時觀察肝臟的顏色和質地，并拍照。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于所述步驟(3)的病理學檢測的具體操作方法為取部分肝葉經(jīng)用10%中性甲醛溶液固定Mh，石蠟包埋，切片后經(jīng)HE染色，用光鏡觀察細胞的變化。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種微囊藻毒素MC-LR促二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于步驟(4)所述的蛋白質含量測定的具體操作是將凍存于_80°C冰箱肝組織取出后進行超聲裂解，4°C條件下12000rpm/min離心10分鐘后，取上清液進行蛋白質免疫印跡，檢測GST-Pi的表達含量。
全文摘要
本發(fā)明是用二乙基亞硝胺DEN聯(lián)合藻毒素MC-LR通過腹腔注射到大鼠體內誘發(fā)大鼠肝癌模型。從肝重體重比、肝臟外觀、肝組織病理學切片、GST-Pi蛋白表達水平等指標清楚地展示了大鼠肝癌發(fā)生過程中的肝細胞損傷期，肝細胞增生-肝硬化期和肝細胞癌變期過程，并且發(fā)現(xiàn)DEN聯(lián)合藻毒素MC-LR比DEN單獨誘發(fā)的肝癌模型在同一時間效果更顯著，成瘤時間更短，是一種研究人體肝癌發(fā)生的理想模型。該模型的特點是清楚地展示了肝癌發(fā)生的各個階段，有利于對肝癌發(fā)生過程機制的研究、癌前病變的檢測以及治療藥物的開發(fā)。
文檔編號A61K38/12GK102524180SQ201110402408
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權日2011年12月7日
發(fā)明者孫韓艷, 徐昌志, 汪宇, 沈敬良, 黃蓓 申請人:安徽大學