專利名稱：氟西汀治療色素脫色疾病的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及氟西汀治療色素脫色疾病的用途。
背景技術：
色素脫失性皮膚病是由于皮膚黑素細胞缺失或合成黑素功能降低、受損而引起的一類常見的后天性色素減退性皮膚病。如白發(fā)為常見的色素脫失疾病，涉及人群廣泛。另皮膚疑難癥白癜風，此類皮膚病在世界各地均有發(fā)生，可以累及所有民族，其嚴重影響患者的正常生活。目前色素脫失性皮膚病的治療仍較困難，且復發(fā)率高。而現(xiàn)有的增色素藥物本身的促進色素合成作用不顯著，且臨床多用的局部外涂增色素藥(如補骨脂素)往往難以有效的發(fā)揮作用，且具光敏性。因此，開發(fā)療效確切的治療藥物的需求日趨緊迫。氟西汀(fluoxetine)，化學名為N-甲基-Y- -(三氟甲基)苯氧基]苯基丙胺， 臨床用的是氟西汀的鹽酸鹽，商品名為百憂解(Prozac )，由美國禮來公司開發(fā)，1987年在美首次上市，先后在英、法、德、日等國家應用，1996年在我國注冊(X960445)。其分子式為C17H18F3NO · HCl，分子量為345. 79，鹽酸鹽為白色結晶，熔點為179_182°C (分解)。氟西汀的主要藥理作用在于選擇性地抑制中樞神經系統(tǒng)突觸前膜對5-羥色胺的再攝取，故又稱為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑。氟西汀口服的吸收良好，吸收不受食物影響。血藥濃度6 他達峰值，其活性代謝產物去甲氟西汀半衰期為7 10d。腎排泄是主要的消除途徑約80%的藥物排在尿液中，15%的藥物排在大便中。氟西汀基本上經肝代謝，肝病可以影響其消除。在臨床上用于成人抑郁癥、強迫癥和神經性貪食癥的治療，還用于治療具有或不具有廣場恐懼癥的驚恐癥。氟西汀主要選擇性作用于5-羥色胺能系統(tǒng)，對膽堿能系統(tǒng)、腎上腺素能系統(tǒng)和組胺系統(tǒng)的作用很弱，所以與傳統(tǒng)的抗抑郁藥三環(huán)類、雜環(huán)類和單胺氧化酶抑制劑類相比具有療效好、不良反應輕而少、安全性高、耐受性好的特點。 其常見的不良反應有腸道不適和神經失調，如厭食、惡心、頭痛、失眠、流汗等。雖然氟西汀臨床應用廣泛、副作用少，但其對皮膚色素合成的影響從未被研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了氟西汀的一種治療用途，即其可用于治療色素脫色性疾病的用途， 特別是治療白發(fā)、白癜風的用途。下面是本發(fā)明的部分藥效學試驗及結果第一部分氟西汀對B16F10小鼠黑素瘤細胞系黑素合成的影響。一、氟西汀對B16F10細胞增值的影響MTT法測定細胞增值率取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的B16F10細胞，消化、計數(shù)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度為2. 2X IO4個/ml，接種量為180 μ 1/孔，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時；加入不同濃度的鹽酸氟西汀， 20 μ 1/孔，培養(yǎng)72小時；每孔加入20μ 1MTT，37°C培養(yǎng)箱中反應4小時；吸除上清液，每孔加入150 μ 1DMS0,平板搖床上振搖10分鐘；用微孔板測讀儀在波長為570nm處測定每孔的吸光值，計算細胞增殖率，結果見圖1。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀給藥組(0. 1-10 μ M)對B16F10細胞生長無顯著性影響(P > 0. 05)。實驗結論氟西汀(0. 1-10 μ Μ)對B16F10黑素瘤細胞顯示出較低的毒性及較低的
促癌作用。二、氟西汀對B16F10細胞酪氨酸酶活性的影響。L-DOPA氧化法測定酪氨酸酶活性取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的B16F10細胞，消化，計數(shù)，將細胞接種于6孔板中， 接種濃度約1 X IO5個/ml，接種量為aiil/孔，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時；換含2. 5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，1. 8ml/孔，加入不同濃度鹽酸氟西汀，0. 2ml/孔， 培養(yǎng)72小時；PBS洗2遍，收集細胞于doff管中，每管加入100 μ 1非變性裂解液(含InM PM SF)，4°C裂解20min，4°C，12000r/min離心lOmin，取上清用于蛋白定量(BCA法)，計算蛋白濃度；取含30 μ g蛋白體積加入96孔板，用PBS (0. ΙΜ,ρΗ 6.8)定量至100μ 1，再加入 0.01% L-DOPAlOOy 1，每一濃度設定3個復孔，37°C避光孵育60min，波長475nm處測定OD 值。計算每yg蛋白的吸光度值，結果以百分率表示，結果見圖2。圖2中與對照組相比ZP < 0. 05，**P < 0. 01。PSO 為補骨脂素。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀顯著促進B16F10細胞的酪氨酸酶活性；氟西汀1，5μΜ時，P < 0. 05 ；氟西汀10 μ M時，P < 0.01 ；最高濃度時，酶活提高率與陽性藥補骨脂素接近。實驗結論氟西汀具顯著的促進B16F10黑素瘤細胞黑素合成限速酶-酪氨酸酶活性效應。三、氟西汀對B16F10細胞黑素含量的影響。NaOH裂解法測定黑色素含量取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的B16F10細胞，消化，計數(shù)，將細胞接種于直徑IOcm 培養(yǎng)皿中，接種量為3 X IO5個/皿，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時；將培養(yǎng)基換為含2. 5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，并加入不同濃度鹽酸氟西汀，培養(yǎng)72小時；PBS洗 2遍，收集細胞，加入300ul非變性裂解液(含InM PMSF)，4°C裂解20min ；4°C，12000r/min 離心lOmin，取上清用于蛋白定量(BCA法)，計算總蛋白含量；下層黑色素沉淀加入200 μ 1 NaOH(含10% DMS0)，置于80°C水浴箱中裂解2小時；用黑素標準品繪制標準黑素含量曲線；將溶解完全的黑素以200 μ 1/孔加入96孔板中，405nm處測定吸光度值，計算每毫克蛋白的黑素含量，結果見圖3。圖3中與對照組相比，乍<0.05，<0.01。PSO為補骨脂
ο實驗結果與空白對照組相比，氟西汀(1-10μΜ)顯著增加B16F10細胞的黑素含量，氟西汀1 μ M時，P < 0. 05 ；氟西汀5，10 μ M時，P < 0. 01，且提高率超過陽性藥補骨脂
ο實驗結論氟西汀可顯著促進B16F10細胞黑素含量。四、氟西汀對B16F10細胞黑素合成重要蛋白TYR，TRP-I，TRP-2及MITF表達的影響。
Western Blotting法檢測黑素合成重要蛋白的表達取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的B16F10細胞，消化，計數(shù)，將細胞接種于6孔板中， 同上分組進行藥物處理，72h后收集細胞，加入細胞裂解液，離心取上清BCA法測定蛋白濃度后，調整蛋白裂解液到相同濃度，與等體積的2倍上樣緩沖液混勻，煮沸5min后進行 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳完畢后，用100V電壓轉移Ih將蛋白轉至測NC膜上， 用含5%脫脂牛奶的TBST(0. 05% Tween-20)封閉Ih ；將膜分別與溶于封閉液中的TYR、 TRP-1、TRP-2、MITF 及 β-actin—抗(1 200) 4°C孵育過夜，TBST 洗 5min，3 次；后加入相應二抗(1 4000)孵育lh，TBST洗3次，每次5min ；將膜浸沒于配置好的ECL超敏感光混合液，計時5min，暗室中采X線片壓膜發(fā)光；經顯影及定影獲得結果，并采用Bio-Rad 公司Quantity one軟件分析結果。結果見圖4、圖5。圖中與對照組相比，乍< 0. 05，**P <0.01。FLU表示氟西汀。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀可顯著提高B16F10細胞MITF、酪氨酸酶 (TYR)及酪氨酸酶相關蛋白I(TRP-I)的蛋白表達，差異具顯著性；而對酪氨酸酶相關蛋白 2 (TRP-2)的蛋白水平無明顯影響。實驗結論氟西汀可通過提高B16F10細胞黑素合成重要蛋白(MITF、TYR、TRP1)的表達而增加黑素含量。第二部分氟西汀對正常人原代黑素細胞黑素合成的影響一、氟西汀對人原代黑素細胞增值的影響MTT法測定細胞增值率取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的正常人原代黑素細胞，消化、計數(shù)，將細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，接種密度為5 X IO4個/ml，接種量為180 μ 1/孔，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)對小時；加入不同濃度的鹽酸氟西汀，培養(yǎng)72小時；每孔加入20 μ 1 MTT，37°C培養(yǎng)箱中反應4小時；吸除上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0，平板搖床上振搖10分鐘；用微孔板測讀儀在波長為570nm處測定每孔的吸光值，計算細胞增殖率。結果見圖6。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀給藥組對正常人原代黑素細胞生長無顯著性影響(P > 0. 05)。實驗結論氟西汀對人原代黑素細胞增殖無顯著影響，且顯示出較低的毒性。二、氟西汀對人原代黑素細胞酪氨酸酶活性的影響L-DOPA氧化法測定酪氨酸酶活性取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的人原代黑素細胞，消化，計數(shù)，將細胞接種于6孔板中，接種濃度約1 X IO5個/ml，接種量為aiil/孔，置37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時；加入不同濃度鹽酸氟西汀，培養(yǎng)72小時；PBS洗2遍，收集細胞于doff管中，每管加入 80 μ 1 非變性裂解液(含 InM PM SF)，4°C裂解 20min, 4°C, 12000r/min 離心 lOmin，取上清用于蛋白定量(BCA法)，計算蛋白濃度；取含10 μ g蛋白體積加入96孔板，用PBS (0. 1M，pH 6.8)定量至100 μ 1，再加入0.01% L-DOPA 100 μ 1，每一濃度設定3個復孔，37°C避光孵育 60min，波長475nm處測定OD值。計算每μ g蛋白的吸光度值，結果以百分率表示，結果見圖7。圖中與對照組相比，*P < 0. 05，**P < 0. 01。PSO表示補骨脂素。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀顯著促進人原代黑素細胞的酪氨酸酶活性(P <0.01)；且氟西汀5、10 μ M時，酶活提高率超過陽藥補骨脂素。實驗結論在所試濃度內，氟西汀具顯著的促進人原代黑素細胞黑素合成限速酶-酪氨酸酶活性效應。三、氟西汀對人原代黑素細胞黑素含量的影響
NaOH裂解法測定黑色素含量取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的人原代黑素細胞，消化，計數(shù)，將細胞接種于6孔板中，接種濃度約1 X IO5個/ml，接種量為2ml/孔，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；加入不同濃度鹽酸氟西汀，培養(yǎng)72小時；PBS洗2遍，收集細胞，加入80 μ 1非變性裂解液(含 InM PMSF)，4°C裂解 20min ；4°C，12000r/min 離心 lOmin，取上清用于蛋白定量(BCA 法)， 計算總蛋白含量；下層黑色素沉淀加入100 μ 1 NaOH(含10% DMSO)，置于80°C水浴箱中裂解2小時；用黑素標準品繪制標準黑素含量曲線；將溶解完全的黑素以100 μ 1/孔加入96 孔板中，405nm處測定吸光度值，計算每毫克蛋白的黑素含量，結果見圖8。圖中與對照組相比，*P < 0. 05，**P < O. 01。PSO 為補骨脂素。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀顯著增加人原代黑素細胞的黑素含量，(P < 0. 01)，且提高率接近或超過陽性藥補骨脂素。實驗結論氟西汀可顯著促進人原代黑素細胞黑素含量。四、氟西汀對人原代黑素細胞黑素合成重要蛋白TYR，TRP-I，TRP_2及MITF表達的影響。Western Blotting法檢測黑素合成重要蛋白的表達取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的人原代黑素細胞，消化，計數(shù)，將細胞接種于6孔板中，同上分組進行藥物處理，72h后收集細胞，加入細胞裂解液，離心取上清BCA法測定蛋白濃度后，調整蛋白裂解液到相同濃度，與等體積的2倍上樣緩沖液混勻，煮沸5min后進行 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳完畢后，用100V電壓轉移Ih將蛋白轉至測NC膜上， 用含5%脫脂牛奶的TBST(0. 05% Tween-20)封閉Ih ；將膜分別與溶于封閉液中的TYR、 TRP-1、TRP-2、MITF 及 β-actin—抗(1 200) 4°C孵育過夜，TBST 洗 5min，3 次；后加入相應二抗(1 4000)孵育lh，TBST洗3次，每次5min ；將膜浸沒于配置好的ECL超敏感光混合液，計時5min，暗室中采X線片壓膜發(fā)光；經顯影及定影獲得結果，并采用Bio-Rad公司Quantity one軟件分析結果。結果見圖9、圖10。圖中與對照組相比，< 0. 05，**P <0.01。FLU表示氟西汀。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀可顯著提高人原代黑素細胞MITF、酪氨酸酶(TYR)及酪氨酸酶相關蛋白I(TRP-I)的蛋白表達，差異具顯著性；而對酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)的蛋白水平無明顯影響。實驗結論氟西汀可通過提高人原代黑素細胞黑素合成重要蛋白(MITF、TYR、 TRP-1)的表達而增加黑素含量。第三部分氟西汀對脫毛同步化C57BL/6小鼠毛囊黑素及黑素合成蛋白表達的影響。一、氟西汀對C57BL/6小鼠皮膚毛囊黑素合成的影響C57BL/6小鼠適應性飼養(yǎng)后，于實驗前1天，用松香/石蠟混合物脫去動物背部毛發(fā)，以誘導同步的毛囊生長周期。動物隨機分為溶媒對照組(生理鹽水)和氟西汀給藥組O0mg/kg)，每組10只。參考臨床給藥方法，灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥12天。于給藥第12天拍照記錄小鼠背部皮膚顏色情況。結果見圖11。實驗結果小鼠背部皮膚照片顯示，給藥第12天時，與溶媒對照組相比，氟西汀給藥組小鼠脫毛區(qū)皮膚顏色顯著加深。實驗結論氟西汀灌胃給藥12天，可顯著促進脫毛同步化C57BL/6小鼠皮膚的黑素合成。二Western Blotting法檢測C57BL/6小鼠毛囊黑素合成重要蛋白的表達于第12天給藥后處死上述動物，采集皮膚樣本進行Wfestern Blotting實驗。取一定量的C57BL/6小鼠皮膚組織，剪碎，加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑，均漿并提取蛋白質；BCA法測定蛋白濃度后，調整蛋白裂解液到相同濃度，與等體積的2倍上樣緩沖液混勻， 煮沸5min后進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳完畢后，用100V電壓轉移Ih將蛋白轉至測NC膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST(0. 05% Tween-20)封閉Ih ；將膜分別與溶于封閉液中的 TYR、TRP-1、TRP-2、MITF 及 β-actin—抗(1 200) 4°C孵育過夜，TBST 洗 5min， 3次；后加入相應二抗(1 4000)孵育lh，TBST洗3次，每次5min ；將膜浸沒于配置好的 ECL超敏感光混合液，計時5min，暗室中采X線片壓膜發(fā)光；經顯影及定影獲得結果，并采用Bio-Rad公司Quantity one軟件分析結果。結果見圖12、圖13。圖中與對照組相比， < 0. 05, **Ρ < 0. Ol0 FLU 表示氟西汀組。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀可顯著提高C57BL/6小鼠脫毛同步化皮膚毛囊MITF、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白I(TRP-I)及酪氨酸酶相關蛋白2 (TRP-2)的蛋白表達，差異具顯著性。實驗結論氟西汀可通過提高C57BL/6小鼠脫毛同步化皮膚毛囊黑素細胞中黑素合成重要蛋白的表達而增加毛囊黑素含量。三、免疫組化法檢測C57BL/6小鼠毛囊黑素合成重要蛋白的表達于第12天給藥后處死上述動物，平行于脊柱線采集皮膚樣本。皮膚組織固定于 10%甲醛48h，石蠟包埋，沿毛囊縱向切片Gym)，分別進行HE、免疫組化染色。HE染色 常規(guī)蘇木素-伊紅染色。免疫組織化學染色切片脫蠟水化，3%過氧化氫室溫孵育lOmin， PBS沖洗5min，重復3次。熱抗原修復后滴加山羊血清封閉液封閉20min，加入兔源TYR、 TRP-I及TRP-2抗體4°C孵育過夜。PBS沖洗3次后加入TRITC標記的山羊抗兔IgG，37°C 孵育30min，PBS沖洗3次，每5min。加入抗熒光淬滅劑，封片。用一抗稀釋液代替一抗重復上述過程作為陰性對照實驗。每只動物選取2張皮膚切片，每張隨機選取5個視野，用熒光顯微鏡拍照記錄。結果見圖14。途中比例尺20ym;dp，毛乳頭。實驗結果與空白對照組相比，氟西汀可顯著提高C57BL/6小鼠脫毛同步化皮膚區(qū)，位于毛乳頭上方的毛囊黑素細胞酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白I(TRP-I)及酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)的蛋白表達。實驗結論與Wfestern Blotting結果一致，氟西汀可通過提高C57BL/6小鼠脫毛同步化皮膚毛囊黑素細胞中黑素合成重要蛋白的表達而增加毛囊黑素含量。


圖1是氟西汀對B16F10細胞生長的影響
圖2是氟西汀對B16F10細胞酪氨酸酶活性的影響圖3是氟西汀對B16F10細胞黑素含量的影響圖4是氟西汀對B16F10細胞黑素合成重要蛋白MITF，TYR，TRP-I及TRP-2蛋白表達的影響圖5是氟西汀對B16F10細胞黑素合成重要蛋白MITF，TYR，TRP-I及TRP-2條帶灰度掃描結果圖6是氟西汀對人原代黑素細胞增值的影響圖7是氟西汀對人原代黑素細胞酪氨酸酶活性的影響圖8是氟西汀對人原代黑素細胞黑素含量的影響圖9是氟西汀對人原代黑素細胞黑素合成重要蛋白MITF，TYR, TRP-I及TRP-2蛋白表達的影響圖10是氟西汀對人原代黑素細胞黑素合成重要蛋白MITF，TYR，TRP_1及TRP-2條帶灰度掃描結果。圖11是氟西汀給藥第12天脫毛同步化C57BL/6小鼠背部皮膚顏色情況圖12是氟西汀對C57BL/6小鼠毛囊黑素細胞MITF，TYR，TRP-I及TRP-2蛋白表達的影響圖13是氟西汀對C57BL/6小鼠毛囊黑素細胞MITF，TYR, TRP-I及TRP-2條帶灰度掃描結果圖14是C57BL/6小鼠毛囊黑素合成重要蛋白免疫組化結果。
權利要求
1.氟西汀用于制備治療和/或預防色素脫色疾病的藥物的用途。
2.權利要求1的用途，其中色素脫色疾病是白癜風。
3.權利要求1的用途，其中色素脫色疾病是白發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及氟西汀治療色素脫色疾病的用途。藥效學試驗證明氟西汀具有治療色素脫色疾病的功效，特別是治療白發(fā)、白癜風的功效。
文檔編號A61P17/00GK102429894SQ20111040317
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權日2011年12月7日
發(fā)明者周佳, 尚靖, 龐司林, 廖莎, 王倩, 田曉麗, 趙國銳, 金 雨 申請人:中國藥科大學