專利名稱：白細胞介素-27在制備抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及白細胞介素-27在制備抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒是引起流行性感冒的病原，甲型流感病毒呈球形，新分離的毒株則多呈絲狀，其直徑在80至120納米之間，絲狀流感病毒的長度可達400納米。流感病毒結(jié)構(gòu)自外而內(nèi)可分為包膜、基質(zhì)蛋白以及核心三部分。流感病毒分為甲、乙、丙三型，其中以甲型流感對人類威脅最大。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型，而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感病毒多為H5、H7和H9亞型，即H5m、H7N7、H9N2等，其中以H5m亞型病死率高。本發(fā)明主要以甲型流感病毒為研究對象，對白介素-27的抗病毒復(fù)制作用進行了探討。流感病毒屬正粘病毒科，是單股負鏈RNA病毒，基因組約為13. 61Λ，具有包膜的8 個片段，共編碼11種蛋白質(zhì)的單鏈負RNA病毒。與其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有 RNA(mRNA、cRNA, vRNA)的合成均在被感染細胞的核內(nèi)完成。mRNA在核內(nèi)合成后轉(zhuǎn)移到胞漿，合成病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白；而后開始裝配流感病毒，完成后以出芽方式釋放出子代病毒顆粒，進一步侵入新的宿主細胞。目前，流感仍屬未能有效控制的急性上呼吸道傳染病。由于流感病毒的抗原變異能力強，加之個體免疫力的不同，疫苗的保護率并不高，且疫苗只對已知的流感病毒亞型有預(yù)防作用，而對于由抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)換所產(chǎn)生的新型流感病毒無效。流感病毒感染將導(dǎo)致宿主細胞變性、壞死乃至脫落，造成粘膜充血、水腫和分泌物增加，從而產(chǎn)生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染癥狀，當(dāng)病毒蔓延至下呼吸道，則可能引起毛細支氣管炎和間質(zhì)性肺炎。流感病毒不僅感染人類而且感染畜禽類，給人類和畜禽的健康造成極大的威脅。白細胞介素27 (Interleukin 27，IL-27)是最近發(fā)現(xiàn)的I型細胞因子IL-6/IL-12 家族的新成員。IL-27是一個異源二聚體蛋白，由P^和Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)3蛋白組成。通過由TCCR/WSX-1組成的受體介導(dǎo)信號傳導(dǎo)。IL-27具有促進炎癥和抑制炎癥的作用，在橋接先天免疫和適應(yīng)性免疫中起到重要作用，并且調(diào)控INF-α、IFN-γ、IL-10、IL-17 和IL-21的表達。除此以外，IL-27還具有抑制HIV在⑶4+T細胞中復(fù)制，抑制HCV和HCV/ HIV共感染。IL-27通過與IL-27受體結(jié)合后，激活STATl，繼而促進轉(zhuǎn)錄因子T_bet、IL-12Rβ 和IFN-γ等的表達。在IL-27高表達的病毒性肝炎和腫瘤模型中，可增強⑶8+Τ細胞 IFN-Y產(chǎn)生，增強細胞毒作用和對腫瘤的清除能力。在自身免疫性疾病動物模型中如關(guān)節(jié)炎，IL-27可促進炎性反應(yīng)，而IL-27特異性抗體可改善動物模型中的炎性反應(yīng)。然而，在一些寄生蟲和細菌感染的IL-27受體缺失動物模型中，IL-27卻主要表現(xiàn)為T細胞反應(yīng)的拮抗因子。雖然內(nèi)源性IL-27在感染過程中促進細胞免疫反應(yīng)的證據(jù)有限，但是一些研究顯示它能促進自身免疫性疾病動物模型和腫瘤動物模型的炎癥反應(yīng)。在IL-27高表達的病毒性肝炎和腫瘤模型中，可增強CD8+T細胞INF- γ產(chǎn)生，增強細胞毒作用和對腫瘤的清除能力。另外，有報道在嚴(yán)重的由佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型和EAE小鼠模型可通過使用IL-27 特異性抗體從而改善其炎性反應(yīng)，在后一模型中使用IL-27p^能顯著增加INF-Y和TNF 的產(chǎn)生并放大炎癥反應(yīng)。雖然在最初的研究證實IL-27及其受體在促進Thl反應(yīng)中扮演重要角色，但最近的研究表明它們同時也抑制不同的免疫細胞反應(yīng)的過程，包括抑制免疫細胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生。IL-27及其受體的這種相互矛盾的作用，既可促進炎癥反應(yīng)又可抑制炎癥反應(yīng)，可能對調(diào)解控制機體的免疫平衡起到重要作用，進一步深入研究IL-27及其受體的生物學(xué)功能可更加完善地了解機體的免疫系統(tǒng)及免疫過程，從而為人們對控制和預(yù)防疾病將起到至關(guān)重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研究白細胞介素-27在流感病毒復(fù)制中的作用，探討流感病毒感染后誘導(dǎo)白介素-27表達上調(diào)的作用機制，從而揭示出白細胞介素-27在制備抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。白細胞介素-27在細胞和分子水平上對流感病毒復(fù)制有抑制作用，預(yù)示IL-27可以做為臨床抗病毒藥物而進一步研究開發(fā)。通過流感病毒感染上調(diào)IL-27在A549細胞和人外周血細胞中的表達實驗證實了流感病毒感染人外周血細胞能上調(diào)IL-27的表達，并以 A549細胞作為細胞模型來研究流感病毒誘導(dǎo)IL-27表達的分子機制；通過流感病毒感染通過CREB激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子實驗確定了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CREB在A型流感病毒感染激活 EBI3啟動子的過程中是必需的；通過PKA是A型流感病毒通過CREB激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子的上游信號通路的實驗，我們可以得出A型流感病毒感染通過PKA信號通路激活CREB，促進CREB結(jié)合到IL-27/EBI3啟動子，激活I(lǐng)L-27表達，同時，Ca離子信號通路又在PKA-CREB 信號通路的上游；通過流感病毒通過C0X-2/PGE2-PKA通路誘導(dǎo)IL-27表達實驗我們得出A 型流感病毒感染誘導(dǎo)炎癥因子C0X-2的高表達和其催化產(chǎn)物PGE2的累積，PGE2累積則激活 PKA-CREB信號通路，最后促進IL-27/EBI3啟動子的活化和IL-27的表達；通過IL-27可以通過激活PKR來抑制流感病毒的復(fù)制實驗我們得出流感病毒感染上調(diào)IL-27的表達是機體應(yīng)對病毒的入侵，自我防衛(wèi)的免疫機制，IL-27能起到類似干擾素的作用，激活抗病毒信號激活因子STATl和STAT2，促進抗病毒因子PKR的磷酸化，最終抑制流感病毒的復(fù)制；通過 IL-27在流感病人血清中表達水平和血清PGE2的臨床相關(guān)性實驗驗證了簽名細胞水平上 IL-27表和PGE2的關(guān)系，進一步說明了流感病毒感染，PGE2表達和IL-27上調(diào)的相關(guān)性?？傮w實驗揭示了尚未被發(fā)現(xiàn)的A型流感病毒感染誘導(dǎo)IL-27表達的機制。即A型流感病毒感染后，激活炎癥因子C0X-2的表達，C0X-2催化機體產(chǎn)生大量的PGE2，PGE2促及PKA的磷酸化，磷酸化后的PKA具有激酶活性，激活轉(zhuǎn)錄因子CREB轉(zhuǎn)核并結(jié)合到IL-27/ EBI3的啟動子上，促進IL-27的表達。同時A型流感病毒感染也能激活Ca依賴的PKA-CREB 信號通路，后者也能促進IL-27的表達。機體應(yīng)答流感病毒的感染產(chǎn)生的大量IL-27，IL-27 發(fā)揮類似與干擾素的作用，激活抗病毒信號通路和促進抗病毒因子的表達，最后抑制流感病毒的復(fù)制。臨床上，IL-27在流感病毒感染者血清中的高表達以及和PGE2的相關(guān)性，反過來證明了這里實驗在細胞水平的結(jié)果和臨床一致。本發(fā)明揭示了尚未被發(fā)現(xiàn)的A型流感病毒感染誘導(dǎo)IL-27表達的機制。在流感病毒感染細胞后能促進IL-27表達的上調(diào)，抑制病毒的復(fù)制，這一新發(fā)現(xiàn)為研制流感病毒藥物提供基礎(chǔ)。本發(fā)明實驗結(jié)果說明，白細胞介素-27是一種很有潛力的抗甲型流感病毒藥物， 可以用于制備抗甲型流感病毒藥物。本發(fā)明也公開了抗甲型流感病毒的藥物，其中含有白細胞介素-27，其制備方法按制藥工業(yè)現(xiàn)有技術(shù)制備。


圖IA型流感病毒可以上調(diào)IL-27在A549細胞和PBMCs中的表達。A. A/Hong Kong/H3N2感染上調(diào)IL-27在A549細胞中的表達。B. A/Hong Kong/H3N2 感染上調(diào) IL-27 在 PBMCs 中的表達。C. A/Hong Kong/H3N2感染后，IL-27在單核細胞和淋巴細胞中的表達情況。D. A/Hong Kong/H3N2 感染 PBMCs 后，IL-27 表達呈時間趨勢。E. A/Hong Kong/H3N2感染PBMCs后，IL-27兩個亞基基因的表達呈時間趨勢。圖2CREB在A型流感病毒感染激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子中是必須的。A. CREB截短和突變對A型流感病毒感染激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子的影響。B. SiCREB敲除對A型流感病毒感染激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子的影響。C. A型流感病毒感染促進CREB轉(zhuǎn)核。D. A型流感病毒感染促進CREB結(jié)合到IL-27/EBI3啟動子。圖3流感病毒通過PKA信號通路促進CREB激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子和IL-27表達。A.蛋白酶抑制劑篩選。B. PKA抑制劑H-89抑制流感病毒誘導(dǎo)IL-27表達。C.流感病毒感染促進PKA磷酸化。D. PKA抑制劑H-89抑制流感病毒促進CREB轉(zhuǎn)核。圖4有機化學(xué)試劑對細胞活性和病毒感染的影響。A.各種有機化學(xué)試劑對細胞活性的影響。B.各種有機化學(xué)試劑對流感病毒感染的影響，以病毒的NP蛋白是否存在來表示化學(xué)試劑是否影響了病毒的感染。圖5Ca離子參與了流感病毒通過PKA-CREB通路誘導(dǎo)IL-27表達。A-B. Ca離子螯合劑EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子。C. Ca離子螯合劑EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒誘導(dǎo)IL-27表達。D. Ca離子螯合劑EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒促進CREB轉(zhuǎn)核。圖6A型流感病毒通過C0X-2/PGE2-PKA信號通路誘導(dǎo)IL-27表達。A-C.過表達C0X-2上調(diào)IL-27表達，促進CREB轉(zhuǎn)核和PKA磷酸化。D-F.抑制C0X-2可抑制流感病毒感染誘導(dǎo)的IL-27表達，CREB轉(zhuǎn)核和PKA磷酸化而外源PGE2可以回復(fù)抑制。G-I. PGE2可以單獨上調(diào)IL-27表達，促進CREB轉(zhuǎn)核和PKA磷酸化，而這些誘導(dǎo)可以被PKA抑制劑所抑制。圖7重組人IL-27抑制流感病毒的復(fù)制。圖8IL-27抗流感病毒的機制。圖9IL-27的臨床水平和PGE2的相關(guān)性。
具體實施例方式白細胞介素-27目前已經(jīng)商品化，可以直接購得成品的白細胞介素-27。一、流感病毒感染上調(diào)IL-27在A549細胞和PBMCs中的表達(一 )實驗材料1、臨床樣本健康人全血來自獻血志愿者。2、生化試劑及試劑盒人外周血單核細胞(PBMCs)分離試齊[J pyrogen-free saline over Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, USA)購自武漢天源生物技術(shù)公司。LEGEND MAX Human IL-27 ELISA kit 購自 BioLegend(San Diego, CA, USA)?？俁NA 提取試劑盒 RNeasy Mini Kit 購自 Qigen (Dusselforf, Germany)。F12K 培養(yǎng)基，RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco-BRL，Gaithersburg, MD)購自武漢生命生物技術(shù)公司。細胞用青霉素和鏈霉素購自武漢大學(xué)校醫(yī)院。3、細胞和病毒毒株人肺癌細胞系A(chǔ)549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供，由本實驗室保存。4、逆轉(zhuǎn)錄酶等M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶夠自Promega公司。dNTP和熒光定量預(yù)混合物購自hvitrogen公司。Oligo dT(18T)和 RNase 抑制劑 RNasin 購自 Invitrogen 公司。5、耗材及儀器細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)皿和細胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司。4°C高速離心機、臺式小型高速離心機、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱和細胞操作臺購自 Herus0超純水系統(tǒng)購自Millipore。熒光定量PCR 系統(tǒng) LightCycler480II 購自 Roche。RNA提取所使用的RNase free的各種型號槍頭和EP管購自Eppendorf。常規(guī)PCR儀購自東勝創(chuàng)新。( 二)實驗方法1、哺乳動物細胞(貼壁)的培養(yǎng)(1)細胞復(fù)蘇1)預(yù)先準(zhǔn)備好37°C _38°C溫水，從液氮罐中取出需要復(fù)蘇的細胞，用眼科手術(shù)鑷子固定，迅速置于水中，保證凍存管完全浸沒與水中，使其均勻受熱，直到凍存管內(nèi)的細胞完全融化。2)用酒精消毒凍存管。3)用吸管預(yù)先吸取5ml細胞培養(yǎng)基于T25細胞培養(yǎng)瓶中，再用新的吸管將融化的細胞轉(zhuǎn)移到細胞瓶中并輕輕吹打一遍。4)蓋好細胞瓶蓋，將細胞瓶放置于細胞培養(yǎng)箱中，37°C，5% (體積比)CO2靜置培養(yǎng)。5)約6-8小時后(取決于不同的細胞)，更換信息培養(yǎng)基以消除細胞凍存液中存留的DMSO對細胞生長的影響。(2)細胞的傳代和凍存1)當(dāng)細胞長滿T25細胞瓶后，用吸管吸取培養(yǎng)基并棄去。2)加入IOml的PBS，輕柔洗滌細胞后用吸管吸取并棄去。3)用吸管吸取1-1. 5ml胰酶，使其覆蓋住細胞瓶底部，將細胞瓶放入37°C，5% CO2 細胞培養(yǎng)箱靜止3-5min(消化時間的長短取決于細胞種類)。4)顯微鏡觀察，貼壁細胞變圓并且全部從細胞瓶壁脫離。5)在細胞操作臺內(nèi)，用吸管吸取約培養(yǎng)基，加入細胞瓶內(nèi)，輕柔的吹打，以吹散細胞和中和胰酶的消化效果。6)用吸管吸取吹勻的細胞懸液(體積約1/3-2/3)到另一新的細胞瓶，再補加5ml 的培養(yǎng)基，放置于細胞培養(yǎng)箱中，37V,5% (體積比)CO2的環(huán)境下繼續(xù)靜置培養(yǎng)。(3)細胞的凍存1)處于生長旺盛期的細胞用胰酶消化下后，轉(zhuǎn)移到細胞離心管中，2000rpm離心 5min。2)用全血清重懸細胞，加入終濃度10% (質(zhì)量比)的凍存液DMS0，吹勻后分裝到細胞凍存關(guān)。3)做好標(biāo)記后，進行梯度降溫凍存細胞，即4°C放置lh，_20°C放置lh，_80°C過夜， 再轉(zhuǎn)到液氮罐中凍存。2、單核細胞(monocytes)和淋巴細胞(lymphocytes)PBMCs分離好計數(shù)，按一定的量接種于M孔細胞培養(yǎng)板，放置37°C，5% (體積比) CO2細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)池，此時單核細胞均貼壁生長，而淋巴細胞則懸浮生長。用移液器將培養(yǎng)全部轉(zhuǎn)移到新的細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)即分離得到淋巴細胞，再補充原體積的培養(yǎng)基到原細胞培養(yǎng)板中，即分離得到單核細胞。H3N2感染，polyI:C處理A549細胞、PBMCs、單核細胞和淋巴細胞。H3N2感染或polyl C誘導(dǎo)A549前，將含有胎牛血清的完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，H3N2感染的劑量為IMOI，polyl:C的終濃度為50 μ g。PBMCs，單核細胞和淋巴細胞的處理由于分離后為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，所以無需更換培養(yǎng)基，處理方法同A549細胞。感染或處理24h后，收集培養(yǎng)上清進行下一步實驗。3、ELISA試劑盒檢測 IL-27 表達水平(根據(jù) LEGEND MAX Human IL-27 ELISAKit)1)使用前l(fā)h，將試劑盒所有試劑放到室溫平衡。2)準(zhǔn)備500 μ 1濃度為16ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線母液。在6個EP管中依次倍比稀釋母液，得到濃度為 8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 和 0. 25ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品，另外以稀釋液作為Ong/ml。3)每孔加入300 μ 1 IX漂洗緩沖液振蕩洗滌所需要的ELISA板，吸水紙上拍干，
重復(fù)4次。4)每孔加入50 μ 1 Assay Buffer A和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均做3個復(fù)孔作為重復(fù)。5)用ELISA板密封膜將所以空密封，室溫，水平搖床放置池。6)棄去ELISA板中的溶液，每孔加入300 μ 1 IX漂洗緩沖液振蕩洗滌，并在吸水紙上拍干，重復(fù)4次。7)每孔加入100 μ 1 IL-27檢測抗體，用密封膜封好，室溫，水平搖床放置lh。8)棄去ELISA板中的溶液，每孔加入300 μ 1 IX漂洗緩沖液振蕩洗滌，并在吸水
紙上拍干，重復(fù)4次。9)每空加入100 μ 1 Avidin-HRP A溶液，用密封膜封好，避光，室溫，水平搖床放置 lh。10)棄去ELISA板中的溶液，每孔加入300 μ 1 1 X漂洗緩沖液振蕩洗滌，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。加入漂洗緩沖液后靜置30s到lmin，有助于減少背景。11)每孔加入100 μ 1底物溶液F，室溫避光放置15min，IL-27含量高的孔，此時溶
液顏色會變藍。12)每孔加入100 μ 1終止液，此時此時溶液顏色變成黃色。13) 30min內(nèi)，酶標(biāo)儀450nm參考波長，570nm校正波長讀板，450nm波長下的讀數(shù)減去570nm波長下的讀數(shù)即為最后的讀數(shù)。4、熒光定量PCR檢測IL-27兩個亞基EBI3和p28的mRNA表達水平(1)細胞總 RNA的提取(以用Qiagen試劑盒提前6孔板培養(yǎng)貼壁細胞為例)1)用移液槍吸取細胞培養(yǎng)板每個孔中的培養(yǎng)基并棄去，加入Iml預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次。2)加入600μ 1 Buffer RLT Plus，用槍反復(fù)吹吸，使細胞裂解均勻。3)將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至除gDNA的離心柱中，12000rpm離心30s，棄去離心柱，留溶液。4)加入1200 μ 1 70% (體積比)的乙醇到含離心溶液離心管中，輕輕吹打混勻。5)每700 μ 1混合物轉(zhuǎn)移到RNeasy離心柱中，12000rpm離心15s，保留離心柱，棄
去離心所得。6)向離心柱中加入500μ1 Buffer RPE，12000rpm離心15s，漂洗離心柱，棄去離心所得。7)向離心柱中加入500μ1 Buffer RPE，12000rpm離心2min，漂洗離心柱。8)將離心柱轉(zhuǎn)移到新的套管中，12000rpm離心lmin，以除去殘余的漂洗液。9)將離心柱轉(zhuǎn)移到新的套管中，加入50μ 1 RNase-free水溶解掛在離心柱上的 RNA, 12000rpm離心Imin得到總RNA，取2 μ 1 RNA溶液，在測定RNA濃度以進行下一步實驗。(2)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達水平1)在 PCR 管中按如下體系依次加入 M-MLV IOXbuffer 2. 5 μ 1，RNasin 0. 5μ 1，dNTP 2 μ 1，Olgio dT 3 μ 1，M-MLV 1 μ 1，用 RNase-free 水補足總體積至 25
Total RNA 溶液200 ngM-MLV 10 X緩沖液2.5 μ 1RNasin0.5 μ 1dNTP IOmM2μ 1Olgio dT3 μ 1M-MLV1 μ 1補足RNase-free水至25 μ 1
2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37°C lh, 75°C IOmin
Real-time反應(yīng)體系
1)目的基因的檢測引物和內(nèi)參引物
EBI3 :5’ -GAGCCAGGTACTACGTCCAA-3’(正義鏈，SEQ ID NO 1)
5，-GCTAGGCAGATCCCATCC-3，(反義鏈，SEQ ID NO 2)
p28 :5，-CGCTTTGCGGAATCTCAC-3，(正義鏈，SEQ ID NO 3),
5，-GGGCATGGAAGGGCTGAA-3，(反義鏈，SEQ ID NO 4)
GAPDH :5，-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3，(正義鏈，SEQ ID NO
5' -CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3‘(反義鏈，SEQ ID NO 6)
2)反應(yīng)體系L
2 X Real-time 混合物10μ 1cDNA產(chǎn)物2μ 1primer正義鏈2μ 1primer反義鏈2μ 1
補足RNase-free水至
25 μ 1
3)反應(yīng)條件
95 "C 95 "C 56 "C
72°C(采集熒光信號) 56 "C
5 min 30 s 30 s 30 s 1 min
I^I
45循環(huán)
溶解曲線分析
95 V
(三)實驗結(jié)果和討論
當(dāng)A型流感病毒1 MOI A/Hong Kong/H3N2感染A549細胞M小時或終濃度為50 μ g/ml的polyl :C作為模擬流感病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA模型作為對照誘導(dǎo)A549 細胞M小時后，和對照組相比IL-27的表達量都有顯著提高。病毒感染使IL-27的表達量從 176. 45士 19. 81pg/ml 上升到 327. 73士 13. 50pg/ml ；polyl :C 誘導(dǎo)使 IL-27 的表達量上升到245.88±21.36pg/ml(圖1A)。同樣的處理，在PBMCs中，H3N2感染使IL-27的表達量從 98. 00士26. 43pg/ml 上升到 309. 73士91. 54pg/ml ；polyl :C 誘導(dǎo)使 IL-27 的表達量上升到198. 17 士 37. 69pg/ml (圖IB)。由于PBMCs是淋巴細胞(B細胞和T細胞)、單核細胞 (包括為分化的單核細胞、由單核細胞分化而來的巨噬細胞和樹突狀細胞)的混合物。為了區(qū)分流感病毒感染哪一種類的細胞，淋巴細胞還是單核細胞，在分泌IL-27起主要作用， 我們又用IMOI的病毒或50 μ g/ml的polyl C分別感染或誘導(dǎo)貼壁生長的單核細胞和懸浮生長的淋巴細胞，結(jié)果顯示兩種細胞類型在應(yīng)答流感病毒感染或polyl C誘導(dǎo)時都產(chǎn)生大量的IL-27，但兩種細胞相比并無顯著性差異(圖1C)。因此，后面感染PBMCs實驗不再區(qū)分細胞類型。接著我們用1M0I H3N2感染PBMCs，再不同的時間點檢測IL-27的表達情況。 結(jié)果顯示，流感病毒感染PBMCs后，IL-27的表達呈現(xiàn)出時間梯度，對比0小時的IL-27表達量84. 24 士 20. 77pg/ml，感染6小時后的表達量上升為342. 00 士 13. 41pg/ml ；感染12小時后的表達量升到頂峰，為411. 04士38. 52pg/ml ；到M小時，IL-27的表達量略有下降，為 312. 49士26. 68pg/ml ；到 48 小時，IL-27 的表達量則進一步下降，為 167. 10士 18. 02pg/ml, 但仍顯著高于感染0小時的表達(圖ID)。由于IL-27是一個異源二聚體復(fù)合物，我們進一步檢測的流感病毒感染后，IL-27的兩個亞基EBI3和p^基因的表達情況。和IL-27蛋白表達水平一樣，兩個亞基EBI3和p^基因的表達水平也呈現(xiàn)出時間梯度。和0小時相比， 感染6小時后，EBI3和p^基因的表達水平即顯著上調(diào)。到12小時，p28基因的表達水平即達到峰值，并且從M小時到48小時開始逐漸降低；EBI3基因的表達水平則在感染后M 小時達到峰值，并且也是到48小時開始降低(圖1E)。該部分實驗表明流感病毒感染PBMCs能上調(diào)IL-27的表達。而感染A549細胞也同樣能上調(diào)IL-27的表達則為我們的后續(xù)實驗，即A549細胞可以作為細胞模型來研究流感病毒誘導(dǎo)IL-27表達的分子機制。對于流感病毒感染PBMCs后，IL-27的兩個亞基EBI3和 P28基因的表達水平在時間上不同步。P^基因的表達比EBI3基因的表達早12小時達到峰值，也印證了別人研究的結(jié)果，即P^的表達比EBI3早10-12小時。二、流感病毒感染通過CREB激活I(lǐng)L-27/EBI3啟動子(一)實驗材料1、細胞及病毒株同前所述。2、生化試劑及試劑盒轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)。熒光素酶活性報告基因試劑盒購自Promega公司。高純度基因組DNA提取試劑盒購自Qigen公司。核抽提物試劑盒購自Chemicon公司。DNA膠回收試劑盒購自Tiangen公司。兔多克隆抗體CREB，鼠單克隆抗體lamin A，prtoeinA/G購自Santa CruzBiotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA)。
3、工具酶和質(zhì)粒載體高保真Taq酶KOD購自日本Τ0Υ0Β0公司。限制性內(nèi)切酶MluI and BglII購自大連Takara公司。限制性內(nèi)切酶DpnI購自晶美公司。
T4 DNA連接酶購自Promega公司。pGL3載體購自Promega公司，由本室保存。pSliencer2. lU6_neo購自美國Ambion公司，由本室保存。pSliencer2. 1 U6_siCREB 有本室構(gòu)建保存。4、感受態(tài)細菌DH5a由本室保存。5、耗材及儀器熒光素酶活性檢測儀。超聲破碎儀、16°C低溫連接水浴鍋購自Fisher公司。凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀及Western轉(zhuǎn)膜儀購自北京君意東方公司。Western掃描系統(tǒng)購自日本富士公司。(二)實驗方法1、IL-27/EBI3啟動子的預(yù)測、克隆、截短和突變啟動子的預(yù)測由在線軟件 http //www. genomatix. de/cgi-bin/. /eldorado/ main, pi 完成。2、IL-27/EBI3啟動子的克隆之人基因組DNA的提取(以Qigen細胞基因組DNA提取試劑盒從H3N2感染的PBMCs提取DNA為例)1)H3N2感染PBMCs如前所述。2)用細胞刮輕輕刮動細胞生長面，使細胞全部從細胞培養(yǎng)板的生長面脫落，懸浮于培養(yǎng)液中。3)用移液槍將懸浮液轉(zhuǎn)移至EP管，500g離心;3min以收集細胞。4)加入預(yù)冷的PBS，重新懸浮細胞，500g離心;3min以清洗細胞，除去培養(yǎng)基。5)除去上清，加入Iml細胞裂解液，用移液槍反復(fù)吹打，是細胞均勻重懸，37°C放置，直至溶液均勻無細胞塊存在。6)加入 15 μ 1 RNase A，37°C放置 5min 以除去 RNA。7)加入Iml蛋白沉淀溶液，振蕩器最高速度振蕩20s。8) 13000g離心lmin，將上清轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，加入3ml異丙醇并上下顛倒輕柔混勻50次。9) 13000g離心lmin，棄去上清，此時DNA作為可見的白色小團被離到管底。10)加入:3ml 70 % (體積比)乙醇，上下顛倒洗滌DNA團。ll) 13000g離心lmin，棄去上清，空氣中干燥DNA團。12)加入250 μ 1 DNA溶解液，中速振蕩以促進DNA溶解。13) 65°C放置Ih以徹底溶解DNA，此時得到的DNA將作為模版供PCR使用。3、IL-27/EBI3啟動子的克隆、截短和突變1)引物
正義鏈5，-CTACGCGTTCTGTCATCCCCCTT-3，,(SEQ ID NO 7)反義鏈5’ -ATTAGATCTAGACATGATCCGAGGCCAGTCCTCG-3，(SEQ IDNO 8)-464/+142 正義鏈5，-CTACGCGTGTCTCTGTATCCCTC-3，, (SEQ ID NO 9)-105/+142 正義鏈5，-CTACGCGTGGCCTGTGCTCCCCA-3，, (SEQ ID NO 10)+50/+142 正義鏈5，-CTACGCGTTCCCACGACGTTCCC-3’ (SEQ ID NO 11)2)反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.白細胞介素-27用于制備抗甲型流感病毒藥物。
2.抗甲型流感病毒的藥物，其中含有白細胞介素-27。
全文摘要
本發(fā)明公開了白細胞介素-27在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證實白細胞介素-27在體外對A型流感病毒具有良好的抑制流感病毒復(fù)制的作用。用蛋白抗體芯片技術(shù)篩選到流感病毒感染的病人血清和體外感染的PBMCs中，IL-27都是顯著上調(diào)的，并且，A型流感病毒通過促炎因子COX-2激活PKA-CREB通路IL-27的表達，IL-27起到類似干擾素的作用來抑制病毒復(fù)制。
文檔編號A61P31/16GK102416164SQ20111041078
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者劉禮, 吳建國, 曹中瑩, 朱應(yīng) 申請人:武漢大學(xué)