專利名稱：用連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗及方法，特別是指一種用鵪鶉肉瘤纖維細(xì)胞QT6生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗及其方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病(Marek’s disease,MD)是由皰疫病毒科的馬立克氏病病毒(Marek’sdisease virus,MDV)引起的雞的一種傳染性腫瘤性疾病，以淋巴組織增生和腫瘤形成為特征，在外周神經(jīng)、性腺、虹膜各種臟器、肌肉和皮膚發(fā)生單核細(xì)胞浸潤。MD在臨床上引起腫瘤和死亡的同時，更重要的是損害感染雞的免疫器官，造成免疫抑制，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降和對接種疫苗的免疫應(yīng)答降低或不應(yīng)答，引發(fā)其他多種疾病的并發(fā)和繼發(fā)感染，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
疫苗接種仍是目前控制馬立克氏病的有效途徑之一。目前使用的商品化雞馬立克氏病疫苗大都是用原代 雞胚成纖維細(xì)胞作為制苗材料。制備原代細(xì)胞的方法不但費(fèi)時而且成本高。生產(chǎn)疫苗的大約30%的成本是用于制備雞胚成纖維細(xì)胞。疫苗生產(chǎn)十分依賴SPF種蛋的供應(yīng)。SPF禽群在特殊條件下飼養(yǎng)并且定期證明其不含禽類病原體。SPF種蛋的供應(yīng)的任何中斷都將中斷MDV疫苗的生產(chǎn)。并且每次制備的原代細(xì)胞勞動強(qiáng)度大，批間差異也大，從而引起質(zhì)量不穩(wěn)定，操作過程易污染，疫苗產(chǎn)量及質(zhì)量受到極大限制。
家禽養(yǎng)殖工業(yè)一直以來急需可用于生產(chǎn)馬立克氏病疫苗的連續(xù)傳代細(xì)胞系。盡管發(fā)展了許多禽類或哺乳動物細(xì)胞系(如EP0748867和EP0884382)，但依然沒有連續(xù)細(xì)胞系可以在馬立克氏病疫苗中作為有效的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的替代物。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種利用可連續(xù)傳代的傳代細(xì)胞系生產(chǎn)馬立克氏病疫苗，以實現(xiàn)通過使用可傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞系——鵪鶉肉瘤纖維細(xì)胞系QT6 (保藏號為ATCC CRL-1708)，替代原代雞胚成纖維細(xì)胞，用于連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗，從而獲得一種疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量高、批次差異小、免疫效力穩(wěn)定的馬立克氏病疫苗。
技術(shù)方案
一種連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的馬立克氏病疫苗，其中，每支馬立克氏病疫苗成品(2ml體積)中包含以下組分:
Ham' s F12K 培養(yǎng)液:1.4 1.7ml ；
胎牛血清:0.2 0.4ml ；
DMSO:0.1 0.2ml;
其中，馬立克氏病病毒含量> 6 X IO6PFU,所述的馬立克氏病病毒為使用傳代細(xì)胞系生產(chǎn)獲得。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述傳代細(xì)胞系為鵪鶉肉瘤纖維細(xì)胞系QT6，該細(xì)胞系為可傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞系，購自ATCC CRL-1708。
優(yōu)選地,本發(fā)明所述馬立克氏病病毒為馬立克氏病病毒CVI988/Rispens株,為商品化的病毒株，并在《雞馬立克氏病CVI988_Rispens毒株生物學(xué)特性的研究》(中國獸醫(yī)雜志，2002年第38卷第5期)中公開。
本發(fā)明對馬立克氏病病毒的類型沒有特別地限定，優(yōu)選地，本發(fā)明所述馬立克氏病病毒為血清I型、血清II型或血清III型中的任意一個或多個的組合。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述馬立克氏病疫苗為液氮疫苗或凍干疫苗。
上述馬立克氏病病毒及馬立克氏病疫苗是通過下述方法獲得的，即用連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)馬立克氏病疫苗的方法，包括以下步驟:
I)傳代細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):將傳代細(xì)胞使用細(xì)胞分散液進(jìn)行消化傳代，用細(xì)胞生長液培養(yǎng)，以形成良好的細(xì)胞單層；
2)細(xì)胞毒種的繁殖:將馬立克氏病病毒在步驟I)獲得的形成良好的細(xì)胞單層的傳代細(xì)胞繼代，以獲得工作種毒；
3)工作種毒的繁殖:將步驟I)獲得的形成良好的細(xì)胞單層的傳代細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長液，接種含細(xì)胞維持液的工作種毒，在37 38°C下培養(yǎng)；
4)當(dāng)培養(yǎng)至CPE彡80%以上時，收獲馬立克氏病病毒，并配苗分裝以獲得馬立克氏病疫苗。
其中，配苗之前收獲馬立克氏病病毒的方法為:
培養(yǎng)至80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)致病變效應(yīng)時，即可收獲，棄去細(xì)胞維持液，加入EDTA-胰酶細(xì)胞分散液，使消化液與細(xì)胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入細(xì)胞維持液，停止消化，收獲馬立克氏病病毒，無菌檢驗后，分至離心瓶中；于2 8°C、1500r/min離心10 20min,離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞(其含有馬立克氏病病毒)。
其中，配苗時使用的培養(yǎng)液及比例如下:
體積75 85%的Ham' s F12K培養(yǎng)液(不加血清)，PH值調(diào)為7.2 ;體積10 20%的胎牛血清和體積5 10%的DMS0，加入收集的沉淀細(xì)胞中，搖勻，取樣做收獲前的無菌檢驗，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)后，定量分裝到無菌安瓿瓶中封口。
優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中步驟4)還包括將獲得的馬立克氏病疫苗進(jìn)行降溫，至-90°C _120°C時將疫苗放入液氮中保存，以獲得馬立克氏病液氮疫苗的過程。
優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中傳代細(xì)胞`為鵪鶉肉瘤纖維細(xì)胞系QT6。
優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中所述馬立克氏病病毒為馬立克氏病病毒CVI988/Rispens 株。
優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中馬立克氏病病毒為血清I型、血清II型或血清III型中的任意一個或多個的組合。
技術(shù)效果
本發(fā)明使用傳代細(xì)胞生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗的方法，至少具有以下優(yōu)點:
I)無需在每次生產(chǎn)疫苗時都制備原代雞胚成纖維細(xì)胞，不但大大降低了生產(chǎn)成本，也簡化了操作程序，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定、易操作，使病毒產(chǎn)量大幅度的提高。
2)本發(fā)明生產(chǎn)的雞馬立克氏病毒疫苗質(zhì)量優(yōu)良，批間差異小，免疫效力高，免疫效果穩(wěn)定O


圖1為本發(fā)明使用傳代細(xì)胞生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗的流程圖。
具體實施方式
以下結(jié)合說明書附圖及具體實施例來對發(fā)明作進(jìn)一步的描述:
實施例1傳代細(xì)胞生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗的方法
(I)制苗用QT6細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):
QT6細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，一瓶傳三瓶，用細(xì)胞生長液于37°C繼續(xù)培養(yǎng)，每4天傳一代。形成良好單層時，即可用于繼續(xù)傳代或接種病毒。細(xì)胞接種密度為2X 105cells/ml ；
(2)細(xì)胞毒種的繁殖:
取液氮保存的雞馬立克氏病毒CVI988/RiSpenS株，在上述細(xì)胞上復(fù)壯繼代I 2代，制備工作種毒；
(3)接種工作毒種:
取已形成良好單層的10000ml細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，棄去細(xì)胞生長液，接種含CVI988/Rispens株的維持液1000ml，每毫升含I 2萬個含毒細(xì)胞，在37 38°C下轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。
(4)收獲:
培養(yǎng)至80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)致病變效應(yīng)時，即可收獲，棄去維持液，加入28mlEDTA-胰酶細(xì)胞分散液，使消化液與細(xì)胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入維持液，停止消化，收獲，無菌檢驗后，分至離心瓶中；
(5)離心提取細(xì)胞:
于2 8 、1500r/min離心10 20min,離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞；
(6)配苗分裝:
將配苗體積75 85%的培養(yǎng)液、配苗體積10 20 %的胎牛血清和配苗體積5 10%的DMS0，混勻后加入收集的沉淀細(xì)胞中，搖勻，取樣做收獲前的無菌檢驗，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)后，分裝到無菌安瓿瓶中，2ml/瓶，封口，使每毫升所含的病毒蝕斑數(shù)不低于3 X IO6PFU ；
(7)程序降溫:
利用程序降溫儀進(jìn)行程序降溫，待苗溫降至_90°C _120°C時將疫苗放入液氮中保存；
上述步驟可參考本發(fā)明的附圖1。
(8)疫苗稀釋液配制:
普通肉湯培養(yǎng)基50ml ;L_ 谷氨酸單鈉 0.83g ；KH2PO4 0.52g ；Κ2ΗΡ04.3H20 1.64g ；蔗糖76.62g，加去離子水配成1000ml，115°C高壓滅菌20min，經(jīng)檢驗無菌后4°C保存，疫苗使用前稀釋使用。
上述細(xì)胞生長液為5%胎牛血清濃度的Ham' s F12K培養(yǎng)液，PH值調(diào)為7.2 ;維持液為3%胎牛血清濃度的Ham' s F12K培養(yǎng)液，PH值調(diào)為7.4 ;配苗用Ham' s F12K培養(yǎng)液不加血清，PH值調(diào)為7.2。胎牛血清的生產(chǎn)廠家是PAA Laboratories GmbH。
上述EDTA-胰酶細(xì)胞分散液的配制方法:
0.02%乙二胺四乙酸二鈉溶液配制(EDTA):乙二胺四乙酸二鈉溶液配制(EDTA) 0.2g ；NaCl 8.0g ;Na2HP04.12H20 1.15g ；KC1 0.2g ；KH2PO4 0.2g ;葡萄糖0.2g ;補(bǔ)去離子水至1000ml溶解后分裝，高壓滅菌(15磅15min)4°C保存；
0.25 %胰蛋白酶:胰蛋白酶0.25g溶于IOOml 0.0lM PH7.4的PBS，過濾分裝，-20°C保存。
0.0lM PH7.4 的PBS:7.9g NaCl, 0.2g KCl，0.24g KH2PO4 (或 1.44gNa2HP04)和 1.8gK2HPO4，溶于800ml去離子水中，調(diào)PH值至7.4，最后加去離子水定容至1000ml。于4°C冰箱中保存即可。
臨用時0.25%胰蛋白酶與0.02%的乙二胺四乙酸二鈉溶液配制(EDTA)按1: 4混合即為EDTA-胰酶細(xì)胞分散液。
實施例2雞馬立克氏病疫苗與使用CEF細(xì)胞制備雞馬立克氏病疫苗的比較研究
1制備現(xiàn)有的雞馬立克氏病疫苗主要步驟如下:
(1)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)單層的制備:
選擇10日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酊棉球消毒氣室部位，再用75%的酒精棉球脫碘，無菌挑出胚體置于無菌平皿中，用0.1M的PBS洗滌胚體并去除眼睛、爪及內(nèi)臟，然后采用連續(xù)消化法制備CEF懸液，制成150萬/ml的細(xì)胞密度，混勻后接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶。；
(2)細(xì)胞毒種的繁殖:
取實施例1中的雞馬立克氏病毒CVI988/Rispens株，在上述CEF上復(fù)壯繼代I 2代，制備工作種毒；
(3)接種病毒:
將培養(yǎng)24h生長狀態(tài)良好的細(xì)胞單層的10000ml轉(zhuǎn)瓶，棄去培養(yǎng)液，接種含CVI988/Rispens株的維持液1000ml，每毫升含I 2萬個含毒細(xì)胞，在37 38°C下轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。
(4)收獲:
當(dāng)80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)典型病變時，即可收獲。棄去維持液，加入28ml EDTA-胰酶細(xì)胞分散液，使消化液與細(xì)胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入維持液，停止消化，收獲，無菌檢驗后，分至離心瓶中；
(5)離心提取細(xì)胞:
于2 8°C、1500r/min離心10 20min，離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞；
(6)配苗分裝:
將配苗體積75 85%的培養(yǎng)液、配苗體積10 20 %的胎牛血清和配苗體積5 10%的DMS0，混勻后加入收集的沉淀細(xì)胞中，搖勻，取樣做收獲前的無菌檢驗，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)后，分裝到無菌安瓿瓶中，2ml/瓶，封口，使每毫升所含的病毒蝕斑數(shù)不低于3X 1O6PFU ；
(7)程序降溫:
利用程序降溫儀進(jìn)行程序降溫，待苗溫降至_90°C _120°C時將疫苗放入液氮中保存；
上述細(xì)胞生長液為4%胎牛血清的M199培養(yǎng)液；維持液為2%胎牛血清的M199培養(yǎng)液；配苗用M199營養(yǎng)液不加血清。
(8)疫苗稀釋液配制:
普通肉湯培養(yǎng)基50ml ;L_ 谷氨酸單鈉 0.83g ；KH2PO4 0.52g ；Κ2ΗΡ04.3H20 1.64g ；蔗糖76.62g，加去離子水配成1000ml，115°C高壓滅菌20min，經(jīng)檢驗無菌后4°C保存?zhèn)溆谩?br> 2免疫比較:
將160只由北京梅里亞維通實驗技術(shù)有限公司提供的I日齡SPF雞，隨機(jī)分成4組，每組40只。免疫組共2組，分別接種實施例1生產(chǎn)的雞馬立克氏病疫苗和使用原代雞胚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)的雞馬立克氏病疫苗，用疫苗稀釋液稀釋后每只頸背部皮下注射0.2ml (含2000PFU)。另外2組為非免疫組，其中一組為不免疫也不攻毒對照組(空白對照)，另一組為攻毒對照組(陽性對照組)。4組雞分別在隔離器中飼養(yǎng)，喂給消毒的飼料和飲水。
3 攻毒:
免疫后21天，將免疫組和陽性對照組分別接種馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株京-1株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保藏號CVCC AV86)，lml/支。攻毒時，分別用M199培養(yǎng)液作10倍稀釋，每只雞腹腔注射0.5ml。繼續(xù)在隔離其中飼養(yǎng)，每天觀察、記錄發(fā)病和死亡情況，對死亡雞及時剖檢，觀察病變。攻毒后63天，對存活雞剖檢觀察肉眼病變，計算保護(hù)指數(shù)。
4實驗結(jié)果:
疫苗免疫組的攻毒保護(hù)結(jié)果:
結(jié)果表明，兩組雞馬立克氏病疫苗均能有效抵抗MD標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒的攻擊，保護(hù)指數(shù)分別為90.6%、87.5%。具體數(shù)據(jù)見表I。
表I免疫組和對照組接種強(qiáng)毒后的保護(hù)指數(shù)和死亡情況表
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的馬立克氏病疫苗，其特征在于， 每2ml馬立克氏病疫苗成品包含以下組分:Ham' s F12K 培養(yǎng)液:1.4 1.7ml ； 胎牛血清:0.2 0.4ml ； DMSO:0.1 0.2ml ； 馬立克氏病病毒含量> 6X IO6PFU,其中，所述的馬立克氏病病毒為使用傳代細(xì)胞系生產(chǎn)獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬立克氏病疫苗，其特征在于，所述傳代細(xì)胞系為鵪鶉肉瘤纖維細(xì)胞系QT6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬立克氏病疫苗，其特征在于，所述馬立克氏病病毒為馬立克氏病病毒CVI988/Rispens株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬立克氏病疫苗，其特征在于，所述馬立克氏病病毒為血清I型、血清II型或血清III型中的任意一個或多個的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬立克氏病疫苗，其特征在于，所述馬立克氏病疫苗為液氮疫苗或凍干疫苗。
6.一種用連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)馬立克氏病疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將傳代細(xì)胞使用細(xì)胞分散液進(jìn)行消化傳代，用細(xì)胞生長液培養(yǎng)，以形成良好的細(xì)胞單層； 2)將馬立克氏病病毒在步驟I)獲得的形成良好的細(xì)胞單層的傳代細(xì)胞繼代，以獲得工作種毒； 3)將步驟I)獲得的形成良好的細(xì)胞單層的傳代細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長液，接種含細(xì)胞維持液的工作種毒，在37 38°C下培養(yǎng)，以繁殖馬立克氏病病毒； 4)當(dāng)培養(yǎng)至CPE≥ 80%以上時，沉淀細(xì)胞，收獲馬立克氏病病毒，并配苗分裝以獲得馬立克氏病疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟4)還包括將獲得的馬立克氏病疫苗進(jìn)行降溫，至_90°C _120°C時將疫苗放入液氮中保存，以獲得馬立克氏病液氮疫苗的過程。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述傳代細(xì)胞為鵪鶉肉瘤纖維細(xì)胞系QT6。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述馬立克氏病病毒為馬立克氏病病毒 CVI988/Rispens 株。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述馬立克氏病病毒為血清I型、血清II型或血清III型中的任意一個或多個的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用可傳代細(xì)胞系生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗的方法，包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)；(2)細(xì)胞毒種的繁殖；(3)接種病毒；(4)離心提取細(xì)胞，收獲病毒；(5)配苗分裝。本發(fā)明使用傳代細(xì)胞替代原代雞胚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗大大降低了生產(chǎn)成本，且具有生產(chǎn)工藝簡單且穩(wěn)定、易操作，病毒蝕斑含量高，批間差異小，質(zhì)量易控制，可顯著提高疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn)的雞馬立克氏病疫苗對標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株有較高的免疫效力，免疫效果高于同類制品。
文檔編號A61P31/22GK103157107SQ201110420140
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者張許科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司