專利名稱：一種羅非魚用口服疫苗免疫佐劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羅非魚用口服疫苗免疫佐劑，具體涉及一種羅非魚重組分泌型熱休克蛋白70蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，近20年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的疫病頻繁發(fā)生，經(jīng)濟損失嚴(yán)重，據(jù)不完全統(tǒng)計，全國每年水產(chǎn)養(yǎng)殖以疫病為主的病害發(fā)病率達50%以上，損失率20%左右，年經(jīng)濟損失達數(shù)百億元，并且還有上升的趨勢，疫病已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大制約因素之一。1942年，Duff次應(yīng)用滅活的殺鮭產(chǎn)氣 單胞菌(A. salmonicida) 口服免疫硬頭鱒獲得成功，開創(chuàng)了疫苗在魚類應(yīng)用的歷史。之后，弧菌病菌苗、腸道性紅嘴病(ERM)菌苗等獲得了成功，使人們認(rèn)識到應(yīng)用疫苗預(yù)防魚類疾病的可能，1975年美國疫苗有限公司(AVI)開始生產(chǎn)商品性魚用疫苗ERM菌苗。目前，在挪威等發(fā)達國家，已出現(xiàn)許多商品化的魚用疫苗，但這些疫苗大多以注射或浸浴的方式接種，口服免疫的很少。大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖場采用注射法進行預(yù)防接種，顯然比較麻煩，特別是在進行多種疾病的防治過程中，要耗費大量的人力和時間，同時會對魚體組織器官造成一定的損害，對于規(guī)格較小的稚魚或幼魚，其難度將更大。相比之下，通過口服免疫接種，則安全易行、實用方便，不受魚體大小的限制，且使用量比浸浴免疫要少，更易為廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖戶所接受。但目前研制的魚類口服疫苗普遍存在免疫效果差、免疫期短、成本高等各種不利于推廣的因素。羅非魚是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要品種，中國羅非魚產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的55%，其中出口量22. 44萬噸，是我國水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯主要品種之一。近年來隨著片面地重視規(guī)模發(fā)展和追求高產(chǎn)，造成病害頻頻暴發(fā)，養(yǎng)殖發(fā)病率高達75%。對廣東、廣西和海南羅非魚養(yǎng)殖病害的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鏈球菌病是羅非魚養(yǎng)殖的主要病害，并且有逐年遞增的均勢。按2010年我國羅非魚產(chǎn)量計算，估計鏈球菌病給我國羅非魚產(chǎn)業(yè)造成的直接經(jīng)濟損失就高達15-30億元。病害的暴發(fā)與隨之帶來的產(chǎn)品安全問題已成為制約我國羅非魚產(chǎn)業(yè)繼續(xù)向前發(fā)展的瓶頸。然而，目前缺乏一套行之有效的方案預(yù)防和治療該病，藥物只能在早期起到控制病情的輔助性作用，但隨著耐藥和抗藥性的產(chǎn)生和積累，該病的現(xiàn)狀幾乎是“無藥可治可防”。由于傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防控魚類傳染病導(dǎo)致病原體產(chǎn)生抗藥性、污染環(huán)境、藥物殘留等，使用疫苗防控魚類病害逐漸成為更為理想的魚病防治手段。近幾十年來，隨著魚用疫苗的發(fā)展和應(yīng)用，與魚用疫苗密切相關(guān)的魚用免疫佐劑和免疫增強劑的研究也越來越受到重視。免疫增強劑是指一些化學(xué)物質(zhì)、藥物、應(yīng)激原或某些能引起特異、非特異性免疫反應(yīng)活動，增強動物對病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等抵抗的物質(zhì)；免疫佐劑，是能非特異性地改變或增強機體對抗原的特異性免疫應(yīng)答，增強相應(yīng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型，本身無免疫原性，發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)，屬于免疫增強劑的范疇。免疫佐劑和免疫增強劑的研制與應(yīng)用對魚類病害的防控有重要意義，目前水產(chǎn)常用的免疫佐劑或免疫增強劑主要有以下幾類(一 )油類及礦物質(zhì)類包括弗氏佐劑、鋁鹽佐劑、微硅粉等。弗氏佐劑是免疫學(xué)上廣泛應(yīng)用的一種油類佐劑，分為弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，近幾十年來一直都有弗氏佐劑在魚類免疫上應(yīng)用的報道，應(yīng)用弗氏佐劑后可顯著提高特異性抗體水平，大量的實驗都證明弗氏佐劑是一種極為有效的佐劑，但是弗氏佐劑在應(yīng)用中造成魚類腹部損傷的副作用很明顯，因此有學(xué)者認(rèn)為該佐劑不太可能應(yīng)用到生產(chǎn)當(dāng)中。這類免疫佐劑或免疫增強劑普遍存在使用副作用大等缺點。( 二 )微生物來源類包括霍亂毒素、葡聚糖、肽聚糖、脂多糖、殼多糖等?；魜y毒素尤其是它無毒的B亞單位可以與動物細(xì)胞膜成分結(jié)合，是一種有效的哺乳動物粘膜免疫佐劑，但在魚類中應(yīng)用的佐劑效應(yīng)顯示的不明顯。葡聚糖在水產(chǎn)動物中的免疫增強效果有較為廣泛而深入的研究，當(dāng)福爾馬林滅活的殺鮭氣單胞菌與葡聚糖混合后接種大西洋鮭，與單獨注射全菌疫苗相比，前者分別針對殺鮭氣單胞菌的全菌、外膜、LPS的血清抗體水平顯著提高，但是攻毒試驗顯示試驗魚接種疫苗后沒有產(chǎn)生有效的針對殺鮭氣單胞菌的免疫保護作用。這類免疫佐劑或免疫增強劑多為借鑒人或畜牧應(yīng)用經(jīng)驗，在魚類中的應(yīng)用效果和應(yīng)用方法還需進一步深入研究。、
(三)動植物來源類包括蜂膠、甘草皂苷、伴刀豆球蛋白A等，這些免疫佐劑或免疫增強劑的使用均能不同程度的增強魚類非特異性或特異性免疫，但特異性和針對性較尋層。(四)生物活性分子類包括細(xì)胞因子、含有CpG的寡聚脫氧核糖核苷酸、激素、乳鐵蛋白等。細(xì)胞因子是一類具有特定生物學(xué)功能的多肽或糖蛋白，近年來，魚類細(xì)胞因子的研究已取得較大進展，特別是一批免疫相關(guān)的細(xì)胞因子及其基因被鑒定和克隆，在這些細(xì)胞因子中，已有部分被證實是有效的免疫增強劑和免疫佐劑，可用于魚類病害的免疫防治。用體外表達的鯉魚IL-I的一段C端多肽與福爾馬林滅活的嗜水氣單胞菌共同注射鯉魚，檢測到特異性抗體滴度顯著提高，并且沒有哺乳動物中出現(xiàn)的發(fā)熱等副作用，表現(xiàn)出良好的佐劑效應(yīng)。這類免疫佐劑或免疫增強劑對基礎(chǔ)研究要求較高，開發(fā)難度大。隨著分子生物學(xué)的進步和魚類免疫學(xué)的發(fā)展，可以根據(jù)魚類自身免疫特點針對性的設(shè)計表達生物活性分子，生物活性分子免疫佐劑和免疫增強劑的優(yōu)點越來越突出，面對水產(chǎn)養(yǎng)殖病害越來越嚴(yán)重的趨勢，迫切需要研制開發(fā)新型生物活性分子免疫佐劑和免疫增強劑。熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp)是廣泛存在于生物界中進化上具有高度保守性的一組蛋白，現(xiàn)已證實Hsp家族中的一些成員具有分子伴侶及免疫佐劑功能，Hsps呈遞抗原分子過程中同時輔助抗原分子成熟，具有潛在的免疫功能，在免疫系統(tǒng)激活中起雙重作用。Hsp70為Hsps家族重要一員，其分子的N端具有結(jié)合ATP功能,C端可結(jié)合蛋白和肽類分子，Hsp70通過與ATP結(jié)合及對ATP水解促使Hsp70與蛋白和肽類的結(jié)合、解離，并維持蛋白正確構(gòu)象，防止蛋白易位過程中產(chǎn)生過早性折疊及損害性折疊。研究表明Hsp70結(jié)合抗原分子向抗原呈遞細(xì)胞遞呈抗原，并可激活A(yù)PCs分泌細(xì)胞因子。Hsp70-肽復(fù)合物或肽-Hsp70融合蛋白中的Hsp70不但具有分子伴侶作用，而且可激活T或B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)。研究表明體外培養(yǎng)中添加Hsp70與蛋白gp33可誘導(dǎo)部分樹突細(xì)胞成熟，體內(nèi)同時給與Hsp70與蛋白gp33可倒轉(zhuǎn)T細(xì)胞自身免疫耐受作用。另外，重組人熱休克蛋白70可在體外誘導(dǎo)部分DCs的成熟，作為疫苗佐劑時則可顯著提高特異性抗體滴度，呈現(xiàn)出高效免疫佐劑作用。從小鼠腫瘤移植實驗中偶然發(fā)現(xiàn)Hsp70具有腫瘤免疫原性以來，Hsp70參與腫瘤免疫研究成為Hsps家族研究的熱點。進一步研究證實，Hsp70參與的腫瘤免疫中，抗原性來之于與Hsp70結(jié)合的多肽，Hsp70則通過參與抗原呈遞起作用。近20年已大量開展了抗腫瘤、病毒、細(xì)菌及寄生蟲病原多種Hsp70分子疫苗的設(shè)計研究，抗腫瘤Hsp70分子疫苗已完成了 1、2和3期臨床試驗。熱休克蛋白70雖然在人免疫佐劑和免疫增強劑、腫瘤疫苗等方面被廣泛研究，但對于人和其它動物，魚類對免疫佐劑和免疫增強劑的應(yīng)答有其自身的特點，而基于魚類免疫機理的熱休克蛋白70作為魚類免疫佐劑和免疫增強劑的研究還未見報道。面對魚類口服疫苗及免疫佐劑免疫增強劑應(yīng)用存在的問題，迫切需要一種有效免疫佐劑的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述魚用免疫佐劑和免疫增強劑及魚類口服疫苗開發(fā)存在的問題，本發(fā)明主要解決的問題是提供一種羅非魚用口服疫苗免疫佐劑，該佐劑還具有免疫增強劑作用。
為實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下(1)39°C熱激羅非魚3min (分鐘)，無菌采血IOml (毫升)；(2)用TRIZOL法進行血細(xì)胞總RNA抽提并檢測其質(zhì)量；(3)利用熱休克蛋白70互補DNA (cDNA)序列，設(shè)計合成上下游引物Hsp70F、Hsp70R，分別引入EcoRl和AvrII兩個酶切位點；(4)摸索RT-PCR條件，在最佳條件下進行羅非魚Hsp70的大量擴增；(5)瓊脂糖凝膠電泳回收的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pPIC9k分別經(jīng)EcoRl和Sacll酶消化，消化產(chǎn)物去磷酸化并回收特異片段，用T4DNA連接酶進行連接及鑒定；(6)連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并用Zeocin抗生素LB平板進行選擇培養(yǎng)，對陽性克隆進行酶切鑒定及核酸測序鑒定；(7)大量制備pPIC9k-Hsp70質(zhì)粒并用BstXI酶消化線性化，同時用山梨醇法制備感受態(tài)畢赤酵母，通過電穿孔儀將線性化的pPIC9k-Hsp70質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)畢赤酵母，在Zeocin的YPD板上選擇培養(yǎng)，對菌斑進行PCR鑒定；(8)利用甲醇對多個陽性克隆工程酵母進行目的蛋白誘導(dǎo)表達，在48h/72h分別取上清進行SDS-PAGE電泳分析，選擇表達量較高的克隆進行表達時間及PH值優(yōu)化，并對候選菌株進行多次傳代及誘導(dǎo)表達，篩選出高效穩(wěn)定分泌表達酵母工程菌株；(9)用Ni-NTA agarose親和層析柱純化pPIC9k_Hsp70誘導(dǎo)上清,用40mM咪唑洗脫目的蛋白，并進行脫鹽和濃縮，制的熱休克蛋白70蛋白，即重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白(tHsp70)ο上述RT-PCR擴增熱休克蛋白70cDNA所用引物Hsp70F、Hsp70R,分別加入保護堿基和酶切位點Hspf-EcoRI 5， CGGAC GAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC 3’保護堿基EcoRIHspr-AvrII 5’ TATTT CCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT 3’保護堿基AvrII上述RT-PCR的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘；進行35個循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。
上述酵母菌表達載體是pPIC9k質(zhì)粒DNA。上述羅非魚重組分泌型熱休克蛋白70蛋白的制備方法，包括如下順序的步驟(一)熱休克蛋白70基因的克隆I.熱應(yīng)激處理
試驗魚在500L大水缸內(nèi)暫養(yǎng)I周后(水溫約25°C，氣泵充氣)，將其放入39°C水溫下IOmin進行熱應(yīng)激，然后在室溫下放置6h。2.總 RNA 抽提用75%酒精棉球?qū)υ囼烎~表面擦洗消毒，置于無菌托盤上，用肝素鈉溶液潤洗后的5ml注射器進行尾靜脈采血。將同一品系3尾魚的血液混合成I份。取混合血液O. 2ml (約
2.OX IO7個血細(xì)胞)加入ImlTrizol試劑，劇烈震蕩至液體完全透明，室溫作用5min ;力口入O. 2ml氯仿劇烈震蕩30s后室溫作用5min，4°C，12000gX 15min ;小心吸取上層水相，力口入 O. 5ml 異丙醇 _20°C沉淀 30min，4°C，12000gX10min ;棄上清，加 Iml 75% 乙醇，4°C，7500gX5min洗滌沉淀兩次；室溫干燥15min，加適量DEPC水溶解(55°C水浴助溶5min)。核酸蛋白測定儀測量OD值和變性電泳檢測其完整性。3.引物設(shè)計根據(jù)羅非魚的熱休克蛋白70cDNA序列(http://www. ncbi. nlm. nih. gov),設(shè)計合成上下游引物Hspf-EcoRI、Hspr_AvrII,分別引入EcoRl和AvrII兩個酶切位點，理論擴增片段大小為1945bp，包括Hsp70基因的完整編碼區(qū)。Hspf-EcoRI 5， CGGAC GAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC 3’保護堿基EcoRIHspr-AvrII 5’ TATTT CCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT 3’保護堿基AvrII4. RT-PCR擴增及克隆以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，反應(yīng)體系為
H2O2.25pL (微升)
MgC 12(25 mmol/L)2 μι
IOxAMV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液I pL
dNTP(10 mmol/L)I μ
反轉(zhuǎn)錄通用弓I物(25 μιηοΙ/L)I μL
反轉(zhuǎn)錄酶(5 U/L)0.5 μL
RNA 酶抑制劑(40 υ/μ )0.25 μL
RNA模板2 μL混勻，30°C下保溫10111；[11,421€下退火反應(yīng)30111；[11,951€下滅活反轉(zhuǎn)錄酶5111；[11,51€下冷卻5min。PCR擴增目的基因PCR擴增反應(yīng)體系(總體積50 μ L)
模板4 μL
Hspf-EcoRI (25 pmol/pL)IpL
Hspr-AvrII (25 pmol^L)I μι
IOxLA PCR Buffer5 pL
dNTP MixtureI μΙ>
TaqDNA 聚合酶0.25 μL
ddH2050 μι擴增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性I分鐘，55. 6°C退火45分鐘，72°C延伸45秒，共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。Hsp70基因克隆取5 μ LPCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的I %瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察，切下1923bp的目的DNA條帶，使用Agarose Gel DNA purificationKit(TaKaRa公司)回收純化PCR產(chǎn)物，連接到pMD18_T載體中，按照NEB Double Digest軟件推薦，選用酶切反應(yīng)體系，進行雙酶切反應(yīng)。5.重組質(zhì)粒的粘端連接按Vector DNA Insert DNA的I : 3 10摩爾比在10 μ I反應(yīng)體系進行連接
Seq3BPCR 產(chǎn)物(Avrll/EcoRI)4 μ
pPIC9k (Avrll/EcoRI)3 μ1(50η§)
T4 DNA ligase0.5 μ
IOxBuffer1.5 μ
ddH20I μ 6.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化采用諾賽化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化效率> IO8)，按常規(guī)42°C熱擊法進行轉(zhuǎn)化。重組體DNA加入新鮮制備的感受態(tài)菌中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴熱休克90秒，立即轉(zhuǎn)入冰浴2分鐘，加800 μ I的LB培養(yǎng)基，37°C緩慢搖動I小時，I, OOOrpm(轉(zhuǎn)每分鐘)離心lOmin，倒去培養(yǎng)液，另加150 μ I的LB培養(yǎng)基懸起轉(zhuǎn)化菌，涂布于含有(Amp，100 μ g/mL)的LB瓊脂板上，同時做陰性對照一板，37°C過夜倒置培養(yǎng)。7.質(zhì)粒DNA的限制性酶切鑒定按照NEB Double Digest軟件推薦，選用酶切反應(yīng)體系，進行雙酶切反應(yīng)，酶切結(jié)果正確者送測序。( _.)熱休克蛋白70基因的表達I.線性化質(zhì)粒DNA按照PmeI反應(yīng)體系要求，在80 μ I NEB Buffer4反應(yīng)體系中37°C 4h酶切2 μ gpPIC9k-Hsp70和pPIC9k質(zhì)粒進行質(zhì)粒DNA線性化。2.重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞取80 μ I酵母感受態(tài)細(xì)胞與5 μ I線性化DNA (O. I μ g)混合，冰上放置5min ;轉(zhuǎn)入預(yù)冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化(1500v,5ms);立即取出電擊杯,加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇至電擊杯中，輕輕混勻，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入滅菌離心管中。取適量涂于MD平板上30°C培養(yǎng)。3. PCR鑒定陽性克隆取少量酵母菌液，利用Hsp70特異性的上下游引物，通過PCR反應(yīng)進行陽性克隆鑒定。4.重組Hsp70蛋白的小量誘導(dǎo)表達
挑取單克隆，接種至含IOml BMGY培養(yǎng)基的試管中，28-30°C，250-300rpm搖床培養(yǎng)至0D600 = 2-6 (約16-18小時)，利用本實驗室建立的甲醇誘導(dǎo)表達方法進行蛋白誘導(dǎo)表達，在誘導(dǎo)后24h、48h、72h、96h的時間點，分別取200 μ I培養(yǎng)基至Iml離心管，通過SDS-PAGE分析檢測重組蛋白表達水平，確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時間為72-96h。5.重組Hsp70蛋白大量誘導(dǎo)重組酵母菌表達挑取經(jīng)過小量誘導(dǎo)表達篩選出的較高表達水平的菌株，接種至含IOml BMGY培養(yǎng)基的試管中，28-30°C，260rpm搖床培養(yǎng)至0D600 = 2-6 (約16-18小時)，將IOml培養(yǎng)物接種至含IL BMGY的3L搖瓶中，28-30°C劇烈震蕩，260rpm，至對數(shù)生長期(0D600 = 2-6)。用滅菌離心管，室溫2000g離心5min收集細(xì)胞。誘導(dǎo)表達時，去除上清，將細(xì)胞重懸于300mlBMMY培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基加至2L搖瓶中，用2層滅菌紗布蓋住，放入28-30°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)(260rpm)。甲醇誘導(dǎo)至72小時,室溫2000g離心5min收集上清。(三)熱休克蛋白70蛋白純化I.親和層析用Ni-NTA agarose (QIANGEN)親和層析柱純化 pPIC9k_Hsp70 誘導(dǎo)上清，用 40mM咪唑洗脫目的蛋白。2.脫鹽利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對Hsp70用HiTrap Desalting預(yù)裝柱進行脫鹽,收集蛋白峰組分用超濾離心管進行濃縮，由于蛋白峰和咪唑峰較接近，超濾同時再進行更換緩沖液，將蛋白保存在PBS (pH7. 3)緩沖液中。3.濃縮將脫鹽后的蛋白用超濾離心管進行濃縮。上述重組羅非魚熱休克蛋白70作為佐劑在羅非魚用口服疫苗的應(yīng)用。重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白作為免疫佐劑用于羅非魚病害防治的口服疫苗。重組羅非魚熱休克蛋白70作為免疫增強劑用于羅非魚養(yǎng)殖。重組羅非魚熱休克蛋白70用于預(yù)防或治療魚類病害，特別是預(yù)防或治療羅非魚鏈球菌病感染的藥物組合。采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明利用從羅非魚血液中克隆的熱休克蛋白70基因，構(gòu)建出一種新型的熱休克蛋白70分泌型酵母表達載體pPIC9K-Hsp70。此表達載體具有引導(dǎo)蛋白出胞的信號肽，可使產(chǎn)物分泌出細(xì)胞，有利于產(chǎn)品的純化和生產(chǎn)。通過電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入比赤酵母菌中進行表達，從酵母菌的培養(yǎng)上清中獲得有活性的重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白，經(jīng)純化后可作為羅非魚免疫增強劑和羅非魚鏈球菌病疫苗免疫佐劑，可有效提高魚體免疫力和疫苗的免疫效果，特別是在羅非魚病害防治中進行應(yīng)用，如口服疫苗。具體實施效果如下(一 )重組羅非魚熱休克蛋白70、重組羅非魚熱休克蛋白70-抗原復(fù)合物對腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響I.巨噬細(xì)胞NO ( 一氧化氮)及吞噬活性檢測分別制備羅非魚鏈球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原復(fù)合物，設(shè)12個試驗組tHsp70_thallus (菌體)復(fù)合物組(菌體量均為 I. 0 X 106cell)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I u g/mL 3 個濃度；tHsp70-ECP 復(fù)合物組(ECP 量均為 lug), Hsp70 設(shè) 100 u g/mL> 10 V- g/mL 和 I ii g/mL 3 個濃度；tHsp70 刺激組設(shè) IOOii g/mL、IOy g/mL、I u g/mL 3 個濃度；另設(shè)thallus (1.0X106cell)、ECP (I U g)及無刺激物3個對照組，每組設(shè)3個試驗平行、 L。將分離到的腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，每孔100 y L (細(xì)胞個數(shù)約I X IO5)，培養(yǎng)24h，吸走未貼壁細(xì)胞并加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸去培養(yǎng)基上清，加入190 u L新培養(yǎng)基及10 ii L上述準(zhǔn)備好各種刺激物，繼續(xù)培養(yǎng)。于刺激后24h和48h分別吸取50 ii L培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板，按NO檢測試劑盒(Promega, USA)操作說明進行NO濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和樣品NO檢測。同時，按巨曬細(xì)胞吞曬活性檢測試劑盒(Jiancheng, Nanjin, China)說明進行抗原刺激48h各試驗孔巨噬細(xì)胞吞噬活性的檢測。培養(yǎng)基中加入tHsp70 (100 U g/mL, 10 U g/mL和I ii g/mL三個濃度)均可顯著刺激羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞的貼壁和生長，細(xì)胞間突觸樣的細(xì)胞連接明顯增多，其中以濃度為IOOii g/mL的tHsp70試驗組細(xì)胞生長狀態(tài)最好。NO檢測結(jié)果顯示(圖I)，除tHsp70-thallus 復(fù)合物(tHsp70 濃度為 100 u g/mL)和 tHsp70(100ii g/mL)兩個試驗組 NO釋放顯著(P< 0.05)，其余組NO釋放水平在24h差異不明顯。tHsp70-ECP復(fù)合物(tHsp70濃度為100 u g/mL)可顯著增強巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生(P < 0. 01)。tHsp70 (100 u g/mL)單獨作用也可刺激巨噬細(xì)胞NO釋放(P < 0. 05)。腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性檢測結(jié)果顯示(圖2)，海豚鏈球菌菌體或ECP與tHsp70體外非共價結(jié)合后，濃度為IOOil g/mL的tHsp70試驗組可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性(P<0.05)。tHsp70 (100 ii g/mL，10 ii g/mL和I ii g/mL)單獨作用同樣可以提高巨噬細(xì)胞吞噬活性，濃度為100 Ii g/mL的tHsp70試驗組最顯著(P < 0. 01)。2.免疫相關(guān)基因表達檢測分別制備羅非魚鏈球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原復(fù)合物，設(shè)12個試驗組Hsp70_thallus 復(fù)合物組(菌體量均為 I. OX 106cell)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I ii g/mL3 個濃度；tHsp70-ECP 復(fù)合物組(ECP 量均為 lug), Hsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 V- g/mL 和 I ii g/mL 3 個濃度；tHsp70 刺激組設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL、I u g/mL 3 個濃度；另設(shè)thallus (I. OX 106cell)、ECP(I U g)及無刺激物3個對照組，每組設(shè)3個試驗平行孔。刺激24h后對PGK、MMP9、ICER、MHC II四個免疫相關(guān)基因進行定量檢測。此夕卜，對tHsp70-thallus復(fù)合物(菌體量為I X 106，tHsp70濃度為100 u g/mL)，菌體(1.0X106cell)和無刺激對照組的上述四基因進行了 12、24、48和72h 4個時間點的表達定量分析。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示(圖3)，tHsp70_抗原復(fù)合物(tHsp70濃度為100 u g/mL)及單獨tHsp70 (100 i! g/mL)刺激羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞24h均可極顯著提高其IL-8，Hsp70, CXCR4和PGRN四個基因表達水平(P < 0. 01，相對于菌體或ECP單獨作用)，10 u g/mL和I ii g/mL兩個濃度作用不明顯(P > 0. 05)。相對于無刺激物對照組，菌體和ECP也可以提高腹腔巨噬細(xì)胞IL-8，Hsp70, CXCR4和PGRN四個基因的表達(P < 0. 01)。羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞12h，24h，48h和72h四個時間點基因表達結(jié)果顯示(圖4)，tHsp70-菌體復(fù)合物組IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四個基因的在四個時間點的表達量均極顯著高于菌體組和無刺激對照組(P < 0. 01)。從12h開始菌體組IL-8和Hsp70表達量超過無刺激對照組(P < 0. 05) ；CXCR4和PGRN從48h開始菌體組表達量才超過無刺激對照組(P < 0. 05)。另外，IL-8表達峰值出現(xiàn)在48h，而Hsp70，CXCR4和PGRN三個基因一直呈上升趨勢。上述實驗結(jié)果表明tHsp70單獨使用或tHsp70與抗原聯(lián)合使用均可提高腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放并增強其吞噬活性，顯著調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達，顯示出很好的免疫佐劑和 免疫增強劑功能。( 二)重組羅非魚熱休克蛋白70對外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的影響I.魚熱休克蛋白70提高外周血淋巴細(xì)胞增殖活性分別制備羅非魚鏈球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原復(fù)合物，將分離的外周血淋巴細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)12h后加入相應(yīng)的刺激物，實驗共設(shè)12個試驗組tHsp70_thallus 復(fù)合物組(菌體量均為 1.0X 106cell)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和I U g/mL 3 個濃度；tHsp70-ECP 復(fù)合物組(ECP 量均為 lug), Hsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 Iii g/mL 3 個濃度；tHsp70 刺激組設(shè) 100 ii g/mL、10 ii g/mL、I ii g/mL 3 個濃度；另設(shè)thallus (I. OXlO6Cell) ,ECP (I U g)及無刺激物3個對照組，每組設(shè)3個試驗平行孔。刺激24h后按BrdU Cell Proliferation Assay (GE)操作說明測定外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性。檢測結(jié)果顯示(圖5):濃度為IOii g/mL的Hsp70和Hsp70_thallus均可極顯著促進羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖(P < 0. 01);海豚鏈球菌菌體對羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖活性也有顯著增強作用(P < 0. 05)，而ECP對羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖活性有一定的抑制作用(P = 0. 056)。但當(dāng)ECP與濃度為10 u g/mL的tHsp70體外非共價結(jié)合形成復(fù)合物后可減輕其對細(xì)胞增殖的抑制作用，濃度為100 u g/mL和I ii g/mL的tHsp70與抗原作用后其差異不明顯。2.重組羅非魚熱休克蛋白70對外周血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)分別制備羅非魚鏈球菌CMS005菌株抗原及tHsp70-抗原復(fù)合物，將分離的外周血淋巴細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)12h后加入相應(yīng)的刺激物，實驗共設(shè)12個試驗組tHsp70_thallus 復(fù)合物組(菌體量均為 1.0X 106cell)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I ii g/mL 3 個濃度；tHsp70_ECP 復(fù)合物組(ECP 量均為 I U g)，Hsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 V- g/mL 和 I ii g/mL 3 個濃度；tHsp70 刺激組設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL、I u g/mL 3個濃度；另設(shè)thallus (I. OX IO6ceIl)、ECP (I u g)及無刺激物3個對照組，每組設(shè)3個試驗平行孔。刺激24h后對PGK、MMP9、ICER、MHC II四個免疫相關(guān)基因進行定量檢測。此外，對tHsp70_thallus復(fù)合物(菌體量為IXlO6, tHsp70濃度為100 u g/mL),菌體(1. 0 X IO6ce11)和無刺激對照組的上述四基因進行了 12h、24h、48h和72h四個時間點的表達定量分析。如圖6所示，濃度為100 U g/mL的tHsp70與海豚鏈球菌菌體或ECP體外非共價結(jié)合形成的tHsp70-抗原復(fù)合物及單獨的tHsp70刺激羅非魚外周血淋巴細(xì)胞24h均可以極顯著提高其 PGK，ICER, MMP9and MHC II 四個基因的表達(P < 0. 01)，10 y g/mL 和 I y g/mL兩個濃度對PGK，MMP9and MHC II三個基因的表達也有提高(P < 0. 05)，100 u g/mL與10ug/mUu g/mL兩個濃度的作用結(jié)果差異顯著(P < 0. 01)。羅非魚外周血淋巴細(xì)胞12h，24h，48h and 72h四個時間點基因表達結(jié)果顯示(圖7)，tHsp70_菌體復(fù)合物組的PGK，ICER,MMP9and MHC II四個基因在4個時間點的表達量均極顯著高于菌體組和無刺激對照組(P < 0. 01);從24h開始，菌體組與對照組4個基因表達量開始出現(xiàn)差異，48h后菌體組明顯高于對照組(P < 0. 05)。同時，ICER和MHC II兩個基因在48h均達到表達峰值，而PGK和MMP9兩個基因一直呈上升趨勢。
上述實驗結(jié)果表明Hsp70單獨使用或Hsp70與抗原聯(lián)合使用均可提高外周血淋巴細(xì)胞增值活性，顯著調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達，顯示出很好的免疫佐劑和免疫增強劑功能。(三)魚熱休克蛋白70作為免疫佐劑和免疫增強劑的效果使用已公開報道的方法制備殼聚糖-海藻酸鈉微粒，利用該技術(shù)分別包裹熱休克蛋白70-菌體、熱休克蛋白70、菌體、空微粒，分別拌魚用膨化飼料曬干后在ld、7d、14d飼喂免疫羅非魚，同時設(shè)空白對照組。最后一次免疫結(jié)束10天后，使用CMS005菌株3倍半數(shù)致死量進行攻毒，計算各組的相對免疫保護率。結(jié)果顯示熱休克蛋白70-菌體組、熱休克蛋白70組、菌體組、空微粒組相對免疫保護率分別為78. 57%,60. 71%,53. 57%U0. 71%，表明熱休克蛋白70具有良好的免疫佐劑和免疫增強劑作用。


圖ltHsp70對體外培養(yǎng)羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放的影響a/A代表與medium(培養(yǎng)基)對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ;b/B代表tHsp70-thallus復(fù)合物和tHsp70-ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP對照組的方差分析，其 P < 0. 05/0. 01。圖2tHsp70對體外培養(yǎng)羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響a/A代表與medium對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ；b/B代表tHsp70-thallus復(fù)合物和tHsp70-ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP對照組的方差分析，其 P < 0. 05/0. 01。圖3tHsp70對腹腔巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達影響的濃度效應(yīng)a/A代表與medium對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ；b/B代表tHsp70-thallus復(fù)合物和tHsp70-ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP對照組的方差分析，其 P < 0. 05/0. 01。圖4tHsp70對腹腔巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達影響的時間效應(yīng)a/A代表與medium對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ；b/B代表tHsp70-thallus復(fù)合物和tHsp70-ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP對照組的方差分析，其 P < 0. 05/0. 01。圖5tHsp70對羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖活性影響a/A代表與medium對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ；b/B代表tHsp70-thallus復(fù)合物和tHsp70-ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP對照組的方差分析，其 P < 0. 05/0. 01。圖6tHsp70對外周血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達影響的濃度效應(yīng)a/A代表與medium對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ；b/B代表tHsp70-thallus復(fù)合物和tHsp70-ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP 對照組的方差分析，其 P < 0. 05/0. 01。圖7tHsp70對外周血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達影響的時間效應(yīng)a/A代表與medium對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01 ；b/B代表tHsp70_thallus復(fù)合物和tHsp70_ECP復(fù)合物與對應(yīng)的thallus和ECP對照組的方差分析，其P < 0. 05/0. 01。圖8重組Hsp70蛋白誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化。圖9Hsp70蛋白用HiTrap Desalting預(yù)裝柱進行脫鹽。圖10tHsp70與不同量胞外產(chǎn)物ECP非共價結(jié)合后SDS-PAGE電泳.1，未結(jié)合tHsp70 (lug) ;2，胞外產(chǎn)物 ECP (50 u L) ；3-6,10u g 的 tHsp70 分別與 I y L、10 y L、25 y L、50 u L胞外產(chǎn)物ECP非共價結(jié)合后取1/10體積反應(yīng)液進行SDS-PAGE。圖lltHsp70與不同量菌體非共價結(jié)合離心后上清SDS-PAGE電泳.1-4，10 y g的tHsp70 分別與 I X 104、I X 105、I X 106、I X 107 菌體非共價結(jié)合，離心(10000g, IOmin)后取上清1/10體積進行SDS-PAGE電泳；5，未結(jié)合tHsp70 (lug)。圖12tHsp70對羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)生長的影響(200X)(A)培養(yǎng)基中含有100 u g/mL的tHsp70 ； (B)培養(yǎng)基中含有I U g的ECP/孔；(C)未含刺激物對照組；(D)培養(yǎng)基中含有tHsp70-ECP復(fù)合物(tHsp70濃度為100 u g/mL, ECP含量為I U g/孔)。
具體實施例方式實施例I :羅非魚熱休克蛋白70的表達與純化(I)羅非魚熱休克蛋白70基因的克隆①熱應(yīng)激處理試驗魚在500L大水缸內(nèi)暫養(yǎng)I周后(水溫約25°C，氣泵充氣)，將其放入39°C水溫下IOmin進行熱應(yīng)激，然后在室溫下放置6h。②總RNA抽提用75%酒精棉球?qū)υ囼烎~表面擦洗消毒，置于無菌托盤上，用肝素鈉溶液潤洗后的5ml注射器進行尾靜脈采血。將同一品系3尾魚的血液混合成I份。取混合血液0. 2ml (約
2.OX IO7個血細(xì)胞)加入ImlTrizol試劑，劇烈震蕩至液體完全透明，室溫作用5min ;力口A 0. 2ml氯仿劇烈震蕩30s后室溫作用5min，4°C，12000gX15min ;小心吸取上層水相，加入 0. 5ml 異丙醇 _20°C沉淀 30min,4°C,12000gX IOmin ;棄上清，加 lml75 % 乙醇，4°C，7500gX5min洗滌沉淀兩次；室溫干燥15min，加適量DEPC水溶解(55°C水浴助溶5min)。核酸蛋白測定儀測量OD值和變性電泳檢測其完整性。③引物設(shè)計根據(jù)羅非魚的熱休克蛋白70 (tHsp70) cDNA 序列(http://www.ncbi.nlm.nih. gov),設(shè)計合成上下游引物Hspf-EcoRI、Hspr_AvrII,分別引入EcoRl和AvrII兩個酶切位點，理論擴增片段大小為1945bp，包括Hsp70基因的完整編碼區(qū)。Hspf-EcoRI 5 CGGAC GAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC 3’保護堿基EcoRIHspr-AvrII 5’ TATTT CCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT 3’保護堿基AvrII④RT-PCR擴增及克隆 以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，反應(yīng)體系為
H2O2.25|aL
MgC 12(25mmol/L)2(j.L
IOxAMV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液InL
dNTP(10mmol/L)I^iL
反轉(zhuǎn)錄通用引物(25pmol/L)I^L
反轉(zhuǎn)錄酶(5U/L)0.5[iL
RNA 酶抑制劑(40U4iL)0.25
RNA模板2pL混勻，30°C下保溫10111；[11,421€下退火反應(yīng)30111；[11,951€下滅活反轉(zhuǎn)錄酶5111；[11,51€下冷卻5min。PCR擴增目的基因PCR擴增反應(yīng)體系(總體積50 ii L)
模板4成
Hspf-EcoRI (25pmol/^L)I^iL
Hspr-AvrII (25pmol/卩L)l|aL
10 x LA PCR Buffer5|aL
dNTP MixtureI ^iL
TaqDNA 聚合酶0.25|iL
ddH2050mL擴增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性I分鐘，55. 6°C退火45分鐘，72°C延伸45秒，共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。tHsp70基因克隆取LPCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察，切下1923bp的目的DNA條帶，使用Agarose Gel DNA purificationKit(TaKaRa公司)回收純化PCR產(chǎn)物，連接到pMD18_T載體中，按照NEB Double Digest軟件推薦，選用酶切反應(yīng)體系，進行雙酶切反應(yīng)。
⑤重組質(zhì)粒的粘端連接按Vector DNA Insert DNA的I: 3 10摩爾比在10 ii I反應(yīng)體系進行連接
Seq3BPCR 產(chǎn)物(Avrll/EcoRI)4^1
pPIC9k (Avrll/EcoRI)3 j_il(50ng)
T4 DNA ligase0.5|al
IOxBuffer1.5|j,l
ddH20I^il
⑥連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化采用諾賽化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化效率> IO8)，按常規(guī)42°C熱擊法進行轉(zhuǎn)化。重組體DNA加入新鮮制備的感受態(tài)菌中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴熱休克90秒，立即轉(zhuǎn)入冰浴2分鐘，加800 ill的LB培養(yǎng)基，37°C緩慢搖動I小時，I, OOOrpm離心10分鐘，倒去培養(yǎng)液，另加150 ill的LB培養(yǎng)基懸起轉(zhuǎn)化菌，涂布于含有(Amp，100 u g/mL)的LB瓊脂板上，同時做陰性對照一板，37°C過夜倒置培養(yǎng)。⑦質(zhì)粒DNA的限制性酶切鑒定按照NEB Double Digest軟件推薦，選用酶切反應(yīng)體系，進行雙酶切反應(yīng)，酶切結(jié)果正確者送測序。(2)熱休克蛋白70基因的表達①線性化質(zhì)粒DNA按照PmeI反應(yīng)體系要求，在80 ill NEB Buffer4反應(yīng)體系中37°C 4h酶切2 y gpPIC9k-Hsp70和pPIC9k質(zhì)粒進行質(zhì)粒DNA線性化。②重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞取80ul酵母感受態(tài)細(xì)胞與5 u I線性化DNA (0. I u g)混合，冰上放置5min ;轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化(1500v,5ms);立即取出電擊杯,加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇至電擊杯中，輕輕混勻，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入滅菌離心管中。取適量涂于MD平板上30°C培養(yǎng)。③PCR鑒定陽性克隆取少量酵母菌液，利用tHsp70特異性的上下游引物，通過PCR反應(yīng)進行陽性克隆鑒定。④重組tHsp70蛋白的小量誘導(dǎo)表達挑取單克隆，接種至含IOml BMGY培養(yǎng)基的試管中，28-30°C，250-300rpm搖床培養(yǎng)至0D600 = 2-6 (約16-18小時)，利用本實驗室建立的甲醇誘導(dǎo)表達方法進行蛋白誘導(dǎo)表達，在誘導(dǎo)后24h、48h、72h、96h的時間點，分別取200 培養(yǎng)基至Iml離心管，通過SDS-PAGE分析檢測重組蛋白表達水平，確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時間為72-96h(圖8)。⑤重組tHsp70蛋白大量誘導(dǎo)重組酵母菌表達挑取經(jīng)過小量誘導(dǎo)表達篩選出的較高表達水平的菌株，接種至含IOml BMGY培養(yǎng)基的試管中，28-30°C，260rpm搖床培養(yǎng)至0D600 = 2-6 (約16-18小時)，將IOml培養(yǎng)物接種至含IL BMGY的3L搖瓶中，28-30°C劇烈震蕩，260rpm，至對數(shù)生長期(0D600 = 2-6)。用滅菌離心管，室溫2000g離心5min收集細(xì)胞。誘導(dǎo)表達時，去除上清，將細(xì)胞重懸于300mlBMMY培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基加至2L搖瓶中，用2層滅菌紗布蓋住，放入28_30°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)(260rpm)。甲醇誘導(dǎo)至72小時,室溫2000g離心5min收集上清。(3)熱休克蛋白70蛋白純化①親和層析用Ni-NTA agarose (QIANGEN)親和層析柱 純化 pPIC9k_tHsp70 誘導(dǎo)上清,用 40mM咪唑洗脫目的蛋白。②脫鹽利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對tHsp70用HiTrap Desalting預(yù)裝柱進行脫鹽，圖中(圖9)紅色A1、A2、A3為蛋白峰，A4-A8組分為咪唑峰(咪唑有較高紫外吸收峰)，收集Al、A2、A3組分用超濾離心管進行濃縮，由于蛋白峰和咪唑峰較接近，超濾同時再進行更換緩沖液，將蛋白保存在PBS (pH7. 3)緩沖液中。③濃縮將脫鹽后的蛋白用超濾離心管進行濃縮。實施例2 :重組分泌表達羅非魚熱休克蛋白70蛋白活性鑒定(I)羅非魚熱休克蛋白70蛋白按照實施例I表達與純化步驟獲得。(2)抗原制備使用羅非魚養(yǎng)殖主要病害病原羅非魚鏈球菌，菌株編號CMS005，接種于兔血平板，28°C培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種于含TSB培養(yǎng)基50mL的250mL三角瓶，150r/min，28°C振蕩培養(yǎng)24h。加入甲醛使其最終濃度為0. 25%，150r/min，28°C靜止滅活24h。2kD超濾濃縮到原體積的1/10,超濾產(chǎn)物IOOOOg離心IOmin,分別獲得菌體(thallus)和分子量大于2kD胞外產(chǎn)物(ECP)抗原。將thallus用PBS重懸，濃度調(diào)整為1.0X109/mL。(3)活性鑒定-重組分泌表達魚熱休克蛋白70與抗原體外結(jié)合取上述準(zhǔn)備的ECP抗原(體積分別為 luL>10uL,25u L、50 u L)、菌體抗原 10 U L (濃度分別為 I X 109/mL、l X 108/mL、
IX 107/mL、I X lOVmL)，分別加入 35 u L tHsp70 (10 u g)混合，加 PBS 至 _ L，再加入 10 X結(jié)合反應(yīng)液(10mmol/L KCl,20mmol/L MgCl2, lmmol/L ADP) 10 y L，37°C孵育 45min。分別取ECP-Hsp70復(fù)合物10 u L, thallus-tHsp70復(fù)合物離心后上清10 y L進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果等量tHsp70 (IOiig)與不同量海豚鏈球菌ECP(體積分別為1、10、25、50 u L)非共價結(jié)合后SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示(圖10)，結(jié)合前海豚鏈球菌ECP量越多，對應(yīng)泳道tHsp70條帶越亮，表明結(jié)合的海豚鏈球菌ECP越多。同時，不同量菌體與等量tHsp70體外非共價結(jié)合后離心取上清SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖11)顯示，海豚鏈球菌體量越多，結(jié)合的tHsp70越多，離心后上清中tHsp70蛋白條帶越暗(上清中剩余的tHsp70蛋白量變小)。結(jié)果證明表達純化獲得的重組分泌型魚熱休克蛋白70具有體外活性。實施例3 :羅非魚熱休克蛋白70提高腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能(I)羅非魚熱休克蛋白70蛋白按照實施例I表達與純化步驟獲得。(2)tHsp70_抗原復(fù)合物制備按照實施例2中重組分泌表達魚熱休克蛋白70與抗原體外結(jié)合方法獲得。實驗共設(shè)12個試驗組tHsp70-thallus復(fù)合物組(菌體量均為
I.OX IO6Cell)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I u g/mL 3 個濃度；tHsp70-ECP 復(fù)合物組(ECP 量均為 I y g)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I y g/mL 3 個濃度；tHsp70 刺激組設(shè) 100 V- g/mL、10 V- g/mL、I u g/mL 3 個濃度；另設(shè) thallus (I. OX 106cell)、ECP (I U g)及無刺激物3個對照組，每組設(shè)3個試驗平行孔。(3)羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)取雄性奧尼羅非魚腹腔注射250 u L角鯊烯，正常飼養(yǎng)48h后，100mg/L的MS-222麻醉，75%酒精消毒體表。用連接有三通閥的注射器吸取預(yù)冷的PBS對腹腔進行沖洗，沖洗液收集于45mL離心管中，300g、4°C離心lOmin。吸去上清，細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的HBSS重懸，300g、4°C離心IOmin洗滌I次。細(xì)胞重懸于2mLHBSS，加入9mL滅菌三蒸水作用20s破裂紅細(xì)胞，立即加入lmLlOXHBSS。300g、4°C離心lOmin，HBSS洗滌2次，最后用L-15完全培養(yǎng)基(含10%羅非魚血清、5 X l(T5ii mol/L ￠-巰基乙醇、100IU/mL氨芐青霉素、IOOii g/mL硫酸鏈霉素)重懸細(xì)胞。取適量細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色計數(shù)，瑞氏染色觀察細(xì)胞狀態(tài)。調(diào)整細(xì)胞密度為I. 0X106/mL，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100iiL，28°C培養(yǎng)。(4)巨噬細(xì)胞NO及吞噬活性檢測、
將分離到的腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，每孔100 y L (細(xì)胞個數(shù)約I X IO5)，培養(yǎng)24h，吸走未貼壁細(xì)胞并加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸去培養(yǎng)基上清，加入190 u L新培養(yǎng)基及10 ii L上述準(zhǔn)備好各種刺激物，繼續(xù)培養(yǎng)。于刺激后24h和48h分別吸取50 ii L培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板，按NO檢測試劑盒(Promega, USA)操作說明進行NO濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和樣品NO檢測。同時，按巨曬細(xì)胞吞曬活性檢測試劑盒(Jiancheng, Nanjin, China)說明進行抗原刺激48h各試驗孔巨噬細(xì)胞吞噬活性的檢測。(5)免疫相關(guān)基因表達檢測刺激24h后對CXCR4、PGRN、Hsp70、IL-8四個基因進行定量檢測。此外，對 tHsp70_thallus 復(fù)合物(菌體量為 IX 106cell, tHsp70 濃度為 100 u g/mL),菌體(LOXlO6Cell)和無刺激對照組的上述四基因進行了 12、24、48和72h 4個時間點的表達
定量分析。將各試驗組3個平行孔細(xì)胞收集于離心管，2000g離心lOmin，去除上清，加入ImLTrizol混合作用5min。加入200 u L氯仿潤旋振蕩15s, 12000g, 4°C離心15min。吸取上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入500 ii L異丙醇混勻-20°C靜置30min。12000g，4°C離心15min。棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2次，7000g, 4°C離心5min。棄上清，室溫干燥沉淀，加入10 u LTE,55°C水浴助溶5min。獲得的RNA按熒光定量PCR劑盒SYBR PrimeScript RT-PCR KitII中反轉(zhuǎn)錄說明進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA于_80°C備用。CXCR4、PGRN、Hsp70、IL-8和及內(nèi)參基因P -actin引物序列分別為CXCR4F 5' AAGGGCCAGACACTGAAGAAAA-3’CXCR45’ -AGTAGGGGAGCCAGCAACAA-3 ’ ；PGRN F5’ -GCGGTCACAGTCAAATCCAA-3 ’PGRN R5’-TGTCCTGATGGCACTACTTGCT-3’，Hsp70F5，-GGCGATTTTGTCCCTCTGAA-3 ’Hsp70R5，-GGCCGACTGAGCAAAGAAGA-3 ’ ；IL-8F5，-GCACTGCCGCTGCATTAAG-3’IL-8R5，-GCAGTGGGAGTTGGGAAGAA-3，； ^ -actinF5，-AACAACCACACACCACACATTTC-3P-actinR5，-TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTT-3，。
用ddH20對cDNA進行5倍稀釋，使用ABI 7500Fast熒光定量PCR儀進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系(50iiL) SYBR Premix Ex Taq (2X) 25 U L, ROX Reference DyeII(50X)luL,正反引物各 2u L(10u mol/L)，稀釋后的 cDNA 模板 4u L, ddH20 16 u L ;反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 2min，95°C 30 秒，60°C 30 秒，72°C 30 秒，40 個循環(huán)。結(jié)果(I)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)觀察顯微鏡下觀察(圖12)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中加入tHsp70 (100 V- g/mL, 10 V- g/mL和I ii g/mL三個濃度)均可顯著刺激羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞的貼壁 和生長，細(xì)胞間突觸樣的細(xì)胞連接明顯增多，其中以濃度為100 u g/mL的tHsp70試驗組細(xì)胞生長狀態(tài)最好。加入ECP試驗組貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯少于其它試驗組，出現(xiàn)大量的死亡細(xì)胞(疑似調(diào)亡的細(xì)胞)，tHsp70-ECP復(fù)合物(tHsp70濃度為IOOii g/mL)試驗組盡管細(xì)胞生長狀態(tài)不如無刺激對照組，但細(xì)胞死亡程度明顯減弱。菌體和tHsp70-thallus復(fù)合物對羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞生長也有一定的刺激作用，其中以濃度為IOOii g/mL的tHsp70-thallus試驗組的細(xì)胞生長狀態(tài)最佳。(2)腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測NO檢測結(jié)果顯示(圖I),除tHsp70_thallus復(fù)合物(tHsp70濃度為IOOiig/mL)和tHsp70 (100 ii g/mL)兩個試驗組NO釋放顯著(P < 0. 05)，其余組NO釋放水平在24h差異不明顯。刺激48h后，ECP可顯著降低羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放(P < 0. 05)；而tHsp70-ECP復(fù)合物(tHsp70濃度為100 y g/mL)卻可顯著增強巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生(P< 0. 01)。tHsp70(100u g/mL)單獨作用也可刺激巨噬細(xì)胞NO釋放(P < 0. 05)。(3)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性檢測結(jié)果顯示(圖2)，海豚鏈球菌菌體或ECP與tHsp70體外非共價結(jié)合后，濃度為100 u g/mL的tHsp70試驗組可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性(P < 0. 05)。tHsp70(100ug/mL, 10 y g/mL和I y g/mL)單獨作用同樣可以提高巨噬細(xì)胞吞噬活性，濃度為100 Ii g/mL的tHsp70試驗組最顯著(P < 0. 01)。(4)免疫相關(guān)基因表達分析實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示(圖3)，tHsp70_抗原復(fù)合物(tHsp70濃度為100 u g/mL)及單獨tHsp70 (100 i! g/mL)刺激羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞24h均可極顯著提高其IL-8，Hsp70, CXCR4和PGRN四個基因表達水平(P < 0. 01，相對于菌體或ECP單獨作用)，
10u g/mL和I ii g/mL兩個濃度作用不明顯(P > 0. 05)。相對于無刺激物對照組，菌體和ECP也可以提高腹腔巨噬細(xì)胞IL-8，Hsp70, CXCR4和PGRN四個基因的表達(P < 0. 01)。羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞12h，24h，48h和72h四個時間點基因表達結(jié)果顯示(圖4)，tHsp70-菌體復(fù)合物組IL-8，Hsp70，CXCR4和PGRN四個基因的在四個時間點的表達量均極顯著高于菌體組和無刺激對照組(P < 0. 01)。從12h開始菌體組IL-8和Hsp70表達量超過無刺激對照組(P < 0. 05) ；CXCR4和PGRN從48h開始菌體組表達量才超過無刺激對照組(P < 0. 05)。另外，IL-8表達峰值出現(xiàn)在48h，而Hsp70，CXCR4和PGRN三個基因一直呈上升趨勢。實施例4 :羅非魚熱休克蛋白70提高外周血淋巴細(xì)胞的免疫功能(I)羅非魚熱休克蛋白70蛋白按照實施例I表達與純化步驟獲得。(2)tHsp70-抗原復(fù)合物制備按照實施例2中重組分泌表達魚熱休克蛋白70與抗原體外結(jié)合方法獲得。實驗共設(shè)12個試驗組tHsp70-thallus復(fù)合物組(菌體量均為I. OX IO6Cell)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I u g/mL 3 個濃度；tHsp70-ECP 復(fù)合物組(ECP 量均為 I y g)，tHsp70 設(shè) 100 u g/mL、10 u g/mL 和 I y g/mL 3 個濃度；tHsp70 刺激組設(shè) 100 V- g/mL、10 V- g/mL、I u g/mL 3 個濃度；另設(shè) thallus (I. OX 106cell)、ECP (I U g)及無刺激物3個對照組，每組設(shè)3個試驗平行孔。(3)外周血淋巴細(xì)胞分離與培養(yǎng)取IOOg健康羅非魚，MS-22麻醉，尾靜脈采血3mL，加入8mL含肝素20IU/mL的HBSS輕輕混均，300g,離心IOmin洗漆2次。棄上清,加入HBSS至6mL。稀釋的血液緩慢加到等體積65% percoll (Sigma7USA)液面上,4°C,400g離心30min。吸取白細(xì)胞層,用5倍體積HBSS洗滌2次。細(xì)胞重懸于lmLHBSS，加入4. 5mL滅菌去離子水作用20s破裂紅細(xì)胞，立即加入 0. 5mL 10 XHBSS 平衡，4°C，300g 離心 IOmin0 用 HBSS 重懸細(xì)胞，4°C、300g 離心 IOmin,洗滌2次。最后用適量L-15完全培養(yǎng)基(含10%羅非魚血清、5X10_5iiM ￠-巰基乙醇、100IU/mL氨節(jié)青霉素、IOOii g/mL硫酸鏈霉素)重懸細(xì)胞。取適量細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1.0\1071^，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100111，281培養(yǎng)。 (4)外周血淋巴細(xì)胞增殖活性檢測將分離的PBL于96孔板中培養(yǎng)12h后加入相應(yīng)的刺激物，刺激24h后按BrdU CellProliferation Assay (GE)操作說明，每孔加入10 ii I含BrdU (100 ii M)的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)18h。300g離心lOmin，吸去上清，60°C干燥lh。每孔加入固定液200 y L，室溫作用30min。吸去固定液，每孔加入200 ii L封閉工作液，室溫作用30min。吸去封閉液，每孔加入100 u L酶標(biāo)抗BrdU單抗工作液，室溫作用lh。每孔加入200 u L沖洗工作液，沖洗3次，每次5min。每孔加入IOOu L底物工作液，室溫作用5 30min，待反應(yīng)充分后每孔加H2SO4 (IM) 25 u L終止反應(yīng)，并在5min內(nèi)進行吸光度測定。(5)免疫相關(guān)基因表達檢測將分離的PBL于96孔板中培養(yǎng)12h后加入相應(yīng)的刺激物，刺激24h后對PGK、MMP9、I CER, MHC II四個基因進行定量檢測。此外，對tHsp70_thallus復(fù)合物(菌體量為IXlO6, tHsp70濃度為100 ii g/mL)，菌體(1.0X106cell)和無刺激對照組的上述四基因進行了 12h、24h、48h和72h四個時間點的表達定量分析。將各試驗組3個平行孔細(xì)胞收集于離心管，2000g離心lOmin，去除上清，加入ImLTrizol混合作用5min。加入200 u L氯仿渦旋振蕩15s, 12000g,4°C離心15min。吸取上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入500 ii L異丙醇混勻-20°C靜置30min。12000g, 4°C離心15min。棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌兩次，7000g，4°C離心5min。棄上清，室溫干燥沉淀，加入IOuLTE，55°C水浴助溶5min。獲得的RNA按熒光定量PCR劑盒SYBR PrimeScript RT-PCRKit II中反轉(zhuǎn)錄說明進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄所得cDNA于-80°C備用。PGK、MMP9、MHC II、ICER和內(nèi)參基因P-actin引物序列分別為MMP9F 5， -GGGACACCACCAAAGACAACA-3，MMP9R 5’ -CTTCTGGAGGCTGGATGTGAA-3’ ；PGK F 5，-TGTGAGCCGTCCCAAAGG-3’PGK R5，-AGGCAACCCAGGAGCAGATT-3，；MHC II F5，-GTGCTAAGCATACGCAATCGAG-3’MHC II R5，-GCAATGCGATCGGCTAAGCAG-3，；
ICER F5’ -CTGGAGACGCAGCCATTACA-3 ’ICER R5’ -AGTCAGCCGCTACTGGAGACA-3 ；P-actin F5，-AACAACCACACACCACACATTTC-3’^ -actin R5’ -TGTCTCCTTCATCG TTCCAGTTT-3’。用ddH20對cDNA進行5倍稀釋，使用ABI 7500Fast熒光定量PCR儀進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系(50iiL) SYBR Premix Ex Taq (2X) 25 U L, ROX Reference Dye II(50X) Iii L，正反引物各 2 ii L(IOiiM)，稀釋后的 cDNA 模板 4iiL，ddH20 16 y L ;反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 2min，95°C 30 秒，60°C 30 秒，72°C 30 秒，40 個循環(huán)。結(jié)果(I)淋巴細(xì)胞增殖檢測tHsp70_ 抗原復(fù)合物刺激外周血淋巴細(xì)胞 48h, BrdU Cell Proliferation AssayKit檢測結(jié)果顯示(圖5):濃度為10 u g/mL的tHsp70和tHsp70_thallus均可極顯著促進羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖(P < 0. 01);海豚鏈球菌菌體對羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖活性也有顯著增強作用(P < 0. 05)，而ECP對羅非魚外周血淋巴細(xì)胞增殖活性有一定的抑制作用(P = 0. 056)。但當(dāng)ECP與濃度為10 u g/mL的tHsp70體外非共價結(jié)合形成復(fù)合物后可減輕其對細(xì)胞增殖的抑制作用，濃度為100 u g/mL和I ii g/mL的tHsp70與抗原作用后其差異不明顯。(2)免疫基因表達分析如圖6所示，濃度為100 U g/mL的tHsp70與海豚鏈球菌菌體或ECP體外非共價結(jié)合形成的tHsp70-抗原復(fù)合物及單獨的tHsp70刺激羅非魚外周血淋巴細(xì)胞24h均可以極顯著提高其 PGK，I CER, MMP9and MHC II 四個基因的表達(P < 0. 01)，10 y g/mL 和 I y g/mL兩個濃度對PGK，MMP9and MHC II三個基因的表達也有提高(P < 0. 05)，100 u g/mL與10ug/mUu g/mL兩個濃度的作用結(jié)果差異顯著(P < 0. 01)。羅非魚外周血淋巴細(xì)胞12h，24h，48h and 72h四個時間點基因表達結(jié)果顯示(圖7)，tHsp70_菌體復(fù)合物組的PGK，ICER,MMP9and MHC II四個基因在4個時間點的表達量均極顯著高于菌體組和無刺激對照組(P < 0. 01);從24h開始，菌體組與對照組4個基因表達量開始出現(xiàn)差異，48h后菌體組明顯高于對照組(P < 0. 05)。同時，ICER和MHC II兩個基因在48h均達到表達峰值，而PGK和MMP9兩個基因一直呈上升趨勢。實施例5 :重組羅非魚熱休克蛋白70作為免疫增強劑和羅非魚鏈球菌病疫苗免疫佐劑(I)選健康的羅非魚,體重60g 80g，由國家級羅非魚良種場提供。用胰胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基隨機對試驗魚的腦、肝和腎進行細(xì)菌分離，鑒定為陰性，并且試驗魚在塑料大桶(240L)中飼養(yǎng)連續(xù)7d未出現(xiàn)死亡方可試驗。每天換水1/3，水溫25°C 32°C，定時使用虹吸管進行吸污，使用增氧機通過氣石不間斷充氣增氧。每天按體重2%的投喂量早上和晚上進行投喂。(2)重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白(tHsp70)按照實施例I表達與純化步驟獲得。(3) tHsp70-抗原復(fù)合物制備按照實施例2中重組分泌表達魚熱休克蛋白70與抗原體外結(jié)合方法獲得。(4)參考公開發(fā)表的學(xué)術(shù)報道，采用優(yōu)化后的乳化復(fù)沉淀再包裹法進行免疫佐劑及抗原的海藻酸鈉-殼聚糖微球包裹，試驗分組包括tHsp70-thallus復(fù)合物組(tHsp70濃度為 10 ii g/mL，菌體量為 I. OX IO6Cell)、tHsp70 組(濃度為 10 y g/mL)、thallus 組(菌體量為I. OX IO6ceIl)、空微球組、空白對照組，每組40尾羅非魚，各免疫組分別免疫三次，免疫間隔為7天。實驗魚免疫前停止進食24小時，免疫時將制備的口服疫苗拌于日常投喂的羅非魚配合飼料，晾干后進行投喂。(5)羅非魚鏈球菌病微球口服疫苗免疫效果檢測最后一次免疫10天后，使用羅非魚鏈球菌CMS005菌株3倍半數(shù)致死量進行攻毒，攻毒后用雞血平板對瀕死和死亡試驗魚進行細(xì)菌分離，攻毒組死亡魚均分離到鏈球菌，記錄每個試驗組的死亡數(shù)，持續(xù)到所有試驗組連續(xù)5d未出現(xiàn)死亡的次日。計算各組的相對免疫保護率。表I重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白免疫羅非魚的保護性結(jié)果、
組別 tHsp70-thallus tHsp70組 thallus組空微球組空白對照組總魚數(shù)(尾) 40 40 40 40 40死亡數(shù)(尾) 6 11 13 25 28死亡率(％) 15.00 27.50 32.50 62.50 70.00免疫保護率(％)_78.57_6071_53.57 10.71_-結(jié)果空白對照組死亡率達到70%，根據(jù)公式免疫保護率=(I-免疫組死亡率/對照組死亡率，計算不同免疫組的相對保護率，結(jié)果如表I所示，重組羅非魚熱休克蛋白70-菌體組、重組羅非魚熱休克蛋白70組、菌體組、空微粒組相對免疫保護率分別為78. 57%,60. 71%,53. 57%、10. 71 %，表明羅非魚熱休克蛋白70具有良好的免疫增強劑和羅非魚鏈球菌病疫苗免疫佐劑作用。
權(quán)利要求
1.一種羅非魚用口服疫苗免疫佐劑，其特征是重組羅非魚熱休克蛋白70作為佐劑在羅非魚用口服疫苗的應(yīng)用。
2.重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白作為免疫佐劑用于羅非魚病害防治的口服疫苗。
3.重組羅非魚熱休克蛋白70作為免疫增強劑用于羅非魚養(yǎng)殖。
4.如權(quán)利要求I所述的羅非魚用口服疫苗免疫佐劑，其特征是重組羅非魚熱休克蛋白70用于預(yù)防或治療魚類病害，特別是預(yù)防或治療羅非魚鏈球菌病感染的藥物組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅非魚用口服疫苗免疫佐劑及其應(yīng)用，這種羅非魚用口服疫苗免疫佐劑是重組羅非魚熱休克蛋白70蛋白，簡稱tHSP70，利用熱休克蛋白70特異性上下游引物克隆羅非魚熱休克蛋白70基因，構(gòu)建tHSP70酵母表達系統(tǒng)并表達純化獲得tHsp70蛋白，該蛋白與羅非魚鏈球菌病口服疫苗聯(lián)合使用，可顯著提高羅非魚腹腔巨噬細(xì)胞NO釋放和吞噬活性；提高外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性；調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達；提高羅非魚鏈球菌病口服疫苗的免疫保護率。該佐劑的應(yīng)用克服了目前羅非魚口服疫苗免疫效果差的不足，促進疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/17GK102716481SQ201110420839
公開日2012年10月10日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者李莉萍, 李超, 梁萬文, 王瑞, 王秋華, 甘西, 陳明, 陳曉漢, 雷愛瑩, 黃婷 申請人:廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所