專利名稱：信筒子醌在制備治療自身免疫疾病藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥應用技術領域，涉及中藥單體信筒子醌(Embelin)在制備作為治療自身免疫性疾病、神經系統(tǒng)炎癥性疾病藥物方面應用。
背景技術：
樹突狀細胞(dendritic cells, DC)是已知的機體內功能最強的抗原呈遞細胞( antigen-presenting cells, APC)，也是目前發(fā)現(xiàn)的能直接激活初始型T細胞的APC[1]。發(fā)生炎癥時，DC最先與抗原接觸進而捕獲抗原，經加工處理后使抗原肽與MHC分子結合而提呈到其他免疫細胞表面，引起細胞因子分泌，在第一、第二信號共同作用下，激活T淋巴細胞，產生特異性的免疫應答反應；另一方面DC可誘導胸腺清除自身反應性細胞、分化調節(jié)性細胞，維持自身耐受，成為介導免疫應答與耐受的關鍵因素[2]。因此，APC是免疫反應的首要環(huán)節(jié)。免疫樹突狀細胞是免疫系統(tǒng)的前沿“哨兵”，加拿大科學家斯坦曼(Ralph Μ. Meinman)因發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞而獲得2011年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。諾貝爾生理學與醫(yī)學獎評委會評價他的成就為“發(fā)現(xiàn)了免疫應答的‘守門人’，從而徹底革新了我們對于免疫系統(tǒng)的認識”。免疫樹突狀細胞起始的不同信號決定免疫系統(tǒng)的免疫反應類型和反應程度。自身免疫疾病是由于免疫系統(tǒng)異?；蛘呙庖呦到y(tǒng)過度激活而導致的自身免疫系統(tǒng)攻擊自身組織或細胞而產生的疾病。因此，抑制免疫樹突狀細胞分化和激活的物質可以抑制免疫系統(tǒng)的激活，有望成為治療自身免疫性疾病和器官移植后免疫排斥的藥物。一般認為，人體DC有不同的DC亞群存在，如郎罕細胞、DCl和DC2。DCl與單核、粒細胞有共同的祖細胞，能分化成為巨噬細胞；DC2與T、NK細胞有共同的前體細胞， 能分化成為淋巴細胞。若根據其分化發(fā)育主要經歷的四個階段即分化程度，DC又可分為4 類骨髓中起源于CD34+多能干細胞的遠祖細胞，外周血中的前體細胞，定居于外周組織中的未成熟DC (immature DC, iDC)，定居于次級淋巴組織中的成熟DC (mature DC, mDC)。鑒于DC前體細胞在不同分化階段，不同的微環(huán)境中，發(fā)揮著不同的生物學功能。 Banchereau將DC的發(fā)育分為4個階段(1)骨髓中的祖細胞；(2)與病原體相互識別前在血液、淋巴管和淋巴組織中巡邏的DC前體，它們可分泌大量的細胞因子使炎癥局限化；(3) 駐留組織的不成熟DC，它們擁有強大的吞噬功能便于抗原的攝取；(4)成熟DC，出現(xiàn)于次級淋巴器官中，高表達協(xié)同刺激分子進行抗原的提呈M。DC的成熟狀態(tài)決定免疫應答的結局。iDC就象體內的“衛(wèi)兵”，起著免疫監(jiān)視的作用，它分布于幾乎所有組織和器官，具有強大的內吞作用，持續(xù)地從外周組織攝取抗原遷移至局部次級淋巴組織，但其抗原提呈功能低下。在無感染和無組織損傷的正常生理狀態(tài)下，存在于外周組織的iDC不斷地攝取自身抗原及非感染環(huán)境中的蛋白質(如呼吸道和消化道中的蛋白質)，進入引流淋巴結，誘導外周耐受[5]?！澳褪苄訢C”可能通過如下機制誘導耐受 (1)誘導T細胞的無能或低能反應。耐受性DC低水平表達MHC分子，幾乎不表達CD40， CD80, CD86, IFA3, ICAM-I等激活T細胞所必須的第二信號分子；(2)誘導T細胞凋亡?？乖禺愋訲細胞TCR與表達!^asL的DC的MHC結合的同時，其!^as與DC表面!^asL結合，介導這些T細胞凋亡[6]。( 誘導調節(jié)性T細胞產生。耐受性DC能夠促進初始T細胞轉化為 T-reg，反過來T-reg又可以誘導DC前體轉化為耐受性OCm。這種機制使得機體的免疫系統(tǒng)能夠更好地識別和防御炎癥和組織損傷時的“危險信號”(danger signal )，而對自身抗原和無害的外源性抗原保持耐受。DC是一把雙刃劍，既可誘導免疫耐受，也可刺激強烈的免疫應答，其成熟狀態(tài)在免疫平衡中起決定性作用。不成熟DC具有很強的捕獲抗原的能力，但是刺激T細胞的能力很低。只有在出現(xiàn)刺激性的信號(如IL-I β，TNF)或由細菌引起的刺激時，DC由不成熟階段轉向成熟DC，高表達細胞表面共刺激分子同時遷移到淋巴結誘導抗原特異性T細胞的增殖。活化了的T細胞又反過來通過CD 40為信號，釋放細胞因子刺激DC，誘導DC活化。 在癌癥病人，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的DC經常處于一種不成熟的狀態(tài)，不能遷移到淋巴結[8]。由腫瘤組織釋放的因子，如TGF- β . IL-10和VEGF等可以阻礙DC分化并且下調DC刺激T細胞的功能。因此，利用體外發(fā)育完善的成熟DC激活免疫應答可治療腫瘤患者。信筒子醌(英文名Embelin)是從白花酸藤果中提純出的一種具有抗生育作用的苯醌類化合物，后來研究發(fā)現(xiàn)信筒子醌也是具有抗癌和抗關節(jié)炎作用的中藥提取物，可抑制XIAP (X連鎖凋亡抑制蛋白)。信筒子醌最初被發(fā)現(xiàn)可以強烈抑制腫瘤細胞的生長；研究發(fā)現(xiàn)其可通過PTEN酪氨酸磷酸化發(fā)揮抑制STAT3的作用[9]，而STAT3是ΤΗ17細胞分化成熟的關鍵調控信號通路。Dai Y等人發(fā)現(xiàn)信筒子醌在結腸癌中可促進PPARy，抑制NF-kB信號通路_。NF-kB是產生炎癥因子IL-I β、IL-6和TNF- α的關鍵信號通路，而IL-I β和 IL-6是ΤΗ17細胞分化起始的必需因子；Klotzl[11]等人發(fā)現(xiàn)PPARy選擇性抑制TH17的分化。但是信筒子醌對T細胞介導的自身免疫反應以及對不同T細胞亞群的影響尚不清楚， 尤其是對炎癥反應的輔助性T細胞TH17亞群及其介導的EAE的調節(jié)作用尚無報道。DCs在先天和適應性免疫反應引發(fā)中期重要的作用。雖然DCs的普遍作用是抗原提呈和T淋巴細胞的激活，DCs在分化的不同階段有不同的表面標志物、遷移模式以及細胞因子產量。這些不同決定了T細胞他們相互作用的命運。最初的T細胞激活依賴于T細胞受體的牽引和通過在APCs (例如DCs)表面上表達的⑶觀和⑶80/86共刺激信號。因此， 我們通過監(jiān)測DC細胞因子產量和表面標記物⑶80，⑶83，⑶86以及HLA-DR的表達來調查信筒子醌是否影響DC分化和激活。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是公開一種信筒子醌(Embelin)在制備作為治療自身免疫性、神經系統(tǒng)炎癥性疾病藥物方面的應用。其中信筒子醌在治療自身免疫性疾病、神經系統(tǒng)炎癥性疾病藥物中的有效劑量優(yōu)選為20-50 mg/Kg體重/天。本發(fā)明進一步公開了信筒子醌在制備治療器官移植抑制免疫排斥藥物中的應用。 實驗結果表明信筒子醌(Embelin)抑制LPS激活的人樹突細胞的成熟圖(流式細胞儀數據圖)；它可以抑制免疫系統(tǒng)的激活，因此可以治療自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥。本發(fā)明所述的自身免疫性疾病指的是免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫性疾病。本發(fā)明所述的免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫疾病指的是多發(fā)性硬化癥、自身免疫性視網膜炎、視神經脊髓炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、甲狀腺炎、溶血性貧血、 萎縮性睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、潰傷性結腸炎、皮炎、肌炎、系統(tǒng)性硬化癥。本發(fā)明所述的神經系統(tǒng)炎癥性疾病指的是多發(fā)性硬化癥、視神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎；其有效劑量優(yōu)選為25-50 mg/Kg體重/天。本發(fā)明運用免疫細胞分化和激活模型以及實驗動物模型進行了大量的藥理實驗， 實驗結果表明信筒子醌可以抑制人免疫樹突狀細胞的分化，抑制LPS激活的人免疫樹突狀細胞的成熟度；可以抑制未成熟樹突細胞的抗原攝取能力和成熟樹突狀細胞的抗原提呈能力，可以抑制樹突細胞刺激的T細胞增殖反應。特別是信筒子醌可以減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病程度。實驗性自身免疫腦脊髓炎是多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎的實驗動物模型，也是研究自身免疫和炎癥性疾病的典型的動物模型。因此，本發(fā)明有望在臨床上成為治療多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。免疫活性細胞如樹突狀細胞等具有識別外來抗原或者認為對生物體有害的自身抗原的機制。免疫細胞識別自身抗原而引起自身免疫反應是多種免疫疾病的發(fā)病基礎。例如多發(fā)性硬化癥(Multiple klerosis，MS)、視神經脊髓炎(neuromyelitis optica)、自身免疫性視網膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)、糖尿病、甲狀腺炎、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、古德帕斯徹病(Goodpasturee’ s disease)、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis)、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、斯耶格倫綜合癥(Sjogren syndrome)、潰傷性結腸炎、皮炎、萊特爾綜合癥(Reiter syndrome)、肌炎(miositis)、系統(tǒng)性硬化癥等。而抑制免疫細胞，尤其是抑制免疫系統(tǒng)前沿的具有專業(yè)的抗原呈遞能力的樹突狀細胞的物質將具有潛在的治療自身免疫性疾病的用途。本發(fā)明所述的應用，其中自身免疫性疾病指的是上述所指的自身免疫疾病，尤其是中樞神經系統(tǒng)炎癥性疾病，例如人多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等等，典型的是人多發(fā)性硬化癥。多發(fā)性硬化癥是自身免疫性炎癥性疾病，特征是中樞神經系統(tǒng)功能障礙的癥狀和體征的多樣化，配合反復的緩解與復發(fā).最常見的發(fā)病癥狀為感覺異常，出現(xiàn)在一個或幾個肢體，軀干或一側的面部；腿或手的無力或笨拙；或視覺障礙，例如單眼的部分性失明與眼球活動時的疼痛，視物模糊或暗點.其他常見的早期癥狀包括眼肌癱瘓造成的復視， 一個或多個肢體的短暫無力，輕微的步態(tài)障礙，一個肢體的輕度僵硬與異常的易疲乏，膀胱控制困難，眩暈，以及輕度的情緒障礙。自身免疫性炎癥特別指的是人多發(fā)性硬化癥、視神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎，通過抑制免疫樹突狀細胞的分化、成熟、抗原呈遞和T細胞增殖等細胞學實驗和小鼠疾病動物模型實驗證明可以治療多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性中樞神經系統(tǒng)炎癥性疾病。視神經脊髓炎最早認為是多發(fā)性硬化的一種，近些年隨著臨床診斷和病理研究的發(fā)展，才細分為自身免疫性視神經脊髓炎。急性播散性腦脊髓炎，又稱感染后腦脊髓炎、預防接種后腦脊髓炎，是指繼發(fā)于麻診、風疹、水痘、天花等急性出疹性疾病，或預防接種后，因免疫機能障礙引起中樞神經系統(tǒng)內的脫髓鞘疾病。
^ ! g ^1 ! WfS ^(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE )是人多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis, MS)和急性播散性腦脊髓炎(Acute disseminated enc印halomyelitis，ADEM)等腦脊髓炎癥性疾病的動物模型，也是研究自身免疫性和炎癥性疾病的典型動物模型。是一種中樞神經系統(tǒng)自身免疫炎癥性脫髓鞘疾病。 其發(fā)病機理是由免疫細胞(輔助性T細胞THl和TH17細胞)介導的自身免疫性炎癥反應。本發(fā)明以研究自身免疫性和炎癥性疾病的典型動物模型-小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎為例，發(fā)現(xiàn)信筒子醌以有效減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，本發(fā)明在臨床上有望成為治療多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。本發(fā)明公開的信筒子醌(Embelin)在制備作為治療自身免疫性、神經系統(tǒng)炎癥性疾病藥物方面的應用，通常是以藥物組合物的形式服用的，可口服或非口服給藥，或者以和藥學上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物(如片劑、緩釋制劑、膠囊劑、注射齊 、溶液劑)安全的口服或非口服給藥。當口服給藥時，組合物可配制成片劑、糖衣劑或膠囊。為制備口服藥物組合物可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、 聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤滑劑。例如， 可通過壓制濕顆粒來制備片劑?；钚猿煞峙c載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設備中進行顆粒化，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。本發(fā)明的系列化合物可以注射劑形式給藥，雖然劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變。實際服用的信筒子醌(Embelin)化合物的劑量應該由醫(yī)生根據有關的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)，選者的給藥途徑、年齡、體重、患者對藥物的個體反應，患者癥狀的嚴重程度寸寸。


圖1為信筒子醌(Embelin)抑制人樹突細胞的分化圖(流式細胞儀數據圖)； 圖2為信筒子醌(Embelin)抑制人樹突細胞的分化圖(對應流式細胞儀數據的柱狀圖)；
圖3為信筒子醌(Embelin)抑制LPS激活的人樹突細胞的成熟圖(流式細胞儀數據圖)；它可以抑制免疫系統(tǒng)的激活，因此可以治療自身免疫性疾??；
圖4為信筒子醌(Embelin)抑制LPS激活的人樹突細胞的成熟圖(流式細胞儀數據圖)；它可以抑制免疫系統(tǒng)的激活，因此可以治療自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥；
圖5為信筒子醌(Embelin)抑制未成熟樹突細胞的抗原攝取能力圖；它可以抑制免疫系統(tǒng)對抗原的反應能力。在自身免疫疾病中，可以降低自體免疫細胞識別自身抗原的能力。 因此可以治療自身免疫性疾??；
圖6為信筒子醌(Embelin)抑制樹突細胞刺激的異體T細胞增殖反應(CFSE法)圖；它可以治療多發(fā)性硬化癥等T細胞介導的自身免疫性疾??；
圖7為信筒子醌(Embelin)抑制樹突細胞介導的促進T輔助性細胞分化的細胞因子的分泌圖；它主要抑制炎癥性細胞因子的分泌，可能用于治療T細胞介導的自身免疫性炎癥性疾?。?br> 圖8為口服信筒子醌(Embelin，20mg/kg)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病程度圖；說明信筒子醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等神經系統(tǒng)炎癥性疾??；
圖9為口服信筒子醌(Embelin，50mg/kg)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病程度圖；說明信筒子醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等神經系統(tǒng)炎癥性疾??；
圖10為信筒子醌(Embelin)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病臨床評分的最高分數圖；說明信筒子醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等神經系統(tǒng)炎癥性疾?。?br> 圖11為信筒子醌(Embelin)減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病臨床評分的總分數圖。說明信筒子醌可以治療自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等神經系統(tǒng)炎癥性疾病；
其中圖10圖11說明與對照組小鼠相比，口服信筒子醌(Embelin)的小鼠臨床病情評分降低(給藥組最高只有2分，而未給藥組為3分);給藥組的發(fā)病高峰峰值較對照組明顯降低，證明信筒子醌(Embelin)可明顯減緩小鼠EAE發(fā)病程度(n=8，p<0. 05)。
具體實施例方式
下面結合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發(fā)明的范圍內，本發(fā)明的范圍和實質由權利要求來限定，其中信筒子醌(Embelin)有市售，其它所用的試劑，除特別標注外均有市售。其中血液需經過衛(wèi)生管理部門批準。實施例1
1. 1人外周血單核細胞的分離
(1)去血站取新鮮血液(不超過8小時)。大約為40 mL。(2)用3倍體積的PBS稀釋(稀釋的血樣越多，單核細胞的純化越好)。共160 mL 取15 mL的淋巴細胞分離液Ficoll-Paque加入50 mL的離心管，離心管傾斜45°，吸取35 mL稀釋的血液，在分離液面1 cm處沿管壁疊加在分離液上，勿破壞分離界面。(分4管，先在每管15 mL的淋巴細胞分離液Ficoll-Paque中加入35 mL血液，再平均剩余的血液)
(3)室溫400g離心30 min,緩慢減速，不可設置剎車檔，。(4)平穩(wěn)取出離心管，最下層是紅細胞和粒細胞，中間層是淋巴細胞分離液，最上層是血漿和稀釋液等。血漿層和分離液交界處為易渾濁到灰白層(白膜)，吸出上層，留下單核細胞細胞層(一層白膜)，分布在相面上。(5)仔細轉移白膜(淋巴細胞、單核細胞、血小板)到新的50mL離心管。轉移至兩管。(6)在離心管中加入3倍體積的磷酸緩沖液(PBS)，混合，室溫300g離心10 min。 小心完全除去上清液。(7)為了除去血小板，在50 mL的緩沖液中重懸細胞沉淀，室溫下200g離心15 min,小心完全除去上清液。在200g離心時，血小板大部分停留在上清液中。(8)加入3倍體積的PBS混勻后計數。
(9)再重復洗1次。注外周血單核細胞可能貯存于5%的牛血清白蛋白(BSA)或血清和抗凝劑(肝素、 EDTA或檸檬酸磷酸葡萄糖)中過夜。細胞在冰箱中貯存不超過一天。1. 2人類⑶14+單核細胞的純化
(1)取80PL的細胞懸浮液與20 PL的⑶14+微珠(購自美天旎公司)混勻后4°C孵育15 min，中間要混合一次(細胞與微珠按4:1加入)。(所有血細胞加300 μ 磁珠，再加1200 μ 含 0. 5%BSA 的 PBS)
(2)用20倍體積(2mL)預冷的PBS(含0. 5%BSA) 200g離心5 min洗滌一次，棄上清， 加入500 μ 的PBS。(3)離心期間，將分離磁鐵安裝在多用支架上，并將分選柱放在磁體中，分選柱下放一支干凈的無菌離心管。用遇冷的磷酸緩沖液沖洗分選柱3次，每次0.5 mL。棄洗脫液， 再在分選柱下置一支干凈的無菌離心管，將細胞懸液上樣到分選柱上。(4)用PBS緩沖液沖洗分離柱，每次0. 5mL,洗3次(第一個0. 5 mL慢加入以免擾動分選柱中的細胞)。(5)待細胞懸液全通過柱后，從磁體上取下分選柱，放在一個無菌15 mL心管上。 在分選柱中加入1 mL全RPMI1640培養(yǎng)基，將活塞塞入分離柱并洗脫⑶14+單核細胞，計數。 將CD14—細胞凍存用于T細胞增殖實驗。(6)流式細胞分選儀確認純度(95%)
(7)用含有1000 U/mL GM-CSF (粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)，1000 U/mL IL-4 (白介素4)的完全1640培養(yǎng)基(含10 mM的丙酮酸鈉，10 mM的谷氨酰胺，100 Pg/mL那霉素) 調整細胞濃度為IXlO6個/mL并加入藥物。將細胞懸浮液2 mL/孔接種于十二孔板。1. 3.信筒子醌(Embelin)處理時間和濃度確定
將得到的DC分成三組，根據查閱文獻，每組進行了不同濃度的處理
第一組(分化)第一天加藥，第五天進行流式細胞術檢測。Embelin處理不同的濃度
正常對照組；②ΙθμΜ/L Embelin處理五天組；30μΜ/1 Embelin處理五天組；⑨θθμΜ/L
Embelin處理五天組。第二組(分化)第五天加藥，第七天進行流式細胞術檢測。Embelin處理不同的濃度①正常對照組；②ΙθμΜ/L Embelin處理兩天組；@ 30μΜ/1 Embelin處理兩天組；@ θθμΜ/L Embelin處理兩天組。第三組(成熟)第五天加藥以及LPS (脂多糖，lipopolysaccharide) (lPg/ml)， 第七天進行流式細胞術檢測。Embelin處理不同的濃度①陰性對照組(Embelin和LPS都
不加)；②對照組(只加LPS) ；@ ΙθμΜ/L信筒子醌(Embelin) +LPS處理兩天組；⑨30μΜ/1
Embel in+LPS處理兩天組；⑤θθμΜ/L Embel in+LPS處理兩天組。在培養(yǎng)的第三天，吸取50%的上清，加入等量的含有1000 U/ml的GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)，1000 U/ml的IL-4的1640培養(yǎng)基并加入藥(按2ml加)。注在第五天，在未加藥的孔中分別加入LPS及藥物，并在含有等量的1000 U/mL的GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)，1000 U/mL的IL-4的1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)兩天。結論信筒子醌(Embelin)可抑制人樹突細胞的分化(圖1、2)、抑制LPS激活的人樹突細胞的成熟(圖3、4)，圖中表明隨著信筒子醌的濃度增加，抑制程度加大；抑制樹突細胞的分化可以減少免疫細胞的數量，從而降低免疫反應；它同時可以抑制免疫系統(tǒng)的激活。 在自身免疫疾病中，抑制免疫反應可以減輕自身免疫系統(tǒng)攻擊自體細胞或組織的能力。因此可以治療自身免疫性疾病或抑制器官移植中的免疫排斥；
1. 4流式分析
(1)在細胞分化成熟的第五天、第七天末收集細胞至1.5mL離心管，兩管。2000轉離心 10 min，再轉移上清至1. 5mL離心管，保留上清；
(2)用含有2mLPBS洗滌細胞，按照每IO5 cell/2 μ 的量加入DC表面標記⑶80，⑶86， CD83，HLA-DR，4°C下避光孵育 30 min ；
(3)棄去染料，用2mL PBS洗滌細胞一次；
(4)用2mL PBS重懸細胞，再加入ImL洲的多聚甲醛固定，300目濾網過濾，流式分析備用。(5)用流式細胞儀進行檢測。FACS數據用CELLQuest軟件分析。1. 5 FITC-dextran 攝取檢測
收集第五天的分化未成熟細胞按IO5 cells/ml懸于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，再加入 FITC-dextran (0.1 mg/mL)(熒光標記的葡聚糖)，37°C培養(yǎng)箱孵育 30 min, 1000 r/min 離心10 min，收集細胞，用PBS清洗2次，最后重懸于流式管，分別檢測細胞的熒光強度，以 4°C條件為基準，判斷細胞的抗原攝取能力。結論圖5中橫軸為細胞吞噬熒光標記的葡聚糖(抗原)后的熒光強度，吞噬越多熒光強度越強，峰值越靠右側。右側37° C峰值為陽性對照，左側4° C峰值為陰性對照。 結果顯示隨著信筒子醌的濃度增加，峰值左移，說明熒光強度減弱，即吞噬抗原能力減弱。 信筒子醌Embelin抑制未成熟樹突細胞的抗原攝取能力(圖5)；不能有效識別和攝取抗原會降低針對抗原的免疫激活效果。說明它可以抑制免疫系統(tǒng)對抗原的反應能力，在自身免疫疾病中，可以降低自體免疫細胞識別自身抗原的能力。因此可以治療自身免疫性疾??；
1. 6 Embelin抑制成熟DC引起的異體T細胞增殖(治療T細胞介導的相關疾病) 利用⑶4+磁珠分選異體⑶4+細胞，PBS洗兩遍，37°C標記CFSE (羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂)染料10 min,2X105 cell/200 μ 植于圓底96孔板，再按1 10、1 20、 1 40 (DC/⑶4+)加入絲裂霉素C和Embelin處理過的成熟DC，共同培養(yǎng)4天后，收集細胞，做流式分析，以CFSE熒光強度的衰減次數顯示細胞增殖變化。結論在免疫系統(tǒng)反應中，樹突細胞根據來源于不同抗原的信號刺激初始T細胞向不同的效應T細胞分化和增值，進而介導不同的免疫反應。圖6橫軸為樹突狀細胞和T 細胞混合比(DC:T)，縱軸為T細胞增值指數。信筒子醌(Embelin)抑制樹突細胞刺激的異體T細胞增殖反應(CFSE法)，T細胞數目減少會抑制T細胞介導的相關疾??；它可以治療多發(fā)性硬化癥等T細胞介導的自身免疫性疾??；
1. 7信筒子醌抑制成熟DC產生促進輔助T細胞Thl和Thl7細胞分化的細胞因子為了研究不同濃度的信筒子醌(Embelin)對成熟DC產生細胞因子的影響，我們在DC分化到第6天時，加入不同濃度(0，10，30，60 μΜ/L)的Embelin預處理3h，然后用100ng/ml 的LPS (脂多糖)刺激其成熟，分別于LPS加入的OhUKau^jhUM1收集細胞，熒光定量 PCR 檢測 IL-12p;35、IL_12/23p40、IL_23pl9、IL_6、TNF_a、IFN-y 基因的表達。在免疫系統(tǒng)反應中，樹突細胞根據來源于不同抗原的信號刺激初始T細胞向不同的效應T細胞分化和增值，進而介導不同的免疫反應。圖7結果說明30 μΜ/L信筒子醌可以抑制樹突狀細胞產生促進輔助T細胞Thl細胞分化的細胞因子IL-12p35和IFN- γ表達， 同時抑制促進 ι17細胞分化的細胞因子IL-12/23p40和IL-6以及炎癥因子TNF-α的表達。而Thl7細胞可介導自身免疫疾病和炎癥。實驗性自身免疫腦脊髓炎也是Thl和Thl7 細胞介導的疾病。此結果證明信筒子醌可治療T細胞介導的自身免疫性和炎癥性疾病。1. 8 EAE小鼠模型的構建方法
小鼠EAE的誘導參考Mromnes 等方法和臨床評分標準Gtromnes IM, et al. Nature Protocols, 2006，1 1810-19)。應用 M0G35-55 多 Jft 片段 MEVGffYRSPFSRVVHLYRNGK作為免疫抗原誘導野生型小鼠EAE發(fā)生。小鼠EAE動物模型神經功能評分具體標準如下0分，無明顯異常；0. 5分，部分尾巴無力松弛；1分，完全尾巴癱瘓；2分，后肢無力，行動遲緩，輕度共濟失調；2. 5分，一條后肢癱瘓；3分，兩條后肢癱瘓；3. 5分，后肢癱瘓，前肢無力；4分，前肢癱瘓；5分，瀕臨死亡。小鼠在9-14天時發(fā)生EAE，每天檢查并記錄疾病臨床神經功能分級。實驗方法8-10周大的性別、年齡和體重相同的雌性C57BL/6野生型小鼠用來分組誘導EAE，每組n=8只小鼠。100 μ gM0G35_55多肽和500 μ g滅活的分支桿菌 (Mycobacterium tuberculosis，結核桿菌，購自 Difco 公司)與 100 μ 1 生理鹽水和 100 μ 1 Freund' s佐劑(購自SIGMA公司)完全混合，乳化，小鼠后背皮下分四個點注射(50 μ 1/ 點)。同時在當天和免疫48小時后每只小鼠分別腹腔注射200ng百日咳毒素(pertussis toxin，購自List Biological Laboratories)。給藥組從第7天開始每天每公斤體重喂食 20、50mg的Embelin。9_14天后小鼠開始發(fā)生EAE。每天檢查記錄疾病臨床神經功能分級。結果實驗性自身免疫腦脊髓炎是人多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等腦脊髓炎癥性疾病的疾病動物模型，也是研究自身免疫性和炎癥性疾病的典型動物模型。本發(fā)明每天每公斤體重喂食20、50mg的Embelin可以顯著抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病程度(圖8、9)，抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎發(fā)病的最高分和臨床評分總和(圖 10、11)，對小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎具有明顯的治療作用。綜合上述結果，說明信筒子醌可以抑制免疫系統(tǒng)激活，可以治療自身免疫性炎癥性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等神經系統(tǒng)炎癥性疾病。
參考文獻范凡，朱正秋。樹突狀細胞在腫瘤免疫治療中的應用進展。Medical Recapitulate Feb 2011 Vol 17，No. 4 文章編號1006-2084(2011)04-0542-03.SteinmanRM, HawigerD, NussenzweigMC. Tolerogenic dendritic cells [J]· Annu Rev Immuno, 1 2003，21 (12): 685-711.Tjoa BA, Murphy GP. Progress in active specific immunotherapy ofprostate cancer[ J]. Semin Surg Oncol，2000， 18(1):80-97Banchereau J，Briere F，Caux C，et al. Immunobiology of dendritic cells[J]. Annu Rev Immunol, 2000， 18:767-811Steinman RMj Hawiger D，Liu K，et al. Dendritic cell function in vivo during the steady state:a role in peripheral tolerance [J]. Ann NY Acad Sci，2003 ，987:15-24Min W, Huang X， Gorezynski R， et al. Fas ligand-transfected dendritic cells induce apoptosis of antigen-specific T cells [J]. Transplant Proc, 2001，33(1-2) :234-241Min MP，Zhou D，Ichim TEj et al. Inhibitory feedback loop between tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells in transplant tolerance[J]. J Immunol, 2003， 170:1304-1312Lespagnard L，Gancberg D，Rouas G， et al . Tumorinfiltrating den-dritic cells in adenocarcinomas of the breast :a study of 143neoplasmswith a correlation to usual prognostic factors and to clinical outcome[J] Int J Cancer ， 1999 ,84(3) :309-314Heo JYj Kim HJj Kim SMj Park KRj Park SYj Kim SWj Nam D，Jang HJj Lee SGj Ahn KSj Kim SHj Shim BSj Choi SHj Ahn KS. (2011) Embelin suppresses STAT3 signaling, proliferation, and survival of multiple myeloma via the protein tyrosine phosphatase PTEN. Cancer Lett. 308 (1):71-80Dai Y，Qiao Lj Chan KWj Yang M，Ye J，Ma J，Zou B，Gu Q，Wang J，Pang Rj Lan HYj Wong BC. (2009) Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma contributes to the inhibitory effects of Embelin on colon carcinogenesis. Cancer Res. 69(11) :4776-83Klotz Lj Burgdorf S，Dani I，Saijo K，F(xiàn)lossdorf J，Hucke S， Alferink J， Nowak N， Beyer M， Mayer G， Langhans B， Klockgether T， Waisman A， Eberl G，Schultze J，F(xiàn)amulok M，Kolanus W, Glass C, Kurts C，Knolle PA. (2009) The nuclear receptor PPAR gamma selectively inhibits Th 17 differentiation in a T cell-intrinsic fashion and suppresses CNS autoimmunity. J Exp Med. 206(10):2079-896。
權利要求
1.信筒子醌在制備作為治療自身免疫性疾病、神經系統(tǒng)炎癥性疾病藥物方面的應用。
2.信筒子醌在制備治療器官移植抑制免疫排斥藥物中的應用。
3.權利要求1所述的應用，其中所述的自身免疫性疾病指的是免疫樹突狀細胞或T 細胞相關的自身免疫性疾病。
4.權利要求3所述的應用，其中免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫疾病指的是 多發(fā)性硬化癥、自身免疫性視網膜炎、視神經脊髓炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、潰傷性結腸炎、皮炎、肌炎、系統(tǒng)性硬化癥。
5.權利要求1所述的應用，其中神經系統(tǒng)炎癥性疾病指的是多發(fā)性硬化癥、視神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了信筒子醌(Embelin)在制備治療自身免疫疾病藥物方面的應用。本發(fā)明的實驗結果表明信筒子醌可以抑制人免疫樹突狀細胞的分化，抑制LPS激活的人免疫樹突狀細胞的成熟度；可以抑制未成熟樹突細胞的抗原攝取能力和成熟樹突狀細胞的抗原提呈能力，可以抑制樹突細胞刺激的T細胞增殖反應，抑制樹突狀細胞分泌的促進輔助型T細胞1型和17型細胞分化的細胞因子表達。特別是信筒子醌可以減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病程度。因此，本發(fā)明涉及制備抑制免疫系統(tǒng)的藥物，有望在臨床上成為治療多發(fā)性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。
文檔編號A61P37/06GK102488678SQ201110434108
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權日2011年12月22日
發(fā)明者張榮信, 薛振毅 申請人:天津醫(yī)科大學