專利名稱：預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗及其制備方法，屬于獸用疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,簡稱PRRS)，是一種危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡段豬的呼吸道疾病和高死亡率為特征。2006年夏秋季，我國南方部分省份發(fā)生豬“高熱病”疫情，農(nóng)業(yè)部積極組織科研人員聯(lián)合攻關(guān)，確定豬藍(lán)耳病變異病毒為主要病原，定名為“高致病性豬藍(lán)耳病”。直至今日，疫病形勢依然嚴(yán)峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于藍(lán)耳病的治療，免疫接種是防制該病的最有效方法?！へi痕(ClassicalSwine fever,簡稱 CSF)又稱為豬霍亂(Hog cholera)或歐洲型豬痕(European swine fever),是一種豬只急性或超急性發(fā)熱的病毒傳染性疾病，臨床上的特征是散播迅速、發(fā)燒，解剖檢驗(yàn)時(shí)可看到典型的出血病變。豬瘟可感染各種年齡的豬只，一年四季流行，發(fā)病率和死亡率均高，對豬只危害極大。本病是威脅養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，中國則定為一類烈性傳染病。目前，僅有豬藍(lán)耳病和豬瘟的單價(jià)疫苗，需要單獨(dú)分別注射，不僅免疫工作量大，成本很高，而且多次免疫對豬機(jī)體造成更大的應(yīng)激反應(yīng)，需要間隔免疫。然而，一直以來尚未見到豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗制備成功，本發(fā)明二聯(lián)疫苗能實(shí)現(xiàn)一針兩防，減少免疫刺激，促使機(jī)體能夠產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)預(yù)防和治療豬藍(lán)耳病和豬瘟病。技術(shù)方案—種預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗，包含以下成分豬藍(lán)耳病抗原成分、豬瘟抗原成分及疫苗凍干保護(hù)劑。優(yōu)選地，本發(fā)明所述豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO5TCID5tl/頭份，更優(yōu)選地，本發(fā)明所述豬藍(lán)耳病抗原含量為IO6TCID5tl/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明豬瘟抗原含量至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份，優(yōu)選地，每頭份應(yīng)含有0.015ml細(xì)胞毒液。優(yōu)選地,本發(fā)明所述豬痕抗原含量為9000個(gè)家兔感染量/頭份,優(yōu)選地,每頭份應(yīng)含有0. Olml細(xì)胞毒液。上述預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟二聯(lián)疫苗的制備方法，包括以下步驟使用傳代細(xì)胞培養(yǎng)豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒，以獲得豬藍(lán)耳病抗原和豬瘟抗原，按比例混合二種抗原成分，輔以凍干保護(hù)劑制備成凍干疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中，所述豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO5TCID5tl/頭份；優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中，所述豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO6TCID5tl/頭份；優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中，所述豬瘟抗原含量至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中，所述豬瘟抗原含量為9000個(gè)家兔感染量/頭份。優(yōu)選地，本發(fā)明上述方法中，所述抗原混合體積比例為豬藍(lán)耳病抗原豬瘟抗原體積比為I : 5 I : 10。即，通過按比例混合二種抗原成分，使二聯(lián)疫苗中的豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO5TCID5tl/頭份，更優(yōu)選地，豬藍(lán)耳病抗原含量為IO6TCID5tl/頭份；使得豬瘟抗原含量至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份，每頭份應(yīng)含有0. 015ml細(xì)胞毒液；最優(yōu)選地，豬瘟 抗原含量為9000個(gè)家兔感染量/頭份，每頭份應(yīng)含有0. Olml細(xì)胞毒液。本發(fā)明的另一目的在于提供一種如上所述的二聯(lián)疫苗在預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟方面的用途。由上可見，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗中，通過使兩種抗原達(dá)到合適配比，使得兩種抗原互相沒有干擾，疫苗效力至少達(dá)到或超出原有單苗的效力。其次，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗制備方法簡單，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的分次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上兩種疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的二聯(lián)疫苗中所述豬藍(lán)耳病病毒為JXAl-R株，公開于中國專利CN101307305A，保藏號(hào)CGMCCNo. 2467，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。本發(fā)明的二聯(lián)疫苗中所述的豬瘟病毒為豬瘟兔化弱毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌株保藏編號(hào)CVCC AV1412。本發(fā)明實(shí)施例二聯(lián)疫苗中優(yōu)選凍干前藍(lán)耳病病毒含量為109TCID5(l/ml ;豬瘟病毒凍干前含量為90萬個(gè)家兔感染量/ml。本發(fā)明實(shí)施例中可以通過調(diào)整凍干前藍(lán)耳病病毒液與豬瘟病毒液比例至I : 5 I 10體積，可以獲得使二聯(lián)疫苗中的豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO5TCID5tl/頭份，更優(yōu)選地，豬藍(lán)耳病抗原含量為IO6TCID5tl/頭份；使得豬瘟抗原含量至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份，每頭份應(yīng)含有0. 015ml細(xì)胞毒液；最優(yōu)選地，豬瘟抗原含量為9000個(gè)家兔感染量/頭份，每頭份應(yīng)含有0.01ml細(xì)胞毒液。其中，本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選調(diào)整凍干前藍(lán)耳病病毒與豬瘟病毒比例為I : 5體積比，獲得的二聯(lián)疫苗每頭份含藍(lán)耳病病毒為IO6TCID5tl、豬瘟病毒為9000個(gè)家兔感染量。實(shí)施例I、豬藍(lán)耳病與豬瘟二聯(lián)活疫苗的制備I.生產(chǎn)用毒種的制備豬藍(lán)耳病毒種的制備取生長良好的Marc-145細(xì)胞(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，用胰酶消化，并接種于細(xì)胞瓶內(nèi)，同時(shí)將毒種用含1% v/v胎牛血清(PAA公司生產(chǎn))的MEM (Invitrogen公司生產(chǎn))維持液作10倍稀釋，按5%體積接種量接種病毒，37°C培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng)70%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，凍融3次，收獲病毒，病毒滴度為每Iml病毒含量為109_ 5TCID5qij豬瘟病毒種的制備用含1% v/v胎牛血清(PAA公司生產(chǎn))的a -MEM(Invitrogen公司生產(chǎn))細(xì)胞維持液，將毒種制成0. 3 % v/v的病毒懸液，接種生長良好的ST細(xì)胞(購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心)單層，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種。細(xì)胞毒種每Iml含病毒90萬個(gè)家兔感染量。2.病毒液的培養(yǎng)制備藍(lán)耳病病毒液的制備取生長良好的單層覆蓋率達(dá)80%以上的Marc-145細(xì)胞，棄去含5% v/v胎牛血清的MEM生長液，同時(shí)將毒種用含1% v/v胎牛血清的MEM維持液作10倍稀釋，按5% v/v接種量接種病毒，37°C培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察由病毒引起的細(xì)胞病變(CPE)，直至CPE達(dá)到80% -90%時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，收獲病毒，病毒滴度為每Iml病毒含量為IO9TCID5tlt5
豬瘟病毒液的制備取已形成良好單層的ST細(xì)胞，接種含3% v/v生產(chǎn)用細(xì)胞毒種的維持液(維持液為含I % v/v胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液)，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后第3日作第一次收獲換液，以后每隔2日收獲換液一次,收獲3次,收獲的病毒液置于_20°C以下保存。病毒液每Iml含病毒90萬個(gè)家兔感染量。3.病毒含量測定藍(lán)耳病病毒液病毒含量測定將收獲的病毒液用無血清的MEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋，取lo'io'io'io'io-'io—ne個(gè)稀釋度，分別接種于96孔細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度接種6孔，每孔0. 1ml，在含5% CO2、37 °C下培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察3-5日，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50 0 每 Iml 病毒含量為 IO9TCID500豬瘟病毒液病毒含量測定將收獲的病毒液取Iml用無菌生理鹽水倍比系列稀釋，取6X IO5倍、7X IO5倍、8X IO5倍、9X IO5倍、IO6倍、I. I X IO6倍6個(gè)稀釋度，耳靜脈注射體重為I. 5-3kg家兔兩只，每只1ml。家兔接種后，上下午個(gè)測體溫I次，48小時(shí)后，每隔6小時(shí)測體溫I次，根據(jù)體溫反應(yīng)和攻毒結(jié)果進(jìn)行綜合判定。每Iml病毒含量為90萬個(gè)家兔感染量。4.配苗、分裝及凍干將檢驗(yàn)合格的豬藍(lán)耳病、豬瘟病病毒液，以I : 5的體積比例混合，混合于同一容器內(nèi)，加入凍干保護(hù)劑，充分搖勻，定量分裝，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。連續(xù)生產(chǎn)三批疫苗1001、1002和1003，1001批每頭份藍(lán)耳病病毒含量為IO6 5TCID5tl、豬瘟病毒含量為9000個(gè)家兔感染量；1002批每頭份藍(lán)耳病病毒含量為IO6 2TCID5tl、豬瘟病毒含量為9000個(gè)家兔感染量；1003批每頭份藍(lán)耳病病毒含量為106_3TCID5tl、豬瘟病毒含量為9000個(gè)家兔感染量。5.疫苗的安全及效力檢驗(yàn)安全性檢驗(yàn)藍(lán)耳病部分，將三批疫苗分別用生理鹽水做適當(dāng)稀釋(10頭份/ml)，用3-4周齡豬藍(lán)耳病病毒抗原、抗體陰性仔豬15頭。每批疫苗用5頭，各肌肉注射稀釋好的疫苗lml，逐日測量體溫，觀察21日，均沒有出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身反應(yīng)。同時(shí)，選用經(jīng)中和試驗(yàn)方法檢測無豬瘟抗體的健康易感斷奶豬12頭(注苗前觀察5-7日，每日上下午各測體溫I次。挑選體溫、精神、食欲正常者使用)。每批凍干疫苗樣品等量混合，按瓶簽注明的頭份用滅菌生理鹽水稀釋成每Iml含6頭份疫苗，肌肉注射豬4頭，每頭5ml (含30個(gè)使用劑量)。注苗后，每日上、下午各觀察并測體溫I次，觀察21日。體溫、精神、食欲與注苗前相比沒有明顯變化，疫苗判為合格。效力檢驗(yàn)藍(lán)耳病部分，用4-6周齡豬藍(lán)耳病病毒抗原、抗體陰性豬30頭，每批疫苗10頭，其中5頭肌肉注射疫苗I頭份，另5頭作為對照，同等條件下隔離飼養(yǎng)。28日后，所有豬肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒NVDC-JXAl株的病毒培養(yǎng)液(彡104 5TCID5(l/ml) 3ml，每日測溫并觀察21日。對照豬5頭均發(fā)病，且3頭死亡，免疫豬5頭全保護(hù)。豬瘟部分，每批按瓶簽注明頭份用無菌生理鹽水將每頭份疫苗稀釋9000倍，耳靜脈注射體重為I. 5-3kg家兔2只，每只lml。家兔接種后，上下午各測體溫I次，48小時(shí)后，每隔6小時(shí)測體溫I次，根據(jù)體溫反應(yīng)和攻毒結(jié)果進(jìn)行綜合判定。①家兔接種疫苗后，體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如下定型熱反應(yīng)(++)潛伏期48 96小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個(gè)溫次超過常溫1°C以上，并稽留18 36小時(shí)。如稽留42小時(shí)以上，必須攻毒，攻毒后無反應(yīng)可判 為定型熱。輕熱反應(yīng)(+)潛伏期48 96小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個(gè)溫次超過常溫0. 50C以上，并稽留12 36小時(shí)?？梢煞磻?yīng)(±)潛伏期48 96小時(shí)，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時(shí)；或潛伏期在24小時(shí)以上，不足48小時(shí)及超過96小時(shí)至120小時(shí)出現(xiàn)熱反應(yīng)。體溫反應(yīng)呈二次高峰,有一次高峰符合定型熱反應(yīng)(++)或輕熱反應(yīng)(+)標(biāo)準(zhǔn)者，均須攻毒。攻毒后無反應(yīng)時(shí)，該兔熱反應(yīng)可判為定型熱或輕熱反應(yīng)。無反應(yīng)(_)體溫正常。②結(jié)果判定注苗后，當(dāng)2只家兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)、另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，疫苗判為合格。注苗后，當(dāng)I只家兔呈定型熱反應(yīng)(++)或輕熱反應(yīng)(+)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±);或2只兔均呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，可在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒或凍干毒)。攻毒時(shí)，加對照兔2只，攻毒劑量為50 100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后的體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如下熱反應(yīng)⑴潛伏期24 72小時(shí)，體溫上升呈明顯曲線，超過常溫1°C以上，稽留12 36小時(shí)。可疑反應(yīng)(±)潛伏期不到24小時(shí)或72小時(shí)以上，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時(shí)或超過36小時(shí)而不下降。無反應(yīng)(_)體溫正常。攻毒后，當(dāng)2只對照兔均呈定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)，另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)，而2只注苗兔均無反應(yīng)(_)，疫苗判合格。注苗后，如有I只兔呈定型熱(++)或輕熱反應(yīng)(+)，另I只兔呈可疑反應(yīng)(±)或無熱反應(yīng)(_)，可對可疑反應(yīng)兔或無反應(yīng)兔采用剖殺或采心血分離病毒的方法，判明是否隱性感染；或注苗后，2只兔均呈輕熱反應(yīng)，亦可對其中I只兔分離病毒。方法是接種疫苗后96 120小時(shí)之間，將兔剖殺，采取脾臟，用生理鹽水制成50倍稀釋乳劑(脾乳劑應(yīng)無菌)，或采取心血(全血)，接種2只家兔，每只兔耳靜脈注射lml。凡有I只兔潛伏期24 72小時(shí)出現(xiàn)定型熱反應(yīng)(++)，疫苗可判為合格。結(jié)果三批疫苗注射后，每批2只家兔均呈現(xiàn)定型熱反應(yīng)(++)，或I只兔呈定型熱反應(yīng)(++)、另I只兔呈輕熱反應(yīng)(+)時(shí)，疫苗判為合格。6.免疫保護(hù)試驗(yàn)將三批疫苗分別用生理鹽水按瓶簽注明的頭份稀釋成每Iml含I頭份疫苗，選用經(jīng)中和試驗(yàn)方法檢測無豬瘟抗體，且豬藍(lán)耳病病毒抗原、抗體陰性的健康易感斷奶豬60頭，每批疫苗20頭，其中10頭肌肉注射疫苗I頭份，另10頭作為對照，同等條件下隔離飼養(yǎng)。14日后，其中5頭注苗豬及5頭對照豬，注射豬瘟石門系血毒Imiao5最小致死量，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保藏編號(hào)CVCC AV1411)，觀察16日。對照豬全部發(fā)病，且至少有4頭死亡，免疫豬全部健活。每批另外5頭注苗豬在注苗后28日，連同剩余5頭對照豬肌肉注射檢驗(yàn)用強(qiáng)毒NVDC-JXAl株(公開于CN 101045917A，保藏號(hào)為CGMCCN0. 1964)的病毒培養(yǎng)液(彡104 5TCID5(l/ml)3ml，每日測溫并觀察21日。對照豬5頭均發(fā)病，且至少4頭死亡，免疫豬5頭全保護(hù)。具體結(jié)果見表I?！け鞩 二聯(lián)苗免疫保護(hù)試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗，其特征在于，包含以下成分豬藍(lán)耳病抗原成分、豬瘟抗原成分及疫苗凍干保護(hù)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO5TCID50/ 頭份。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述豬瘟抗原含量至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述豬瘟抗原含量為9000個(gè)家兔感染量/頭份。
5.一種如權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的二聯(lián)疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟使用傳代細(xì)胞培養(yǎng)豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒，以獲得豬藍(lán)耳病抗原和豬瘟抗原，按比例混合二種抗原成分，輔以凍干保護(hù)劑制備成凍干疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述豬藍(lán)耳病抗原含量至少為IO5TCID5tl/頭份。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述豬瘟抗原含量至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述豬瘟抗原含量為9000個(gè)家兔感染量/頭份。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗原混合比例為豬藍(lán)耳病抗原豬瘟抗原為1:5。
10.一種如權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的二聯(lián)疫苗在預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療豬藍(lán)耳病和豬瘟的二聯(lián)疫苗，包含以下成分含量至少為105TCID50/頭份豬藍(lán)耳病抗原和至少為7500個(gè)家兔感染量/頭份的豬瘟抗原含量。本發(fā)明的二聯(lián)疫苗制備方法為使用傳代細(xì)胞培養(yǎng)豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒，獲得豬藍(lán)耳病抗原和豬瘟抗原后，按比例混合二種抗原成分，輔以凍干保護(hù)劑制備成的凍干疫苗。本發(fā)明首次通過使兩種抗原達(dá)到合適配比，實(shí)現(xiàn)了二聯(lián)疫苗達(dá)到或超出原有單苗的效力。其次，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗制備方法簡單，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的分次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上兩種疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102973933SQ20111044819
公開日2013年3月20日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司