專利名稱：作為熱燒蝕裝置的dna樹枝狀聚合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用輻射吸收納米顆粒的靶向遞送進(jìn)行細(xì)胞和組織的熱燒蝕的材料和方法。背景3DNA 樹枝狀聚合物為僅由DNA組成的專利樹枝狀分子。作為一個(gè)種類，樹枝狀聚合物為從相互連接的天然或合成單體亞基構(gòu)建的復(fù)雜的高度支化的分子。3DNA 樹枝狀聚合物由DNA單體構(gòu)成，所述每一個(gè)DNA單體由兩條共有位于每一條鏈的中央部分的具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域的DNA鏈制成(圖I)。在制備過程中組合單體以制備具有不同尺寸和形狀的DNA樹枝狀聚合物(圖2)。為了防止DNA樹枝狀聚合物隨時(shí)間過去解體 (fall apart)，所述過程中，使用紫外光通過補(bǔ)骨脂素交聯(lián)劑的嵌入和活化將化學(xué)“點(diǎn)焊接頭(spot weld)”添加至不斷生長(zhǎng)的裝配體。在超速離心后在變性蔗糖梯度上根據(jù)它們的尺寸和分子量純化樹枝狀聚合物(圖3)。DNA樹枝狀聚合物具有被共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合于許多不同種類的分子和顆粒的能力。此類分子和顆粒通常已被用作DNA樹枝狀聚合物上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向裝置，從而使得能夠?qū)NA樹枝狀聚合物靶向特定的分子靶并且通過檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分(signalingmoiety)來檢測(cè)樹枝狀聚合物與靶的結(jié)合。信號(hào)生成分子包括大量熒光染料、半抗原、酶和其它分子材料以及顆粒例如金納米顆粒和量子點(diǎn)。靶向裝置包括DNA、RNA和PNA寡核苷酸、抗體、抗體片段、半抗原、適體、肽等。此類DNA樹枝狀聚合物構(gòu)建體已在許多體外應(yīng)用中用作信號(hào)放大器，通常用于檢測(cè)特定核酸和蛋白質(zhì)，而且還可用作電子設(shè)備的檢測(cè)裝置。應(yīng)用包括DNA和蛋白質(zhì)陣列、ELISA和ELOSA、Luminex珠粒測(cè)定、原位雜交等上的信號(hào)放大。已標(biāo)記的靶向DNA樹枝狀聚合物的用途已詳盡地公布于研究中并且此類材料可作為商業(yè)研究產(chǎn)品獲得或由Genisphere LLC(Hatfield, PA)生產(chǎn)。也已顯示DNA樹枝狀聚合物在體外和體內(nèi)應(yīng)用中具有作為遞送和轉(zhuǎn)染裝置的潛在用途。參見，例如，U. S. 2005/0089890、W02008/147526 和 WO 2010/017544，將所述專利申請(qǐng)通過引用整體并入本文。具體地，將DNA樹枝狀聚合物與靶向裝置(例如，對(duì)于能夠引發(fā)細(xì)胞內(nèi)吞的內(nèi)化事件的細(xì)胞表面特性是特異性的抗體)結(jié)合，所述靶向裝置結(jié)合被靶向的細(xì)胞上的表面特征以接收負(fù)荷(例如，藥物)的遞送。負(fù)荷可與靶向DNA樹枝狀聚合物被動(dòng)締合并且僅通過與樹枝狀聚合物空間締合進(jìn)入細(xì)胞，或可通過許多連接策略將負(fù)荷直接與樹枝狀聚合物結(jié)合。經(jīng)歷100至2000瓦(在13. 56MHz的波長(zhǎng)上)的射頻場(chǎng)達(dá)5分鐘的金納米顆粒(和包含其它金屬(包括銀、鎘、鐵等)的納米顆粒)已在體外和體內(nèi)應(yīng)用中被用于細(xì)胞的熱燒蝕。參見，例如，Cardinal 等人,2008, Surgery 144:125-132 和 Gannon 等人，2008,J. Nanobiotechnology6:2,將所述每一篇文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。此類方法可稱為射頻燒蝕(radiofrequency ablation) (RFA),并且已在臨床實(shí)踐中用于治療腫瘤。然而,存在對(duì)開發(fā)用于治療腫瘤的改進(jìn)的熱燒蝕技術(shù)的特別需要，因?yàn)楫?dāng)前的治療是需要將針電極直接插入腫瘤的侵入法，完全的腫瘤破壞難以實(shí)現(xiàn)(特別是對(duì)于更大的腫瘤)并且治療對(duì)于經(jīng)歷熱傷的電極周圍的惡性腫瘤和正常組織是相對(duì)非特異性的。聚焦的外部射頻能量場(chǎng)對(duì)人組織的穿透是有效的，但外部能量源的使用需要對(duì)RFA特異性反應(yīng)以將熱療法(thermaltherapy)靶向惡性細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)或瘤內(nèi)試劑的存在。此外，存在對(duì)使由靶向分子或載體分子遞送的熱燒蝕能力最大化，從而使必須被遞送至患者的熱燒蝕組合物的量降至最低，從而減小組合物本身的任何潛在毒性的組合物和方法的需要。此外，為了將納米顆粒遞送至被靶向的組織，載體必須大至足以避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)消除但小至足以從循環(huán)進(jìn)入(例如，通過外滲)腫瘤組織。這對(duì)此類組合物設(shè)置了尺寸限制。概述本發(fā)明包括包含能夠通過使用遠(yuǎn)程電磁場(chǎng)例如射頻(RF)或紅外場(chǎng)(infraredfield)進(jìn)行原位加熱的顆粒的DNA樹枝狀聚合物的用途以及其制備。與包含在電磁場(chǎng)存在的情況下加熱的成分的顆粒結(jié)合的DNA樹枝狀聚合物適合用作能夠在體外、離體、體內(nèi)應(yīng)用中熱燒蝕靶的裝置。可通過使用每個(gè)樹枝狀聚合物分子包含多個(gè)金屬納米顆粒來實(shí)現(xiàn)靶 細(xì)胞和組織的熱燒蝕效率的顯著增加，特別地當(dāng)DNA樹枝狀聚合物也包含能夠?qū)⒊錆M樹枝狀聚合物的顆粒導(dǎo)向期望被靶向的細(xì)胞和組織的表面的靶向裝置時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的樹枝狀聚合物導(dǎo)向的熱燒蝕的應(yīng)用包括I)患病細(xì)胞和組織例如集中在腫瘤中的癌細(xì)胞、全身擴(kuò)散的轉(zhuǎn)移細(xì)胞或如在白血病和其它白細(xì)胞增殖障礙中發(fā)現(xiàn)的循環(huán)癌細(xì)胞的熱燒蝕；2)可另外地通過手術(shù)除去的細(xì)胞和組織的燒蝕；3)抗其它治療性治療的微生物(例如，抗抗生素細(xì)菌和其它生物)的燒蝕；4)移植之前細(xì)胞、組織和器官(包括移植器官、血液制品和骨髄)的離體治療；和5)其中熱響應(yīng)納米裝置的接近可具有益處的其它應(yīng)用，包括范圍廣泛的體內(nèi)、離體和體外方法。鑒于DNA樹枝狀聚合物被內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)核酸酶降解的可能性，在活細(xì)胞體外、離體和體內(nèi)存在的情況下DNA樹枝狀聚合物的穩(wěn)定性也已弓I起嚴(yán)重關(guān)注。例如，先前的數(shù)據(jù)顯示DNA樹枝狀聚合物在新鮮人或動(dòng)物血清存在的情況下不能完整地保持超過數(shù)分鐘。預(yù)料之外地，我們發(fā)現(xiàn)包含嵌入交聯(lián)劑補(bǔ)骨脂素以及還包含DNA連接的標(biāo)記物(和其它)部分(例如FITC)和蛋白質(zhì)(例如靶向抗體)的樹枝狀聚合物在人或動(dòng)物血清樣品的存在下極抗核酸酶降解。參見W02010/017544，將其通過引入整體并入本文。這是令人驚訝的結(jié)果，因?yàn)榉菢渲顂sDNA或dsDNA分子通常在核酸酶存在的情況下相當(dāng)快速地降解。雖然熱燒蝕的靶主要包括有生命的和生物的物體，但使用樹枝狀聚合物熱燒蝕無(wú)生命的物體(其中暴露于包含在非常小的體積的充滿DNA樹枝狀聚合物的顆粒內(nèi)的高溫將使特定方法具有附加值)存在可能的益處。多種納米材料可從通過含有靶向DNA樹枝狀聚合物的納米顆粒的熱燒蝕的使用(包括各種含有納米顆粒的材料的電子學(xué)和制造中的應(yīng)用)受益。在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及連接至一個(gè)或多個(gè)靶向部分和一個(gè)或多個(gè)輻射吸收納米顆粒(其可通過電磁能量原位進(jìn)行加熱)的DNA樹枝狀聚合物。在具體的實(shí)施方案中，可通過外部施加的電磁輻射將與DNA樹枝狀聚合物締合的輻射吸收納米顆粒加熱至至少40°C、40-50で、50-60で、60-70で或甚至70-80°C。在其它具體實(shí)施方案中，靶向部分是識(shí)別并且結(jié)合細(xì)胞表面上的腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原例如受體的抗體。在其它具體實(shí)施方案中，輻射吸收納米顆粒為金納米顆粒。在其它實(shí)施方案中，電磁能為射頻輻射。在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于制備熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的方法，其中所述方法包括將一個(gè)或多個(gè)輻射吸收納米顆粒和一個(gè)或多個(gè)靶向部分共價(jià)地結(jié)合至DNA樹枝狀聚合物。在特定方面，可將捕獲寡核苷酸添加至DNA樹枝狀聚合物臂并且綴合至納米顆粒的互補(bǔ)寡核苷酸可與所述捕獲寡核苷酸雜交。還可將靶向部分共價(jià)地結(jié)合至與DNA樹枝狀聚合物臂上的捕獲序列互補(bǔ)并且與捕獲寡核苷酸序列雜交的寡核苷酸。在與捕獲寡核苷酸雜交后，可任選地將互補(bǔ)寡核苷酸的任一個(gè)或兩個(gè)與DNA樹枝狀聚合物的捕獲寡核苷酸交聯(lián)。在其它方面，本發(fā)明提供了用于使用熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物和藥物組合物熱燒蝕細(xì)胞或組織的方法。例如，可將細(xì)胞或組織與包含熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的藥物組合物接觸，所述DNA樹枝狀聚合物在允許DNA樹枝狀聚合物的靶向部分結(jié)合細(xì)胞或組織上的互補(bǔ)靶的條件下靶向細(xì)胞表面上的特征。隨后將具有結(jié)合的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的細(xì)胞或組織暴露于外部施加的電磁輻射例如射頻輻射，以足以引起連接的納米顆粒發(fā)射熱的功率進(jìn)彳丁足以引起所述效應(yīng)的時(shí)間。優(yōu)選地，將納米顆粒暴露于電磁福射例如射頻福射，以便納米顆粒產(chǎn)生至少401、40-501、50-601、60-701或70-801的熱，從而導(dǎo)致與熱燒蝕 DNA樹枝狀聚合物結(jié)合的細(xì)胞或組織熱燒蝕。在具體實(shí)施方案中，將體外細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞與熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物接觸，然后使其暴露于來自導(dǎo)向細(xì)胞培養(yǎng)物的外部來源的電磁輻射例如射頻輻射，以實(shí)現(xiàn)靶向細(xì)胞的熱燒蝕。在可選擇的具體實(shí)施方案中，將細(xì)胞或組織與熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物體內(nèi)或離體接觸，然后將其暴露于來自導(dǎo)向與熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物結(jié)合的細(xì)胞或組織的外部來源的電磁輻射例如射頻輻射，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或組織的熱燒蝕。用于體內(nèi)或離體熱燒蝕的細(xì)胞和組織的實(shí)例包括腫瘤和用于移植的生物材料。附圖簡(jiǎn)述圖I舉例說明用于將用輻射吸收納米顆粒標(biāo)記的寡核苷酸與DNA樹枝狀聚合物的延伸寡核苷酸和臂雜交的方法。圖2舉例說明靶向部分至具有圖I中顯示的連接的輻射吸收納米顆粒的DNA樹枝狀聚合物的附著。圖3舉例說明用輻射吸收納米顆粒標(biāo)記的寡核苷酸與非球狀DNA樹枝狀聚合物的延伸寡核苷酸和臂的雜交。圖4舉例說明用輻射吸收納米顆粒標(biāo)記的寡核苷酸與DNA樹枝狀聚合物單體的延伸寡核苷酸的雜交。圖5舉例說明用輻射吸收納米顆粒標(biāo)記的寡核苷酸與線性DNA樹枝狀聚合物的雜交。下列實(shí)施例無(wú)意是限定性的，并且對(duì)其的變動(dòng)和變化完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。詳細(xì)描述如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物”是指共價(jià)或非共價(jià)地連接至a) —個(gè)或多個(gè)靶向部分和b) —個(gè)或多個(gè)輻射吸收納米顆粒的DNA樹枝狀聚合物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“靶向部分”或“靶向裝置”是指識(shí)別并且結(jié)合細(xì)胞或組織的表面上的互補(bǔ)分子的分子。靶向部分的非限定性實(shí)例包括抗體、抗體片段、結(jié)合蛋白和肽、受體及受體的配體。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“輻射吸收納米顆粒”是指吸收電磁輻射(包括例如紅外、近紅外(NIR)和射頻(RF)輻射)并且將吸收的能量轉(zhuǎn)化成可用于產(chǎn)生局部過熱的釋放的熱的納米顆粒。如本文中所用，關(guān)于對(duì)電磁輻射的暴露的術(shù)語(yǔ)“外部來源”或“外部施加的”是指將電磁輻射從患者的身體外部或細(xì)胞或組織培養(yǎng)物的外部導(dǎo)向細(xì)胞或組織靶。為了生物醫(yī)學(xué)目的將電磁輻射遞送至期望的位置的該方法將不同于其中通過在所述位置植入的針或探針將這樣的輻射遞送至靶位置的常規(guī)方法。如本文中所用，關(guān)于DNA樹枝狀聚合物的術(shù)語(yǔ)“臂”是指形成DNA樹枝狀聚合物并且可用于功能性分子例如檢測(cè)、遞送和捕獲試劑的雜交或附著的単體的單鏈末端。在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物。熱燒蝕樹枝狀聚合物包含一個(gè)或多個(gè)連接至一個(gè)或多個(gè)樹枝狀聚合物臂的靶向部分和一個(gè)或多個(gè)也連接至一個(gè)或多個(gè)樹枝狀聚合物臂的輻射吸收納米顆粒?？蓪邢虿糠趾图{米顆粒之任一或兩者直接共價(jià)地連接至DNA樹枝狀聚合物?；蛘?，可通過將攜帶靶向部分或納米顆粒的寡核苷 酸與DNA樹枝狀聚合物雜交來將靶向部分和納米顆粒之任一或兩者連接至DNA樹枝狀聚合物，如圖I和圖2中顯示的。在其它可選擇方面，可將靶向部分和納米顆粒之任一或兩者通過與綴合至祀向部分或納米顆粒的載體寡核苷酸的DNA樹枝狀聚合物雜交來連接至DNA樹枝狀聚合物?？扇芜x地將載體寡核苷酸與DNA樹枝狀聚合物交聯(lián)。熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的DNA樹枝狀聚合物組分可以是本領(lǐng)域已知的任何DNA 樹枝狀聚合物，例如美國(guó)專利 No. 5，175，270,5,484, 904,5,487,973,6, 110,687 和6，274，723中描述的DNA樹枝狀聚合物，包括非球狀和三維或球狀DNA樹枝狀聚合物。三維或球狀DNA樹枝狀聚合物可以是I層、2層、3層或4層DNA樹枝狀聚合物，但還可包含超過4層。在第一具體實(shí)例中，DNA樹枝狀聚合物包含至少4層。非球狀和線性DNA樹枝狀聚合物提供了比三維DNA樹枝狀聚合物更致密的結(jié)構(gòu)和更高的納粒顆粒對(duì)樹枝狀聚合物質(zhì)量比，這可促進(jìn)組織的攝入并且增強(qiáng)熱燒蝕的效率。例如，圖3、圖4和圖5顯示與用輻射吸收納米顆粒標(biāo)記的寡核苷酸雜交的不同類型的非球狀和線性DNA樹枝狀聚合物。在一些情況下，可將約30-35個(gè)納米顆粒連接至僅由4條鏈組成的線性ニ聚體DNA樹枝狀聚合物。三維DNA樹枝狀聚合物中的層的數(shù)目或線性DNA樹枝狀聚合物的鏈的數(shù)目決定了DNA樹枝狀聚合物的尺寸。這可用于選擇和最化化本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物，因?yàn)槌叽缬绊憻釤gDNA樹枝狀聚合物進(jìn)入熱燒蝕靶位置和當(dāng)胃腸外施用以進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用時(shí)避開吞噬清除的能力。醫(yī)生因此可基于層或鏈的數(shù)目構(gòu)建選擇的尺寸的DNA樹枝狀聚合物以獲得胃腸外施用時(shí)的期望的半衰期和期望量的熱燒蝕能力的遞送。例如，4層DNA樹枝狀聚合物直徑通常為約170nm，并且預(yù)期對(duì)吞噬清除不太易感。其還大至足以攜帶大量靶向部分和大量輻射吸收納米顆粒以提供目標(biāo)細(xì)胞或組織的熱燒蝕效率和高效靶向?？梢岳缬醚a(bǔ)骨脂素交聯(lián)DNA樹枝狀聚合物核心的單體以確保在體內(nèi)使用期間的穩(wěn)定性。然而，構(gòu)建的無(wú)交聯(lián)(即，僅基于單體的臂的雜交)的DNA樹枝狀聚合物在37 °C下是穩(wěn)定的，因此預(yù)期在體內(nèi)保持雜交。此外，臂的結(jié)合位置在長(zhǎng)度上通常為31個(gè)核苷酸或更多，Tm估計(jì)為65°C，并且單體的“腰部”在長(zhǎng)度上為至少50個(gè)核苷酸，Tm估計(jì)超過80-90 V。基于這些原因，如果交聯(lián)劑被認(rèn)為是不適合于體內(nèi)使用的，則預(yù)期通過單獨(dú)雜交構(gòu)建的本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物在體內(nèi)溫度下是穩(wěn)定的。連接至熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的臂的輻射吸收納米顆?？梢砸赃m合于在選擇的應(yīng)用中產(chǎn)生期望的熱燒蝕效率的任何數(shù)目存在。應(yīng)理解，每個(gè)樹枝狀聚合物的納米顆粒的數(shù)目將受到它們所連接至的DNA樹枝狀聚合物的尺寸限制，但可如上所述適當(dāng)?shù)馗淖僁NA樹枝狀聚合物的尺寸。還應(yīng)理解，至少一些可獲得的樹枝狀聚合物臂可保持不與靶向部分連接。例如，熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物可包含15-1200個(gè)輻射吸收納米顆粒、25-500個(gè)輻射吸收納米顆粒、50-350個(gè)輻射吸收納米顆粒、100-500個(gè)輻射吸收納米顆粒、200-400個(gè)輻射吸收納米顆?；蚣s300個(gè)輻射吸收納米顆粒。輻射吸收納米顆粒在尺寸上通常為約5_20nm、5nm、10nm、15nm 或 20nmo連接至熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的臂的靶向部分可以以適合于在選擇的應(yīng)用中獲得期望的與被靶向的組織或細(xì)胞結(jié)合的程度的任何數(shù)目存在。應(yīng)理解，每個(gè)樹枝狀聚合物的靶向部分的數(shù)目將受限于它們所連接至的DNA樹枝狀聚合物的尺寸，但可如上所述適當(dāng)?shù)母淖僁NA樹枝狀聚合物的尺寸。類似地應(yīng)理解，至少一些可獲得的樹枝狀聚合物臂可 保持不與輻射吸收納米顆粒連接。例如，熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物可包含足以提供至至少40°C、40-50°C、50-60°C、60-7(rC或70_80°C的原位加熱(使用外部施加的電磁輻射例如射頻輻射進(jìn)行的)的許多輻射吸收納米顆粒。取決于樹枝狀聚合物的尺寸和結(jié)構(gòu)(線性的或三維的)，根據(jù)本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物可具有平均少于I至大于100個(gè)，2至120個(gè)，15至50個(gè)或30至35個(gè)連接至臂的靶向部分。在具體的實(shí)例中，可將約25個(gè)靶向部分連接至4層DNA樹枝狀聚合物。在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的方法。上文中提及了用于構(gòu)建DNA樹枝狀聚合物的方法。隨后可將靶向部分和輻射吸收納米顆粒連接至DNA樹枝狀聚合物的臂。在第一實(shí)例中，將靶向部分和/或輻射吸收納米顆粒通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)綴合直接連接至DNA樹枝狀聚合物的臂。然而，在第二實(shí)例中，將靶向部分和/或輻射吸收納米顆粒通過與DNA樹枝狀聚合物的臂締合的捕獲寡核苷酸連接至DNA樹枝狀聚合物。通常將捕獲寡核苷酸與DNA樹枝狀聚合物臂的末端締合。一般地，將其連接至DNA樹枝狀聚合物的臂的末端，但還可將其與末端雜交以及任選地與其交聯(lián)或通過使用下文中描述的延伸寡核苷酸與臂締合。捕獲寡核苷酸提供了以確定量存在的特定的確定的序列以與連接至靶向部分或納米顆粒的互補(bǔ)載體寡核苷酸雜交。捕獲寡核苷酸還提供了用于控制連接至DNA樹枝狀聚合物的靶向部分和納米顆粒的數(shù)目的工具，因?yàn)榭蓪⑤d體寡核苷酸與確定濃度的捕獲寡核苷酸雜交，所述濃度導(dǎo)致期望數(shù)目的DNA樹枝狀聚合物臂被每一個(gè)組分占據(jù)。因此可改變載體寡核苷酸的雜交濃度和體積以調(diào)整每個(gè)樹枝狀聚合物的納米顆粒和靶向部分的數(shù)目。在互補(bǔ)載體寡核苷酸雜交后，靶向部分或納米顆粒通過沃爾森-克里克堿基配對(duì)連接至DNA樹枝狀聚合物的臂。圖2顯示靶向抗體通過與連接至樹枝狀聚合物的臂的捕獲序列雜交的載體寡核苷酸與DNA樹枝狀聚合物的連接。任選地，隨后例如通過交聯(lián)雜交的寡核苷酸將所述雜交的載體寡核苷酸共價(jià)地結(jié)合至DNA樹枝狀聚合物的臂。一種這樣的方法包括將DNA-DNA交聯(lián)劑例如補(bǔ)骨脂素(例如，2，4，8-三甲基補(bǔ)骨脂素)摻入寡核苷酸并且將雜交的寡核苷酸暴露于紫外光?？墒褂糜糜趯⒌鞍踪|(zhì)或肽連接至寡核苷酸的縮合化學(xué)(這在本領(lǐng)域是已知的)，例如使用可從Solulink, Inc. (San Diego, CA)獲得的化學(xué)品將革巴向部分綴合至載體寡核苷酸?？梢岳缡褂糜蒁avid J. Javier等人2008 BioconjugateChem.，19 (6) :1309-1312描述的方法將輻射吸收納米顆粒綴合至載體寡核苷酸。簡(jiǎn)而言之，利用TCEP (三(2-羧こ基)膦鹽酸鹽)還原HPLC純化的寡核苷酸，將所述寡核苷酸添加至膠體金納米顆粒的溶液中。利用濃度遞增的PBS陳化綴合物直至達(dá)到IX濃度的PBS。通過離心除去未反應(yīng)的捕獲寡核苷酸。當(dāng)將靶向部分和/或輻射吸收納米顆粒綴合至載體寡核苷酸時(shí)，有益地在體內(nèi)用于選擇載體和捕獲寡核苷酸序列和長(zhǎng)度以便雙鏈體具有至少40°C、40-70°C、50-70°C或 60_70°C的 Tni 以阻止體內(nèi)離解。在具體實(shí)施方案中，如上文中所描述的，可通過與捕獲寡核苷酸互補(bǔ)的載體寡核苷酸將靶向部分連接至DNA樹枝狀聚合物，將納米顆粒直接綴合至樹枝狀聚合物臂的DNA或通過連接至納米顆粒的互補(bǔ)寡核苷酸的雜交與臂雜交(參見

圖1，頂部)。在本實(shí)施方案中，具有靶向部分的載體寡核苷酸與樹枝狀聚合物臂的末端序列(通過捕獲寡核苷酸的添加延伸的)的雜交在相同臂的內(nèi)部區(qū)段上留下充足的空間以連接輻射吸收納米顆粒。可以例如通過生物素化內(nèi)部區(qū)段的DNA以及將鏈霉抗生物素蛋白涂覆的納米顆粒與生物素結(jié)合來連接納米顆粒。在其它具體實(shí)施方案中，可通過與延伸寡核苷酸雜交延伸DNA樹枝狀聚合物的游 離臂(參見圖I和圖2，底部)?？蓪⒉东@寡核苷酸連接于或另外地連接至延伸寡核苷酸的末端以與載體寡核苷酸/靶向部分雜交，或可將靶向部分直接連接至延伸寡核苷酸。延伸寡核苷酸可用于將靶向部分置于離DNA樹枝狀聚合物的核心比単獨(dú)的捕獲寡核苷酸更遠(yuǎn)的距離，從而當(dāng)多個(gè)熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物與細(xì)胞或組織結(jié)合時(shí)減小位阻。即，雖然捕獲寡核苷酸相對(duì)較短(大約25-40個(gè)核苷酸長(zhǎng))，但延伸寡核苷酸可具有在特定應(yīng)用中減小或克服位阻所必需的任何長(zhǎng)度。例如，延伸寡核苷酸可為60-140個(gè)核苷酸長(zhǎng)，80-130個(gè)核苷酸長(zhǎng)，100-125個(gè)核苷酸長(zhǎng)或124個(gè)核苷酸長(zhǎng)。例如，124個(gè)核苷酸的延伸寡核苷酸可在與樹枝狀聚合物臂雜交后提供85-90個(gè)核苷酸的延伸。同樣地，通過使用延伸寡核苷酸，樹枝狀聚合物的臂與捕獲寡核苷酸之間的延伸寡核苷酸的未雜交區(qū)段可用干與其它標(biāo)記的或納米顆粒連接的寡核苷酸雜交(參見圖I和圖2，底部)。在第一方面，延伸寡核苷酸可具有確定的核苷酸序列。確定的核苷酸序列可以是任何選擇的序列，但優(yōu)選為非生物序列。在可選擇的方面，延伸寡核苷酸可具有同聚物序列(例如poly (dT)、poly (dA)、poly (dG)或poly(dC))或它們可包含重復(fù)序列。如果延伸寡核苷酸包含重復(fù)序列，則所述重復(fù)序列在長(zhǎng)度上通常為2-15個(gè)核苷酸、2-12個(gè)核苷酸、2-10個(gè)核苷酸或2-8個(gè)核苷酸。然而，應(yīng)理解，重復(fù)序列可具有任何長(zhǎng)度，只要其在延伸寡核苷酸中出現(xiàn)至少兩次。用于使用重復(fù)序列制備最佳標(biāo)記的寡核苷酸的有用方法可見于美國(guó)專利 No. 6072043 和 6046038 中。在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物進(jìn)行選擇的細(xì)胞或組織的靶向熱燒蝕的方法。一般地，可基于期望的結(jié)果、被靶向以進(jìn)行熱燒蝕的細(xì)胞或組織的特定性質(zhì)以及選擇的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的產(chǎn)熱和細(xì)胞靶向能力選擇電磁輻射例如射頻輻射的暴露時(shí)間和功率?？蓪⒔Y(jié)合至熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的細(xì)胞或組織暴露于來自外部來源的功能為IW至2000W、IOff至1500W、IOff至200W或約50W的電磁場(chǎng)I分鐘至2小時(shí)，或直至達(dá)到期望的熱燒蝕程度。在此類方法的具體實(shí)施方案中，將細(xì)胞或組織與熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物體外例如在細(xì)胞或組織培養(yǎng)中體外接觸。在此類方法的其它具體實(shí)施方案中，例如通過給人胃腸外施用，將細(xì)胞或組織與熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物體內(nèi)接觸。在體內(nèi)使用的一個(gè)實(shí)例中，可靜脈內(nèi)施用熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物，或通過針或?qū)Ч軐⑵渲苯邮┯萌胍唤M細(xì)胞或組織中。這樣的施用可以是暴露于外部電磁場(chǎng)之前的單次快速靜脈注射或連續(xù)輸注。在施用后，通常期望在暴露于電磁場(chǎng)之前允許熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物與靶細(xì)胞或組織結(jié)合，進(jìn)行充足的時(shí)間。如果靜脈內(nèi)施用熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物，則與被靶向的細(xì)胞或組織結(jié)合所需的時(shí)間將因樹枝狀聚合物的循環(huán)和在靶位置的積累所需的時(shí)間而長(zhǎng)于直接注射。當(dāng)用于選擇細(xì)胞或組織的靶向熱燒蝕時(shí)，可在接觸選擇用于熱燒蝕的細(xì)胞或組織之前構(gòu)建DNA樹枝狀聚合物。即，如果將在體內(nèi)進(jìn)行熱燒蝕，則可在給患者施用之前完全裝配熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物(連接至輻射吸收納米顆粒和靶向部分的樹枝狀聚合物)。如果將在體外或離體進(jìn)行熱燒蝕，則可在接觸用于熱燒蝕的細(xì)胞或組織之前完全裝配熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物?；蛘?，可通過獨(dú)立地施用熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的組分并且使得能夠在被靶向的細(xì)胞或組織上進(jìn)行施用后裝配來體內(nèi)構(gòu)建熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物。例如，可施用DNA樹枝狀聚合物(連接的輻射吸收納米顆?；虬邢虿糠?，然后按順序或同時(shí)施用靶向部分和輻射吸收納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)例中，可施用靶向部分，然后按順序或同時(shí)施用 DNA樹枝狀聚合物和輻射吸收納米顆粒。該順序裝配法還可用于體外和離體使用。在具體的使用方法中，可如對(duì)于腫瘤例如肝癌、胃腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和可被DNA樹枝狀聚合物祀向并且順從于外部電磁場(chǎng)暴露的任何其它局部實(shí)體瘤的燒蝕所描述的，使用本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物。在其它具體使用方法中，可如對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞例如白血病或淋巴瘤細(xì)胞的燒蝕或?qū)τ诎┌Y轉(zhuǎn)移的病灶的熱燒蝕所描述的，使用本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物。此外，本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物可用于微生物例如疏螺旋體屬(Borrelia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(包括抗甲氧西林金黃色葡萄球菌，MRSA)和抗萬(wàn)古霉素細(xì)菌的燒蝕。在離體應(yīng)用中，可在移植之前，使用燒蝕不期望的細(xì)胞例如癌細(xì)胞的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物處理生物材料例如用于移植的器官、細(xì)胞和組織。在具體的實(shí)例中，可將本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物在自體骨髓移植中在將骨髓重新引入患者之前用于從所述癌癥患者的抽取的骨髓燒蝕癌細(xì)胞。在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于描述的治療癌癥和腫瘤的方法中的包含熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的藥物組合物。通常將此類藥物組合物配制用于全身性或局部胃腸外施用，例如用于靜脈內(nèi)施用或用于使用注射器或?qū)Ч苤苯幼⑸淙氪委煹奈恢?。藥物組合物通常還包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，這在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，〃Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 4 版(2003) Raymond C. Crowe 等人編著.Pharmaceutical Press, Chicago。藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑包括穩(wěn)定劑、緩沖齊U、增溶劑等例如淀粉、纖維素衍生物、聚乙二醇、碳酸鈣、磷酸鈣、磷酸鈉、糖等。適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物的配方可見于“雷明頓制藥科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)’lackPublishing Co.，Easton，PA。本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物在水溶液中是可溶的，這使得能夠在生理相容性含水緩沖液例如Hank氏溶液、林格氏溶液、生理鹽水或生理緩沖鹽溶液中制備藥物組合物。在上述實(shí)施方案的任何實(shí)施方案中，連接至熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的靶向部分可以是特異性結(jié)合用于熱燒蝕的目標(biāo)細(xì)胞或組織上的選擇的靶的任何部分。與選擇的靶的特異性結(jié)合不僅包括對(duì)用于熱燒蝕的目標(biāo)細(xì)胞或組織的專一結(jié)合，而且還包括用于熱燒蝕的目標(biāo)細(xì)胞或組織與不被靶向以進(jìn)行熱燒蝕的細(xì)胞或組織之間的差異結(jié)合。例如，與其它展示相同靶的細(xì)胞或組織相比較展示更高密度的靶的細(xì)胞或組織可基于更大量的DNA樹枝狀聚合物的結(jié)合以及從而更大的對(duì)輻射吸收納米顆粒的暴露而被選擇性燒蝕。靶向部分包括蛋白質(zhì)、肽和適體。在具體的實(shí)施方案中，此類靶向部分可以是抗體或抗體片段(包括Fab、F(ab)2、scFv、雙體和微小抗體(minibody))。抗體或抗體片段被導(dǎo)向用于熱燒蝕的目標(biāo)細(xì)胞或組織的表面上的結(jié)合伴侶，優(yōu)選區(qū)分靶細(xì)胞或組織與不被靶向以進(jìn)行熱燒蝕的其它細(xì)胞或組織的特異性結(jié)合伴侶。如果被靶向以進(jìn)行熱燒蝕的細(xì)胞或組織為惡性細(xì)胞或腫瘤，則抗體或抗體片段可結(jié)合腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原，例如甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮腫瘤抗原、酪氨酸酶、黑色素瘤相關(guān)抗原或ras或p53基因產(chǎn)物。靶向部分抗體或抗體片段可以可選地結(jié)合被靶向以進(jìn)行熱燒蝕的細(xì)胞或組織的表面上的受體，例如EGFR或HER2。所述細(xì)胞或組織表面上的肽或蛋白質(zhì)還可被抗體或抗體片段靶向，例如LHRH肽或整聯(lián)蛋白?；蛘撸谄渌唧w的實(shí)施方案中，連接至熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的靶向部分可以是細(xì)胞或組織表面上的受體的配體。此類配體通常是肽或小蛋白質(zhì)例如TNF-α、淋巴毒素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、VEGF、PDGF、EGF、FGF、
TSH 和 ACTH。在前述實(shí)施方案的任何實(shí)施方案中，連接至熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的輻射吸收納米顆粒可以是吸收電磁能量例如射頻能量并且將其以熱釋放的任何組合物，包括金屬納米顆粒和基于碳的納米顆粒。此類福射吸收納米顆?？梢砸约{米球、納米棒、納米球殼(nanoshell)、納米籠(nanocage)、納米管或表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)納米顆粒的形式存在，這在本領(lǐng)域是已知的。在具體的實(shí)例中，納米顆粒包含碳、銀或金。在其它具體實(shí)例中，納米顆粒包含金，其具有早先用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用并從而顯示醫(yī)學(xué)可接受性的有利方面。在上述實(shí)施方案的任何實(shí)施方案中，本發(fā)明的熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物還可包括通過本文中描述的任何方法和結(jié)構(gòu)連接至樹枝狀聚合物臂的示蹤標(biāo)記。示蹤標(biāo)記使得熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的定位能夠被檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，這對(duì)于其中在施用后需要時(shí)間來使樹枝狀聚合物在期望的靶向位置積累的體內(nèi)應(yīng)用是特別有用的。通過包括示蹤標(biāo)記，用戶可監(jiān)測(cè)隨時(shí)間過去樹枝狀聚合物的積累以及確定對(duì)靶位置施加外部電磁場(chǎng)的適當(dāng)時(shí)間。有用的示蹤標(biāo)記包括熒光標(biāo)記例如近紅外熒光染料(用于光學(xué)成像)、放射性標(biāo)記例如18F(用于PET掃描的放射性示蹤劑)和造影劑(contrast agent)例如禮(用于MRI的順磁性材料)。在某些實(shí)施方案中，包含至少ー個(gè)靶部分和至少ー個(gè)金屬輻射吸收納米顆粒的本發(fā)明的DNA樹枝狀聚合物還可體內(nèi)、離體或體外用作成像劑。在本實(shí)施方案中，給患者、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織施用DNA樹枝狀聚合物，使所述DNA樹枝狀聚合物在用于成像的目標(biāo)細(xì)胞或組織上結(jié)合它們的靶。不是將結(jié)合的DNA樹枝狀聚合物暴露于外部電磁場(chǎng)來產(chǎn)生熱，而是利用檢測(cè)與DNA樹枝狀聚合物締合的結(jié)合的輻射吸收納米顆粒的成像技術(shù)來檢測(cè)結(jié)合的DNA樹枝狀聚合物的定位。例如，可將成像DNA樹枝狀聚合物用作用于反射成像(Javier 等人，同上)、光熱干涉對(duì)比(photothermal interference contrast)、暗視野成像、掃描電子顯微鏡術(shù)、突光顯微鏡術(shù)、光聲成像(photoacoustic tomography)、光學(xué)相干斷層成像(optical coherence tomography)、磁共振成像和拉曼光譜學(xué)(綜述于Cai等人，Nanotechnology, Science and Applications 2008:1 17-32)的分子特異性造影剤。當(dāng)用于細(xì)胞或組織成像時(shí)，可在接觸細(xì)胞或組織之前構(gòu)建DNA樹枝狀聚合物。SP，如果將進(jìn)行體內(nèi)成像，則可在給患者施用之前完全裝配DNA樹枝狀聚合物(連接至輻射吸收納米顆粒和靶向部分的樹枝狀聚合物)。如果將進(jìn)行體外或離體成像，則可在接觸細(xì)胞或組織之前完全裝配DNA樹枝狀聚合物?；蛘?，可通過單獨(dú)施用DNA樹枝狀聚合物的組分并且允許在被靶向的細(xì)胞或組織上進(jìn)行施用后裝配來構(gòu)建DNA樹枝狀聚合物。例如，可施用DNA樹枝狀聚合物(無(wú)連接的輻射吸收納米顆?；虬邢虿糠?，然后按順序或同時(shí)施用靶向部分和輻射吸收納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)例中，可施用靶向部分，然后按順序或同時(shí)施用DNA樹枝狀聚合物和輻射吸收納米顆粒。該順序裝配法還可用于體外和離體使用。
實(shí)施例實(shí)施例I :包含捕獲寡核苷酸的DNA樹枝狀聚合物的制備如先前所公開的(參見，例如，專利5，175, 270,5, 484, 904,5, 487, 973,6, 110,687和6，274，723，將所述每一個(gè)專利通過引用整體并入本文)，制備DNA樹枝狀聚合物。簡(jiǎn)而言之，從DNA單體構(gòu)建DNA樹枝狀聚合物，所述每一個(gè)DNA單體由兩條共有位于每一條鏈的中央部分中的具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域的DNA鏈制成。當(dāng)兩條鏈退火形成單體時(shí)，所得的結(jié) 構(gòu)可被描述為具有由4個(gè)單鏈“臂”鄰接的中央雙鏈“腰部”。該腰部-加-臂結(jié)構(gòu)包含基本3DNA'￥單體。在5個(gè)單體類型的每一個(gè)的末端上的單鏈臂被設(shè)計(jì)來以精確且特異性的方式彼此相互作用?；パa(bǔ)單體的臂之間的堿基配對(duì)使得能夠通過單體層的順序添加來定向裝配樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物的每一層的裝配包括交聯(lián)過程，在所述交聯(lián)過程中將DNA的鏈彼此共價(jià)結(jié)合，從而形成對(duì)于變性條件是不能滲透的完全共價(jià)分子，所述變性條件在另外的情況下可引起樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)變形。此外，如下將用作互補(bǔ)捕獲寡核核苷酸的38個(gè)堿基的寡核苷酸通過簡(jiǎn)單的T4DNA連接酶依賴性連接反應(yīng)連接至可獲得的樹枝狀聚合物臂的5’末端可使用“橋連寡核苷酸”通過簡(jiǎn)單的核酸連接反應(yīng)將38個(gè)堿基的DNA捕獲寡核苷酸共價(jià)地連接至樹枝狀聚合物臂的末端，所述橋連寡核苷酸與樹枝狀聚合物臂和捕獲寡核苷酸的鄰近部分重疊，從而將捕獲寡核苷酸橋連至樹枝狀聚合物臂的末端。橋連寡核苷酸與鄰近的樹枝狀聚合物臂和捕獲寡核苷酸序列的每一個(gè)重疊至少5個(gè)堿基以促進(jìn)核酸連接酶(優(yōu)選T4DNA連接酶)的連接活性，每一個(gè)序列的至少7個(gè)堿基的重疊是優(yōu)選的。當(dāng)將樹枝狀聚合物用于非-樹枝狀聚合物核酸或其它分子的特異性靶時(shí)，靶向寡核苷酸還可用作其互補(bǔ)序列的核酸阻斷劑。向微量離心管中添加下列組分
于IX TE緩沖液中的4層DNA樹枝狀聚合物(500ng/pL) 5.4 pL.(2680ng) a(-)LIG-BR7 橋連寡核苷酸(14 聚體)(50 ng^L)2.7 μ .(134 ng)
IOX連接酶緩沖液10.2 μι
不含核酸酶的水%\JpL
CapO3 捕獲寡核苷酸(38 聚體)(50 ng/pL)4.0 gL(200 ng)
T4 DNA 連接酶(I U/pL)10.0 pL(10 個(gè)單位)將前4種反應(yīng)物添加在一起，加熱至65°C，然后冷卻至室溫。隨后加入第5和第6種反應(yīng)物，溫育45分鐘。通過添加2. 8 μ L的O. 5MEDTA溶液終止連接反應(yīng)。通過使用大小排阻離心柱(spin column)除去未連接的寡核苷酸。將與Cap03序列連接的樹枝狀聚合物于IX TE緩沖液中調(diào)整至50ng/y L以在隨后步驟中用于將金納米顆粒和抗體連接至DNA樹枝狀聚合物。實(shí)施例2 :通過生物素標(biāo)記的寡核苷酸將金納米顆粒(AuNP)連接至DNA樹枝狀聚合物和通過載體寡核苷酸將靶向抗體連接至DNA樹枝狀聚合物向微量離心管中添加下列組分
具有連接的Cap03序列的4層DNA樹枝狀聚合物(50 ng/^iL) 50.0 μL 用生物素標(biāo)記的c(+)寡核苷酸3'末端(500 ng^L)2.6 μ
用生物素標(biāo)記的a(+)寡核苷酸5'末端(500 ng/pL)2 6 pL
5M NaCl4.0
于乙醇中飽和的2,4,8三甲基補(bǔ)骨脂素7.0隊(duì)將上述反應(yīng)物添加在一起，充分混合，置于一容器65°C的水中，隨后緩慢地冷卻至42 0C。對(duì)紫外光(320-400nm)暴露10分鐘(2次)，引發(fā)將生物素化的寡核苷酸共價(jià)地結(jié)合至DNA樹枝狀聚合物的臂的交聯(lián)事件。通過使用大小排阻離心柱除去非交聯(lián)連接的寡核苷酸。將少量的熒光c(+)和/或a(+)寡核苷酸添加至ー些制劑中以提供熒光標(biāo)記來幫助示蹤樹枝狀聚合物對(duì)細(xì)胞表面的結(jié)合。首先通過使用標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)縮合綴合化學(xué)，將DNA寡核苷酸共價(jià)綴合至完全抗體或抗體片段(Fab或Fab’(2))，隨后將抗體結(jié)合的寡核苷酸與樹枝狀聚合物的臂上的互補(bǔ)序列雜交來將靶向抗體結(jié)合至DNA樹枝狀聚合物。該雜交包括具有高于65°C的解鏈溫度的31個(gè)堿基對(duì)，從而提供了在生理溫度和條件下穩(wěn)定的與抗體結(jié)合的樹枝狀聚合物的復(fù)合物。與靶向抗體對(duì)樹枝狀聚合物結(jié)合的同吋，以適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量添加鏈霉抗生物素蛋白-AuNP，使其與先前連接于樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)的生物素部分結(jié)合。向微量離心管中添加下列組分
權(quán)利要求
1.ー種DNA樹枝狀聚合物,其連接至至少ー個(gè)福射吸收納米顆粒和至少ー個(gè)IE向部分。
2.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其中所述至少一個(gè)輻射吸收納米顆粒為基于碳的納米顆?；蚪饘偌{米顆粒。
3.權(quán)利要求2所述的DNA樹枝狀聚合物，其中所述至少一個(gè)輻射吸收納米顆粒為金納米顆粒。
4.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其中所述輻射吸收納米顆粒為納米球、納米棒、納米球殼、納米籠、納米管或表面增強(qiáng)拉曼散射納米顆粒。
5.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其包含與所述DNA樹枝狀聚合物的臂締合的捕獲寡核苷酸，并且至少ー個(gè)輻射吸收納米顆粒和至少ー個(gè)靶向部分之任一或兩者通過載體寡核苷酸與捕獲寡核苷酸的雜交而被連接至所述DNA樹枝狀聚合物。
6.權(quán)利要求5所述的DNA樹枝狀聚合物，其中將所述捕獲寡核苷酸連接至延伸寡核苷酸的末端并且將所述延伸寡核苷酸與所述DNA樹枝狀聚合物的臂雜交。
7.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其中將所述輻射吸收納米顆粒通過生物素/鏈霉抗生物素蛋白連接至所述DNA樹枝狀聚合物。
8.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其還包含連接至所述DNA樹枝狀聚合物的臂的示蹤標(biāo)記物。
9.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其中所述靶向部分為蛋白質(zhì)、肽、適體、抗體、抗體片段或受體配體。
10.權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物，其中所述樹枝狀聚合物包含交聯(lián)的單體。
11.一種用于熱燒蝕細(xì)胞或組織的方法，包括 a)將所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物接觸，以便所述靶向部分結(jié)合所述細(xì)胞或組織上的互補(bǔ)靶；和 b)將具有所述結(jié)合的DNA樹枝狀聚合物的所述細(xì)胞或組織暴露于外部施加的電磁福射，以足以引起連接至所述DNA樹枝狀聚合物的納米顆粒發(fā)射熱的功率進(jìn)行足以引起所述效應(yīng)的時(shí)間，從而導(dǎo)致與DNA樹枝狀聚合物結(jié)合的細(xì)胞或組織熱燒蝕。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述細(xì)胞或組織與所述DNA樹枝狀聚合物體內(nèi)或尚體接觸。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織選自實(shí)體瘤、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、癌癥轉(zhuǎn)移灶、微生物和用于移植的生物材料。
14.權(quán)利要求11所述的方法，其中単獨(dú)地施用所述DNA樹枝狀聚合物的組分并且使其在細(xì)胞或組織上進(jìn)行施用后裝配。
15.—種藥物組合物，其包含熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形齊U，其中所述熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物包含至少ー個(gè)輻射吸收納米顆粒和至少ー個(gè)靶向部分。
16.權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其包含生理上相容的含水緩沖液。
17.權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其經(jīng)配制用于胃腸外施用。
18.—種制備熱燒蝕DNA樹枝狀聚合物的方法，其包括將至少一個(gè)靶向部分和至少ー個(gè)輻射吸收納米顆粒連接至所述DNA樹枝狀聚合物的臂。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中通過載體寡核苷酸與捕獲寡核苷酸在所述臂的末端雜交來將至少一個(gè)靶向部分和至少一個(gè)輻射吸收納米顆粒之任一或兩者連接至所述DNA樹枝狀聚合物的臂。
20.權(quán)利要求19所述的方法，還包括與所述DNA樹枝狀聚合物的臂雜交并且在其末端具有所述捕獲寡核苷酸的延伸寡核苷酸。
21.權(quán)利要求19所述的方法,還包括連接于所述DNA樹枝狀聚合物的臂的示蹤標(biāo)記。
22.權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的DNA樹枝狀聚合物，其用作藥物。
23.權(quán)利要求22所述的DNA樹枝狀聚合物，其中胃腸外施用所述藥物。
24.權(quán)利要求23所述的DNA樹枝狀聚合物，其中靜脈內(nèi)施用所述藥物。
25.權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的DNA樹枝狀聚合物用于制備藥物的用途。
26.一種用于對(duì)細(xì)胞或組織成像的方法,包括 a)將所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求I所述的DNA樹枝狀聚合物接觸，以便所述靶向部分結(jié)合所述細(xì)胞或組織上的互補(bǔ)靶，其中所述DNA樹枝狀聚合物包含至少一個(gè)金屬輻射吸收納米顆粒；和 b)使用與所述細(xì)胞或組織結(jié)合的金屬輻射吸收納米顆粒對(duì)所述細(xì)胞或組織成像。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中獨(dú)立地施用所述DNA樹枝狀聚合物的組分，并且使其能夠在所述細(xì)胞或組織上進(jìn)行施用后裝配。
28.權(quán)利要求26所述的方法，其中體內(nèi)接觸所述細(xì)胞或組織。
全文摘要
提供了用于輻射吸收納米顆粒的靶向遞送以及細(xì)胞和組織的熱燒蝕(thermal ablation)的DNA樹枝狀聚合物。還提供了制備DNA樹枝狀聚合物的方法和使用DNA樹枝狀聚合物的方法。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102869383SQ201180008762
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者J·卡杜山, R·C·蓋茨 申請(qǐng)人:詹尼斯費(fèi)爾公司