專利名稱：鈉/鉀三磷酸腺苷酶及膽固醇相關(guān)的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)、化學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及與心血管疾病相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、小的藥物活性分子、研究工具、診斷學(xué)、試劑盒及處理方法。影響膽固醇介導(dǎo)的心血管疾病的強(qiáng)心類固醇拮抗劑及組合物在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)。其他領(lǐng)域，如物理學(xué)及生物化學(xué)也為本發(fā)明提供了框架。
背景技術(shù)：
本發(fā)明部分基于對(duì)鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結(jié)構(gòu)構(gòu)象及功能的闡明，尤其是對(duì)新的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用的闡明。本發(fā)明提供了 Na/K ATPase及與Na/KATPase相互作用的化合物之間的驚人的結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系的應(yīng)用。本發(fā)明提供了解決方案，其在化學(xué)上影響了 Na/K ATPase相互作用以及已知的上游和下游的調(diào)節(jié)子。Na/K-ATPase起初是作為位于質(zhì)膜內(nèi)的活性離子轉(zhuǎn)運(yùn)子發(fā)現(xiàn)的。功能性的Na/K-ATPase主要是由α和β亞基構(gòu)成。α亞基為催化亞基，因?yàn)槠浒潴w及核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。盡管其長(zhǎng)期以離子轉(zhuǎn)運(yùn)子為人所知，近期的研究表明Na/K-ATPase除了其離子泵功能外，還能夠進(jìn)行多種其他功能。例如,發(fā)現(xiàn)Na/K-ATPase與Src激酶相互作用，形成功能性信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，能夠?qū)⒓?xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入而激活細(xì)胞內(nèi)激酶級(jí)聯(lián)。有趣的是，證明了進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的Na/K-ATPase主要位于專門(mén)的質(zhì)膜微結(jié)構(gòu)域(稱為穴樣內(nèi)陷(“小窩”))并與穴樣內(nèi)陷標(biāo)記物——窖蛋白-I蛋白質(zhì)相互作用。窖蛋白-I蛋白質(zhì)是一種 22-kD蛋白質(zhì)，主要位于質(zhì)膜中。除了其在穴樣內(nèi)陷的生物形成中的作用外，已知其在細(xì)胞膽固醇體內(nèi)平衡中起作用。已經(jīng)證明其與膽固醇以1:1的比率相結(jié)合，并參與膽固醇在質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器之間的運(yùn)輸。進(jìn)一步地，細(xì)胞膽固醇的耗盡使得窖蛋白-I重新分配至核周區(qū)域。在另一方面，Na/K-ATPase調(diào)控窖蛋白-I的細(xì)胞膜運(yùn)輸。Na/K-ATPase α I的梯度敲除導(dǎo)致窖蛋白-I在穴樣內(nèi)陷結(jié)構(gòu)域內(nèi)移動(dòng)，并使得窖蛋白-I重新分配至核周區(qū)域。細(xì)胞膽固醇的耗盡使得Na/K-ATPase α I重新分配到穴樣內(nèi)陷之外。發(fā)明概述在其他廣泛的實(shí)施方式中，提供了鑒定能夠調(diào)制細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的測(cè)試組合物的方法，包括a.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中將測(cè)試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的調(diào)制。還提供了鑒定能夠調(diào)制質(zhì)膜膽固醇濃度的測(cè)試組合物的方法，包括a.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中將測(cè)試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的調(diào)制。優(yōu)選的是上述權(quán)利要求的任何項(xiàng)，其中調(diào)制為細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的降低，其中測(cè)試模型為細(xì)胞培養(yǎng)物，其中測(cè)試模型為哺乳動(dòng)物的，其中測(cè)試模型選自肝細(xì)胞；腎細(xì)胞；腦細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞；胰腺細(xì)胞；肺細(xì)胞；皮膚細(xì)胞；心臟細(xì)胞；嚙齒動(dòng)物細(xì)胞；人細(xì)胞；小鼠；大鼠；豚鼠；猴；以及人，其中測(cè)試模型選自以下的測(cè)試模型=NPCl??；病理性脂質(zhì)積累；脈管疾?。恍呐K??；中風(fēng)；超重；肥胖；糖尿病；代謝綜合征；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關(guān)節(jié)硬化；心力衰竭；心臟疾??；阿爾茨海默??；帕金森??；亨廷頓?。惶┧_二氏??；以及神經(jīng)退行性疾病。
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還提供了鑒定能夠調(diào)制膽固醇濃度的測(cè)試組合物的方法，包括a.將測(cè)試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生對(duì)Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。優(yōu)選的那些方法中，步驟a.是以選自體外和體內(nèi)的形式完成的。還提供了影響細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，包括影響Na/K ATPase的膽固醇結(jié)合活性。優(yōu)選的是那些方法，其中Na/K ATPase的膽固醇結(jié)合活性以以下方式受到影響降低；增加；消除；階段性破壞；以及階段性增強(qiáng)。還提供了在需要這種改善的器官中改善由于病理性細(xì)胞內(nèi)膽固醇累積導(dǎo)致的神經(jīng)退行的方法,包括降低Na/K ATPase的膽固醇結(jié)合活性。還提供了治療Cl型Neumann Pick病的方法,包括專門(mén)降低Na/K ATPase結(jié)合膽固醇的能力，其中降低是以選自以下的方式完成的拮抗Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域；以及抑制Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域。還提供了鑒定能夠治療膽固醇相關(guān)疾病狀態(tài)的組合物的方法，包括a.將測(cè)試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生對(duì)膽固醇結(jié)合Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域的能力的拮抗。優(yōu)選的是所描述的那些方法，其中疾病狀態(tài)選自NPCl ;病理性脂質(zhì)積累；脈管疾病；心臟病；中風(fēng)；超重；肥胖；糖尿?。淮x綜合征；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關(guān)節(jié)硬化 ’心力衰竭;心臟疾病；阿爾茨海默??；帕金森??；亨廷頓??；泰薩二氏??；以及神經(jīng)退行性疾病。還提供了在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中下調(diào)Na/K ATPase的方法，包括在測(cè)試模型中耗盡質(zhì)膜膽固醇濃度。還提供了在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中將Na/K ATPase的α I亞基重新分配到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的方法，包括在測(cè)試模型中耗盡質(zhì)膜膽固醇濃度。還提供了在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中影響窖蛋白-I的運(yùn)輸和表達(dá)的方法，包括下調(diào)質(zhì)膜的Na/K ATPase的α I亞基。還提供了治療NPCl病的方法，包括改變Na/K ATPase的α I亞基的表達(dá)，以改善NPCl病的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員在參考附隨的圖示并閱讀以下優(yōu)選實(shí)施方式的詳述本發(fā)明的多個(gè)方面后將清楚本發(fā)明的多個(gè)方面。附圖簡(jiǎn)述本專利或申請(qǐng)文件可以包含一個(gè)或多個(gè)彩色圖片及/或一張或多張照片。帶有彩色圖片及/或照片的本專利或?qū)＠暾?qǐng)出版物的副本將由美國(guó)專利商標(biāo)局在收到請(qǐng)求及必要的支付費(fèi)用時(shí)進(jìn)行提供。
圖I. Μβ -⑶引起的膜膽固醇的急性耗盡下調(diào)了 Na/K-ATPase α I。在無(wú)血清培養(yǎng)基中用IOmM M β-⑶處理LLC-PKl細(xì)胞，在37°C進(jìn)行l(wèi)h，洗滌，并在洗滌后的細(xì)胞于無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、6和24h后收集細(xì)胞。

圖1A.測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞裂解物中膽固醇含量，根據(jù)蛋白質(zhì)水平進(jìn)行調(diào)整并比較。圖1B.代表性的Western印跡顯示了 Na/K-ATPase α I、胰島素受體β亞基及α-微管蛋白(用作上樣對(duì)照)的水平。結(jié)合四次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得出定量數(shù)據(jù)，表示為平均值土SE. *，Ρ〈0. 05。圖1C.顯示了未處理細(xì)胞及Μβ-⑶處理的細(xì)胞中Na/K-ATPase α I的細(xì)胞內(nèi)分布的代表性共聚焦圖像。圖2.慢性膽固醇耗盡下調(diào)了 Na/K-ATPase α I。將LLC-PK1細(xì)胞在含有10%FBS(對(duì)照)或10%無(wú)血清或10%無(wú)脂蛋白FBS的DMEM中培養(yǎng)48h，裂解并測(cè)量α I亞基以及α -微管蛋白，如圖2Α的圖所示，膽固醇情況在圖2Β中顯示。結(jié)合四次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得出定量數(shù)據(jù)，表示為平均值土 SE. *，Ρ〈0. 05。圖3.化合物U18666A耗盡質(zhì)膜膽固醇并特異性下調(diào)Na/K-ATPase α I。圖3Α.將LLC-PKl細(xì)胞以不同劑量的U18666A處理24h，然后進(jìn)行菲律賓菌素處理(上圖)及α I免疫染色(下圖)。代表性的圖片顯示了 U18666A化合物對(duì)膽固醇及Na/K-ATPase α I的細(xì)胞分配的劑量依賴性影響。圖3Β.三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性Western印跡顯示了細(xì)胞處理48h后，U18666A對(duì)Na/K-ATPase α I、窖蛋白-I以及α -微管蛋白的影響(上圖)。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性Western印跡分別顯示了細(xì)胞受U18666A處理24h和48h后，U18666A對(duì)Na/K-ATPase α I、胰島素受體β亞基及α -微管蛋白的蛋白質(zhì)水平的影響(下圖)。標(biāo)尺20 μ m。U，U18666A。圖3C.細(xì)胞表面的Na/K-ATPase通過(guò)3H-烏本苷結(jié)合進(jìn)行定量。圖4.膜膽固醇耗盡導(dǎo)致對(duì)Na/K-ATPase α I的細(xì)胞內(nèi)吞。圖4Α.將LLC-PK1細(xì)胞以10 μ g/ml的U18666A處理24h。如本文所描述的方法提取總RNA并進(jìn)行定量RT-PCR以探測(cè)α I和GAPDH的mRNA。數(shù)據(jù)來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖4B.在暴露于不同劑量的U18666A以24小時(shí)之前，將LLC-PKI細(xì)胞以IO μ g/ml放線菌酮處理Ih。然后固定細(xì)胞并就Na/K-ATPasea I進(jìn)行免疫染色。顯示了代表性的共聚焦圖像。CHX，放線菌酮。U，U18666A。圖4C.在暴露于5 μ g/ml U18666A以另外的24h之前，將LLC-PKl細(xì)胞以YFP-a I轉(zhuǎn)染24h。將細(xì)胞固定并以菲律賓菌素對(duì)膽固醇進(jìn)行染色，顯示了 YFP-a I、膽固醇的代表性共聚焦圖像和合并圖片。箭頭指向YFP-Ci I和膽固醇的共定位。相同的實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次。標(biāo)尺20 μ m。圖4D.在暴露于5 μ g/ml U18666A以24h之前，將LLC-PKl細(xì)胞以RFP_rab7轉(zhuǎn)染24h。之后，固定細(xì)胞并以Na/K-ATPase α I進(jìn)行免疫染色。顯示了 α I染色、RFP_rab7的代表性共聚焦圖像以及合并圖片。箭頭指向RFP_rab7和α I的共定位。相同的實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次。標(biāo)尺20μηι。圖5. NBD-膽固醇直接與純化的Na/K-ATPase相互作用。從豬腎髓質(zhì)中制備純化的Na/K-ATPase膜樣品(PKE )。圖5A. PKE樣品的SDS-PAGE凝膠顯示有兩條帶，Na/K-ATPasea I和β 1，如箭頭所顯示的。圖5Β.在4 °C下將PKE用IOmM Μβ-CD或IOmMM β -⑶/ImM膽固醇處理Ih。測(cè)量不同處理的PKE中的膽固醇含量。圖5C.膽固醇及NBD-膽固醇的結(jié)構(gòu)示意圖。將Μβ-⑶處理的ΡΚΕ(200ηΜ)與不同劑量的NBD-膽固醇一同孵育。以473nm或295nm的激發(fā)在530nm處檢測(cè)NBD信號(hào)(圖OT)或FRET信號(hào)(圖5E)。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中代表性的劑量依賴飽和曲線。NBD-CH，NBD-膽固醇。將62. 5nM的NBD-膽固醇與不同劑量的經(jīng)Μβ -⑶處理的PKE —同孵育。以473nm或295nm的激發(fā)在530nm處檢測(cè)NBD信號(hào)(圖5F)或FRET信號(hào)(圖5G)。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中典型的劑量依賴飽和曲線。圖5H.用GST下拉測(cè)定來(lái)純化GST和帶GST標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳并用考馬斯亮藍(lán)染色。顯示了代表性的考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠。圖51.將62. 5nM NBD-膽固醇與不同劑量的純化的蛋白質(zhì)一同孵育。以295nm的激發(fā)在530nm處檢測(cè)FRET信號(hào)。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中典型的劑量依賴飽和曲線。圖5J.將IOOnM純化的蛋白質(zhì)與不同劑量的NBD-膽固醇一同孵育。以295nm的激發(fā)在530nm處檢測(cè)FRET信號(hào)。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中典型的劑量依賴飽和曲線。圖5K.將IOOnM PKE與30nM NBD-膽固醇相混合，然后加入不同劑量的膽固醇以競(jìng)爭(zhēng)NBD-膽固醇對(duì)PKE的結(jié)合。顯示了 FRET信號(hào)，其為膽固醇劑量增加的結(jié)果。圖6.膽固醇調(diào)控的α I膜運(yùn)輸和表達(dá)需要膽固醇/α I相互作用。將野生型大鼠α I-修復(fù)的細(xì)胞(圖6Α)或膽固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變體大鼠α I-修復(fù)的細(xì)胞(圖6Β)以不同 劑量的U18666A化合物處理24h，并進(jìn)行菲律賓菌素(上圖)和Na/K-ATPase α I (下圖)染色。標(biāo)尺20μηι。圖6C.四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性Western印跡顯示了 10 μ g/ml U18666A及不同劑量的TAT-CRAC對(duì)細(xì)胞處理24h后，LLC-PKl細(xì)胞中大鼠Na/K-ATPase α I以及α_微管蛋白的水平。定量數(shù)據(jù)顯示于下文，表示為平均值土S.E. 相比于未處理對(duì)照，p〈0. Ol0圖7.對(duì)BALB/cnpcnih/npcnih小鼠的靶標(biāo)器官中Na/K-ATPase α I的下調(diào)。圖7Α.代表性Western印跡顯示了 NPCl敲除對(duì)腦Na/K-ATPase α I、α 2、α 3及胰島素受體β亞基的影響。在胰島素受體雜交中較低的條帶旁的星號(hào)表示非特異性條帶。圖7Β.顯示了 NPC1+/+和NPC1+/+小鼠的肝臟樣品中Na/K-ATPase α I和胰島素受體β的代表性Western印跡結(jié)果。來(lái)自5NPC1+/+和5NPC1+/+小鼠的所有Western印跡結(jié)果都進(jìn)行定量，顯示于右圖并表示為平均值土SE. **，ρ〈0·01。發(fā)明詳述本發(fā)明人研究了細(xì)胞膽固醇耗盡是否導(dǎo)致細(xì)胞表面Na/K-ATPase α I的下調(diào)，隨后導(dǎo)致窖蛋白-I進(jìn)行重新分配。在本發(fā)明中，發(fā)明者證明了質(zhì)膜膽固醇的耗盡導(dǎo)致對(duì)Na/K-ATPasea I的細(xì)胞內(nèi)吞及下調(diào)。如Cl型Niemann-Pick(NPCl)病中所顯示出的對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸?shù)钠茐呐c細(xì)胞表面Na/K-ATPase α I的耗盡相關(guān)。另外，Na/K-ATPase α I能夠通過(guò)其N末端膽固醇相互作用基序與膽固醇直接相互作用。α I-膽固醇相互作用影響膽固醇耗盡誘導(dǎo)的α 下調(diào)。最后，證明了 NPCl小鼠模型的肝臟和腦中的Na/K-ATPaseal有下調(diào)。由于已知Na/K-ATPase參與細(xì)胞生長(zhǎng)及存活，因此本發(fā)明提供了新的解釋，將膽固醇運(yùn)輸缺陷與NPCl病中大量的神經(jīng)退行相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明提供了質(zhì)膜膽固醇調(diào)控細(xì)胞表面的Na/K-ATPase α I亞基含量這一發(fā)現(xiàn)的實(shí)際應(yīng)用。質(zhì)膜中膽固醇耗盡導(dǎo)致細(xì)胞表面α I的細(xì)胞內(nèi)吞及降低。α I表達(dá)的降低不僅在體外培養(yǎng)的LLC-PKl細(xì)胞中觀察到，也在來(lái)自NPCl突變體小鼠的腦和肝細(xì)胞中得到體內(nèi)的驗(yàn)證。有趣的是，已知Na/K-ATPase對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要。因此，這些發(fā)現(xiàn)為脂質(zhì)儲(chǔ)存障礙如NPCl病中的神經(jīng)退行效應(yīng)的分子機(jī)制提供了新的解釋。細(xì)胞表面Na/K-ATPase受到質(zhì)膜膽固醇的調(diào)控。膽固醇富集于專門(mén)的質(zhì)膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域——穴樣內(nèi)陷中。維持穴樣內(nèi)陷需要有膽固醇的存在，因?yàn)槟懝檀己谋M導(dǎo)致穴樣內(nèi)陷結(jié)構(gòu)的破壞。此外，細(xì)胞表面膽固醇的降低動(dòng)員穴樣內(nèi)陷標(biāo)記物窖蛋白-1，并將其從穴樣內(nèi)陷重新分配至細(xì)胞質(zhì)。上述膽固醇耗盡效應(yīng)與Na/K-ATPase α I對(duì)穴樣內(nèi)陷窖蛋白-I蛋白質(zhì)的敲除效應(yīng)有驚人的類似之處。因此，有人提出膽固醇耗盡可以下調(diào)細(xì)胞表面Na/K-ATPasea 1，后者有助于窖蛋白-I的重新分配。該命題得到本發(fā)明的數(shù)據(jù)的支持。例如，不管是細(xì)胞膽固醇的急性或慢性耗盡都導(dǎo)致Na/K-ATPase的下調(diào)(圖I和2)。此外，細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸抑制劑U18666A (其破壞晚期內(nèi)體/溶酶體和質(zhì)膜之間的運(yùn)輸)也下調(diào)細(xì)胞表面Na/K-ATPase α I (圖3)。由于U18666A處理的細(xì)胞中總細(xì)胞膽固醇未顯示顯著差異，因此這些結(jié)果清楚地表示是質(zhì)膜膽固醇含量調(diào)控了細(xì)胞表面Na/K-ATPase。這種膽固醇耗盡效應(yīng)似乎是特異性針對(duì)Na/K-ATPase α I的，因?yàn)橐葝u素受體表達(dá)水平并未改變(圖3Β)。在這一點(diǎn)上，檢查膽固醇耗盡如何下調(diào)細(xì)胞表面α I很有意義。免疫染色表明了在膽固醇耗盡時(shí)α I從細(xì)胞表面向細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的重新分配(圖IC和3Α)。這些觀察提示有兩種可能的情況或者是新合成的α I無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，或者是表面α I在表面膽固醇耗盡后受到細(xì)胞內(nèi)吞。隨后的研究指向第二種情況。首先，α I的轉(zhuǎn)錄在U18666A處理的 細(xì)胞中看上去很正常，因?yàn)閙RNA水平未變化。第二，對(duì)蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)行普遍的阻斷未阻止α I的重新分配。最后，α I在U18666A處理后與膽固醇以及晚期內(nèi)體標(biāo)記物Rab7共定位(圖4)?？偠灾@些數(shù)據(jù)有力地提示了質(zhì)膜蛋白質(zhì)庫(kù)調(diào)控細(xì)胞表面的α 含量。質(zhì)膜膽固醇庫(kù)的降低導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞表面αI的細(xì)胞內(nèi)吞和下調(diào)。Na/K-ATPase α I直接與膽固醇相互作用，且膽固醇調(diào)控的α I細(xì)胞內(nèi)吞依賴于α I-膽固醇相互作用。我們的之前的研究表明Na/K-ATPase α I和膽固醇之間的膜分布有相互調(diào)控；這兩種廣泛表達(dá)的分子可以直接相互作用。其他的研究顯示膜膽固醇含量影響了 Na/K-ATPase的活性，甚至有一項(xiàng)研究提出了 Na/K-ATPase和膽固醇之間有直接結(jié)合。然而，在本研究之前，缺少所述問(wèn)題的直接證據(jù)。在本發(fā)明中，發(fā)明者相反地使用了 FRET分析以闡明該問(wèn)題，并證明純化的豬腎Na/K-ATPase直接與膽固醇類似物——NBD-膽固醇相互作用(圖5)。本發(fā)明人進(jìn)一步將膽固醇結(jié)合位點(diǎn)定位于α I亞基內(nèi)的NT，并顯示了 CRAC基序?qū)τ诮Y(jié)合是至關(guān)重要的(圖5)。有趣的是，似乎CRAC基序?qū)τ谀懝檀颊{(diào)控的α I的細(xì)胞內(nèi)吞很重要，因?yàn)槎c(diǎn)誘變?cè)斐纱嘶虻钠茐氖沟忙?I對(duì)質(zhì)膜膽固醇耗盡不敏感。進(jìn)一步地，向細(xì)胞中加入膜通透性的CRAC肽保護(hù)α I使之不受U18666A的下調(diào)，這與上述觀點(diǎn)一致(圖6)。因?yàn)镃RAC突變體α I正常定位在質(zhì)膜內(nèi)(圖6Β)，所以α I-膽固醇相互作用不大可能穩(wěn)定細(xì)胞表面的Na/K-ATPase0相反，膽固醇可能加速Na/K-ATPase進(jìn)入脂後的分選,這介導(dǎo)了 Na/K-ATPase的細(xì)胞內(nèi)吞。有人提出脂筏(鞘脂類和膽固醇的集合體)對(duì)于蛋白質(zhì)運(yùn)輸中的蛋白質(zhì)分選很重要。此外，顯示一種類型的脂筏——穴樣內(nèi)陷能濃縮Na/K-ATPase并介導(dǎo)其內(nèi)吞作用?？紤]到本發(fā)明中的結(jié)果，令人信服的是α I-膽固醇相互作用是在應(yīng)答多種信號(hào)時(shí)對(duì)Na/K-ATPase進(jìn)行恰當(dāng)?shù)姆诌x進(jìn)入脂筏如穴樣內(nèi)陷并產(chǎn)生隨后的細(xì)胞內(nèi)吞作用的關(guān)鍵。Na/K-ATPase α I為潛在的質(zhì)膜膽固醇感受子。作為所有哺乳動(dòng)物中至關(guān)重要的分子，膽固醇水平受到細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)節(jié)。研究最多的細(xì)胞膽固醇調(diào)控機(jī)制包括處于ER膜內(nèi)的HMG-CoA還原酶和SCAP-SREBP2復(fù)合物，它們的蛋白質(zhì)豐度和活性依賴于ER膽固醇庫(kù)。然而，大多數(shù)細(xì)胞膽固醇在質(zhì)膜中定位并起作用，ER膽固醇庫(kù)受到質(zhì)膜膽固醇含量的控制。因此，有人提出存在質(zhì)膜膽固醇感受子，其調(diào)控質(zhì)膜和內(nèi)膜之間的膽固醇運(yùn)輸。本發(fā)明人研究了 Na/K-ATPase α I是否為質(zhì)膜膽固醇感受子。首先，像膽固醇一樣，α I在所有哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)并主要定位于質(zhì)膜內(nèi)。第二，α I通過(guò)調(diào)控窖蛋白-I (一種參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸?shù)摩恋鞍踪|(zhì))的膜運(yùn)輸而控制質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室之間的膽固醇運(yùn)輸。第三，膽固醇可與α I相互作用，且質(zhì)膜膽固醇的耗盡下調(diào)其細(xì)胞表面的水平。最后，在體內(nèi)α I的減少導(dǎo)致質(zhì)膜膽固醇的降低，這隨后減少了 ER膽固醇庫(kù)，并激活SREBP2通路。因此，建立了 α 調(diào)控細(xì)胞膽固醇含量典型的負(fù)反饋循環(huán)。NPCl病中的Na/K-ATPase。NPCl病特征為細(xì)胞內(nèi)膽固醇在晚期內(nèi)體/溶酶體中的積累，這被認(rèn)為是由內(nèi)膜和質(zhì)膜間膽固醇運(yùn)輸缺陷所導(dǎo)致。但是該疾病的主要問(wèn)題在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。然而，還不很了解這兩個(gè)事件如何相聯(lián)系。在另一方面，Na/K-ATPase是神經(jīng)系統(tǒng)中一種至關(guān)重要的分子，因?yàn)槠涫蔷S持靜止膜電位的主要驅(qū)動(dòng)力之一。近期的研究已經(jīng)表明其還調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，并在細(xì)胞存活/細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用。Na/K-ATPase α亞基中的突變與神經(jīng)退行相聯(lián)系。因?yàn)橛肬18666A處理細(xì)胞能模擬NPCl病的表型，U18666A對(duì)Na/K-ATPase α I的下調(diào)使得我們研究NPCl動(dòng)物模型中的α I 表達(dá)水平。有趣的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 α I水平在NPCl突變體小鼠的腦和肝臟中都有下降(圖7)。該現(xiàn)象似乎特異性針對(duì)α I分子，因?yàn)榱硪环N質(zhì)膜信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)(胰島素受體)的表達(dá)水平不受U18666A或NPCl突變的影響(圖3和7)。進(jìn)一步地，NPCl腦中的其他兩種α異構(gòu)體(α2和α 3)未顯示出顯著差異(圖7Α)。因此，NPCl腦中α I的特異性下調(diào)為細(xì)胞內(nèi)膽固醇積累和神經(jīng)退行之間的聯(lián)系提供了新的可能的解釋。這提高了我們對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝的認(rèn)識(shí)，也促進(jìn)了關(guān)于Na/K-ATPase α I作為治療神經(jīng)退行疾病新型靶標(biāo)的新的藥物開(kāi)發(fā)。質(zhì)膜膽固醇耗盡導(dǎo)致LLC-PKl細(xì)胞中Na/K-ATPase α I的下調(diào)。先前的研究已經(jīng)表明細(xì)胞膽固醇或Na/K-ATPase的耗盡將窖蛋白_1重新分配至核周區(qū)域，且膽固醇的耗盡將Na/K-ATPase α I重新分配出穴樣內(nèi)陷結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明人研究了細(xì)胞膽固醇水平的變化是否影響Na/K-ATPase的表達(dá)和重新分配，而調(diào)控合適的窖蛋白_1分配。首先，將細(xì)胞用膽固醇耗盡藥物環(huán)糊精(Μβ-⑶)進(jìn)行處理。因?yàn)槠鋵?duì)膽固醇有高的親和力，Μβ-⑶能夠特異性將膽固醇從質(zhì)膜中抽取出來(lái)，這極大地降低了細(xì)胞表面膽固醇庫(kù)并重新分配窖蛋白-I。此外，本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室先前的工作證明用IOmM M β-⑶在37 °C下處理LLC-PKl細(xì)胞30-60分鐘顯著地降低了質(zhì)膜膽固醇庫(kù)。因此，本發(fā)明人在這些研究中使用了相同的條件。在M β -⑶處理耗盡細(xì)胞膽固醇后，本發(fā)明人洗去藥物并通過(guò)將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞膽固醇。然后，本發(fā)明人在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解物并檢查蛋白質(zhì)和膽固醇水平。如圖IA中所示，Μβ -CD造成的細(xì)胞膽固醇耗盡導(dǎo)致α I水平有 40%的降低。有趣的是，Μβ-CD處理還導(dǎo)致細(xì)胞膽固醇水平的類似的降低(圖1Β)。細(xì)胞恢復(fù)后6小時(shí)，α I和膽固醇還保持在類似的低水平，這表示細(xì)胞需要更長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)。然而，細(xì)胞恢復(fù)24小時(shí)后，α I和膽固醇水平回到對(duì)照水平(圖IA和1Β)。應(yīng)當(dāng)注意的是α I和膽固醇水平的變化都顯示了在膽固醇耗盡和補(bǔ)充過(guò)程中類似的形式，這表明細(xì)胞α I水平與膽固醇水平正相關(guān)。此外，膽固醇耗盡對(duì)α I表達(dá)的影響不是對(duì)所有膜蛋白質(zhì)的普遍影響，因?yàn)榱硪环N質(zhì)膜蛋白質(zhì)胰島素受體在膽固醇耗盡和補(bǔ)充過(guò)程中沒(méi)有變化(圖IA和1Β)。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，本發(fā)明人在Μβ-⑶的膽固醇耗盡后進(jìn)行了 α 免疫染色。與Western印跡數(shù)據(jù)相一致，本發(fā)明人在來(lái)自Μβ-CD處理的細(xì)胞的質(zhì)膜中檢測(cè)到了較低的α 信號(hào)。此外，本發(fā)明人在Μβ-CD處理的細(xì)胞中觀察到很多細(xì)胞內(nèi)α I信號(hào)，這表示膽固醇耗盡導(dǎo)致α 重新分配到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(圖1C)。上述數(shù)據(jù)表明急性膽固醇耗盡下調(diào)質(zhì)膜的α I水平。為測(cè)試慢性膽固醇耗盡是否具有類似的效應(yīng)，本發(fā)明人接著將細(xì)胞于作為對(duì)照培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)基(加血清的DMEM)及無(wú)血清培養(yǎng)基(只有DMEM)或無(wú)脂蛋白培養(yǎng)基(加了物質(zhì)蛋白血清的DMEM)中培養(yǎng)48小時(shí)。正如所預(yù)期的，在兩種膽固醇耗盡的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞膽固醇水平的減少(圖2Α)。因此，α I水平在兩種膽固醇耗盡的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中有降低(圖2Β)。進(jìn)一步地，α I和膽固醇水平在無(wú)脂蛋白培養(yǎng)基中顯示了類似的減少百分比再一次提示了 αI水平與細(xì)胞膽固醇水平正相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞表面膽固醇庫(kù)調(diào)控了質(zhì)膜α 1，本發(fā)明人用細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸抑制劑U18666A處理細(xì)胞。所述U化合物為一種破壞內(nèi)膜和細(xì)胞表面之間細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸?shù)膬捎H分子，這導(dǎo)致膽固醇在晚期內(nèi)體/溶酶體內(nèi)的積累(模擬了 NPCl突變體細(xì)胞的表型)。用U18666A處理LLC-PKl導(dǎo)致游離膽固醇從質(zhì)膜向細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的重新分配。α I信 號(hào)在質(zhì)膜中減少但在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中增加，這與膽固醇分布形式相關(guān)(圖3Α)。進(jìn)一步地，U18666A對(duì)α I表達(dá)的下調(diào)是劑量和時(shí)間依賴性的(圖3Β)。與膽固醇耗盡類似，U化合物對(duì)α I表達(dá)的作用似乎不是對(duì)所有質(zhì)膜蛋白質(zhì)的普遍作用，因?yàn)橐葝u素受體含量在U18666A處理后保持不受干擾(圖3Β)。最后，為確證U18666A下調(diào)了細(xì)胞表面α I,本發(fā)明人進(jìn)行了 3Η-烏本苷結(jié)合測(cè)定。結(jié)果驗(yàn)證了質(zhì)膜膽固醇的減少導(dǎo)致細(xì)胞表面α I的下調(diào)(圖3C)。最后，與表面α I調(diào)控窖蛋白-I的運(yùn)輸和表達(dá)這一觀點(diǎn)一致，U18666A也下調(diào)了窖蛋白-I的蛋白質(zhì)水平(圖3Β)?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)證明αI蛋白質(zhì)水平受到質(zhì)膜膽固醇水平的調(diào)控。質(zhì)膜膽固醇耗盡導(dǎo)致Na/K-ATPase α I的細(xì)胞內(nèi)吞。為探索質(zhì)膜膽固醇耗盡對(duì)α I分布及表達(dá)的作用的分子機(jī)制，本發(fā)明人進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)。首先，對(duì)于α I下調(diào)的一個(gè)可能的解釋是質(zhì)膜膽固醇耗盡降低了 α I的合成。為測(cè)試這種可能性，本發(fā)明人從對(duì)照及U18666A處理的細(xì)胞中提取總mRNA并進(jìn)行定量PCR分析。如圖4A所示，a ImRNA水平相對(duì)于對(duì)照未顯示出差異，這表示質(zhì)膜膽固醇耗盡可能不影響α I的從頭合成。另一個(gè)可能性是其破壞了新合成的α I從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向質(zhì)膜的運(yùn)輸。因此，其局限在特定的細(xì)胞區(qū)室內(nèi)，因?yàn)楸景l(fā)明人在Μβ-CD和U18666A處理的細(xì)胞中觀察到更多的細(xì)胞內(nèi)α I信號(hào)(圖IC和3Α)。為測(cè)試這種可能性，本發(fā)明人在向細(xì)胞加入U(xiǎn)18666A之前用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)糊精處理細(xì)胞。如圖4Β所示，環(huán)糊精阻斷蛋白質(zhì)從頭合成沒(méi)有阻止U18666A誘導(dǎo)的α I向細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的重新分配。此結(jié)果表明U18666A可能誘導(dǎo)了細(xì)胞表面α I的內(nèi)化作用。因?yàn)閁18666A的處理也導(dǎo)致了膽固醇在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的積累(圖3Α)，本發(fā)明人下一步檢查了 α I和膽固醇是否局限在相同的細(xì)胞區(qū)室。對(duì)游離膽固醇的染色操作流程需要與αI的那些不同的固定試劑，而且不可能在相同視野中觀察膽固醇和內(nèi)源αI二者。為了解決這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明人用YFP-α I轉(zhuǎn)染LLC-PKl細(xì)胞，隨后進(jìn)行U18666A處理和膽固醇染色。這些結(jié)果證明在U18666A處理后大多數(shù)內(nèi)化的α I與游離膽固醇共定位(圖4C，箭頭指向共定位區(qū)域)。根據(jù)文獻(xiàn)，U18666A處理導(dǎo)致游離膽固醇在晚期內(nèi)體/溶酶體中的積累。因此，本發(fā)明人研究了 αI是否受到細(xì)胞內(nèi)吞并與膽固醇一同在晚期內(nèi)體/溶酶體中積累。本發(fā)明人在加入U(xiǎn)18666A之前用RFP標(biāo)簽的Rab7 (晚期內(nèi)體/溶酶體的標(biāo)記物)對(duì)LLC-PKl細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。如圖4D中所示，在未處理的對(duì)照細(xì)胞中大多數(shù)位于質(zhì)膜內(nèi)，沒(méi)有檢測(cè)到α I和Rab7之間的共定位。然而，U18666A處理導(dǎo)致了大量的細(xì)胞內(nèi)α I積累，其中大多數(shù)明顯的與Rab7信號(hào)共定位(箭頭指向共定位區(qū)域)。這確認(rèn)了在U18666A處理時(shí)α I積累于晚期內(nèi)體/溶酶體之內(nèi)?？偠灾?，在LLC-PKl細(xì)胞中通過(guò)阻斷其細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸而造成的質(zhì)膜膽固醇耗盡不僅誘導(dǎo)了 αI的細(xì)胞內(nèi)吞，還導(dǎo)致αI在晚期內(nèi)體/溶酶體內(nèi)的積累。Na/K-ATPase α I能夠在體外通過(guò)N末端膽固醇結(jié)合基序與膽固醇直接相互作用。如本發(fā)明人先前證明的，質(zhì)膜中的Na/K-ATPase α I調(diào)控細(xì)胞膽固醇分布。在另一方面，本研究的數(shù)據(jù)顯示質(zhì)膜膽固醇也調(diào)控Na/K-ATPase α I的膜分布。因此，本發(fā)明人研究了這兩種廣泛表達(dá)的分子是否與彼此有直接的相互作用。為測(cè)試這項(xiàng)命題，本發(fā)明人首先使用一種已經(jīng)建立很好的方法從豬腎外髓質(zhì)獲得細(xì)胞膜片段內(nèi)的純化的Na/K-ATPase。
為確保此方法能有效地運(yùn)行，將純化的豬腎酶(PKE )樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并用考馬斯亮藍(lán)溶液對(duì)膠進(jìn)行染色。如圖5A所示，在膠中檢測(cè)到兩條帶，具有Na/K-ATPase α I和β I的對(duì)應(yīng)大小。進(jìn)一步的Western印跡分析確認(rèn)了上方條帶代表α I亞基而下方條帶代表β I亞基(數(shù)據(jù)未顯示)。由于純化的細(xì)胞膜片段含有大量膽固醇，其可能已經(jīng)飽和了 Na/K-ATPase上的結(jié)合位點(diǎn)，所以大多數(shù)膽固醇成分由Μβ -CD抽取出來(lái)(圖5Β)。為研究Na/K-ATPase和膽固醇之間的結(jié)合，使用一種膽固醇類似物，25-[N-[ (7-氮-2-1，3-苯并惡二唑-4-基)甲基]氨基]-27-降膽甾醇(NBD膽固醇)進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。NBD-膽固醇在之前就用于研究蛋白質(zhì)-膽固醇相互作用。和膽固醇不同，NBD-膽固醇當(dāng)在473nm處激發(fā)時(shí)能夠發(fā)射峰在 530nm處的熒光信號(hào)，因?yàn)樵贑25位置處的甲基基團(tuán)被NBD基團(tuán)取代(圖5C)。在水溶液中，其熒光大部分淬滅了。然而當(dāng)其結(jié)合于蛋白質(zhì)并暴露于疏水環(huán)境時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)增加。此外，其具有比膽固醇(30nM)更高的臨界微團(tuán)濃度( 650nM)，這樣，在結(jié)合測(cè)定中可使用較高濃度的NBD-膽固醇。將200nM的PKE與不同劑量的NBD-膽固醇一同孵育并測(cè)量NBD熒光信號(hào)，觀察到NBD-膽固醇的劑量依賴性飽和曲線(圖OT)。Kd值為100nM-200nM。膽固醇競(jìng)爭(zhēng)了NBD-膽固醇和純化的PKE之間的結(jié)合(圖5K)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果代表了脂類-蛋白質(zhì)相互作用而不是脂類-脂類相互作用，本發(fā)明人測(cè)量了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)。當(dāng)NBD-膽固醇結(jié)合于蛋白質(zhì)時(shí)，氨基酸色氨酸可在295nm處激發(fā)并且在 350nm處發(fā)射，這與NBD-膽固醇的激發(fā)譜相重疊。在將PKE與NBD-膽固醇一同孵育并在295nm處激發(fā)Trp后，本發(fā)明人在530nm處檢測(cè)到FRET信號(hào)的NBD-膽固醇劑量依賴性飽和曲線(圖5E)。為驗(yàn)證這些結(jié)果，本發(fā)明人將62. 5nM的NBD-膽固醇與不同濃度的PKE —同孵育。與前述實(shí)驗(yàn)相一致，將NBD-膽固醇與PKE —同孵育產(chǎn)生了 NBD信號(hào)(圖5F)和FRET信號(hào)(圖5G) 二者的PKE劑量依賴性飽和曲線。總而言之，這些觀察表明純化的Na/K-ATPase能夠在體外直接與NBD-膽固醇相互作用。為進(jìn)一步解析Na/K-ATPase中的膽固醇結(jié)合位點(diǎn)，本發(fā)明人搜索文獻(xiàn)并發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)已知的膽固醇結(jié)合蛋白質(zhì)中都鑒定有一段膽固醇識(shí)別/相互作用氨基酸序列及一致模式(CRAC)。隨后的研究進(jìn)一步表明CRAC負(fù)責(zé)膽固醇結(jié)合且將CRAC中間的關(guān)鍵氨基酸Tyr突變完全消除了其的膽固醇結(jié)合親和力。在本發(fā)明人搜索人Na/K-ATPase α I的一級(jí)序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)在N末端結(jié)構(gòu)域(NT)內(nèi)有一個(gè)CRAC (Leu51-Arg61)且此CRAC基序在哺乳動(dòng)物種屬之間是高度保守的。為測(cè)試NT是否是Na/K-ATPase-膽固醇相互作用的關(guān)鍵因素，本發(fā)明中首先將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽連接于NT肽并通過(guò)GST下拉測(cè)定法純化GST-NT (圖5H)。然后進(jìn)行了如圖5E NBD-膽固醇結(jié)合測(cè)定。如圖51和5J所顯示的，GST自身不誘導(dǎo)出FRET信號(hào)，而GST-NT誘導(dǎo)了劑量依賴性的FRET信號(hào)飽和曲線，表明NT具有膽固醇結(jié)合親和力。進(jìn)一步地，本發(fā)明人將CRAC中間的氨基酸Tyr53突變?yōu)镾er53并且進(jìn)行了同樣的NBD-膽固醇結(jié)合測(cè)定。有趣的是，突變體NT-Y53S未顯示出膽固醇結(jié)合親和力。這表明NT中的CRAC是膽固醇結(jié)合的關(guān)鍵因素。Na/K-ATPase α I的CRAC對(duì)于膽固醇調(diào)控的α I膜運(yùn)輸至關(guān)重要。前節(jié)的數(shù)據(jù)表明Na/K-ATPase α I的NT能夠在體外通過(guò)CRAC與膽固醇相互作用。因此，探索CRAC是否在膽固醇耗盡誘導(dǎo)的α I細(xì)胞內(nèi)吞中起作用很有意義。首先，本發(fā)明人用U18666A處理野生型大鼠α I修復(fù)的細(xì)胞——AAC-19，并對(duì)α I和膽固醇二者進(jìn)行染色。如圖6Α所示，LLC-PKl細(xì)胞中的野生型大鼠α I與內(nèi)源豬α I作用相同(圖3Α)。質(zhì)膜膽固醇的耗盡以劑量依賴的形式導(dǎo)致α I的細(xì)胞內(nèi)吞作用。接著，本發(fā)明人通過(guò)定點(diǎn)誘變方法將大鼠a ICRAC中關(guān)鍵的Tyr55(對(duì)應(yīng)豬α I中的Tyr53)突變?yōu)镾er55并生成穩(wěn)定的突變體大鼠α I修復(fù)的細(xì)胞系(PY-17-Y55S)。在細(xì)胞系建立時(shí)，本發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了在AAC-19細(xì)胞上進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)。有趣的是，與野生型大鼠α I相反，所述Y55s突變體大鼠α I未顯示對(duì)U18666A處理的應(yīng)答的明顯細(xì)胞內(nèi)吞作用(圖6Β)。為確認(rèn)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人合成了具有陽(yáng)性電荷的前導(dǎo)肽HIV-TAT的CRAC，將其標(biāo)記于CRAC的N末端以使TAT-CRAC肽具有細(xì)胞通透性。理論上，將TAT-CRAC肽加入細(xì)胞可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制打斷內(nèi)源α I和膽固醇之間的結(jié)合。如圖6C所示，TAT-CRAC肽以劑量依賴的形式修復(fù)了 U18666A引起的α I下調(diào)作用?？偠灾?，膽固醇調(diào)控的Na/K-ATPase α I膜運(yùn)輸依賴于膽固醇-α I相互作用。Na/K-ATPase α I在NPCl突變體小鼠的肝臟和腦中下調(diào)。如上文提到的，兩親化合物U18666A對(duì)細(xì)胞的處理導(dǎo)致NPCl-樣表型。U18666A處理的細(xì)胞中Na/K-ATPase α I的下調(diào)促使我們檢測(cè)此作用是否在生理學(xué)上于NPCl疾病相關(guān)。因?yàn)镹PCl疾病是一種脂類儲(chǔ)存障礙并顯示有顯著的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行，所以本發(fā)明人聚焦于兩種最相關(guān)的器官腦和肝臟。如圖7Α所示，Na/K-ATPase α I蛋白質(zhì)表達(dá)水平在NPC-/-小鼠腦中下降了 大約40%，這與我們前面的體外數(shù)據(jù)相一致。因?yàn)槟X細(xì)胞表達(dá)α亞基的三種異構(gòu)體，所以本發(fā)明人檢測(cè)了 α2和α3的蛋白質(zhì)水平。α2水平有少量但不顯著的增加，而α 3在對(duì)照與NPCl小鼠腦中未顯不任何差異。進(jìn)一步地，與前文數(shù)據(jù)相一致，胰島素受體蛋白質(zhì)水平在NPCl小鼠腦中沒(méi)有改變(圖7Α)。因此，似乎NPCl病中的膽固醇運(yùn)輸缺陷特異性影響α I的表達(dá)。最后，發(fā)現(xiàn)了 α 水平在NPCl小鼠肝細(xì)胞中也減少至一半，而胰島素受體未顯示出明顯的差異(圖7Β)。然而，α I下調(diào)的作用似乎為器官特異性的，因?yàn)樾呐K和腎臟中的α I水平未顯示出顯著差
巳
實(shí)施例
實(shí)施例I.材料細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen?？贵w及其來(lái)源如下用于Western印跡分析的小鼠單克隆抗-Na/K-ATPase α I抗體(a6F)購(gòu)自愛(ài)荷華大學(xué)的發(fā)育研究雜交瘤細(xì)胞庫(kù)(Developmental Studies Hybridoma Bank)。用于免疫細(xì)胞化學(xué)的小鼠單克隆抗-Na/K-ATPase α I 抗體購(gòu)自 Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid,NY)。小鼠單克隆抗-胰島素受體β亞基抗體、兔多克隆抗-窖蛋白-I抗體、小鼠單克隆抗_α -微管蛋白抗體及所有二抗來(lái)自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)。兔多克隆抗-Na/K-ATPase α 2抗體(HERED)及兔多克隆抗-Na/K-ATPase α 3抗體由德克薩斯科技大學(xué)的 Thomas A. Pressley 博士惠贈(zèng)。Optitran 硝酸纖維素膜來(lái)自 Schleicher&Schuell。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光SuperSignal試劑盒購(gòu)自Pierce。Μ β -⑶、環(huán)糊精和菲律賓菌素獲自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。U18666A 化合物來(lái)自 Cayman Chemical (Ann Arbor,MI)。Lipofectamine 2000 購(gòu)自 Invitrogen。Amplex Red Cholesterol Assay Kit 購(gòu)自Molecular Probes, Inc. (Eugene, 0R)o [3H]烏本苷來(lái)自 PerkinElmer Life Sciences(Waltham, MA)。NBD-膽固醇來(lái)自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)。QuikChange 定點(diǎn)誘變?cè)噭┖蝎@自Stratagene (La Jolla，CA)。TAT-CRAC肽是高純度(>95%)合成的。通過(guò)高效液相色譜質(zhì)譜確定其特性及純度。細(xì)胞培養(yǎng)LLC-PKl細(xì)胞獲自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心。大鼠α I修復(fù)的Na/K-ATPase α I敲除細(xì)胞(AAC-19)以及窖蛋白-結(jié)合基序突變體大鼠α I修復(fù)的Na K-ATPase α I敲除細(xì)胞(mCBM)衍生自如前文所描述的LLC-PKl細(xì)胞。所有細(xì)胞都培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、青霉素(100 單位 /ml) / 鏈霉素(100 μ g/ml)的 Dulbecco's modified Eagle’s 培養(yǎng)基(DMEM)中，在5%C02-增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。除非另有說(shuō)明，在細(xì)胞達(dá)到100%融合度時(shí)，將其進(jìn)行24小時(shí)的血清饑餓并用于實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒構(gòu)建物及轉(zhuǎn)染大鼠a ICRAC突變體(Tyr55至Ser55)是通過(guò)在如前文所生成的pRc/CMV-alAACml質(zhì)粒上進(jìn)行基于PCR的定點(diǎn)誘變而產(chǎn)生。然后使用相同的先前描述的操作流程建立Y55S突變體α I敲入細(xì)胞系。pEYFP-a I質(zhì)粒是按之前描述的方法生成的。RFP_rab7質(zhì)粒獲自WWW. addgene. org。表達(dá)GST融合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒構(gòu)建物是按前文所描述的方法由PGEX-4T-1而制備的。GST-NT (Alal至Serl60)和GST-NT-Y55S表達(dá)載體基于豬腎Na/K-ATPasea I亞基的序列而構(gòu)建。所有構(gòu)建物都通過(guò)DNA測(cè)序得到確認(rèn)。在轉(zhuǎn)染時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)到大約70%的融合度并按前文所述的方法使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。隨后的實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染后34小時(shí)進(jìn)打。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c 遺傳背景的 NPCl+/-小鼠購(gòu)自 The Jackson Laboratory。NPCl+/+ 和NPCl-/-小鼠是通過(guò)交配兩只NPCl+/-小鼠產(chǎn)生的。從尾巴活檢組織獲得DNA并用于基于PCR的基因分型。所有小鼠在12-h的黑夜/白天循環(huán)中生長(zhǎng)并自由攝取標(biāo)準(zhǔn)食物。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都在同窩小鼠間進(jìn)行。所有步驟都得到托雷多大學(xué)醫(yī)學(xué)院校區(qū)的學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)和使用委員會(huì)的認(rèn)可。所有小鼠都在10周齡時(shí)處死，小心地解剖出包括腦、肝臟、心臟和腎臟的器官，并進(jìn)行稱重。所有組織立即冷凍于液氮并儲(chǔ)存于_80°C用于進(jìn)行Western印跡分析。
實(shí)施例2.方法Μβ -⑶的細(xì)胞膽固醇耗盡以及恢復(fù)使LLC-PKl細(xì)胞在6cm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至100%融合度，并進(jìn)行24小時(shí)的血清饑餓。然后對(duì)細(xì)胞用IOmM M β-⑶處理I小時(shí)。下一步，將Μβ-⑶從細(xì)胞中移除，讓細(xì)胞在DMEM中分別恢復(fù)0、6、24小時(shí)，然后在RIPA緩沖液中用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞。用細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定及Western印跡分析。Western 印跡分析細(xì)胞裂解物及組織勻漿的蛋白質(zhì)濃度使用來(lái)自Bio-Rad (Hercules, CA)的Protein Assay Kit進(jìn)行測(cè)量。將等量的蛋白質(zhì)加樣至凝膠并在10%的SDS-PAGE上分離，轉(zhuǎn)移至Optitran膜，并用對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行探測(cè)。用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)。通過(guò)免費(fèi)軟件Image J對(duì)Western印跡條帶的灰度進(jìn)行分析。 免疫細(xì)胞化學(xué)Na/K-ATPase α I的染色按先前描述的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)的血清饑餓并在蓋玻片上進(jìn)行處理。然后用冰冷的甲醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行30min的固定并用來(lái)自Invitrogen的Signal Enhancer進(jìn)行封閉。接著，將細(xì)胞與單克隆抗-Na/K-ATPase α I抗體在4°C孵育過(guò)夜。用PBS洗滌三次，加入二抗Alex 488-綴合的抗小鼠抗體并在室溫孵育3小時(shí)。洗滌蓋玻片，并封片，用Leica共聚焦顯微鏡拍照。膽固醇測(cè)定及菲律賓素染色膽固醇測(cè)定及菲律賓素染色是按Chen等人Regulation of intracellularcholesterol distribution by Na/K-ATPase. Journal Biological Chemistry, Volume284，pages 14881-14890(2009)的方法進(jìn)行的。[3H]烏本苷結(jié)合[3H]烏本苷結(jié)合是按 Tian 等人在 Changes in sodium pump expressiondictate the effects of ouabain on cell growth, Journal of Biological Chemistry,14921-1429(2009)中描述的方法進(jìn)行的。定量RT-PCR對(duì)Na/K-ATPase α I和GAPDH的mRNA水平進(jìn)行定量RT-PCR，是按照Tian等人在 Changes in sodium pump expression dictate the effects of ouabain on cellgrowth, Journal of Biological Chemistry, 14921-1429 (2009)中描述的方法進(jìn)行的。NBD-膽固醇結(jié)合測(cè)定NBD-膽固醇結(jié)合測(cè)定是按 Petrescu 等人 Steroidogenic acute regulatoryprotein binds cholesterol and modulates mitochondrial membrane sterol domandynamics, Journal Biological Chemistry, Volume 276, pages 36970-36982 (2001)中描述的方法進(jìn)行。Na/K-ATPase和GST-融合蛋白質(zhì)的純化使用Jorgensen方法從豬腎外髓質(zhì)中純化出Na/K-ATPase。GST-融合蛋白表達(dá)于大腸埃希氏菌BL21 (Invitrogen)中并使用谷胱甘肽珠子進(jìn)行純化。用洗脫緩沖液(IOmM還原性谷胱甘肽，0. l%Triton X_100，50mM Trish，pH 8. 0)將可溶的GST-融合蛋白質(zhì)從谷胱甘肽珠子上洗脫。將洗脫液在包含0. l%Triton X-100,50mM Tris-HCl，pH 8. O的緩沖液中透析移除殘留的谷胱甘肽。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為平均值土S. E0使用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在p〈0. 05時(shí)的顯著性可接受。實(shí)施例3.對(duì)可能調(diào)制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測(cè)試組合物的測(cè)定本發(fā)明人從對(duì)照和U18666A-處理的細(xì)胞中提取總mRNA并進(jìn)行定量PCR分析。如圖4A所示，α I的mRNA水平相比于對(duì)照沒(méi)有差異，這表明質(zhì)膜膽固醇耗盡可能不影響α 的從頭合成。在一項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人還在U18666A加入細(xì)胞之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)糊精的處理。如圖4Β所示，環(huán)糊精阻斷蛋白質(zhì)從頭合成并未阻止U18666A誘導(dǎo)的α I向細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的重新分配。該結(jié)果表明U18666A可能誘導(dǎo)細(xì)胞表面α I的內(nèi)化作用。 因?yàn)閁18666A處理也導(dǎo)致膽固醇在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的積累(圖3Α)，所以本發(fā)明人下一步檢查了αI和膽固醇是否局限在相同的細(xì)胞區(qū)室。對(duì)游離膽固醇的染色操作流程需要與α 的那種不同的固定試劑，而且不可能在相同視野中觀察膽固醇和內(nèi)源α 二者。為了解決這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明人用YFP-α I轉(zhuǎn)染LLC-PKl細(xì)胞，隨后進(jìn)行U18666A處理和膽固醇染色。這些結(jié)果表明在U18666A處理后大多數(shù)內(nèi)化的α I與游離膽固醇共定位(圖4C，箭頭指向共定位區(qū)域)。在一項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人還在加入U(xiǎn)18666A之前用假RFP標(biāo)簽的Rab7 (晚期內(nèi)體/溶酶體的標(biāo)記物)對(duì)LLC-PKl細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。如圖4D中所示，在未處理的對(duì)照細(xì)胞中大多數(shù)α I位于質(zhì)膜內(nèi)，沒(méi)有檢測(cè)到α I和Rab7之間的共定位。然而，U18666A處理導(dǎo)致了大量的細(xì)胞內(nèi)α I積累，其中大多數(shù)明顯的與Rab7信號(hào)共定位(箭頭指向共定位區(qū)域)。這確認(rèn)了在U18666A處理時(shí)α I積累于晚期內(nèi)體/溶酶體之內(nèi)。實(shí)施例4.對(duì)可能調(diào)制質(zhì)膜膽固醇的測(cè)試組合物的測(cè)定首先，將細(xì)胞用膽固醇耗盡藥物B-環(huán)糊精(Μβ_⑶)進(jìn)行處理。因?yàn)槠鋵?duì)膽固醇有高的親和力，Μβ -CD能夠特異性將膽固醇從質(zhì)膜中抽取出來(lái)，這極大地降低了細(xì)胞表面膽固醇庫(kù)并重新分配窖蛋白-I。此外，本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的先前的工作表明用IOmM Μβ-CD在37°C下處理LLC-PKl細(xì)胞30-60分鐘顯著地降低了質(zhì)膜膽固醇庫(kù)。因此，本發(fā)明人在這些研究中使用了相同的條件。在用Μβ -⑶處理耗盡細(xì)胞膽固醇后，本發(fā)明人洗去藥物并通過(guò)將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育補(bǔ)充回細(xì)胞膽固醇。然后，本發(fā)明人在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解物并檢查蛋白質(zhì)和膽固醇水平。如圖IA中所示，Μβ -⑶造成的細(xì)胞膽固醇耗盡導(dǎo)致α I水平 40%的降低。有趣的是，Μβ-CD處理還導(dǎo)致細(xì)胞膽固醇水平的類似的降低(圖1Β)。細(xì)胞恢復(fù)后6小時(shí)，α I和膽固醇還保持在類似的低水平，這表示細(xì)胞需要更長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)。然而，細(xì)胞恢復(fù)24小時(shí)后，α I和膽固醇水平回到對(duì)照水平(圖IA和1Β)。應(yīng)當(dāng)注意的是α I和膽固醇水平的變化在膽固醇耗盡和補(bǔ)充過(guò)程中都顯示了類似的形式，這表明細(xì)胞αI水平與膽固醇水平正相關(guān)。此外，膽固醇耗盡對(duì)α I表達(dá)的影響不是對(duì)所有細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的普遍影響，因?yàn)榱硪环N質(zhì)膜蛋白質(zhì)胰島素受體在膽固醇耗盡和補(bǔ)充過(guò)程中沒(méi)有變化(圖IA和1Β)。為進(jìn)一步確認(rèn)此結(jié)果，本發(fā)明人在Μβ_⑶的膽固醇耗盡后進(jìn)行了 α I免疫染色。與Western印跡數(shù)據(jù)相一致,本發(fā)明人在來(lái)自Μβ -CD處理的細(xì)胞的質(zhì)膜中檢測(cè)到了較低的α I信號(hào)。此外，本發(fā)明人在Μβ-CD處理的細(xì)胞中觀察到很多細(xì)胞內(nèi)α I信號(hào)，這表示膽固醇耗盡導(dǎo)致α I重新分配到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(圖1C)。上述數(shù)據(jù)表明急性膽固醇耗盡下調(diào)質(zhì)膜的α I水平。為測(cè)試慢性膽固醇耗盡是否具有類似的效應(yīng)，本發(fā)明人接著將細(xì)胞于作為對(duì)照培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)基(加血清的DMEM)及無(wú)血清培養(yǎng)基(只有DMEM)或無(wú)脂蛋白培養(yǎng)基(加了物質(zhì)蛋白血清的DMEM)中培養(yǎng)48小時(shí)。正如所預(yù)期的，在兩種膽固醇耗盡的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞膽固醇水平的減少(圖2Α)。因此，α I水平在兩種膽固醇耗盡的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中降低(圖2Β)。進(jìn)一步地，α I和膽固醇水平在無(wú)脂蛋白培養(yǎng)基中顯示了類似的減少百分比再一次提示了 αI水平與細(xì)胞膽固醇水平正相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞表面膽固醇庫(kù)調(diào)控了質(zhì)膜α 1，本發(fā)明人用細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸抑制劑U18666A處理細(xì)胞。所述U化合物為一種破壞內(nèi)膜和細(xì)胞表面之間細(xì)胞內(nèi)膽固醇運(yùn)輸?shù)膬捎H分子，這導(dǎo)致膽固醇在晚期內(nèi)體/溶酶體內(nèi)的積累，模擬了 NPCl突變體細(xì)胞的表型。用U18666A處理LLC-PKl導(dǎo)致游離膽固醇從質(zhì)膜向細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的重新分配。α I信 號(hào)在質(zhì)膜中減少但在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中增加，這與膽固醇分布形式相關(guān)(圖3Α)。進(jìn)一步地，U18666A對(duì)α I表達(dá)的下調(diào)是劑量和時(shí)間依賴性的(圖3Β)。與膽固醇耗盡類似，U化合物對(duì)α I表達(dá)的效應(yīng)似乎不是對(duì)所有質(zhì)膜蛋白質(zhì)的普遍影響，因?yàn)橐葝u素受體含量在U18666A處理后保持不受干擾(圖3Β)。最后，為確證U18666A下調(diào)了細(xì)胞表面α 1，本發(fā)明人進(jìn)行了 3Η_烏本苷結(jié)合測(cè)定。結(jié)果驗(yàn)證了質(zhì)膜膽固醇的減少導(dǎo)致細(xì)胞表面α I的下調(diào)(圖3C)。最后，與表面α I調(diào)控窖蛋白-I的運(yùn)輸和表達(dá)這一觀點(diǎn)一致，U18666A也下調(diào)了窖蛋白-I的蛋白質(zhì)水平(圖3Β)。雖然本發(fā)明的描述中參考了多種的及優(yōu)選的實(shí)施方式，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是可以做出多種變化，而且等價(jià)物可以置換其中的成分而不偏離本發(fā)明的本質(zhì)范圍。此外，可作出許多修飾以使具體的情況或材料能適合于本發(fā)明的教義，而不偏離其本質(zhì)范圍。因此，不預(yù)期的是將本發(fā)明限制在本文公開(kāi)的用于實(shí)行本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，而是本發(fā)明會(huì)包括所有符合權(quán)利要求范圍的實(shí)施方式。本文用來(lái)闡明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明時(shí)間的其他細(xì)節(jié)的出版物和其他材料通過(guò)引用并入本文，簡(jiǎn)便起見(jiàn)，將其在下文的參考目錄中提供。本文提到的任何文檔的引用不預(yù)期為認(rèn)可前述的任何項(xiàng)為相關(guān)的在先技術(shù)。關(guān)于這些文檔日期的所有陳述或?qū)ζ鋬?nèi)容的表示都是基于申請(qǐng)人可得的信息，不包含任何對(duì)這些文檔的日期或內(nèi)容正確性的認(rèn)可。
權(quán)利要求
1.鑒定能夠調(diào)制細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的測(cè)試組合物的方法，包括 a.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中將測(cè)試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的調(diào)制。
2.鑒定能夠調(diào)制質(zhì)膜膽固醇濃度的測(cè)試組合物的方法，包括 a.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中將測(cè)試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的調(diào)制。
3.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的調(diào)制為細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的降低。
4.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中測(cè)試模型為細(xì)胞培養(yǎng)物。
5.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中測(cè)試模型為哺乳動(dòng)物。
6.上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，，其中測(cè)試模型選自肝細(xì)胞；腎細(xì)胞；腦細(xì)胞；神經(jīng) 細(xì)胞；胰腺細(xì)胞；肺細(xì)胞；皮膚細(xì)胞；心臟細(xì)胞；嚙齒動(dòng)物細(xì)胞；人細(xì)胞；小鼠；大鼠；豚鼠；犬；猴；以及人。
7.權(quán)利要求5的方法，其中測(cè)試模型選自以下的模型NPC1病；病理性脂質(zhì)積累；脈管疾?。恍呐K?。恢酗L(fēng)；超重；肥胖；糖尿??；代謝綜合征；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關(guān)節(jié)硬化；心力衰竭；心臟疾??；阿爾茨海默病；帕金森?。缓嗤㈩D??；泰薩二氏?。灰约吧窠?jīng)退行性疾病。
8.鑒定能夠調(diào)制膽固醇濃度的測(cè)試組合物的方法，包括 a.將測(cè)試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生對(duì)Na/KATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中步驟a.是以選自體外和體內(nèi)的形式完成的。
10.影響細(xì)胞中膽固醇運(yùn)輸?shù)姆椒?，包括影響Na/KATPase的膽固醇結(jié)合活性。
11.權(quán)利要求10的方法，其中Na/KATPase的膽固醇結(jié)合活性以以下方式受到影響降低；增加；消除；階段性破壞；以及階段性增強(qiáng)。
12.在需要這種改善的器官中改善由于病理性細(xì)胞內(nèi)膽固醇累積導(dǎo)致的神經(jīng)退行的方法，包括降低Na/K ATPase的膽固醇結(jié)合活性。
13.治療Cl型NeumannPick病的方法，包括降低Na/K ATPase結(jié)合膽固醇的能力。
14.權(quán)利要求13的方法，其中降低是以選自以下的方式完成的拮抗Na/KATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域；以及抑制Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域。
15.鑒定能夠治療膽固醇相關(guān)疾病狀態(tài)的組合物的方法，包括 a.將測(cè)試組合物與Na/KATPase相接觸；以及 b.鑒定步驟a.是否產(chǎn)生對(duì)膽固醇結(jié)合Na/KATPase的α I亞基的CRAC結(jié)構(gòu)域的能力的拮抗。
16.權(quán)利要求15的方法，其中疾病狀態(tài)選自NPC1;病理性脂質(zhì)積累；脈管疾??；心臟??；中風(fēng)；超重；肥胖；糖尿??；代謝綜合征；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關(guān)節(jié)硬化；心力衰竭；心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森?。缓嗤㈩D?。惶┧_二氏??；以及神經(jīng)退行性疾病。
17.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中下調(diào)Na/KATPase的方法，包括在測(cè)試模型中耗盡質(zhì)膜膽固醇濃度。
18.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中將Na/KATPase的α I亞基重新分配到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的方法，包括在測(cè)試模型中耗盡質(zhì)膜膽固醇濃度。
19.在膽固醇運(yùn)輸測(cè)試模型中影響窖蛋白-I的運(yùn)輸和表達(dá)的方法，包括下調(diào)質(zhì)膜的Na/K ATPase 的 a I 亞基。
20.治療NPCl病的方法，包括改變Na/KATPase的a I亞基的表達(dá)，以改善NPCl病的癥狀。
全文摘要
本發(fā)明部分基于鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結(jié)構(gòu)構(gòu)象及功能的闡明,尤其是對(duì)新的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用的闡明。本發(fā)明提供了Na/K ATPase及與Na/K ATPase相互作用的化合物之間的數(shù)種驚人的結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系的應(yīng)用。這些結(jié)構(gòu)和關(guān)系的公開(kāi)提供了對(duì)在化學(xué)上影響Na/K ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的調(diào)節(jié)子的理解及解決方案。
文檔編號(hào)A61K31/704GK102858346SQ201180010295
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日
發(fā)明者謝子建, 陳逸良, 王浩杰 申請(qǐng)人:托萊多大學(xué)