專利名稱：：癌癥診斷和成像的制作方法癌癥診斷和成像
背景技術：
：常規(guī)癌癥成像是不準確和不精確的。典型地，患者具有注射至其循環(huán)系統(tǒng)中的標記物或其他化學化合物，等待約I小時并然后利用正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)成像。該I小時期限非常短，并且可能不能代表全部數量的癌細胞的一般活性。常規(guī)癌癥成像不準確和不精確的原因部分在于成像標記物的代謝攝取具有細胞循環(huán)特異性作用機制。更具體地，成像標記物的攝取是靶細胞所在的周期部分的功能。在任何指定的一小時(標記物施用和成像之間的典型等待時間)中，待成像癌細胞可以處于細胞周期的任一階段并可以以不同的速率和數量攝入和攝取所述標記物。這種存在于遍及患者的所有癌細胞之間的差別可以導致令人誤解的結果和不正確的診斷。細胞周期是發(fā)生在細胞中的一系列事件，其引起細胞的分裂和復制。在真核細胞中，所述周期可以分為兩個時期，即間期和有絲分裂期。通過細胞周期的這兩個時期被稱為增殖。在間期過程中，細胞生長、積累有絲分裂所需的營養(yǎng)并復制其DNA。在有絲分裂期過程中，細胞自身分裂為兩個不同的子細胞。間期包括三個不同的時期，Gapl(G1)期、S期和Gap2(G2)期；而有絲分裂期包括兩個步驟。G1期包括細胞尺寸的增大，細胞生物合成活性的增加和合成后繼步驟中DNA復制所需的酶。S期包括DNA合成的開始和所有染色體的復制。G2期持續(xù)直至細胞進入有絲分裂期并包括蛋白質合成，包括生成用于有絲分裂劑的微管。有絲分裂期包括細胞染色體在兩個子細胞之間分配的步驟和原始細胞胞質分開形成兩個不同子細胞的胞質分裂步驟。細胞周期還包括靜止期，典型地稱為K。不同時期之間的界限，例如G1和S期之間的界限稱為細胞周期檢查點(checkpoint)。細胞周期的進程可以受到抑制，由此特定的細胞在進發(fā)至下一個時期前，在一個時刻，一個細胞檢查點處終止該周期。細胞周期檢查點位于細胞周期的不同時期之間，其中兩個檢查點處于匕和S期(G/S)之間的分界處和G2和M期之間的分界處。細胞周期抑制劑可以終止細胞轉入下一時期的進程，例如細胞可以在h/S細胞周期檢查點受到抑制，這迫使該細胞保持在G1期，直至除去抑制劑。在個體中的任何特定癌細胞群體或腫瘤中，細胞周期的長度是可變的。該可變性歸因于Gtl的G1中經歷的不同時期，而從S期開始至M期結束的時間長度相對恒定。利用傳統(tǒng)標記物的成像依賴增加的標記物的攝取，這歸因于癌細胞的增加的代謝活性。這種增加的攝取在癌細胞一旦處于S期而非其他細胞周期階段時最明顯。如果大部分待成像癌細胞在施用和成像之間的典型的一小時時間間隔過程中不處于S期，則成像結果可能不代表癌細胞的真實濃度和位置。需要一種處理，以在G1A細胞周期檢查點處停止臨床相關部分的細胞的細胞周期，從而使得成像標記物的功效可以得到提高。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于對哺乳動物中的疾病或病癥進行成像的方法，其包括以下步驟施用治療有效量的細胞周期抑制劑從而在G1和S期之間的細胞周期檢查點處有效終止真核細胞的增殖，停止施用所述細胞周期抑制劑一段時期，將標記物施用于所述哺乳動物并對所述哺乳動物進行成像。圖I是細胞周期的圖示。外環(huán)包括間期(I)和有絲分裂期(M)階段，其中有絲分裂期的持續(xù)時間相對于其他時期被夸大。內環(huán)包括Gapl(G1)、Gap2(G2)和合成(S)期。GapO(G0)或靜止期未顯示。圖2是若干化學試劑抑制鈣流入的能力與相同化學試劑抑制細胞增殖的能力進行比較的圖示。圖3是細胞周期和若干鈣通道阻斷劑對細胞周期進程所具有的影響的圖示。圖4是測量米貝拉地爾(mibefradil)對細胞周期影響的數據的圖示。圖5是測量米貝拉地爾對細胞周期影響的數據的圖示。圖6是測量施用米貝拉地爾后成像標記物攝取的數據的圖示。圖7是測量施用米貝拉地爾后成像標記物攝取的數據的圖示。定義在描述和要求本發(fā)明中，根據下文所述的定義使用以下術語。如本文中所使用地，術語“藥用載體、賦形劑或稀釋劑”包括任何標準藥用載體，諸如磷酸鹽緩沖溶液、水、乳化劑諸如油/水或水/油乳化劑、和多種類型的潤濕劑。該術語還包括由美國聯(lián)邦政府管理機構批準的或美國藥典中列出的用于動物包括人的任何試劑。術語“治療有效量”意指改善、減弱、減少或消除特定疾病或病癥或防止或延遲特定疾病或病癥發(fā)作的本發(fā)明的化合物的量。通過“哺乳動物”，其意指所有哺乳動物，包括，例如，靈長類動物諸如人和猴。本文中包括的其他哺乳動物實例是兔、狗、貓、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠和馬。優(yōu)選地，哺乳動物是女人或男人。表述“癌變前病癥(pre-cancerouscondition)”指這樣的生長,它不是惡性的但如果不治療可能變?yōu)閻盒缘摹！鞍┳兦安“Y”也被本領域普通技術人員稱為“惡變前病癥”。本領域技術人員理解“T型鈣通道阻斷劑”也稱為“T型鈣通道抑制劑”。發(fā)明詳述用于對哺乳動物中的疾病或病癥進行成像的方法包括若干步驟。該方法可以為了許多原因而進行，包括診斷可疑的疾病或病癥，篩選多種治療的效果和監(jiān)測治療進程?；谟伤龇椒ㄉ傻膱D像，衛(wèi)生保健管理者可以更容易地確定診斷，治療效果和當前治療進程。所述方法可以用于成像多種疾病或病癥，包括不穩(wěn)定型心絞痛(unstableangina)、高血壓(hypertension)、癲癇(epilepsy)、神經性疼痛(neuropathicpain)、癲癇小發(fā)作(petitmalseizure)、失神發(fā)作(absenceseizure)、年齡相關性黃斑變性(agerelatedmaculardegeneration)、癌癥和癌變前病癥。在其他實施方案中，該方法可以用于成像腫瘤和癌變前腫瘤。在用于對疾病或病癥進行成像的方法中，首先以治療有效量施用細胞周期抑制劑從而在G1和S期(G/S)之間的細胞周期檢查點處終止真核細胞增殖。細胞周期的不同長度主要由G1期中經歷的時間決定。3、62和11期的長度相對恒定。因此，處于群體中的任何特定細胞將處于G1期一段時間，然后該細胞進入細胞周期的S期。為了終止細胞周期以使其不繼續(xù)通過細胞周期檢查點，可以施用細胞周期抑制劑。施用細胞周期抑制劑導致群體中非同步增殖的癌細胞在它們通過細胞周期時在G/S累積，這是因為它們繼續(xù)到達S期的能力受到細胞周期抑制劑的阻止。對于細胞通過細胞周期檢查點由G1期到達S期，該細胞需要胞外鈣流入從而觸發(fā)該進程所必需的生化級聯(lián)。從胞外培養(yǎng)基中除去鈣阻斷各細胞的細胞周期轉換。因此，各細胞在存在胞外鈣時盡可能長地保持在G1期，但在無鈣條件下，在到達匕#時變?yōu)楸绘i定在原地，由此在G1A同步細胞。丐流入到細胞對于增殖和細胞周期的轉化是必需的。這進一步記述在以下實施例I中。施用細胞周期抑制劑增加處于G1A的細胞的百分比。為了利用G/S處細胞的增力口，向哺乳動物施用細胞周期抑制劑持續(xù)一段時間，然后進行成像。這段時期可以是約I天至約10天(包括端點)。在另一個實施方案中，這段時期可以是約5天至約7天(包括端點)。盡管這些實施方案的上限是10天和7天，但是細胞周期抑制劑可以施用更長的時期。細胞周期抑制劑的劑量在哺乳動物血漿中形成約IUM至約10iiM的濃度。細胞周期抑制劑可以經由若干途徑，包括腸胃外、靜脈內、肌肉、腹膜內、鞘內、栓齊U、經皮、局部或口服施用?？诜┯眉毎芷谝种苿┦亲顑?yōu)選的?？诜┯每梢宰鳛橐粋€劑量單位(典型地連同藥用載體的藥丸或膠囊)來施用。細胞周期抑制劑可以是若干細胞周期抑制劑中的一種或多種。例如，米貝拉地爾、依福地平(efonidipine)、乙琥胺(ethosuxamide)、TTL-1177(專利化合物，記述在參考文獻Gray,L.S.,Perez-Reyes,E.,Gomora,J.C.,Haverstick,D.M.,Shattock,M.，McLatchie,L.，Harper,J.，Brooks,G.，Heady,T.，和MacDonald,T.L.(2004)CellCalcium(細胞鈣)36,489-497中)和鎳。這些細胞周期抑制劑抑制胞外鈣流入至細胞內，這是許多生命細胞過程的關鍵。這些過程所必需的鈣來自經由鈣通道流入的胞外環(huán)境。鈣通道基于序列分析、生物物理特征和藥理學靈敏性而分組為若干家族。其中包括T型鈣通道家族。這些鈣通道在血壓、心律和細胞增殖的調節(jié)中有所涉及。研究還提示T型鈣通道可以在年齡相關性黃斑變性中起重要作用。至少一種藥理學試劑，米貝拉地爾，由于抑制T通道的功能，已經被證明是臨床有效的。鈣進入的抑制劑有效用于治療高血壓、心律失常(cardiacarrhythmia)和臨床有害性細胞增殖。T型鈣通道存在于細胞、細胞系和具體地，癌細胞系中。特別地，T型鈣通道的Cav3.2同種型已經在日本女性中顯示出與正常的鄰近乳腺組織相比在乳腺癌組織中異常表達，如參考文獻Asaga,S.，Ueda,M.，Jinno,H.，Kikuchi,K.，Itano,0.，Ikeda,T.,和Kitajima,M.(2006)AnticancerRes(抗癌研究)26,35-42中討論的。細胞周期抑制劑在細胞周期檢查點處(包括G1A)有效地終止真核細胞的增殖，這在下文的實施例2-4中進一步解釋。施用細胞周期抑制劑后，施用成像標記物，其目標是在細胞周期的S期中被攝取。首次施用細胞周期抑制劑和成像標記物之間的時期容許細胞在細胞周期的G/S累積。該方法增加了處于S期的細胞的百分比，由此增加了進入那些細胞的成像標記物的攝取。施用細胞周期抑制劑后，存在一段不添加細胞周期抑制劑的時期。這段時期可以是約30分鐘至約72小時。這段時期容許在G/S累積的細胞進入細胞周期的S期。約5%至約25%的細胞將在G1A累積。S期中細胞數量的增加使得隨后施用的成像標記物的劑量更有效，原因在于大百分比的細胞將攝取每一劑中的成像標記物。在不添加細胞周期抑制劑的時期之后，施用在S期將要被細胞攝取或吸收的成像標記物。具體的成像標記物將通過本領域中技術人員的臨床經驗來指定，不同疾病使用不同成像標記物來成像。與單獨使用時的成像標記物相比，相同劑量的成像標記物更容易且更特異地被攝取。被攝取的成像標記物的增加在下文中的實施例5中進一步描述。癌細胞可以通過施用結合T型鈣通道或T型鈣通道輔助蛋白的物質而定位于活體內。然后藥物在體內的位置可以通過使用從體外可檢測的物質對其進行標記來確定。例如，放射性原子可以通過在體外進行測量而在體內定位，并且這樣的用于該目的的原子的實例包括99mTc、1251、1311、18F、11C、13N、150、3H、68Ga、67Ga和16F等。許多可能的成像標記物的一些實例包括IlC甲硫氨酸、2-脫氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(FDG)、含氚FDG(3H_FDG)和氟化脫氧胸苷諸如[18F]-3'-氟-3'-脫氧-L-胸苷)。另外，例如，氘可以利用核磁共振(NMR)進行類似的定位，并且利用光學技術定位多種染料、熒光以及非熒光。另外，一種或多種成像標記物可以在對哺乳動物進行成像前，組合并施用于哺乳動物。施用細胞周期抑制劑及隨后終止該施用容許更大百分比的細胞處于細胞周期的特定時期。在細胞周期的不同時期中，多種細胞代謝活動進行到不同程度。通過改變細胞周期特定時期中癌細胞的比例，改變的比例將展示該時期最典型的代謝活動。成像標記物的一個實例是FDG，它累積在這樣的細胞中，所述細胞為了其所處的特定代謝狀態(tài)而需要這種能量源。因此由體外對FDG進行成像將定位通過改變處于最需要葡萄糖的細胞周期部分中的細胞的分數而響應T型鈣通道活性試劑的那些癌細胞。因為，作為實例，癌細胞與非癌細胞相比，優(yōu)先表達T型鈣通道功能，所以癌細胞會優(yōu)先受到T型鈣靶向試劑的影響并被檢測。成像標記物施用于哺乳動物后，對哺乳動物成像。成像標記物可以以任何合適的劑量，例如，約IOOmBq至約600mBq來施用?？梢岳萌魏魏线m的成像設備,例如能夠采集磁共振圖像(MRI)、正電子發(fā)射斷層照片(PET掃描)或計算機斷層照片(CT掃描)的設備來對哺乳動物成像。通過合適的成像設備收集的圖像應該比獲自未使用細胞周期抑制劑預處理的哺乳動物的圖像更靈敏。施用細胞周期抑制劑后進行的掃描將會更靈敏，因為與未施用細胞周期抑制劑的細胞的成像標記物攝取相比，患病細胞具有更高的成像標記物攝取。上述方法可以在每次對哺乳動物進行成像時隨意重復。例如，在哺乳動物接受細胞周期抑制劑的施用，終止細胞周期抑制劑的施用，施用成像標記物和成像后，哺乳動物可以通過接受另一次細胞周期抑制劑的施用而再次開始該過程。根據有資質的衛(wèi)生保健管理者的需要和建議，這種方法可以根據需要被重復許多次。上述方法不僅有效用于在治療或診斷過程中對疾病和病癥諸如癌癥進行成像，上述方法還可以用于幫助篩選哪種類型的腫瘤更多和更少地受到T型鈣通道阻斷劑的影響以及哪種類型的腫瘤更多和更少地受到治療的影響。例如，基于靶向的腫瘤的類型，T型鈣通道阻斷劑在終止細胞周期方面具有不同的功效。例如，在響應一定劑量的T型鈣通道阻斷劑時，胰腺癌腫瘤與胰腺腫瘤相比可以有不同的反應。利用上述篩選方案，可以確定哪種類型的腫瘤更有效地響應該方案以及哪種類型的腫瘤不是那么有效地響應該方案。該信息可以在經歷治療方案前對各個個體進行確定并可以用于以最有效和有利的方式計劃治療方案。實施例I為了測量鈣流入抑制和增殖之間的對應性，將若干化學試劑抑制鈣流入的能力對相同試劑抑制增殖的能力作圖，如以下圖2所示。這些試劑是維吉尼亞大學(UniversityofVirginia)合成的專利化學實體。獲得斜率為0.98且R2值為0.92的最小二乘相關性線。常規(guī)地，相關性不能用于推斷因果性，但是在該情形中，貝葉斯(Bayesian)方法得到保證，原因在于先驗地鈣流入對于增殖是必需的，以致阻斷鈣進入將相應地阻斷增殖。斜率非常接近I的回歸線意味著變量中的基本所有變化都通過另一個中的變化得到說明，這意味著這些試劑對增殖不存在除了抑制鈣進入以外的作用。實施例2利用流式細胞計數法和BUdR染色進行細胞周期分析。在圖3中，“Con”表示未處理的對照細胞。全部其他細胞培養(yǎng)物均使用諾考達唑(nocodazole)來處理，諾考達唑在M期干擾微管聚合并阻斷細胞周期。如通過流式細胞計數法確定地，單獨使用諾考達唑處理AlO細胞阻斷通過M期的細胞周期轉換。因為AlO細胞主要處于Gtl和G1之間的細胞周期檢查點(見圖3的“Con”)，所以評價藥理學試劑抑制脫離該時期的轉換的可能性不如確定在其他細胞周期檢查點處的阻斷那么簡單。因此，在添加諾考達唑前，使用T通道鈣通道阻斷劑米貝拉地爾(mib)、鎳(Ni)或TTL-1177(屬于受讓人陶制藥公司(TauTherapeutics)的專利化合物)將細胞培養(yǎng)物處理24小時。由于缺乏對T通道阻斷劑的作用，細胞將被諾考達唑鎖定在G2和M之間的細胞周期檢查點處，如單獨使用諾考達唑處理的細胞所發(fā)生的一樣。相反地，使用T型鈣通道阻斷劑的處理在Gc^PG1之間的細胞周期檢查點處捕獲細胞并防止否則由諾考達唑引起的在G2和M之間的細胞周期檢查點處的累積。這顯示T型鈣通道阻斷劑在h/S捕獲周期性變化的細胞。實施例3為了測量細胞周期抑制劑米貝拉地爾終止通過細胞周期進程的功效，人肺癌細胞的細胞系A549和人前列腺癌細胞的細胞系使用10iiM米貝拉地爾來孵育48小時(M48H)。如圖4中所示，對于這兩個細胞系，米貝拉地爾通過不容許進行到S期而增加處于細胞周期的Gl期中的細胞的比例。通過使用10uM米貝拉地爾孵育相同細胞系18小時，然后進行12小時洗出及隨后使用米貝拉地爾進行另外8小時孵育來收集進一步數據(M18-12-18h)。這些結果也顯示與未使用米貝拉地爾孵育的對照細胞相比，更大比例的細胞處于Gl期中。實施例4為了測量米貝拉地爾對人前列腺癌細胞的細胞系PC3的細胞周期的作用，使用不同濃度的米貝拉地爾孵育PC3細胞不同的時間。使用5iiM的濃度或10iiM的濃度孵育PC3細胞24小時或48小時。如圖5中所示，米貝拉地爾濃度和接觸時間的增加增大處于Gl期的細胞的比例。實施例5確定在使用細胞周期抑制劑處理后攝取成像標記物的功效。人結腸癌細胞(細胞系HT29)首先使用濃度為5uM(5uM-FDG-HT29)和10uM(10uM-FDG-HT29)的細胞周期抑制劑米貝拉地爾來孵育24小時。用米貝拉地爾孵育24小時后，將HT29細胞從與米貝拉地爾接觸中移開。從與米貝拉地爾接觸中移開60分鐘后，施用成像標記物2-脫氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(下文中，“FDG”)。如圖6中所示，與未孵育的細胞相比，進入到HT29細胞中的成像標記物FDG的攝取在使用米貝拉地爾孵育的細胞中增加。與未使用米貝拉地爾孵育的細胞的攝取相比，使用IOiiM米貝拉地爾的濃度，F(xiàn)DG攝取的增加為約100%。還在人肺癌細胞的細胞系A549中確定成像標記物的攝取。A549細胞用5iiM、10iiM和15iiM濃度的細胞周期抑制劑米貝拉地爾孵育24小時。使用米貝拉地爾孵育24小時后，A549細胞從與米貝拉地爾接觸中移開。從與米貝拉地爾接觸中移開30分鐘后,施用成像標記物含氚FDG(下文中“3H-FDG”)。如圖7中所示，3H-FDG的攝取在5yM時最大，在所有濃度的米貝拉地爾孵育中均觀察到攝取的增加。盡管未顯示，但是使用IOyM米貝拉地爾孵育人前列腺癌細胞的PC3細胞系72小時使隨后引入的成像標記物3H-FDG的攝取增加約60%。實施例6作為說明性實施例，用于對哺乳動物中疾病或病癥進行成像的方法被描述為其將在臨床背景中使用。開始，選擇哺乳動物(在該實施方案中所述哺乳動物是人)進行成像。該選擇可以基于多種因素包括過去對疾病(在該實施方案中是前列腺癌)的治療，或作為對診斷的可能驗證來作出。人最初接受治療有效量的細胞周期抑制劑的施用，在該實施方案中是遞送一定劑量米貝拉地爾的口服藥丸，在安排的成像時間前每天兩次，6天。施用6天的劑量后，停止施用米貝拉地爾。停止施用后，在進行成像程序前存在一段時期。在該實施例中，在停止施用米貝拉地爾和施用成像標記物(在該實施例中是FDG)之間經過6小時。經過6小時后，將足夠劑量的FDG注射到人中。然后使用PET掃描對該人進行成像。由PET掃描產生的數據比獲自其中患者未接受細胞周期抑制劑的PET掃描的數據更精確和更準確。權利要求1.用于對哺乳動物中疾病或病癥進行成像的方法，所述方法包括以下步驟(a)施用治療有效量的細胞周期抑制劑，從而在G1和S期之間的細胞周期檢查點處有效終止真核細胞的增殖；(b)停止施用所述細胞周期抑制劑達一段時期；(C)將成像標記物施用于所述哺乳動物；和(d)使用成像儀對所述哺乳動物進行成像。2.權利要求I的方法，其中所述疾病或病癥選自由以下組成的組不穩(wěn)定型心絞痛、高血壓、癲癇、神經性疼痛、癲癇小發(fā)作、失神發(fā)作、年齡相關性黃斑變性、癌癥和癌變前病癥。3.權利要求2的方法，其中所述疾病或病癥是腫瘤。4.權利要求3的方法，其中所述腫瘤是癌性腫瘤或癌變前腫瘤。5.權利要求I的方法，其中所述哺乳動物是人。6.權利要求I的方法，其中所述細胞周期抑制劑包括米貝拉地爾、依福地平、乙琥胺、TTL-1177、鎳及其組合。7.權利要求I的方法，其中所述成像標記物包括IlC甲硫氨酸、2-脫氧-2-(18F)氟_D_匍萄糖、含氣FDG2-脫氧-2-(18F)氟-D-匍萄糖、氟化脫氧胸苷、氣及其組合。8.權利要求7的方法，其中所述氟化脫氧胸苷是[18F]-3'-氟-3'-脫氧-L-胸苷。9.權利要求I的方法，所述方法還包括通過重復步驟(a)-(d)—次或多次來延長治療的方法。10.權利要求9的方法，其中所述疾病或病癥是腫瘤。11.權利要求10的方法，其中所述腫瘤是癌性腫瘤或癌變前腫瘤。12.權利要求I的方法，其中在停止施用所述細胞周期抑制劑之前，所述細胞周期抑制劑施用約I-約10天，包括端點。13.權利要求12的方法，其中在停止施用所述細胞周期抑制劑之前，所述細胞周期抑制劑施用約5-約7天，包括端點。14.權利要求I的方法，其中在施用所述成像標記物之前，停止施用所述細胞周期抑制劑達約30分鐘至約72小時。15.權利要求I的方法，其中所述成像儀選自由以下組成的組磁共振成像儀、正電子發(fā)射斷層攝影機和計算機斷層攝影機。16.權利要求I的方法，其中施用所述細胞周期抑制劑達到哺乳動物血漿內約IyM至約10μM的濃度。17.權利要求I的方法，其中所述用于成像的方法診斷哺乳動物中的疾病或病癥。18.權利要求I的方法，其中所述用于成像的方法篩選在治療所述疾病或病癥中的治療的功效。全文摘要本發(fā)明提供一種用于對哺乳動物中的疾病或病癥進行成像的方法，其包括以下步驟施用治療有效量的細胞周期抑制劑從而在G1和S期之間的細胞周期檢查點處有效終止真核細胞的增殖，停止施用所述細胞周期抑制劑達一段時期，將標記物施用于所述哺乳動物并對所述哺乳動物進行成像。文檔編號A61B5/055GK102781316SQ201180011495公開日2012年11月14日申請日期2011年2月28日優(yōu)先權日2010年3月1日發(fā)明者勞埃德·S·格雷申請人:陶制藥有限責任公司