專利名稱:人皮膚表皮細胞增殖促進劑、包含該促進劑的皮膚外用組合物及化妝品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及以燕窩的酶解物作為有效成分的人皮膚表皮細胞增殖促進劑。此外本發(fā)明涉及包含作為該有效成分的燕窩的酶解物的皮膚外用組合物以及化妝品。
背景技術(shù):
肌膚粗糙、皺紋、肌膚的松弛、張力的降低等肌膚問題特別對于女性而言是重大關(guān) 心事情??梢哉J為這些肌膚問題通常是由環(huán)境因素、與老化等年齡增長相伴隨的因素、以及壓力等心理因素等引起的。特別是,可以說與近年來的紫外線的增大、空調(diào)的大量使用等相伴隨的生活環(huán)境的干燥化等所造成的對肌膚帶來不良影響的環(huán)境因素不斷增大。皮膚組織包含表皮、真皮、皮下組織。已知表皮為形成皮膚的最外層的構(gòu)成要素,而且基本由角質(zhì)層、顆粒層、棘層、基底層構(gòu)成。在表皮中,在作為最下層的基底層分裂產(chǎn)生新的角質(zhì)形成細胞(表皮細胞),細胞逐漸向上方改變功能和形態(tài),同時上升,形成角質(zhì)層的角質(zhì)細胞后,最后從皮膚的表面剝落。在人的健康皮膚中,在基底層表皮細胞分裂,它們上升而形成角質(zhì)細胞,從皮膚表面剝落,可以說需要28天左右。將這樣的從表皮細胞的分裂開始到細胞在細胞表面剝離為止的一連串流程稱為更新(turnover),通過在表皮反復(fù)進行這樣的更新,從而在皮膚中進行新陳代謝而形成正常健康的皮膚。然而,已知隨著年齡增長,該更新的周期變慢,由于更新周期慢,因而皮膚表面殘留老的角質(zhì)等,導(dǎo)致肌膚的暗淡、肌膚粗糙的狀態(tài)等。因此,通過推進皮膚表皮細胞增殖促進,使皮膚的新陳代謝活化,維持更新的周期,形成正常健康的皮膚表面,這會使肌膚的濕潤提高,調(diào)理肌膚的紋理,可以說帶來生活質(zhì)量(QOL)的提聞。表皮(上皮)細胞生長因子(Epidermal growth factor (EGF))為已知存在于包括人的動物的體內(nèi)的上皮細胞再生因子,是從小鼠的腭下腺的提取物中作為蛋白質(zhì)的一種首次發(fā)現(xiàn)的(mEGF (小鼠EGF))。EGF在每種動物種類中分別不同,小鼠EGF直接在人中不顯示細胞增殖促進效果。關(guān)于人EGF也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),已知EGF對位于皮膚表面的細胞起作用,促進細胞的增殖。另一方面,例如,日本特開2009 - 234980號公報中記載了,人隨著年齡增大,EGF的分泌量減少(Life Sciences vol. 31,pp679_683,1982),這是肌膚的老化現(xiàn)象的一個原因。因此,認為通過對肌膚補給EGF,可以促進人表皮中的細胞的新生(增殖),可以使肌膚的狀態(tài)良好。已知燕窩是穴燕使自己的唾液成為絲狀而作成的巢,作為其成分,大量包含糖蛋白,幾乎不含脂質(zhì)。以往,在中國菜的食用原材料、中藥的原料等中使用燕窩。近年來,還開發(fā)了將燕窩用作原料的健康食品等,但仍僅僅知道極少數(shù)外用劑、化妝品那樣的在外用用途中的適用例。日本特開2003- 095961號公報中公開了使用了燕窩的酶解物的經(jīng)口用的美膚促進劑。然而,這里,只不過僅示出了經(jīng)口用途,對于在外用用途中的利用可能性沒有任何記載和暗示。此外這里的效果為提高皮膚的保水性,形成濕潤的紋理細的肌膚,而關(guān)于通過促進表皮中的細胞增殖來維持更新周期,實現(xiàn)肌膚的紋理細等肌膚的狀態(tài)的維持、提高,沒有任何記載。W099/022709中公開了包含燕窩的含水溶劑提取物、特別是熱水提取物的化妝品。該化妝品可以用于皮膚護理用途,在外用用途中使用。然而,這里所使用的提取物為將燕窩進行熱水提取,除去固體成分而得的提取物,與將燕窩整體進行酶處理而直接使用的燕窩酶解物明顯不同。此外關(guān)于效果,也與基于促進表皮中的細胞增殖的本發(fā)明的效果不同。日本特開2009 - 234980號公報中涉及包含EGF相關(guān)物質(zhì)和神經(jīng)氨酸類的美容組合物,這里公開了利用燕窩作為神經(jīng)氨酸類的補給源之一。然而,這里,神經(jīng)氨酸類是為了 活化EGF相關(guān)物質(zhì)而被使用的,EGF相關(guān)物質(zhì)為必須的成分,另一方面,燕窩不是必須成分,只不過作為雞蛋、牛乳和神經(jīng)氨酸類的供給源而被期待。本發(fā)明人等此次發(fā)現(xiàn),燕窩的酶解物具有人EGF樣的優(yōu)異的人表皮細胞增殖促進效果。令人預(yù)料不到的驚訝的是,來源于與人無關(guān)的穴燕的燕窩的酶解物顯示人EGF樣的細胞增殖促進效果。此外,酶解物中可見的效果與燕窩的水提取物的情況相比是顯著的,這點也是令人驚訝的。本發(fā)明是基于這些認識而提出的。因此,本發(fā)明的目的是提供可以有效率地生產(chǎn),并且安全性高的優(yōu)異的人皮膚表皮細胞增殖促進劑,以及包含該人皮膚表皮細胞增殖促進劑的外用劑和化妝品。本發(fā)明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑以燕窩的酶解物作為有效成分。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方式,上述酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。根據(jù)本發(fā)明的一個更優(yōu)選方式,上述酶解物的分子量為70 200,000。根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選方式,上述酶解物的平均分子量為300 50,000。根據(jù)本發(fā)明的另一方式,提供一種皮膚外用組合物,其包含本發(fā)明的人表皮細胞增殖促進劑。該組合物優(yōu)選用于皮膚護理,更優(yōu)選用于調(diào)理肌膚的紋理,改善肌膚或皮膚的狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明的另一更優(yōu)選方式,本發(fā)明的皮膚外用組合物為化妝品。根據(jù)本發(fā)明的另一進一步優(yōu)選方式,本發(fā)明的皮膚外用組合物為洗劑(lotion)、乳液、皮膚護理用膏(cream)、保濕液、唇膏(lip cream)、美容液面膜、或洗顏料。根據(jù)本發(fā)明的另一方式,提供燕窩的酶解物在制造人皮膚表皮細胞增殖促進劑中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方式,提供燕窩的酶解物在制造皮膚護理用的皮膚外用組合物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的再另一方式,提供一種人皮膚表皮細胞的增殖促進方法,其包含將有效量的作為本發(fā)明的有效性成分的酶解物應(yīng)用于人的皮膚。根據(jù)本發(fā)明的再另一個方式,提供一種皮膚護理方法,其包含將有效量的本發(fā)明的有效成分應(yīng)用于人的皮膚。同樣地,提供一種調(diào)理肌膚的紋理、提高或改善肌膚的狀態(tài)的方法,其包含將有效量的本發(fā)明的有效成分應(yīng)用于人的皮膚。
根據(jù)本發(fā)明,通過使用燕窩的酶解物作為有效成分,與以往相比可以顯著地促進人皮膚表皮細胞增殖。此外通過基于該人皮膚表皮細胞增殖促進能力,將酶解物用于皮膚外用用途或化妝品用途,可以維持皮膚中的更新周期或恢復(fù)周期的延遲,調(diào)理肌膚的紋理,維持或改善肌膚或皮膚的狀態(tài)。這樣根據(jù)本發(fā)明,可以實現(xiàn)消費者的QOL的提高。此外,由于所使用的酶解物使用也作為食用原材料眾所周知的燕窩,因此安全性高,消費者也易于接受。此外由于可以將燕窩直接進行酶處理來獲得酶解物,因此可以有效率地制造,并且制造成本也可以抑制地低。
圖I為顯示燕窩樣品中的唾液酸量的測定結(jié)果的圖。圖2為顯示燕窩樣品中的蛋白質(zhì)的量的測定結(jié)果的圖。圖3為顯示由GPC - HPLC得到的燕窩酶解物I的測定結(jié)果的圖。
圖4為顯示由GPC - HPLC得到的燕窩酶解物2的測定結(jié)果的圖。圖5為顯示實施例(3)的結(jié)果的圖。圖6為顯示實施例(4)的結(jié)果的圖。
具體實施例方式人皮膚表皮細胞增殖促進劑和有效成分關(guān)于本發(fā)明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑,如上所述,以燕窩的酶解物作為有效成分。作為酶解物的原料的燕窩是穴燕使自己的唾液成為絲狀而作成的巢,作為其成分,大量包含糖蛋白,幾乎不包含脂質(zhì)。這里所謂穴燕,是指屬于雨燕科(Apodidae)的金絲燕屬(Collocalia)的燕類,可舉出例如,小灰腰金絲燕(Apodidae Collocalia francica)、苔巢金絲燕(Apodidae Collocalia salanRana)、爪睡金絲燕(Apodidae CollocaliafuciphaRa)、灰腰金絲燕(Apodidae Collocalia inexpectata)、褐腰金絲燕(ApodidaeCollocalia vestita)、白腹金絲燕(Apodidae Collocalia esculenta)、大金絲燕(Apodidae Collocalia maximus)等。在本發(fā)明中,燕窩可以使用市售品。在一般市售的燕窩中,具有從僅除去毛、糞等污物再洗滌而得的燕窩到收集燕窩的碎料進行反復(fù)漂白和洗滌而成形的燕窩等多個種類,但本發(fā)明中所用的燕窩優(yōu)選使用在前處理中沒有進行過度的洗滌、漂白等的燕窩。所謂燕窩的酶解物,是指應(yīng)用酶反應(yīng)將燕窩分解而得的物質(zhì),可以通過使用蛋白酶、包含蛋白酶的復(fù)合酶等對燕窩或其處理物進行分解來獲得。這里作為分解處理中使用的酶,優(yōu)選為蛋白酶,更優(yōu)選為胰酶。燕窩的酶解物通常可以如下獲得首先實施加熱殺菌處理,然后在水中進行酶處理。殺菌處理的條件可以適當參考慣用的加熱殺菌條件來設(shè)定,酶處理的條件也可以根據(jù)所使用的酶的種類、燕窩的狀態(tài)來適當設(shè)定。如果舉出更具體的例子,則燕窩的酶解物可以如下調(diào)制。例如,向粉碎后的燕窩中添加其質(zhì)量的10 50倍的水并使其膨脹,然后在60 130°C加熱殺菌處理5秒 30分鐘。然后,直接添加適量的酶,在酶的最適pH、最適溫度進行O. 5 48小時酶反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后,通過加熱處理等使酶失活,過濾反應(yīng)液而除去不溶物,從而可以獲得燕窩的酶解物。此外,該酶解物可以根據(jù)需要干燥而粉末化。另外,在上述的各工序中,可以進行適當PH調(diào)整、脫色、脫臭等操作。作為其它例,在將燕窩的處理物進行酶解的情況下,向粉碎成粒徑2mm以下、優(yōu)選150 μ m以下的燕窩中添加其質(zhì)量的10 100倍的水,在I 60°C靜置或攪拌O. 5 48小時使其膨脹,然后在60 130°C加熱殺菌處理5秒 30分鐘,根據(jù)需要進行過濾,將所得的溶液與上述同樣地操作進行酶處理,從而可以獲得燕窩的酶解物。在酶解物的調(diào)制法中,酶反應(yīng)的時間越長,則蛋白質(zhì)的分解越進展,獲得包含更低分子的蛋白質(zhì)的酶解物。在本發(fā)明中,使酶反應(yīng)時間為O. 5 48小時、優(yōu)選為O. 5 36小時、更優(yōu)選為3 36小時、進一步優(yōu)選為約24小時左右,優(yōu)選進一步進行了酶反應(yīng)的酶解物。這樣獲得的燕窩的酶解物的分子量優(yōu)選為70 200,000,更優(yōu)選為70 180,000。進一步優(yōu)選分子量為70 150,000,進一步更優(yōu)選為70 120,000。 此外期望燕窩的酶解物的平均分子量(重均分子量)為300 100,000,優(yōu)選為300 70,000。更優(yōu)選平均分子量為300 50,000。皮膚外用組合物本發(fā)明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑可以單獨地直接使用,但也可以作為添加劑包含于化妝品、藥品、準藥品等各種皮膚外用組合物中,可以獲得具有人皮膚表皮細胞的增殖促進效果的組合物。所得的組合物可以有效地用于皮膚護理,優(yōu)選調(diào)理肌膚的紋理,改善或維持肌膚或皮膚的狀態(tài)。作為本發(fā)明的有效成分的燕窩的酶解物具有實際上使EGF - R表達皮膚構(gòu)成細胞增殖的效果,該效果與燕窩的酶解物的非添加組和燕窩的熱水提取物組相比是顯著的(后述的實施例I的試驗結(jié)果)。此外作為本發(fā)明的有效成分的燕窩的酶解物顯示將EGF受體(EGF - R)實際上磷酸化的效果(后述的實施例2的試驗結(jié)果)。EGF — R被磷酸化,表示燕窩的酶解物實際上保持作為EGF - R的配體的作用,即,實際上保持EGF樣的作用。因此,在本發(fā)明中,所謂人皮膚表皮細胞增殖促進活性,是指可以使人皮膚表皮細胞實際上增殖。可以認為燕窩的酶解物中包含可以作為EGF受體的配體起作用的成分,并認為其結(jié)果是促進EGF活性,促進表皮細胞的增殖。另外這是理論,并不限定本發(fā)明。因此,根據(jù)本發(fā)明,通過使用燕窩的酶解物,可以期待EGF樣的效果,其結(jié)果是可以促進表皮中的細胞增殖,可以維持表皮中的更新的周期或恢復(fù)周期的延遲而提高人皮膚的新陳代謝。由此,明確了對于調(diào)理肌膚的紋理,改善和提高肌膚、皮膚的狀態(tài)而言是有效的。此外可以說也能夠達到皮膚的狀態(tài)的惡化的預(yù)防效果。另外,在本說明書中,所謂肌膚或皮膚的狀態(tài)的“改善或維持”,以包含該狀態(tài)的提聞、調(diào)節(jié)、狀態(tài)惡化的延遲或緩和等的意思使用。因此如上所述,根據(jù)本發(fā)明的另一方式,提供包含本發(fā)明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑的皮膚外用組合物。優(yōu)選皮膚外用組合物作為藥品、準藥品、或化妝品被提供,更優(yōu)選作為化妝品被提供。在本發(fā)明的皮膚外用組合物(特別是化妝品)中,作為有效成分的燕窩酶解物的含量(干物換算)沒有特別限制,根據(jù)組合物的形態(tài)的不同而不同,但是一般作為固體成分,為O. OOl 20重量%、優(yōu)選為O. 005 5重量%的范圍,可以根據(jù)組合物的形態(tài)進行適
當變更?;蛘撸景l(fā)明的皮膚外用組合物中的燕窩酶解物的含量(干物換算)優(yōu)選以可以以每I日O. OOlmg以上、更優(yōu)選為O. OOlmg Img應(yīng)用于每I平方cm的皮膚的方式包含。只要本發(fā)明的皮膚外用組合物包含有效成分,并且不損害人皮膚表皮細胞增殖促進效果,則本發(fā)明的促進劑可以進一步包含其它任意成分。作為這樣的任意成分,可舉出例如,皮膚外用劑、化妝品中慣用的各種成 分,例如,保濕劑、低級醇、多元醇、糖類、表面活性齊U、緩沖劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、抗氧化劑、防腐防菌劑、螯合劑、PH調(diào)節(jié)劑、香料、色素、紫外線吸收劑、紫外線散射劑、維生素類、氨基酸類、抗炎劑、水、肽、糖醇類、酶類、植物提取物類、抗氧化物質(zhì)類、滑石、粘土、花粉、珍珠等。這里作為保濕劑,可舉出例如,聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等酸性粘多糖類、氨基酸、膠原、膠原肽、彈性蛋白等。作為低級醇,可舉出例如,乙醇、丙醇、異丙醇等。作為多元醇,可舉出例如,甘油、季戊四醇、二季戊四醇、乙二醇、丙二醇、聚丙二醇、1,3 —丁二醇等。作為糖類,可舉出例如,葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、木糖、D 一葡糖醛酸、蔗糖、葡糖胺、半乳糖胺、D —山梨糖醇、失水山梨糖醇、纖維素、淀粉等糖類、寡糖類、多糖類和它們的衍生物等。關(guān)于本發(fā)明的皮膚外用組合物,通過將包含燕窩酶解物的人皮膚表皮細胞增殖促進劑和上述那樣的任意成分根據(jù)公知的方法適當配合進行調(diào)整,可以制成洗劑、乳液、皮膚護理用膏(例如,雪花膏、營養(yǎng)膏、燒傷膏)、保濕液、面膜劑(例如,美容液面膜)、化妝水、洗顏料、爽身水(body lotion)、潤體霜(body cream)等各種化妝品中慣用的制品形態(tài)。本發(fā)明的皮膚外用組合物還可以用作粉底(foundation)類、唇膏(lip cream)、口紅(lipstick)、眼影(eye shadow)、腮紅等彩妝化妝品、防曬用制品、防臭化妝品等藥用化妝品、香波(shampoo)、護發(fā)素(hair rinse)、整發(fā)料等頭發(fā)用化妝品、皮膚洗滌劑、浴用制劑的浴用化妝品等。根據(jù)本發(fā)明的再另一個方式,如上所述,提供人皮膚表皮細胞的增殖促進方法,其包含將有效量的作為本發(fā)明的有效成分的酶解物應(yīng)用于人的皮膚。另外這里所謂“有效量”,是指根據(jù)應(yīng)用,對于在體內(nèi)的所期望區(qū)域中能夠發(fā)揮人皮膚表皮細胞增殖促進活性而言充分的量。此外,根據(jù)本發(fā)明的再另一個方式,如上所述,提供皮膚護理方法,其包含將有效量的本發(fā)明的有效成分應(yīng)用于人的皮膚。同樣地,還提供調(diào)理肌膚的紋理、提高或改善肌膚的狀態(tài)的方法,其包含將有效量的本發(fā)明的有效成分應(yīng)用于人的皮膚。另外這里所謂“有效量”,是指對于獲得所期望的效果而言充分的量。另外在本說明書中,使用了“約”和“左右”的值的表達意味著,在達成設(shè)定該值的目的的基礎(chǔ)上,包含本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容許的值的變化。意味著例如,可以容許規(guī)定的值或范圍的20%以內(nèi)、優(yōu)選為10%以內(nèi)、更優(yōu)選為5%以內(nèi)的變化。實施例基于以下的例子具體地說明本發(fā)明,但本發(fā)明不限定于這些例子。
(I)燕窩樣品的調(diào)制(1-1)燕窩酶解物I將市售的無漂白的燕窩用粉碎機進行粉碎,獲得100目通過(粒徑150μπι以下)的燕窩粉末,向該燕窩粉末中添加約50倍量(質(zhì)量)的水,在5°C膨脹20小時,然后在121°C加熱殺菌處理15分鐘。將所得的處理液冷卻,然后調(diào)整pH,添加相對于燕窩粉末為2質(zhì)量%的量的含有蛋白酶的酶(商品名“ ^ ^ > 7 f > F”,天野制藥株式會社制),在45°C反應(yīng)3小時。將該酶反應(yīng)液調(diào)整至pH7. 0,然后在90°C加熱5分鐘,使酶失活,過濾,回收濾液(水溶性組分)。濃縮該濾液,然后冷凍干燥,獲得“燕窩酶解物I ”。(1-2)燕窩酶解物2 除了使酶反應(yīng)的時間為24小時以外,與上述(1-1)項的酶解物I同樣地進行,獲得“燕窩酶解物2”。(1-3)燕窩熱水提取物(比較例I將市售的無漂白的燕窩(干燥物)40g用粉碎機進行粉碎,將該粉碎物添加至IOOOml的蒸餾水中,在加熱回流下進行提取處理2小時。加熱回流后,靜置,然后分取上清液并過濾,回收濾液。對于殘渣進一步與上述同樣地添加至IOOOml的蒸餾水中,在加熱回流下進行再提取處理,然后將固體物質(zhì)殘渣通過過濾而除去,回收濾液。合并所得到的濾液(提取液),在減壓下濃縮,冷凍干燥所得的濃縮物,獲得黃白色的“燕窩熱水提取物”(比較例)。(2)燕窩樣品的分析如下測定所得的各燕窩樣品(燕窩酶解物I、燕窩酶解物2和燕窩熱水提取物)中的唾液酸量和蛋白質(zhì)的量。關(guān)于唾液酸的量,在將各試樣酸水解后,采用高效液相色譜作為游離N —乙酰神經(jīng)氨酸進行測定。關(guān)于蛋白質(zhì)的量,使用基于Brad ford法的Bio Rad社的蛋白質(zhì)測定試劑盒進行測定。結(jié)果如圖I和圖2所示。接下來,為了測定燕窩酶解物I和燕窩酶解物2所包含的蛋白質(zhì)的分子量及其分布,采用下述那樣的條件利用GPC進行分析。[HPLC的測定條件]·柱Shodex Asahipak GS320HQ(Φ 7. 6 X 300mm)·柱溫度35°C·流動相50mM CH3COONH3 pH6. 7·流速0. 4ml/ 分鐘·試樣進樣量10 μ I·檢測器紫外分光檢測器(在UV220nm測定)[使用的分子量標準(marker)]· BSA MW 66,000· Gly-gly MW 132. I
· Gly-gly-gly MW 189.17· L-天冬氨酸 MW133. I· DL-天冬氨酸 MW 150. I· N-乙酰神經(jīng)氨酸MW 309. 3測定結(jié)果如圖3和圖4所示。此外,關(guān)于燕窩酶解物所包含的蛋白質(zhì)的分子量,使用蛋白質(zhì)印跡法進行評價。具體而言,首先,按照上述的測定法,確認了燕窩酶解物中的蛋白質(zhì)的量。將來源于燕窩酶解物的蛋白質(zhì)(100 μ g),使用SDS - PAGE,通過10 15%的聚丙烯酰胺進行分離。將凝膠中展開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至免疫印跡PVDF膜(聚1,I-二氟乙烯,由Bio-Lad Lab社獲得)。將PVDF膜在包含3%脫脂奶和O. l%Tween-20的PBS中封閉I小時,進行視覺判定。
另夕卜,在蛋白質(zhì)的分子量的評價時,公知文獻(Guo, C. T.,Suzuki Y.,etal. ,Antiviral Res. 70, pp. 140-146(2006)中顯示的數(shù)據(jù)也作為參考。由這些結(jié)果可知,燕窩酶解物中所包含的蛋白質(zhì)分子量在約70 120,000左右(另外根據(jù)評價條件,有時上限值為200,000左右)的范圍存在。此外,由所得的結(jié)果可知,燕窩酶解物I中的蛋白質(zhì)的平均分子量為約55,000。此外可知,燕窩酶解物2中的蛋白質(zhì)的平均分子量為約33,000。(3)酶處理燕窩的細胞增殖促進活性使用EGF - R表達皮膚構(gòu)成細胞來研究酶處理燕窩的EGF樣作用,即,細胞增殖促進活性。(i)材料細胞使用由ATCC購入的來源于人表皮(皮膚)的EGF — R表達細胞A431細胞。作為燕窩酶解物,使用按照上述(I)獲得的燕窩酶解物I (酶處理3小時)、燕窩酶解物2 (酶處理24小時)以及燕窩熱水提取物。(ii)實驗方法利用添加了 3%FCS的DME培養(yǎng)基,在調(diào)整至5X IO4個細胞/ml的A431細胞中,以下述各種濃度添加燕窩酶解物或燕窩熱水提取物,利用96孔平底板以5X IO3個細胞/lml/孔進行培養(yǎng)。最終添加濃度·燕窩熱水提取物(heart) :1%、0· 1%、0· 01%·燕窩酶解物 I (Enzl) :1%、0· 1%、0· 01%·燕窩酶解物 2 (Εηζ2) :1%、0· 1%、0· 01%此外,作為對照,準備既未添加燕窩酶解物也未添加r - EGF的非添加組,進行培養(yǎng)。經(jīng)時地使用Cell Counting Kit 一 8(同仁化學研究所社制)(氣胸腺卩密唳核苷(tritium thymidine)的攝取試驗的代替法)研究細胞的增殖,調(diào)查EGF樣作用的有無。結(jié)果是,作為在460nm附近具有極大吸收的水溶性甲臜的色素量,以ABS (吸光度,absorbance)顯不。結(jié)果如圖5所示。由結(jié)果可知,明確劃分成與非添加對照組(A431/3%FCS)相比細胞的增殖被抑制的組和被增殖的組。燕窩酶解物I和燕窩酶解物2的添加組(特別是O. 1%和O. 01%的濃度)中都確認了明確的增殖促進效果。另一方面,對于燕窩熱水提取物的1%添加組,即使與非添加對照組相比,細胞增殖也被極端地抑制。即使在燕窩熱水提取物的O. 1%添加組和O. 01添加組中,細胞增殖與非添加對照組相比也低。因此,燕窩酶解物促進細胞增殖,另一方面,關(guān)于燕窩熱水提取物,反而確認了抑制或阻害細胞增殖的傾向。(4)燕窩酶解物的EGF樣作用的驗證^GF — R磷酸化的研討)將EGF - R表達皮膚構(gòu)成細胞的EGF受體磷酸化作為指標研討燕窩酶解物的EGF樣作用。 ⑴材料細胞使用由ATCC購入的來源于人表皮(皮膚)的EGF — R表達細胞A431細胞。作為燕窩酶解物,使用按照上述(I)獲得的燕窩酶解物I (酶處理3小時)和燕窩酶解物2 (酶處理24小時)。作為陽性對照,使用人重組型EGF(r 一 EGF)(由Protein Express獲得)。EGF — R的磷酸化使用Active EGF receptor EIA試劑盒(Takara社)進行測定。(ii)細胞培養(yǎng)利用添加了 3%FCS的DME培養(yǎng)基,分別在調(diào)整至5X IO4個細胞/ml的A431細胞中,以下述各種濃度添加燕窩酶解物和作為陽性對照的r 一 EGF,利用24孔平底板以5X IO4個細胞/lml/孔進行培養(yǎng)。最終添加濃度·燕窩酶解物 I (Enzl) 0. 1%、0· 01%·燕窩酶解物 2 (Εηζ2) :0· 1%、0· 01%· r — EGF 0. 15ng/ml此外,作為對照,準備既未添加燕窩酶解物也未添加r - EGF的非添加組,進行培養(yǎng)。(iv)檢體的調(diào)整和測定在從培養(yǎng)10小時至50小時(數(shù)據(jù)為10 34小時)期間,經(jīng)時地回收細胞,使用附屬于測定試劑盒的受體提取用緩沖液,調(diào)整檢體。除去培養(yǎng)上清液,然后以50 μ I/孔添加受體提取用緩沖液,使用細胞刮刀(Cell Scraper)刮取細胞,將2孔份的細胞提取液集中在I. 5ml用的微量離心管中。在4°C、IOOOOrpm的條件下離心5分鐘,使細胞不溶物沉淀,將提取上清液在一 80°C冷凍保存直至測定。將冷凍保存的提取上清液溶解,使用檢體稀釋液分別稀釋至10倍,按照ActiveEGF receptor EIA試劑盒的測定法進行測定。結(jié)果利用由磷酸化EGF受體標準液得到的標準曲線算出,以EGF受體中的磷酸化酪氨酸數(shù)(fmol/L)表示。結(jié)果如圖6所示。在直至培養(yǎng)34小時的研討中,與非添加對照組(Cont)相比,EGF — R的磷酸化都增強了。燕窩酶解物2的O. 1%和O. 01%添加濃度組(分別為Enz20. 1%,Enz20. 01%)的EGF - R的磷酸化數(shù)與作為陽性對照的r - EGF的O. 15ng/ml添加組(r 一 EGFO. 15ng)相比,都顯示高的值。在燕窩酶解物I的O. 1%添加組(EnzlO. 1%)中,非常早地(10小時)確認了 EGF - R的磷酸化的增強。 由結(jié)果暗示了,燕窩酶解物I和燕窩酶解物2都以O(shè). 1%和O. 01%的添加濃度促進EGF - R的磷酸化,對于表皮細胞(A431細胞)的增殖帶來影響。
權(quán)利要求
1.一種人皮膚表皮細胞增殖促進劑,其以燕窩的酶解物作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人表皮細胞增殖促進劑,酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的人表皮細胞增殖促進劑,酶解物的分子量為70 200,000。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3的任一項所述的人表皮細胞增殖促進劑,酶解物的平均分子量為 300 50,000。
5.一種皮膚外用組合物,其包含權(quán)利要求I 4的任一項所述的人表皮細胞增殖促進劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物,其用于皮膚護理。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合物,其用于調(diào)理肌膚的紋理,改善肌膚或皮膚的狀態(tài)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7的任一項所述的組合物,其為化妝品。
9.根據(jù)權(quán)利要求5 7的任一項所述的組合物,其為洗劑、乳液、皮膚護理用膏、保濕液、唇膏、或美容液面膜、洗顏料。
10.燕窩的酶解物在制造人皮膚表皮細胞增殖促進劑中的應(yīng)用。
11.燕窩的酶解物在制造皮膚護理用的皮膚外用組合物中的應(yīng)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用,皮膚外用組合物用于調(diào)理肌膚的紋理,提高或改善肌膚的狀態(tài)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10 12的任一項所述的應(yīng)用,酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。
14.根據(jù)權(quán)利要求10 13的任一項所述的應(yīng)用,酶解物的分子量為70 200,000。
15.根據(jù)權(quán)利要求10 14的任一項所述的應(yīng)用,酶解物的平均分子量為300 50,OOO0
16.根據(jù)權(quán)利要求11 15的任一項所述的應(yīng)用,皮膚外用組合物為化妝品。
17.一種人皮膚表皮細胞的增殖促進方法,其包含將有效量的酶解物應(yīng)用于人的皮膚。
18.一種皮膚護理方法,其包含將有效量的酶解物應(yīng)用于人的皮膚。
19.一種調(diào)理肌膚的紋理、提高或改善肌膚的狀態(tài)的方法,其包含將有效量的酶解物應(yīng)用于人的皮膚。
20.根據(jù)權(quán)利要求17 19的任一項所述的方法,酶解物為利用蛋白酶得到的分解物。
全文摘要
本發(fā)明的人皮膚表皮細胞增殖促進劑以燕窩的酶解物作為有效成分。根據(jù)本發(fā)明,提供可以有效率地生產(chǎn),并且安全性高的優(yōu)異的人皮膚表皮細胞增殖促進劑,以及包含該人皮膚表皮細胞增殖促進劑的外用劑和化妝品。
文檔編號A61P17/00GK102821751SQ201180014048
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者武川和琴, 藤村響男 申請人:康貝株式會社, 學校法人 北里研究所