專利名稱：含有圓葉蔦蘿提取物的糖尿病治療用藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有圓葉蔦蘿提取物的用于治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，更具體地說，涉及一種圓葉蔦蘿提取物和含有該圓葉蔦蘿提取物的用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物、用于預防或延遲老化的藥物組合物以及用于預防或治療癌癥的組合物。
背景技術：
糖尿病(diabetes)是指由多種病因引起的代謝紊亂，臨床特征為因胰島素分泌缺陷或胰島素作用缺陷所導致的慢性高血糖癥(hyperglycemia)，當血液中的葡萄糖濃度長期持續(xù)異常高的狀態(tài)時，由于慢性代謝紊亂和因其引發(fā)的慢性血管損傷，導致各種并發(fā) 癥。糖尿病為典型的成人代謝性疾病，全世界人口中約5%患此疾病，由此導致的生命和經濟損失巨大。大部分糖尿病患者服用口服藥治療制劑，但目前的現狀是，尚未開發(fā)出安全的治療藥物。雖然胰島素抵抗性(insulin resistance)被視為最重要的原因,但準確的機制尚不明確，只知道由于遺傳因素和環(huán)境的復合原因所導致。糖尿病是世界第三大疾病，預計到2010年會有約2億5千萬的糖尿病患者，預計韓國國內的患病率也會持續(xù)上升。在韓國國內的死亡原因中,糖尿病死因排名第7。占糖尿病患者總人數的90%以上的非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin dependent diabetes,NIDDM)，主要發(fā)生在四十歲以上的中年人身上，因此，稱為成人型糖尿病，是患者無法充分生成胰島素或不能適當利用胰島素而引起的代謝紊亂。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的發(fā)病原因尚未明確，但是，西洋化的飲食生活和生活方式等環(huán)境因素、以及肥胖和缺乏運動等遺傳因素都認為是其原因。通常，首先以飲食療法和運動療法治療非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)，若此療法效果不佳時，通常采用藥物治療，大多數情況下都使用胰島素。胰島素適用于通過飲食療法和口服降糖藥無法調節(jié)血糖的患者，但是，由于胰島素是蛋白質，會在消化道被水解成非活性化，因此，存在著不能口服吸取，只能通過靜脈注射或皮下注射來吸取的缺點?？诜堤撬幠軌蛱岣呒毎囊葝u素受體的敏感度，并刺激胰腺而促進胰島素的分泌，因此，用于調節(jié)非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)患者的血糖。但是，用于治療非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的口服療法有可能導致低血糖癥、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹等，特別是，會導致致命的乳酸酸中毒等嚴重的副作用。此外，長期使用口服降糖藥會引起心血管系統障礙或胃腸及肝的障礙，因此，建議不要長期使用。因上述缺陷和副作用，在目前的治療劑中，還幾乎沒有既具有令人滿意的效果，而且安全性高并在副作用方面也令人放心從而適用于所有糖尿病患者的藥物，因此，迫切需要開發(fā)出治療糖尿病、特別是對非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)有更顯著效果的藥物。通常，患糖尿病10年后，體內大部分器官均受到損傷而并引發(fā)并發(fā)癥。在這些并發(fā)癥中，作為急性并發(fā)癥，有低血糖癥、酮癥酸中毒、高滲性非酮癥高血糖、高血糖性昏迷、糖尿病酸中毒、低血糖癥等；作為慢性并發(fā)癥，有糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病腎病、糖尿病性神經障礙、心血管系統并發(fā)癥、病毒感染等。慢性糖尿病腎病是血液透析治療和末期腎功能衰竭的最重要原因，而糖尿病性白內障會導致失明，最終導致死亡。引發(fā)上述糖尿病并發(fā)癥的機制,大體分為蛋白質的非酶糖化反應(nonenzymaticglycation ofproein)和多兀醇代謝通路(polyol pathway)等。蛋白質的非酶糖化反應(nonenzymatic glycation of protein)是指,蛋白質的賴氨酸殘基等氨基酸基團與還原糖在沒有酶的作用下發(fā)生的縮合反應即美拉德反應，作為該反應的結果，產生糖化終產物。蛋白質的非酶糖化反應分為以下兩個階段(1)蛋白質的賴氨酸殘基等氨基酸基團和還原糖的醛基或酮基在沒有酶的作用下發(fā)生親核加成反應而形成初產物即錫夫氏堿(Schiff base),該錫夫氏堿與相鄰的酮胺加成物(ketoamineadduct)相互縮合而生成可逆性阿馬多里(amadori)型初期糖基化產物；(2)由于持續(xù)高血糖狀態(tài)，從而可逆性阿馬多里(amadori)初期糖基化產物不發(fā)生分解而被重排(rearrangement)并與蛋白質發(fā)生交聯(cross-linking),由此生成非可逆性的糖化終產物。不同于可逆性的阿馬多里型初期糖基化產物，糖化終產物是非可逆性的反應產物，一旦被生成，即使血糖恢復正常也不會被分解，并在蛋白質的生存期間蓄積在組織內，從而使組織結構和功能發(fā)生異常變化，在組織各處引起并發(fā)癥。例如，由葡萄糖和各種蛋白質反應而生成的糖化終產物之一的糖化白蛋白，是引起慢性糖尿性腎病的重要因素。與未糖化的正常白蛋白相比，糖化白蛋白更容易導入到腎小球細胞內，而高濃度的葡萄糖將刺激腎小球系膜細胞，從而加大細胞外基質 (extracellular matrix)的合成。因過度導入的糖化白蛋白和增加的細胞外基質，引起腎小球的纖維化。由于上述原因，腎小球持續(xù)受到破損，最終只能采用血液透析或器官移植等極端方法。另外，有報告稱，由于慢性糖尿，糖化終產物在動脈壁與膠原蛋白相結合，而在腎小球與基底膜蛋白相結合，從而堆積在組織中。如上所述，由于蛋白質非酶糖化反應，在基底I旲、血楽■白蛋白、水晶體蛋白質、纖維蛋白、膠原蛋白等蛋白質中發(fā)生糖化，生成的糖化終產物使組織結構和功能發(fā)生異常變化，從而引發(fā)糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、糖尿病白內障(diabeticcataract)、糖尿腎病(diabetic nephropath)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)等慢性糖尿病并發(fā)癥。因此，為了延遲、預防或治療糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病，抑制糖化終產物的形成是非常重要的。另外，糖化終產物導致血管內皮細胞生長因子VEGF mRNA和蛋白質的過度表達，從而引發(fā)非增殖性或增殖性的糖尿病視網膜病變。非正常的新生血管形成或病理性(pathogenic)新生血管的生長與多數狀態(tài)有關。此狀態(tài)包括糖尿病視網膜病變、牛皮癬、滲出型或濕型(wet)老年黃斑變性(ARMD)、風濕關節(jié)炎和其他炎癥疾病以及大部分癌癥。在患有與此類狀態(tài)有關的疾病的組織或腫瘤中，VEGF表達為異常高的水平，提高了血管新生或血管透過性。特別是，ARMD在臨床上是重要的血管新生疾病。此疾病的特征在于，在老年人的一只或兩只眼睛的脈絡膜形成新生血管，在產業(yè)化國家中成為失明的主要因素。在各種治療療法中使用的抗-新生血管形成制劑只能引導VEGF或VEGF受體的化學量的減少，此類制劑的效果根據在患疾組織中以異常高的濃度形成的VEGF減弱。
為此，本發(fā)明人等為了尋求用于治療糖尿病及其并發(fā)癥且副作用小的天然生藥材進行了悉心的研究，結果發(fā)現圓葉蔦蘿(Quamoclit angulata)提取物可在人視網膜色素上皮細胞株中抑制VEGF，而且在胰腺P細胞株中起到促進胰島素分泌的作用，當向小鼠高脂肪飲食群和糖尿小鼠模型提供圓葉蔦蘿提取物時，能夠減小糖尿指標，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用于治療糖尿病及其并發(fā)癥的天然生藥材即原葉蔦蘿提取物。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，該藥物組合物含有上述原葉蔦蘿提取物。
本發(fā)明的又一目的在于，提供一種用于預防或延遲老化的藥物組合物，該藥物組合物含有上述圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種用于預防或治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物含有上述圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種上述圓葉蔦蘿提取物的制造方法。為了達成上述目的，本發(fā)明提供一種用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，該藥物組合物含有原葉蔦蘿提取物。本發(fā)明還提供一種用于預防糖尿病及其并發(fā)癥的保健功能食品，該保健功能食品含有圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明還提供一種用于預防或延遲老化的藥物組合物，該藥物組合物含有圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明還提供一種用于預防或延遲老化的保健功能食品，該保健功能食品含有圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明還提供一種用于預防或治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物含有圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明還提供一種圓葉蔦蘿提取物的制造方法，包括(a)切碎圓葉鳥蘿的全草后,通過由水、醇(Alcohol)、有機溶劑以及它們的混合物所組成的組中選出的溶劑進行提取，從而獲得提取液的步驟；以及(b)過濾上述提取液，并進行減壓濃縮而獲得圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明的特征在于，還包括(c)利用活性炭，對由上述(b)步驟得到的圓葉蔦蘿提取物進行分離提純，然后進行減壓濃縮而獲得圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明還提供一種圓葉蔦蘿提取物，該圓葉蔦蘿提取物是通過上述方法制造，并具有抑制VEGF效果、促進胰島素分泌效果、降低血糖效果、減少尿蛋白效果和降低水晶體混濁度的效果。本發(fā)明還提供一種預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的方法，包括對有需要的對象給予上述圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明還提供一種預防或延遲老化的方法，包括對有需要的對象給予上述圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明還提供一種預防或治療癌癥的方法，包括對有需要的對象給予上述圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明還提供上述圓葉蔦蘿提取物的治療或預防糖尿病及其并發(fā)癥的用途。本發(fā)明還提供上述圓葉蔦蘿提取物的預防或延遲老化的用途。本發(fā)明還提供上述圓葉蔦蘿提取物的預防或治療癌癥的用途。通過以下的詳細說明和權利要求書，能夠更明確本發(fā)明的其它特征和實施方式。


圖I是確認本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物在人視網膜色素上皮細胞株中抑制 VEGF(vascular endothelial growth factor)表達的圖。圖2是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物在人視網膜色素上皮細胞株中阻礙VEGF蛋白合成的圖。圖3是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物在小鼠的胰腺P細胞株中促進胰島素蛋白合成的圖表。圖4是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物對高脂肪飲食群小鼠體重的影響的圖。圖5是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物對高脂肪飲食群的糖尿并發(fā)癥模型動物血糖的抑制效果的圖。圖6是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物減少高脂肪飲食群的糖尿并發(fā)癥模型動物尿中的尿蛋白效果的圖。圖7是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物對糖尿模型動物血糖的抑制效果的圖。圖8是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物對糖尿模型動物的糖化血紅蛋白的抑制效果的圖。圖9是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物減少糖尿模型動物尿中的尿蛋白效果的圖。圖10是表示本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物降低小鼠水晶體渾濁度效果的圖。
具體實施例方式除非另有定義，本說明書中使用的所有技術用語和科學用語具有與本領域技術人員的通常理解相同的意義。本說明書中使用的命名法和以下所述的實驗方法是在該技術領域中廣為人知而且通常使用的方法。下面，更詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明的一實施方式涉及一種用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物和保健功能食品，該藥物組合物和保健功能食品含有圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明中涉及的圓葉鳥蘿(Quamoclit angulata)為管花目旋花科屬的一年生草質纏繞藤本，又稱圓葉留紅草。其原產地為熱帶美洲，主要作為觀賞植物來栽培，其特征是，藤的生長類似于牽?；ú⑾蜃罄p繞。全草的長度為3m左右。葉互生，葉柄長，并呈心形的圓狀。而且，葉頂端突然變尖，葉底部分的兩側端部呈尖角。通常，是在8 9月開花，花顏色是帶黃的紅色，在長長的花莖頂端生3 5朵花。其花朵模樣類似于縮小版的牽?；?，花萼和雄蕊各5個，雌蕊I個。其果實為蒴果近球形，且在9月成熟，保留花萼。與留紅草相似，但葉子沒有裂。本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物可通過公知的方法來制造。例如，可將水、醇、有機溶劑或它們的混合物作為溶劑來提取，優(yōu)選通過水或醇提取，另外，還可以利用活性炭進行分離提純。在本發(fā)明的一實施方式中，圓葉蔦蘿提取物是按如下所述的方法獲得對破碎的圓葉蔦蘿51g，利用溶劑并在常溫下，使用超聲波提取器每2小時提取15分鐘并持續(xù)進行2-3天，其中，所述溶劑是由水、醇、醇水溶液、有機溶劑和它們的混合溶液所組成的組中選擇的溶劑。然后，在常溫下，利用真空旋轉濃縮機對上述獲得的提取物進行減壓濃縮，用冷凍干燥機對所提取的殘留物進行干燥后，用水溶解，從而獲得圓葉蔦蘿提取物。另外，使上述得到的圓葉蔦蘿提取物通過填充有活性炭的柱子，從而吸附圓葉蔦蘿的有效成分，再用蒸餾水清洗填充有活性炭的柱子而去除非吸附成分。對如上所述的去除了非吸附成分并填充有活性炭的柱子，以連續(xù)或階段性地、并以提高濃度的方式供給10^50%(v/v)乙醇等有機溶劑，從而洗脫附著在活性炭的圓葉蔦蘿有效成分并進行分離提純，得到圓葉蔦蘿提取物。對如此提純過的圓葉蔦蘿提取物，利用真空旋轉濃縮機，在常溫 下進行減壓濃縮，再對該濃縮的提取物進行真空冷凍干燥后，用水溶解，得到溶解于水中的圓葉蔦蘿提取物。在本發(fā)明的一實施例中，作為糖尿的指標，確認了體重，血糖和蛋白尿。對由于高脂肪飲食而誘發(fā)了肥胖的小鼠，給予4周圓葉蔦蘿提取物的結果，確認了具有降血糖活性，且通過尿蛋白減少，確認了能夠減少作為糖尿病腎病的早期癥狀的蛋白尿，由此，確認了本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物能夠預防糖尿病。在本發(fā)明的另一實施例中，將圓葉蔦蘿提取物給予糖尿病小鼠(Male C57BL/KsDB/DB mouse) 12周的結果，確認了顯示降血糖活性，并確認了糖化血紅蛋白數值的降低。并且，通過尿蛋白的減少，確認了作為糖尿病腎病的早期癥狀的蛋白尿的減少，由此，確認了本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物能夠治療糖尿病。除此之外，通過小鼠肝毒性檢查，確認了本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物沒有引發(fā)肝中毒，因此，通過以適當的方式給予哺乳動物，能夠在無毒性的情況下以顯著性水平(Significance Level)改善、治療和預防糖尿病及其并發(fā)癥。在此，上述“預防或治療”是指，治療糖尿病及其并發(fā)癥、提前預防糖尿病及其并發(fā)癥、以及改善因糖尿病及其并發(fā)癥導致的健康狀態(tài)或使其好轉的所有情形。另外，圓葉蔦蘿提取物不僅預防或治療糖尿病，而且對由糖尿病引發(fā)的并發(fā)癥也有預防和治療的作用。作為上述并發(fā)癥，由慢性高血糖癥、動脈粥樣固化癥，微細血管病變，腎病，心臟病，糖尿病視網膜病變和除此以外的一個以上眼科疾病的組合所組成的組中選出。在本發(fā)明的另一實施例中，通過培養(yǎng)小鼠晶狀體，確認了本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物對糖尿病并發(fā)癥之一的白內障有抑制作用。在此，糖尿病包括1型糖尿病、II型糖尿病、年輕人中發(fā)病的成人型糖尿病、隱匿性自身免疫性糖尿病、胰腺糖尿病等所有種類的糖尿病，而且，除糖尿病之外，還包括作為與糖尿病有關聯的疾病即并發(fā)癥在上面所提及的高血糖癥(hyperglycemia),高膜島素血癥(hyperinsulinemia),內糖耐量異常(ompaired glucose tolerance),空腹血糖受損(impaired fasting glucose),血脂障礙(dyslipidemia),高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia)或抗膜島素性(insulin resistance)等。在此，眼科疾病除了糖尿病性視網膜病以外，還包括白內障，黃斑變性，外眼筋麻痹，虹膜睫狀體炎，視神經炎，青光眼，視網膜衰退，眼底出血，異常折射，結膜下出血，玻璃體積血等因糖尿病弓I發(fā)的所有眼科疾病。本發(fā)明的藥物組合物以圓葉蔦蘿提取物作為必要成分，可僅包含該圓葉蔦蘿提取物，也可以包含一種以上的藥物學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑而作為藥物組合物提供。也可以與已知的糖尿病及其并發(fā)癥的治療藥物加以混合而提供。本發(fā)明圓葉蔦蘿提取物的使用量因患者的年齡、性別和體重不同而不同，但通常一天的使用量為0. Ol^OOmg/kg，優(yōu)選為0. f40mg/kg，可一次性給藥，也可以分幾次給藥。另外，也可根據糖尿病及其并發(fā)癥的種類、嚴重程度、患者的年齡、體重、健康狀況、性別、給藥途徑以及治療期間等，以藥物學上的有效量包含在藥物組合物中。
上述“藥物學上可接受”是指，生理上被允許，并向人體提供時，通常不會引起胃腸障礙、眩暈癥等過敏反應或類似的反應的組合物。作為藥物學上可接受的載體，例如，可以舉出乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等口服給藥用載體；以及水、適宜的油、食鹽水、葡萄糖溶液和乙二醇等非口服給藥用載體。還可以包括穩(wěn)定劑、保存劑、填充齊IJ、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑和防腐劑等。作為優(yōu)選的穩(wěn)定劑，可舉出亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸等的抗氧化劑。作為優(yōu)選的保存劑，可舉出苯扎氯銨、羥苯甲酯或羥苯丙酯以及氯丁醇等。作為除此之外的藥物學上可接受的載體，可參考下述文
W (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed. , Mack PublishingCompany, Easton, PA, 1995)。另外，可通過本領域公知的方法將本發(fā)明的藥物組合物制成劑型，以向哺乳動物給藥后，實現活性成分的迅速、持續(xù)或延遲釋放。劑型可以為粉末、顆粒、片劑、乳劑、糖漿、氣霧劑、軟膏或明膠硬膠囊、滅菌注射液、滅菌粉末的形態(tài)。本發(fā)明的藥物組合物可通過各種途徑給予小鼠、大鼠、家畜、人等哺乳動物。給藥途徑可采用通常的所有方式，例如，可采用口服給藥、組織給藥、直腸給藥，或可通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、子宮內膜或腦血管內注射來給藥。另外，本發(fā)明的藥物組合物可與具有治療或預防糖尿病效果的公知的化合物并行地給藥。因此，本發(fā)明涉及治療或預防糖尿病及其并發(fā)癥的方法，該方法包括將上述含有圓葉蔦蘿提取物的藥物組合物以治療學上的有效量給予哺乳動物的步驟。另外，本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物還可以制成食品形態(tài)，以用于預防或改善糖尿病及其并發(fā)癥。因此，本發(fā)明還涉及作為有效成分含有本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物的食品組合物即保健功能食品。本發(fā)明的保健功能食品是食品組合物，包括功能性食品(Functional food)、營養(yǎng)補劑(nutritional supplement)、健康食品(health food)以及食品添加劑(foodadditives)等的所有形態(tài)。上述類型的保健功能食品可通過本領域的公知方法制成各種各樣的形態(tài)。例如，作為保健食品，可將本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物本身制成茶、果汁以及飲料的形態(tài)來飲用，或者對其進行顆粒化、膠囊化和粉末化而攝取。另外，作為功能性食品，可將本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物添加于以下食品等中而制造，所述食品是飲料(包括酒精飲料)、果實及其加工食品(例如水果罐頭、瓶裝食品、果醬、果凍等)，魚類、肉類及其加工食品(例如火腿、香腸、咸牛肉等)，面包和面類(例如切面(烏冬面)，蕎麥面、拉面、意大利面、通心粉等)，果汁、各種飲料、曲奇餅、飴糖、乳制品(例如奶油、干酪等)，食用植物油脂、人造奶油、植物蛋白質、蒸煮袋食品、冷凍食品、各種調味料(例如，醬、醬油、沙司等)等。本發(fā)明的另一實施方式涉及用于防止或遲延老化的藥物組合物和保健功能食品，其含有圓葉蔦蘿提取物。在與糖尿病及其并發(fā)癥有關的研究中，已報道過糖尿病與氧化應激(OxidativeStress，0S)有密切的關聯。糖尿病中出現的慢性高血糖通過葡萄糖的自動氧化、蛋白質糖化等各種途徑加大游離基的生成，并因反應性高的這些物質，提高了氧化應激。本發(fā)明的圓葉鳥蘿提取物通過抑制糖化終產物(advanced glycation end product, AGE)的生成,減少因上述異物質引發(fā)的氧化應激，從而能夠得到防止或延遲老化的效果。
如此的藥物組合物，可通過包含在上面提到的藥物學上可接受的載體、賦形劑等而制成，也可以與以往所公知的延遲或防止老化的物質相混合而制成。另外，根據老化程度、所需效果的程度，圓葉蔦蘿提取物的給予量可不同，也根據患者的年齡、性別、體重、給予期間等而不同，還可利用公知的技術制成各種形態(tài)的劑型，并可通過各種給藥途徑給予。因此，本發(fā)明涉及防止或延遲老化的方法，包括對有需要的對象給予本發(fā)明的上述圓葉蔦蘿提取物的步驟。另外，作為上述保健功能食品即食品組合物，包括功能性食品、營養(yǎng)補劑、保健食品、食品添加劑等的各種形態(tài)?？赏ㄟ^本領域公知的方法，制成各種形態(tài)，例如，如上所述地，可將圓葉蔦蘿提取物本身制成茶、果汁、飲料的形態(tài)，或者對其進行顆?；⒛z囊化、粉末化，或者將上述提取物添加于飲料、果實和加工食品，魚類、肉類及其加工食品，面包類、面類、調味料等各種食品中來進行制造。本發(fā)明的又一實施方式，涉及用于預防或治療癌癥的藥物組合物，其含有圓葉蔦蘿提取物。本發(fā)明的圓葉蔦蘿提取物通過抑制糖化終產物的生成，抑制因異物質引發(fā)的癌癥，從而能夠得到防止和/或治療癌癥的效果。已有報道稱糖化終產物會誘發(fā)老化和致癌物質(carcinogenesis) (Tokuda, H, et al. , Book of Abstract of 53rd GA Congressjoint with SIF, P076, 2005)，由于圓葉蔦蘿提取物阻礙VEGE的生成，由此能夠得到預防或治療癌癥的效果。在本發(fā)明中，上述癌癥是與由VEGF(vascular endothelial growth factor)引發(fā)的新生血管形成有關的疾患之一，作為癌癥的種類，例如包括肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等已知的所有種類的癌癥。另外，“預防或治療癌癥”是指通過阻礙VEGF的生成，能夠同時阻擋癌的增殖和轉移，進而能夠預防癌癥。如此的藥物組合物，可通過包含在上面提到的藥物學上可接受的載體、賦形劑等而制成，也可以與以往所公知的預防、治療癌癥的物質相混合而制成。另外，根據癌癥種類、癌癥的進展狀況，圓葉蔦蘿提取物的給予量可不同，也可根據患者的年齡、性別、體重、給予期間等而不同，還可利用公知的技術制成各種形態(tài)的劑型，并可通過各種給藥途徑給予。因此，本發(fā)明涉及治療和預防癌癥的方法，包括對有需要的對象給予本發(fā)明的上述圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明的又一實施方式涉及一種圓葉蔦蘿提取物的制造方法，包括(a)切碎圓葉鳥蘿的全草后,通過由水、醇(Alcohol)、有機溶劑以及它們的混合物所組成的組中選出的溶劑進行提取，從而獲得提取液的步驟；以及(b)過濾上述提取液，并進行減壓濃縮而獲得圓葉蔦蘿提取物的步驟。對上述(a)步驟中使用的有機溶劑而言，可使用公知的有機溶劑中的任一種，例如，可以使用己烷、醚、苯、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈等。雖然在本發(fā)明的實施例中使用了水和醇，但并不限定于這些。本發(fā)明的上述圓葉蔦蘿提取物的制造方法，其特征在于，還包括(c)利用活性炭，對由上述(b)步驟得到的圓葉蔦蘿提取物進行分離提純，然后進行減壓濃縮而獲得圓葉蔦蘿提取物的步驟。本發(fā)明的上述(C)步驟，是利用活性炭對圓葉蔦蘿的有效成分進行回收、過濾后加以減壓濃縮的步驟，這種利用活性炭的方法，可采用將上述在(b)步驟中進行減壓濃縮而獲得的濃縮液懸浮于水中，并通過填充有活性炭的柱色譜法、以50%乙醇作為流動相進行洗脫并分離純化的方法。 另外，本發(fā)明還涉及一種圓葉蔦蘿提取物，該圓葉蔦蘿提取物是通過上述方法制造，并具有抑制VEGF效果、降低血糖效果、促進胰島素表達效果和減少尿蛋白效果。實施例下面，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明。但只要是本領域技術人員，應該明白以下實施例僅用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不局限于下述的實施例。實施例I:圓葉蔦蘿提取物的制造圓葉蔦蘿是在濟州南郡安德面西光里采集，在室溫下，對51g圓葉蔦蘿，通過100%乙醇、并利用超聲波提取器每2小時提取15分鐘持續(xù)2 3天。提取后，對提取物用真空旋轉濃縮機在常溫下進行減壓濃縮后，對所提取的殘留物用真空冷凍干燥機進行干燥，并將干燥后的7g圓葉蔦蘿提取物，以0. 075mg/ml的濃度溶解于水中。實施例2:利用活性炭的圓葉蔦蘿提取物的制造將從濟州南郡安德面西光里采集的50g圓葉蔦蘿切碎，對上述切碎的圓葉蔦蘿以水為溶劑在室溫下用超聲波提取器每2個小時提取15分鐘并持續(xù)2 3天。過濾上述提取的提取液后，減壓濃縮得到濃縮液。將上述濃縮液懸浮于水中，并通過填充有活性炭的柱色譜法、以50%乙醇為流動相進行洗脫并分離純化，對上述分離純化的圓葉蔦蘿提取物進行減壓濃縮后，在5g濃縮的圓葉蔦蘿提取物中加水溶解至圓葉蔦蘿提取物的濃度達到20mg/ml o實驗例I:確認圓葉蔦蘿全草提取物對VEGF的抑制能力在通過由實施例I和實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物處理過的人視網膜色素上皮細胞株即ARPE 19細胞株上，確認了對引發(fā)糖尿病視網膜病變等糖尿病并發(fā)癥的血管內皮細胞生長因子(VEGF)的抑制能力。ARPE 19 細胞株(ATCC, USA)是在 DMEM ；F12media 中添加 10%FBS(Fetal bovineserum)而培養(yǎng)。為了在ARPE 19細胞株中誘導VEGF mRNA和蛋白質的表達，在600的板(plate)上以IX IO5Cell/板的濃度涂布細胞，并在DMEM low glucose media中添加10%FBS無血清而培養(yǎng)24小時后,替換為在DMEM low glucose media中添加了 25mM和30mM葡萄糖(glucose)的培養(yǎng)液，并以最終濃度達到0. g/ml的方式添加實施例I和實施例2的圓葉蔦蘿提取物后，為了確認對VEGF的mRNA表達的抑制能力，培養(yǎng)了 24小時，并為了確認VEGF蛋白質生成,培養(yǎng)了 72小時。此時,作為對照群，以通過5. 5mM葡萄糖(glucose)進行處理而VEGF未表達的細胞本身作為基準，確認通過25mM和30mM葡萄糖(glucose)進行處理時的VEGF表達程度，比較圓葉蔦蘿提取物對VEGF表達的抑制能力。實驗中使用的25mM及30mM葡萄糖(glucose)濃度，是在各實驗中使誘發(fā)VEGF的表達達到最佳的條件的濃度。(I)對VEGF mRNA表達的抑制效果為了在通過上述方法培養(yǎng)的ARPE 19細胞中分離總(total) RNA，在去除培養(yǎng)基后，使用TRIzol reagent (總RNA抽提試劑、Invitrogen, USA)進行分離，并利用序列號為1^2 的引物，實行 RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈反應，reverse transcriptase-poIymerasechain reaction),確認了 VEGF mRNA 的表達。其結果，如圖I表示，確認了在通過用實施例I中制造的圓葉蔦蘿提取物處理過的試驗群中，抑制了 VEGF mRNA的表達。
序列號I: TTGCCTTGCTGCTCTACCTC序列號2: AAATGCTTTCTCCGCTCTGA(2)對VEGF分泌蛋白質表達的阻礙功效獲取通過上述方法培養(yǎng)的ARPE19細胞的培養(yǎng)液，并利用VEGF ELISA試劑盒(R& D, UK)，測定所分泌的VEGF量。結果，如圖2表示，確認了在通過由實施例I和實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物處理過的試驗群中，減少了 VEGF表達。實驗例2:確認圓葉蔦蘿提取物對胰島素分泌的促進效果在通過由實施例I和實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物處理的小鼠胰腺P -細胞株即Min 6細胞株中，確認是否促進胰島素分泌。Min 6 (ATCC, USA)是在 HDMEM media 中添加 15%FBS (fetal bovine serum)而培養(yǎng)。為了在Min6細胞株中誘導胰島素表達，在96孔(well)板上以I X IO4ceIl/板濃度涂布細胞，并在DMEM high glucose media中添加15%FBS無血清培養(yǎng)72小時后，用PBS緩沖溶液洗滌，并在HBSS緩沖溶液中培養(yǎng)2小時后，換成添加了 25mM葡萄糖(glucose)的HBSS緩沖溶液，并以最終濃度達到0. g/ml的方式添加圓葉蔦蘿提取物后，為了確認是否促進了胰島素表達，培養(yǎng)了 2個小時。此時,作為對照群，以通過5. 5mM葡萄糖(glucose)進行處理從而胰島素未表達的細胞本身的胰島素作為基準點，確認通過25mM葡萄糖(glucose)進行處理時胰島素表達的程度，比較分析圓葉蔦蘿提取物對胰島素表達的促進。獲取通過如上所述的方法培養(yǎng)的Min6細胞的培養(yǎng)液，利用胰島素ELISA試劑盒(R & D, UK)，測定所分泌的胰島素的量。其結果，如圖3所示，能夠確認胰島素表達的增加，特別是，當為實施例2的利用活性炭制造的圓葉蔦蘿提取物的情況下，顯示出更高的胰島素分泌能力。實驗例3:測定用圓葉蔦蘿提取物處理的小鼠糖尿指標變化在正常的小鼠身上處理實施例I中制造的圓葉蔦蘿提取物，并作為糖尿指標，觀察體重、血糖和尿蛋白的變化。購買5周齡的小鼠(Male C57BL/6J, 19g, Core Tech Corp.,平澤)，在規(guī)定的溫度(25°C )和濕度(50%)下適應I周后用于實驗。小鼠按各群組4只分組，作為對照群，分為喂普通飼料的普通飲食群和喂高脂肪飼料的高脂肪飲食群，并作為飲用水提供普通水；作為試驗群，喂高脂肪飼料，并作為飲用水，提供將由實施例I制造的圓葉蔦蘿提取物以0.075mg/ml濃度稀釋的水。分別將對照群和試驗群飼養(yǎng)4周。每周測定體重和血糖的變化，另外，采取給藥4周后的尿樣，測定尿蛋白濃度。其結果，如圖4表示，攝取了圓葉蔦蘿提取物的試驗群的體重與高脂肪飲食群相t匕，有了顯著的減少。在血糖變化方面，高脂肪飲食群的血糖高于普通飲食群，但在高脂肪飲食中提供了以0. 075mg/ml濃度稀釋圓葉蔦蘿提取物的飲用水的群組中，顯示出了顯著的降血糖效果(圖5)。糖尿病患者中出現腎臟和心臟并發(fā)癥的情況常見。蛋白尿(proteinuria)的減少說明腎臟功能已恢復。用于觀察圓葉蔦蘿提取物對腎臟影響的尿蛋白分析，是采取給予圓葉鳥蘿提取物4周后的小鼠尿樣,并利用ELISA試劑盒(Exocel 1，America)來測定。其結果，如圖6所示，高脂肪飲食群的尿蛋白相對于普通飲食群高，但在高脂肪飲 食中提供了以0. 075mg/ml濃度稀釋圓葉蔦蘿提取物的飲用水的群組中，尿蛋白有顯著的減少。這說明改善了特別是因高脂肪飲食而在糖尿病小鼠中出現的腎功能，從而減少了尿蛋白濃度。實驗例4:通過圓葉蔦蘿提取物處理的糖尿病小鼠的糖尿病指標觀察試驗對正常小鼠和實際糖尿病小鼠給予實施例2中制造的圓葉蔦蘿提取物，確認作為糖尿指標的血糖，糖化血紅蛋白(血色素)及尿蛋白的變化。購買6周齡的小鼠(Male C57BL/6J mouse,，20g，中央實驗動物，首爾)和6周齡的糖尿病小鼠(Male C57BL/Ks DB/DB mouse，20g，中央實驗動物，首爾)，并在規(guī)定溫度(250C )和濕度(50%)下適應I周后，用于試驗中。小鼠按各群組5只分組，分為普通小鼠對照群、糖尿病小鼠對照群、對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋由實施例2制造的圓葉蔦蘿活性炭提取物的水的群組，并飼養(yǎng)12周。每2周測定血糖的變化，另外，每6周采取尿樣測定尿蛋白濃度，飼養(yǎng)12周后采取血液測定糖化血紅蛋白濃度。其結果，在血糖變化方面，如圖7表示，糖尿病小鼠對照群的血糖相對于普通小鼠對照群高，但在對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋圓葉蔦蘿活性炭提取物的水的群組中，顯示出明顯的降血糖效果。為了減少糖尿病患者身上引發(fā)的并發(fā)癥，最為重要的是維持適當的血糖值。由于在某個時間點測定的血糖值有可能因各種因素產生變化，因此，為了掌握長期的血糖控制趨勢，最廣泛使用的檢查為糖化血紅蛋白(HbAlc)。糖化血紅蛋白是紅細胞中正常存在的血紅蛋白與糖結合的形態(tài)，當血糖保持高水平時，糖化血紅蛋白值也升高。因糖化血紅蛋白反映2 4個月期間的平均血糖值，所以對掌握長期的血糖控制程度方面有用。為了確認圓葉蔦蘿活性炭提取物對糖化血紅蛋白的影響，對普通小鼠對照群、糖尿病小鼠對照群、以及對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋由實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物的水的群，每6周采取一次血液,并利用ELISA試劑盒(Cusabio biotech, Japan)進行測定。其結果，如圖8中所示，在糖化血紅蛋白值方面，糖尿病小鼠對照群相對普通小鼠對照群，血糖顯示出異常高的數值，但在對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋圓葉蔦蘿提取物的水的群中，與普通小鼠對照群類似地，顯示出明顯的降血糖功效。
糖尿病患者中出現腎臟和心臟并發(fā)癥的情況常見。蛋白尿(proteinuria)的減少說明腎臟功能已恢復。為了觀察圓葉蔦蘿提取物對腎臟的影響，實施尿蛋白分析實驗。采取給予實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物12周的小鼠的尿樣，并利用ELISA試劑盒(Exocell, America)進行測定。其結果，如圖9所顯示，糖尿病小鼠對照群的尿蛋白高于普通小鼠對照群的尿蛋白，但在對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋圓葉蔦蘿提取物的水的群中，顯示出尿蛋白數值明顯減少的效果。實驗例5:糖尿病小鼠的肝毒性檢查購買6周齡的小鼠和6周齡的糖尿病小鼠，并在規(guī)定溫度(25°C )和濕度(50%)下適應I周后，用于肝毒性檢查。小鼠按每群組5只分組，分為普通小鼠對照群、糖尿病小鼠對照群、對糖尿病小鼠 提供以0. lmg/ml濃度稀釋實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物的水的群組，并飼養(yǎng)12周。飼養(yǎng)12周以后，采取血液，測定丙氨酸轉氨酶濃度。丙氨酸轉氨酶為氨基酸的代謝酶，用作診斷及觀察過程的代表性檢查項目。保持丙氨酸轉氨酶的濃度，說明沒有肝損傷。為了確認圓葉蔦蘿提取物對肝的影響，飼養(yǎng)12周后，采取普通小鼠對照群、糖尿病小鼠對照群、對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物的水的群組的血液，并利用ELISA試劑盒(Cusabio biotech, Japan),測定丙氨酸轉氨酶濃度的變化。其結果，如下表I中所顯示，對糖尿病小鼠提供以0. lmg/ml濃度稀釋實施例2制造的圓葉蔦蘿提取物的水的群，顯示出與普通小鼠對照群類似的數值，因此，確認該提取物對肝沒有毒性。表I對糖尿病小鼠給藥12周后的肝毒性測定結果
群組丙氨酸轉氨酶濃度 1
小鼠對照群(C57BL/6L)35.97±2.73
糖尿病小鼠對照群(C57BL/KSDB/DB) ' 37.28土 1.89_
糖尿病小鼠試驗群(C57BL/KSDB/DB):
35.90±1.32
給予實施例2中制造的圓葉蔦蘿
(單位:IU/L)實驗例6:小鼠的肝毒性檢查購買6周齡的小鼠(Male C57BL/6J mouse, 20g,中央實驗動物，首爾)，并在規(guī)定溫度(25°C )和濕度(50%)下適應I周后，用于肝毒性檢查。小鼠按每群組5只分組，分為對照群、給予實施例2中制造的圓葉蔦蘿提取物的群，并以1000mg/kg濃度給藥3次后,采取血液,測定丙氨酸轉氨酶濃度。丙氨酸轉氨酶為氨基酸的代謝酶，用作診斷及觀察過程的代表性檢查項目。保持丙氨酸轉氨酶的濃度，說明沒有肝損傷。為了確認圓葉蔦蘿提取物對肝的影響，采取對照群、給予圓葉鳥蘿提取物的群的血液，并利用ELISA試劑盒(Cusabio biotech, Japan)進行測定。其結果，如下表2中所示，給予圓葉蔦蘿提取物的群組，顯示出與對照群類似的數值，由此確認該提取物對肝沒有毒性。表2小鼠毒性測定結果
權利要求
1.一種用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于，含有圓葉蔦蘿提取物。
2.如權利要求I所述的用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于，通過由水、醇、有機溶劑和它們的混合物所組成的組中選出的溶劑，提取所述提取物。
3.如權利要求I所述的用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于，所述并發(fā)癥是由慢性高血糖癥、動脈粥樣固化癥、微細血管病、腎病、心臟病、糖尿病視網膜病變和除此以外的一個以上眼科疾病的組合所組成的組中選出。
4.一種用于預防糖尿病及其并發(fā)癥的保健功能食 品，其特征在于，含有圓葉蔦蘿提取物。
5.如權利要求4所述的用于預防糖尿病及其并發(fā)癥的保健功能食品，其特征在于，通過由水、醇、有機溶劑和它們的混合物所組成的組中選出的溶劑，提取所述提取物。
6.如權利要求4所述的用于預防糖尿病及其并發(fā)癥的保健功能食品，其特征在于，所述并發(fā)癥是由慢性高血糖癥、動脈粥樣固化癥、微細血管病、腎病、心臟病、糖尿病視網膜病變和除此以外的一個以上眼科疾病的組合所組成的組中選出。
7.一種圓葉蔦蘿提取物的制造方法，包括 (a)切碎圓葉蔦蘿的全草后，通過由水、醇、有機溶劑和它們的混合物所組成的組中選出的溶劑進行提取，從而獲得提取液的步驟；以及 (b)過濾所述提取液，并進行減壓濃縮而獲得圓葉蔦蘿提取物的步驟。
8.如權利要求7所述的圓葉蔦蘿提取物的制造方法，其特征在于，還包括 (C)利用活性炭，對由所述(b)步驟獲得的圓葉蔦蘿提取物進行分離提純，然后進行減壓濃縮而獲得圓葉蔦蘿提取物的步驟。
9.如權利要求8所述的圓葉蔦蘿提取物的制造方法，其特征在于，利用填充有活性炭的柱色譜法，進行所述(C)步驟中的分離提純。
10.一種圓葉蔦蘿提取物，其是通過權利要求7至9中任一項所述的方法制造，并具有抑制VEGF效果、促進胰島素分泌效果、降低血糖效果、減少尿蛋白效果和降低水晶體混濁度效果。
11.一種用于預防或延遲老化的藥物組合物，其特征在于，含有圓葉蔦蘿提取物。
12.如權利要求11所述的用于預防或延遲老化的藥物組合物，其特征在于，通過由水、醇、有機溶劑和它們的混合物所組成的組中選出的溶劑，提取所述提取物。
13.一種用于預防或延遲老化的保健功能食品，其特征在于，含有圓葉蔦蘿提取物。
14.如權利要求13所述的用于預防或延遲老化的保健功能食品，其特征在于，通過由水、醇、有機溶劑和它們的混合物所組成的組中選出的溶劑，提取所述提取物。
15.一種用于預防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，含有圓葉蔦蘿提取物。
16.如權利要求15所述的預防或治療癌癥的藥物組合物，特其征在于，通過由水、醇、有機溶劑和它們的混合物所組成的組中選出的溶劑，提取所述提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療糖尿病及其并發(fā)癥的含有圓葉蔦蘿提取物的藥物組合物，更具體地說，涉及一種圓葉蔦蘿提取物和含有該圓葉蔦蘿提取物的用于預防或治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物、用于預防或延遲老化的藥物組合物、以及用于預防或治療癌癥的藥物組合物。本發(fā)明的組合物具有優(yōu)異的降低血糖、促進胰島素分泌、抑制尿蛋白作用以及減少水晶體混濁度的效果，因此，對糖尿病及其各種并發(fā)癥的預防或治療有顯著的效果。
文檔編號A61P3/00GK102802651SQ201180014267
公開日2012年11月28日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權日2010年2月19日
發(fā)明者鄭鳳鉉, 金文一, 李昭娟, 李義珍, 樸景淑, 裴判基 申請人:韓國生命工學研究院