專利名稱：來自甲型流感2009大流行h1n1病毒的rna依賴性rna聚合酶的pa亞基片段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含具有核酸內(nèi)切酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基之氨基端片段的多肽片段，其中所述PA亞基來自甲型流感2009大流行HlNl病毒或其變體。本發(fā)明還涉及(i)適于使用X射線晶體衍射對所述多肽片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定的多肽片段晶體，以及(ii)使用所述多肽的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來篩選和設(shè)計對多肽片段中的核酸內(nèi)裂解(endonucleolytically)活性位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)的化合物的計算方法。此外，本發(fā)明涉及鑒定(優(yōu)選以高通量形式鑒定)與具有核酸內(nèi)切酶活性的PA多肽片段結(jié)合并且優(yōu)選抑制所述核酸內(nèi)裂解活性的化合物的方法。本發(fā)明還涉及能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)本發(fā)明PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，以及包含所述化合物的藥物組合物，其用于治療由正粘病毒(Orthomyxoviridae)科、布尼亞病毒(Bunyaviridae)科和/ 或沙粒病毒科(Arenviridae)病毒通過病毒感染引起(優(yōu)選由甲型流感2009大流行HlNl病毒的病毒感染引起)的疾病病癥。優(yōu)選地，所述化合物可通過本文公開的方法進(jìn)行鑒定，或者所述藥物組合物可通過本文公開的方法生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
流感在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致很高的發(fā)病率和死亡率，許多人認(rèn)為它對人類來說是最為重要的病毒威脅。每年的流感流行席卷全球，而且偶發(fā)的新毒株導(dǎo)致破壞力巨大的大流行。目前，控制流感病毒流行的主要方法是疫苗接種。但是，很快就產(chǎn)生了避開疫苗接種作用的突變流感病毒。由于生產(chǎn)新的流感疫苗需要約6個月，所以尤其需要替代性治療方法(即抗病毒藥物)來作為對抗迅速傳播的大流行的第一道防線。開發(fā)抗病毒藥物的一個極佳出發(fā)點(diǎn)是病毒必需蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。因此，對流感病毒表面抗原神經(jīng)氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)測定(yon Itzstein等，1993 ;Nature 363:418-423)直接引導(dǎo)開發(fā)出了具有抗病毒活性的神經(jīng)氨酸酶抑制劑，其阻止病毒從細(xì)胞中釋放，但是不阻止病毒產(chǎn)生。隨后這些神經(jīng)氨酸酶抑制劑及其衍生物被開發(fā)成抗流感藥物扎那米韋(Glaxo)和奧司他韋(Roche)，許多國家目前都儲備它們以用作對抗可能的大流行的第一道防線。但是，這些藥物僅僅縮短臨床疾病的持續(xù)時間。作為替代地，其它抗流感化合物例如金剛烷胺和金剛乙胺靶向病毒膜中的離子通道蛋白(即M2蛋白)，干擾病毒在細(xì)胞內(nèi)部的脫殼。但是，由于它們的副作用和抗性病毒突變體的迅速產(chǎn)生，它們尚未被廣泛應(yīng)用(Magden 等，2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66 :612-621)。此外，已經(jīng)表明更不特異的病毒藥物(例如利巴韋林)可用于治療流感感染(Eriksson等，1977, Antimicrob. AgentsChemother. 11 :946-951)。但是，可能是由于嚴(yán)重的副作用，利巴韋林僅在幾個國家得到批準(zhǔn)(Furuta 等，2005, Antimicrob. Agents Chemother. 49 :981-986)。顯然，需要新型抗病毒化合物，優(yōu)選為針對不同靶標(biāo)的化合物。甲、乙、丙型流感病毒和鮭傳貧病毒(Isavirus)以及托高土病毒(Thogotovirus)屬于正粘病毒，其與布尼亞病毒科(包括漢坦病毒(Hantavirus)、內(nèi)羅病毒(Nairovirus)、正布尼亞病毒(Orthobunyavirus)、白蛉病毒(Phlebovirus)和番爺斑萎病毒(Tospovirus))都是負(fù)鏈RNA病毒。它們的基因組是分段的，并且存在于包含RNA依賴性RNA聚合酶的核糖核蛋白顆粒中，所述RNA依賴性RNA聚合酶(i)將最初的單鏈病毒粒RNA(vRNA)復(fù)制為病毒mRNA以及(ii)復(fù)制vRNA。對于病毒mRNA的產(chǎn)生，所述聚合酶利用所謂的“搶帽(cap-snatching) ” 機(jī)制(Plotch 等，1981, Cell 23 :847-858 ;Kukkonen 等，2005，Arch.Virol. 150:533-556；Lcahy 等，1997，J. Virol. 71 :8347-8351 ；Noah 和 Krug,2005，Adv. Virus Res. 65 :121-145)。所述聚合酶包含三個亞基=PBl (聚合酶堿性蛋白)、PB2和PA。對于搶帽機(jī)制，病毒聚合酶通過PB2亞基與細(xì)胞mRNA分子的5’ RNA帽結(jié)合，并且通過聚合酶的核酸內(nèi)裂解活性在核苷酸10至13位對其進(jìn)行切割。加帽的RNA片段作為引物用于通過PBl亞基中的核苷酸轉(zhuǎn)移酶中心合成病毒mRNA (Li等，2001，EMBO J. 20 2078-2086)。最終，通過聚合酶在模板5’端的寡聚U基序處的推進(jìn)，病毒mRNA的3’端被聚腺苷酸化。最近的研究已清楚地確定了負(fù)責(zé)帽結(jié)合的PB2的結(jié)構(gòu)域(Fechter等，2003，J. Biol. Chem. 278 :2038卜20388 ；Guilligay 等，2008 Nat. Struct. Mol. Biol. 15 500-506)。至今認(rèn)為聚合酶的核酸內(nèi)裂解活性存在于PBl亞基中(Li等，同上)。
所述聚合酶復(fù)合體似乎是合適的抗病毒藥物靶標(biāo)，因為其對于病毒mRNA的合成和病毒復(fù)制來說是必需的，并且包含數(shù)個可能與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)中存在的顯著不同的功能性活性位點(diǎn)(Magden等，同上)。因此，例如，已嘗試通過類似于PBl內(nèi)PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的25個氨基酸的肽來干擾聚合酶亞基的組裝(Ghanem等，2007，J. Virol. 81 =7801-7804)。此外，已嘗試通過核苷類似物(如2’ -脫氧-2’ -氟鳥苷)來干擾病毒轉(zhuǎn)錄(Tisdale等，1995，Antimicrob. Agents Chemother. 39 :2454-2458),并且已經(jīng)證明 T-705 (經(jīng)取代的卩比嗪化合物)可用作流感病毒RNA聚合酶的特異性抑制劑(Furuta等，同上)。此外，已祀向聚合酶的核酸內(nèi)切酶活性，并已鑒定出一系列4-取代的2，4-二氧代丁酸化合物作為流感病毒此活性的選擇性抑制劑(Tomassini 等，1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38 :2827-2837)。另外，已證明氟他胺(在真菌物種Delitschia confertaspora的提取物中鑒定到的經(jīng)取代的2,6- 二酮哌嗪)抑制流感病毒的核酸內(nèi)切酶(Tomassini等，1996, Antimicrob. AgentsChemother. 40 :1189-1193)。但是，迄今僅在聚合酶的完整三聚復(fù)合體的環(huán)境下研究了化合物對病毒聚合酶核酸內(nèi)裂解活性的抑制作用。雖然提出了聚合酶的PA亞基的帽結(jié)合和核酸內(nèi)切酶活性、vRNA復(fù)制和有爭議的蛋白酶活性，但是對其的功能性表征是最不充分的。PA(在甲型流感病毒中有716個殘基)可通過胰酶消化在213位殘基處分割。最近所測定的與PBlN端肽結(jié)合的PA C端三分之二的晶體結(jié)構(gòu)提供了對PA亞基的一大部分(但是其功能仍不清楚)和亞基間關(guān)鍵相互作用之一的確切性質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的理解(He等，2008, Nature 454 :1123-1126 ；0bayashi等，2008，Nature 454:1127-1131)。PA氨基端結(jié)構(gòu)域中保守殘基的系統(tǒng)突變已經(jīng)鑒定出對聚合酶復(fù)合體的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、啟動子結(jié)合、帽結(jié)合和核酸內(nèi)切酶活性重要的殘基(Hara等，2006,J. Virol. 80 :7789-7798)。已經(jīng)廣泛研究了完整病毒核糖核蛋白顆粒(RNP)環(huán)境下的核酸內(nèi)切酶的酶學(xué)。最近已發(fā)現(xiàn)，與本領(lǐng)域的一般觀點(diǎn)相反，對于甲型H3N2流感病毒的RNA依賴性RNA聚合酶，核酸內(nèi)裂解活性僅存在于PA亞基內(nèi)(Dias等，2009)。本發(fā)明人現(xiàn)已通過X射線晶體衍射對甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并且鑒定出所述結(jié)構(gòu)域內(nèi)的核酸內(nèi)裂解活性中心。本發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，所述病毒PA亞基的多肽片段易于結(jié)晶，因此，所述多肽片段非常適合于在所述多肽片段環(huán)境下研究甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶的核酸內(nèi)裂解活性，從而簡化靶向所述病毒聚合酶之核酸內(nèi)切酶活性的新型抗病毒化合物的開發(fā)，并且優(yōu)化之前鑒定的化合物。本發(fā)明人對具有甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶之核酸內(nèi)裂解活性的PA多肽片段的重組產(chǎn)生允許使用可從直接表達(dá)系統(tǒng)中易于得到的材料對所述病毒聚合酶功能性位點(diǎn)的抑制劑進(jìn)行體外高通量篩選。此外，核酸內(nèi)裂解性PA HlNl多肽片段以及其中的酶活中心的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)允許定向設(shè)計抑制劑并且用計算機(jī)篩選潛在的治療化合物。而且，本發(fā)明人第一次實現(xiàn)了甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的PA多肽片 段及其變體與結(jié)合的抑制劑的共結(jié)晶，并且發(fā)現(xiàn)可以改進(jìn)靶向甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶之核酸內(nèi)切酶活性的新型抗病毒化合物的開發(fā)。尤其是，共結(jié)晶數(shù)據(jù)第一次詳細(xì)示出甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的PA多肽片段活性位點(diǎn)中所包含的哪些氨基酸特別地參與化合物結(jié)合。該新知識允許對現(xiàn)有抑制劑的修飾進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計以改善其效力，或者允許設(shè)計和優(yōu)化有效阻斷核酸內(nèi)切酶活性的新型抑制劑。本發(fā)明的一個目的是(i)通過X射線晶體衍射提供HlNl病毒聚合酶PA亞基的核酸內(nèi)裂解氨基端結(jié)構(gòu)域的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，(ii)通過X射線晶體衍射提供與已知抑制劑共結(jié)晶的HlNl病毒聚合酶PA亞基的核酸內(nèi)裂解氨基端結(jié)構(gòu)域的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，
(iii)提供計算及體外方法(優(yōu)選是高通量形式)來鑒定可以調(diào)節(jié)且優(yōu)選抑制(優(yōu)選通過阻斷HlNlPA亞基內(nèi)的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn))甲型流感2009大流行HlNl病毒病毒聚合酶的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，以及(iv)提供包含這些化合物的藥理學(xué)組合物以用于治療由利用搶帽機(jī)制合成病毒mRNA的病毒所致的傳染性疾病。發(fā)明概述在第一方面中，本發(fā)明涉及包含具有核酸內(nèi)切酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基的氨基端片段的多肽片段，其中所述PA亞基來自SEQ ID NO :2的甲型流感2009大流行HlNl病毒或者是其變體，其中所述變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸。在另一方面中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的分離多肽片段的分離的多核苷酸。在另一方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的分離多核苷酸的重組載體。在另一方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的分離多核苷酸或本發(fā)明的重組載體的重組宿主細(xì)胞。在另一方面中，本發(fā)明涉及鑒定化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性，所述方法包括以下步驟a)構(gòu)建由以下結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義的活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型(i)如圖I所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(ii)如圖2所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iii)如圖3所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iv)如圖4所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(V)如圖5所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(vi)如

圖15所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或者(Vii)如圖16所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。b)通過選自以下的方法來選擇潛在的調(diào)節(jié)化合物(iv)將分子片段組裝成所述化合物，(V)從小分子數(shù)據(jù)庫中選擇化合物，和(vi)對所述化合物進(jìn)行從頭配體設(shè)計；c)采用計算方法進(jìn)行所述化合物與所述活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型之間的擬合程序運(yùn)算，以提供所述化合物在所述活性位點(diǎn)的能量最低的構(gòu)型；以及d)評價所述擬合運(yùn)算的結(jié)果來定量所述化合物與活性位點(diǎn)的模型之間的關(guān)聯(lián)，從而評價所述化合物與所述活性位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的能力。 在另一方面，本發(fā)明涉及鑒定化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性，所述方法包括以下步驟(i)使本發(fā)明的多肽片段或其變體或者本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞與測試化合物接觸，以及(ii)分析所述測試化合物調(diào)節(jié)所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力。在另一方面中，本發(fā)明涉及能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)本發(fā)明的PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的化合物。優(yōu)選地，所述化合物可通過本發(fā)明的(體外)方法進(jìn)行鑒定。在另一方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明化合物或其可藥用鹽以及一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體的藥物組合物。優(yōu)選地，所述藥物組合物可通過本發(fā)明的(體外)
方法產(chǎn)生。在另一方面中，本發(fā)明涉及針對SEQ ID NO 2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基或其變體的活性位點(diǎn)的抗體，其中所述變體在SEQ ID NO :2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸。 在另一方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物、本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā)明的抗體在制備用于治療、改善或預(yù)防由正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒通過病毒感染所引起(優(yōu)選由甲型流感2009大流行HlNl病毒的病毒感染引起)之疾病病癥的藥物中的用途。在另一方面中，本發(fā)明涉及以下化合物在制備用于治療、改善或預(yù)防由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染所引起之疾病病癥的藥物中的用途4_[3_[ (4-氯苯基)甲基]-I-(苯甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-3)、4-[4-[(4-氯苯基)甲基]-1-(環(huán)己基甲基)-4-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-2)、4- [3- [ (4-氯苯基)甲基]_1_ (苯基甲基磺基)_3_哌啶基]_2_羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-1)或[(2R，3R)-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯(EGCG)。在另一方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物、本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā)明的抗體用于治療、改善或預(yù)防由正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒通過病毒感染所引起(優(yōu)選由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染所引起)的疾病病癥。
在另一方面中，本發(fā)明涉及用于治療、改善或預(yù)防由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染所引起的疾病病癥的以下化合物4-[3-[(4_氯苯基)甲基]-1-(苯甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-3)、4_ [4- [ (4-氯苯基)甲基]-1-(環(huán)己基甲基)-4_哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-2)、4- [3- [ (4-氯苯基)甲基]-I-(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-1)或[(2R，3R)-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯(EGCG)。發(fā)明詳述在下文對本發(fā)明詳細(xì)描述之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文所述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以不同。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語僅用于描述具體的實施方案，而不意在限制僅由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。除非另外定義，否則本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。
以下將描述本發(fā)明的要素。雖然這些要素在具體的實施方案中列出，但是應(yīng)理解它們可以以任何方式和任何數(shù)目組合以產(chǎn)生另外的實施方案。不應(yīng)將多種描述的實施例和優(yōu)選的實施方案解釋為將本發(fā)明限制為僅明確描述的實施方案。應(yīng)將該描述理解為支持和涵蓋具有任何數(shù)目的公開和/或優(yōu)選要素的明確描述的實施方案組合的實施方案。此外，除非另有說明，否則應(yīng)認(rèn)為本申請中所有所述要素的任何排列和組合是本發(fā)明說明書所公開的。例如，如果在一個優(yōu)選實施方案中本發(fā)明的多肽片段對應(yīng)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，而在另一個優(yōu)選實施方案中本發(fā)明的PA多肽片段可以使用優(yōu)選可從PA多肽片段切割(優(yōu)選使用TEV蛋白酶)下來的肽標(biāo)簽來標(biāo)記，那么本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是，利用可使用TEV蛋白酶從PA多肽上切割下來的肽標(biāo)簽標(biāo)記對應(yīng)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸的多肽片段。優(yōu)選地，本文所用術(shù)語如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms (IUPAC Recommendations) ”，H. G. ff. Leuenberger, B. Nagel 和 JJ. K61M 編，Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)中所述。為了實施本發(fā)明，除非另有說明，否則采用在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中解釋的常規(guī)化學(xué)、生物化學(xué)方法和重組DNA技術(shù)(參見,例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，J. Sambrook 等編，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1989)。在本說明書及所附權(quán)利要求的通篇中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含”及其變化形式例如“包括”和“含有”應(yīng)理解為表示包含所述整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組，但是不排除任何其它的整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。除非上下文明確指出，否則本說明書和所附權(quán)利要求書中不使用數(shù)量詞限制時包括復(fù)數(shù)的情況。在本說明書中引用了一些文件。本文上文或下文中所引用的每個文件(包括所有專利、專利申請、科技文獻(xiàn)、制造商說明、說明書等)都通過引用整體并入本文。本文中的任何內(nèi)容均不應(yīng)解釋為認(rèn)可本發(fā)明不能由于在先發(fā)明而早于這些公開內(nèi)容。定義術(shù)語“多肽片段”指包含單個氨基酸鏈的蛋白質(zhì)的一部分。術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括呈現(xiàn)二級和三級結(jié)構(gòu)的多肽片段，還指由形成四級結(jié)構(gòu)的數(shù)個氨基酸鏈(即數(shù)個亞基)形成的蛋白質(zhì)。術(shù)語“肽”指最多50個氨基酸的短氨基酸鏈，其不一定呈現(xiàn)二級或三級結(jié)構(gòu)?！皵M肽”是由N-取代的甘氨酸通過寡聚組裝而產(chǎn)生的肽類似物。如果兩個或更多個多肽中的殘基在多肽結(jié)構(gòu)中占據(jù)類似的位置，則稱所述殘基為彼此“對應(yīng)”。如本領(lǐng)域所熟知的，兩個或更多個多肽中的類似位置可通過根據(jù)氨基酸序列或結(jié)構(gòu)相似性比對多肽序列來確定。這樣的比對工具對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，可以例如獲得自萬維網(wǎng)，例如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的ClustalW(www. ebi. ac. uk/clustalw)或 Align (http: //www. ebi. ac. uk/emboss/align/index, html)，對于 Align 優(yōu)選EMBOSS: :needle, Matrix :Blosum62，缺口打開10. 0，缺口延伸O. 5。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為產(chǎn)生滿意的比對，可能需要在任一序列中引入缺口。如果兩個或更多個PA亞基中的殘基在最佳序列比對中對齊，則稱所述殘基為“對應(yīng)”的。將兩個多肽之間的“最佳序列比對”定義為產(chǎn)生最大數(shù)量的對齊的相同殘基的比對。如果兩個比對序列之間的序列相似性(優(yōu)選同一性)在IO、20或30個氨基酸的長度上降至低于30 %，優(yōu)選低于20 %，更優(yōu)選低于IO %，貝U “最佳序列比對區(qū)”結(jié)束并由此確定用于測定相似性得分的比較序列的長度邊界。本發(fā)明涉及具有核酸內(nèi)切酶活性的甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性 RNA聚合酶PA亞基片段。術(shù)語“RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基”指具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA亞基。術(shù)語“RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基變體”指這樣的甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA亞基變體，其在SEQ ID NO :2的氨基酸位置186或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸，并且優(yōu)選其在使用最佳序列比對的片段全長上和/或在最佳序列比對區(qū)域中與SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的序列相似性(優(yōu)選序列同一性)至少為 60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%，其中的最佳序列比對可用本領(lǐng)域已知工具得到，例如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(優(yōu)選EMBOSS: ineedle,Matrix :Blosum62,缺口打開10. O,缺口延伸O. 5)的Align。優(yōu)選地，當(dāng)PA亞基變體與SEQID NO 2的PA亞基比對時，比對將在兩個多肽的全長上進(jìn)行，并因而在此基礎(chǔ)上確定比對得分。但是，有可能PA亞基變體可包含C端/N端或內(nèi)部的缺失或添加，例如通過N端/C端的融合。在此情況下，僅將最佳比對區(qū)域用于分別評估相似性和同一性。優(yōu)選地，來自這些變體的片段優(yōu)選在產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性所需的區(qū)域內(nèi)分別顯示出所示的相似性和同一性。因此，SEQ ID NO :2與PA亞基變體之間的任何比對都應(yīng)優(yōu)選地包含核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)。因此，上述序列與SEQ ID NO :2的相似性和同一性存在于至少80、90、100、110、120、130、140、150、160、165、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300 個或更多個氨基酸長度上，優(yōu)選包含核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)。因此，本發(fā)明的多肽片段基于上面定義的甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體。因此，在以下說明書中，術(shù)語“多肽片段”和“PA多肽片段”總是包括來自具有核酸內(nèi)切酶活性之SEQ ID NO 2所示PA蛋白質(zhì)和其PA蛋白質(zhì)變體(如上所述)的兩種片段。然而本說明書還使用術(shù)語“PA多肽片段變體”或“PA片段變體”來特別表示來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶之PA亞基變體的具有核酸內(nèi)切酶活性的PA多肽片段或PA片段。因此，本發(fā)明的PA多肽片段優(yōu)選包含天然甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA亞基序列，或基本由其組成或由其組成。但是，還設(shè)想PA多肽片段變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或其對應(yīng)氨基酸位點(diǎn)上包含氨基酸絲氨酸，并且優(yōu)選還包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15位或更多個氨基酸位置上的氨基酸替換，和/或在使用最佳序列比對的片段全長上和/或在最佳序列比對區(qū)域中與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的序列相似性(優(yōu)選序列同一性)為至少
83%,84%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%或99%，其中最佳序列比對可得自于本領(lǐng)域已知工具，例如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(優(yōu)選EMBOSS: :needle, Matrix :Blosum62，缺口打開 10. 0，缺口延伸 O. 5)的 Align。應(yīng)理解本發(fā)明的PA片段可包含不來自PA的另外的氨基酸如標(biāo)簽、酶等，在該比對中不考慮這些另外的氨基酸，即在比對得分的計算中將其排除在外。在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)將片段序列與SEQ ID NO 2 在至少 70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、165、170、180 或 190 個氨基酸的長度上進(jìn)行比對時得到上述比對得分，其中SEQ ID NO :2的序列優(yōu)選包含核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)。在一個優(yōu)選的實施方案中，PA多肽片段變體包含至少這樣的氨基酸殘基其對應(yīng) 于SEQ ID NO :2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的I至190位氨基酸殘基，或者其由SEQ ID NO 2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的I至190位氨基酸殘基組成，并且在使用最佳序列比對的片段全長上和/或在最佳序列比對區(qū)域中與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的I至190位氨基酸殘基的序列相似性(優(yōu)選序列同一性)為至少80%、81%、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97^^98^^99%,其中最佳序列比對可得自于本領(lǐng)域已知工具，例如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(優(yōu)選EMBOSS: :needle, Matrix :Blosum62,缺口打開 10. O,缺口延伸 O. 5)的 Align。更優(yōu)選地，PA多肽片段變體包含至少這樣的氨基酸殘基其對應(yīng)于SEQ ID NO 2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的I至198位氨基酸殘基，或者其由SEQ ID NO 2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的I至198位氨基酸殘基組成，并且在使用最佳序列比對的片段全長上和/或在最佳序列比對區(qū)域中與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸殘基的序列相似性(優(yōu)選序列同一性)優(yōu)選為至少70%、更優(yōu)選75%、更優(yōu)選80%、81%、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97^^98^^99%,其中最佳序列比對可得自于本領(lǐng)域已知工具，例如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(優(yōu)選EMBOSS: :needle,Matrix :Blosum62，缺口打開 10. 0，缺口延伸 O. 5)的 Align。還優(yōu)選 PA 多肽片段變體包含至少這樣的氨基酸殘基，其對應(yīng)于SEQ ID NO :2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的I至200位氨基酸殘基，或者其由SEQ ID NO :2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基的I至200位氨基酸殘基組成，并且在使用最佳序列比對的片段全長上和/或在最佳序列比對區(qū)域中與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至200位氨基酸殘基的序列相似性(優(yōu)選序列同一性)為至少60 %、更優(yōu)選65 %、更優(yōu)選70 %、更優(yōu)選75 %、更優(yōu)選 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %，其中最佳序列比對可得自于本領(lǐng)域已知工具，例如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(優(yōu)選 EMBOSS: :needle，Matrix :Blosum62，缺口打開 10. 0，缺口延伸 O. 5)的 Align。應(yīng)注意，所有上述優(yōu)選的PA多肽片段變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“PA N端(PA-Nter) ”指由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸殘基(PA HlNl I至198)以及任選地額外氨基端接頭(即MGSGMA (SEQID NO :3))所組成的多肽片段。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“PAN端突變體”指由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的I至198位氨基酸殘基(其中52至64位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸)(PA HlNl I至198 Δ 52-64 Gly)以及任選地額外氨基端接頭(即MGSGMA (SEQ IDNO :3))組成的多肽片段(變體)。術(shù)語“序列相似性”意指最佳序列比對中相同位置處的氨基酸相同或相似，優(yōu)選相同。“相似氨基酸”具有相似的特征，例如極性、可溶性、親水性、疏水性、電荷或大小。相似的氨基酸優(yōu)選為亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；賴氨酸、精氨酸和組氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸；蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和甲硫氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常了 解序列相似性檢索工具，例如可從萬維網(wǎng)上獲得(例如WWW.ebi. ac. uk/Tools/similarity, html)。本文使用的術(shù)語“可溶”指在生理等滲條件(例如，O. 14M氯化鈉或蔗糖)下，在有效濃度的變性劑(如胍或尿素)不存在的情況下，的水性緩沖劑中以100，000 X g離心30分鐘之后，仍以至少200 μ g/ml、優(yōu)選至少500 μ g/ml、優(yōu)選至少lmg/ml、更優(yōu)選至少2mg/ml、甚至更優(yōu)選至少3mg/ml、甚至更優(yōu)選至少4mg/ml、最優(yōu)選至少5mg/ml的蛋白質(zhì)濃度保留在上清液中的多肽片段。被測試溶解度的蛋白質(zhì)片段優(yōu)選在下文所述的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)之一中表達(dá)。涉及多肽時，術(shù)語“純化的”不需要是絕對純的(例如均一制備物)，而是表示所述多肽相對于自然環(huán)境中的來說相對更純。通常，純化的多肽基本不含其它蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物或與其天然相關(guān)聯(lián)的其他物質(zhì)，純化的多肽優(yōu)選為功能顯著性水平，例如至少85%純，更優(yōu)選至少90%或95%純，最優(yōu)選至少99%純。表述“純化至適于結(jié)晶的程度”指多肽為85%至100%純，優(yōu)選90%至100%純，更優(yōu)選95%至100%或98%至100%純，并且可以濃縮至高于3mg/ml,優(yōu)選高于10mg/ml,更優(yōu)選高于18mg/ml而沒有沉淀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化多肽?；炯兊亩嚯臅诜沁€原性聚丙烯酰胺凝膠上產(chǎn)生單個主要條帶。在使用本發(fā)明方法鑒定化合物的上下文中使用的術(shù)語“關(guān)聯(lián)”是指部分(即化學(xué)實體或化合物或其部分或片段)與PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)之間接近的狀態(tài)。該關(guān)聯(lián)可以是非共價的，即通過例如氫鍵、范德華力、靜電或疏水性相互作用在能量上有利地接近，或者該關(guān)聯(lián)可以是共價的。術(shù)語“核酸內(nèi)切酶活性”或“核酸內(nèi)裂解活性”是指導(dǎo)致多核苷酸鏈中磷酸二酯鍵的切割的酶促活性。在本發(fā)明的上下文中，多肽片段具有核酸內(nèi)裂解活性，其優(yōu)選對多核苷酸類型是非選擇性的，即本發(fā)明的多肽片段優(yōu)選表現(xiàn)出對DNA和RNA、優(yōu)選對單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA)的核酸內(nèi)裂解活性。在這種情況下中，“單鏈”是指在多核苷酸鏈中優(yōu)選至少3個核苷酸、優(yōu)選至少5個核苷酸、更優(yōu)選至少10個核苷酸的一段是單鏈的，即不與另一核苷酸堿基配對。優(yōu)選地，雖然本發(fā)明的多肽片段的核酸內(nèi)裂解活性不取決于識別位點(diǎn)(即特定核苷酸序列)，但是其引起多核苷酸鏈的非特異性切割。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以這樣測試本發(fā)明多肽片段的核酸內(nèi)裂解活性孵育具有或不具有各自多肽片段的RNA或DNA底物(例如鍋柄狀RNA或者線性或環(huán)形單鏈DNA)(例如在37°C下孵育某一時間段(例如5、10、20、40、60或80分鐘)，并且通過例如凝膠電泳檢測多核苷酸的完整性。本文使用的術(shù)語“核苷酸”是指由與戊糖I’位相連之嘌呤、氮雜嘌呤或嘧啶核苷堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、氮雜腺嘌呤、氮雜鳥嘌呤等)組成的化合物，包括2’ -脫氧和2’ -輕基形式,例如Kornberg和Baker, DNA Replication,第二版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述,并且還包括但不限于具有經(jīng)修飾堿基部分和/或經(jīng)修飾糖部分的合成核苷，例如 Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, N. Y. , 1980)中一般性描述的。術(shù)語“分離的多核苷酸”指這樣的多核苷酸，其為(i)從其天然環(huán)境中分離的，
(ii)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的，或者(iii)全部或部分合成的，并且是指脫氧核糖核苷酸堿基或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈多聚體，包括DNA和RNA分子，有義和反義鏈兩者。該術(shù)語包括cDNA、cRNA、基因組DNA以及重組DNA。多核苷酸可以由完整基因或其部分組成?！け疚氖褂玫男g(shù)語“重組載體”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何載體，包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、曬菌體載體(例如λ曬菌體)、病毒載體(例如腺病毒或桿狀病毒載體)或者人工染色體載體(例如細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)或者Pl人工染色體(PAC))。所述載體包括表達(dá)載體及克隆載體。表達(dá)載體包括質(zhì)粒和病毒載體,并且一般包含期望的編碼序列以及在特定宿主生物(例如細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物)或體外表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)有效連接之編碼序列所需的合適DNA序列?？寺≥d體一般用于改造和擴(kuò)增某個期望的DNA片段，并且可缺乏表達(dá)期望DNA片段所需的功能序列。本文使用的“重組宿主細(xì)胞”是指包含編碼目的多肽片段(即本發(fā)明的甲型HlNl流感的PA多肽片段或其變體)的多核苷酸的宿主細(xì)胞。此多核苷酸可以以如下方式存在于宿主細(xì)胞中(i)本身自由分散的，(ii)整合入重組載體中，或者(iii)整合入宿主細(xì)胞基因組或線粒體DNA中。重組細(xì)胞可用于表達(dá)目的多核苷酸，或者用于擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸或重組載體。術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”包括用本發(fā)明的多核苷酸或重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的原始細(xì)胞的后代。重組宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞如SF9或High Five細(xì)胞或者哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞的實例有中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、非洲綠猴腎(COS)細(xì)胞、人胚腎(HEK293)細(xì)胞、HELA細(xì)胞等。本文使用的術(shù)語“晶體”或“結(jié)晶”是指這樣的結(jié)構(gòu)(例如三維固體聚集體)，其中平面以確定的角度相交，并且其中化學(xué)組成物質(zhì)有規(guī)則的結(jié)構(gòu)(例如內(nèi)部結(jié)構(gòu))。術(shù)語“晶體”可包括下列任一項固體物理晶形例如實驗制備的晶體，可來源于晶體的晶體結(jié)構(gòu)(包括二級和/或三級和/或四級結(jié)構(gòu)元件)，基于晶體結(jié)構(gòu)的2D和/或3D模型、其代表物如其示意圖或圖示或者用于計算機(jī)的其數(shù)據(jù)集。在一個方面中，所述晶體可用于X射線晶體衍射技術(shù)。在這里，所用的晶體可承受X射線束中的暴露并用于產(chǎn)生解析X射線晶體結(jié)構(gòu)所需的衍射圖樣數(shù)據(jù)。晶體可以表征為能夠以T. L. Blundell和L. N. Johnson, “ProteinCrystallography”，Academic Press, New York(1976)所不晶形之一定義的圖樣衍射 X 射線。術(shù)語“晶胞”指基本的立方體形或平行六面體形的單元。晶體的整個體積可以由規(guī)則裝配的這些單元構(gòu)建。每個晶胞包含圖樣單位的完整呈現(xiàn)，對其進(jìn)行重復(fù)構(gòu)建出晶體。
術(shù)語“空間群”指晶體對稱元素的排布。在空間群的命名中，大寫字母表示晶格類型，其它符號表示可以在不改變外觀的情況下對不對稱單元進(jìn)行的對稱操作。術(shù)語“結(jié)構(gòu)坐標(biāo)”是指定義一個或更多個氨基酸殘基相對于坐標(biāo)系的位置的一組數(shù)值。該術(shù)語指定義分子三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)集(例如笛卡兒坐標(biāo)、溫度因子和占位)。結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可略微改變而仍保持幾乎相同的三維結(jié)構(gòu)。獨(dú)特結(jié)構(gòu)坐標(biāo)組的度量是所得結(jié)構(gòu)的均方根差。本領(lǐng)域普遍技術(shù)人員可以認(rèn)為使三維結(jié)構(gòu)(特別是酶促活性中心的三維結(jié)構(gòu))的均方
根差彼此相差小于3 A、2 A. 1.51. 1.0 A或0.5 A的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)非常相似。術(shù)語“均方根差”意指與平均值的偏差的平方的算術(shù)平均值的平方根。這是表示與趨勢或目標(biāo)的偏差或偏離的一種方法。為本發(fā)明的目的，“均方根差”定義PA多肽片段或其酶促活性中心的變體的骨架與圖I中PA多肽片段PA N端的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所定義的PA多肽片段或其酶促活性中心的骨架之間的偏差。本文使用的術(shù)語“構(gòu)建計算機(jī)模型”包括根據(jù)原子結(jié)構(gòu)信息和相互作用模型進(jìn)行 的分子結(jié)構(gòu)和/或功能的定量和定性分析。術(shù)語“建?！卑ǔＲ?guī)的基于數(shù)字的分子動力學(xué)和能量最低化模型，交互式計算機(jī)圖像模型，經(jīng)修改的分子力學(xué)模型，距離幾何以及其它基于結(jié)構(gòu)的約束模型。術(shù)語“擬合程序運(yùn)算”是指利用化學(xué)實體、酶促活性中心、結(jié)合口袋、分子或分子復(fù)合物或其部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，將化學(xué)實體與酶促活性中心、結(jié)合口袋、分子或分子復(fù)合物或其部分相關(guān)聯(lián)的操作。這可通過在酶促活性中心處定位、旋轉(zhuǎn)或移動化學(xué)實體以匹配酶促活性中心的形狀和靜電互補(bǔ)性來實現(xiàn)?？蓪矁r相互作用、非共價相互作用(例如氫鍵、靜電、疏水、范德華力相互作用以及非互補(bǔ)靜電相互作用例如排斥的電荷-電荷、偶極-偶極和電荷-偶極相互作用)進(jìn)行優(yōu)化。或者，可使化學(xué)實體與酶促活性中心的結(jié)合形變能量最小化。本文使用的術(shù)語“測試化合物”是指包含被測試抑制目的多肽片段(即具有核酸內(nèi)裂解活性的本發(fā)明PA多肽片段或其變體)之核酸內(nèi)裂解活性的能力的化合物、分子或復(fù)合物的物質(zhì)。測試化合物可以是任何物質(zhì)，包括但不限于肽、擬肽、多肽、蛋白質(zhì)(包括抗體)、脂類、金屬、核苷酸、核苷酸類似物、核苷、核酸、小有機(jī)或無機(jī)分子、化學(xué)化合物、元素、糖類、同位素、碳水化合物、成像劑、脂蛋白、糖蛋白、酶、分析探針、聚胺以及其組合和衍生物。術(shù)語“小分子”指分子量為50至約2，500道爾頓、優(yōu)選200至800道爾頓的分子。此夕卜，本發(fā)明的測試化合物可任選地包含可檢測標(biāo)記。這些標(biāo)記包括但不限于酶標(biāo)記、放射性同位素或者放射活性化合物或元素、熒光化合物或金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。可使用公知方法將這些可檢測標(biāo)記連接到測試化合物。本發(fā)明的測試化合物還可包含物質(zhì)的復(fù)雜混合物，例如含有天然產(chǎn)物的提取物，或者混合的組合性合成的產(chǎn)物。它們也可以被測試，并且可以在后續(xù)步驟中從混合物純化出抑制靶多肽片段之核酸內(nèi)裂解活性的組分。測試化合物可來自或選自合成或天然化合物的文庫。例如，合成化合物文庫可購自 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK) > ChemBridge Corporation (SanDiego, CA)或 Aldrich (Milwaukee, WI)。天然化合物文庫例如可得自 TimTec LLC (Newark,DE)?；蛘撸墒褂眉?xì)菌、真菌、植物和動物細(xì)胞以及組織提取物形式的天然化合物文庫。另夕卜，測試化合物可使用組合化學(xué)法或作為單個化合物或作為混合物而合成產(chǎn)生。使用組合化學(xué)法制成的化合物集合在本文中稱為組合文庫。
在本發(fā)明的上下文中，“調(diào)節(jié)核酸內(nèi)裂解活性的化合物”可提高或降低(優(yōu)選抑制)甲型流感2009大流行HlNl病毒或甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或者其變體的核酸內(nèi)裂解活性。優(yōu)選地，這類化合物特異性針對甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性，而不調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低)其它核酸內(nèi)切酶(尤其是哺乳動物的核酸內(nèi)切酶)的核酸內(nèi)裂解活性。術(shù)語“降低核酸內(nèi)裂解活性的化合物”是指這樣的化合物與不存在所述化合物而其它反應(yīng)條件(即緩沖條件、反應(yīng)時間和溫度)相同的甲型流感2009大流行HlNl病毒或甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性相比，所述化合物使所述PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性降低50 %、更優(yōu)選60 %、甚至更優(yōu)選70 %、甚至更優(yōu)選80 %、甚至更優(yōu)選90 %，以及最優(yōu)選100 %。最優(yōu)選地，降低甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解 活性的化合物抑制所述活性，即與不存在所述化合物時的活性相比，將所述活性降低至少95 %，優(yōu)選100 %。尤其優(yōu)選地，降低或抑制甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的化合物特異性降低或抑制所述PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性，而不以相同的程度抑制(優(yōu)選根本不抑制)其它核酸內(nèi)切酶(如RNase H或限制性核酸內(nèi)切酶)的核酸內(nèi)裂解活性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用相同的緩沖劑和反應(yīng)條件以及底物和核酸內(nèi)切酶濃度來建立以下樣品(I)底物(如鍋柄狀RNA)、核酸內(nèi)裂解活性的PA HlNl多肽片段或其變體，(2)底物(如鍋柄狀RNA)、核酸內(nèi)裂解活性的PA HlNl多肽片段或其變體、測試化合物，(3)底物(如鍋柄狀RNA)、參照核酸內(nèi)切酶(如RNAse H)，(4)底物(如鍋柄狀RNA)、參照核苷酸(如RNAse H)、測試化合物。孵育樣品之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過例如凝膠電泳分析底物。優(yōu)選對樣品(4)產(chǎn)生切割底物和對樣品(2)產(chǎn)生完整底物的測試化合物。術(shù)語“高通量形式”是指多種類型的高通量篩選測定和技術(shù)，其用于篩選測試化合物文庫抑制目的多肽片段的核酸內(nèi)切酶活性的能力。通常，以多孔形式進(jìn)行高通量測定，并且包括無細(xì)胞測定以及基于細(xì)胞的測定。術(shù)語“抗體”是指單克隆和多克隆抗體二者，即任何免疫球蛋白或其能夠識別抗原或半抗原的部分，即識別具有核酸內(nèi)裂解活性的甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA多肽片段或其肽。在一個優(yōu)選實施方案中，抗體能夠與甲型流感2009大流行HlNl病毒的PA多肽片段或其變體中的酶促(核酸內(nèi)裂解)活性中心結(jié)合?？贵w的抗原結(jié)合部分可通過重組DNA技術(shù)或者對完整抗體進(jìn)行酶促或化學(xué)切割產(chǎn)生。在一些實施方案中，抗原結(jié)合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb以及互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體例如人源化抗體、雙抗體以及多肽，所述多肽至少含有抗體中足以使特異性抗原與該多肽結(jié)合的部分。術(shù)語“可藥用鹽”是指可通過本發(fā)明的方法鑒定的化合物的鹽或本發(fā)明化合物的鹽。合適的可藥用鹽包括酸加成鹽，其可以例如通過將本發(fā)明化合物的溶液與可藥用酸(如鹽酸、硫酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液混合來形成。此外，當(dāng)所述化合物帶有酸性部分時，其合適的可藥用鹽可包括堿金屬鹽(例如鈉鹽或鉀鹽)；堿土金屬鹽(例如鈣或鎂鹽)；以及與合適的有機(jī)配體形成的鹽(例如使用反陰離子(counteranion)例如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、燒基磺酸根和芳基磺酸根形成的銨，季銨，以及胺陽離子)?？伤幱名}的示例性實例包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、丁酸鹽、乙二胺四乙酸鈣、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、右旋樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、克拉維酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、二鹽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯十二烷硫酸鹽、乙磺酸鹽(esylate)、乙磺酸鹽(ethanesulfonate)、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate)、葡庚糖酸鹽(glucoheptonate)、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、甘油磷酸鹽、對羥乙酰氨基苯胂酸、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、己基間苯二酸鹽、哈胺鹽(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、羥基萘酸鹽、碘化物、異硫代羥酸鹽(isothionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate)、甲磺酸鹽(methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、2_萘磺酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、N-甲基葡糖胺銨鹽、油酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate)(恩波酸鹽(embonate))、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、pectinate、過硫酸鹽、3_苯基丙酸鹽、磷酸鹽/ 二磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、硫酸鹽、堿式醋酸鹽、琥珀酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、甲苯磺酸鹽、三乙基碘化物、i^一酸鹽、戊酸鹽等(參見例如 S. M. Berge 等，“Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66 1-19 (1977))。 在用于本文時，術(shù)語“賦形劑”用于表示藥物制劑中非活性成分的所有物質(zhì)，例如載體、粘合劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、乳化劑、緩沖劑、調(diào)味劑或著色劑。術(shù)語“可藥用載體”包括例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可脂等。詳述盡管之前人們認(rèn)為僅可在三聚復(fù)合體中檢測到核酸內(nèi)切酶活性，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基N端的獨(dú)立折疊的小結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出對三聚復(fù)合體所報道的核酸內(nèi)切酶功能特性。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該P(yáng)A多肽片段可通過重組方法容易地產(chǎn)生，因此適用于核酸內(nèi)裂解活性及其調(diào)節(jié)的體外研究。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基N端的結(jié)構(gòu)域易于結(jié)晶，因此所述結(jié)構(gòu)域適用于鑒定、選擇和設(shè)計靶向甲型流感2009大流行HlNl聚合酶之核酸內(nèi)切酶活性的新型抗病毒化合物，以及通過計算機(jī)方法優(yōu)化先前鑒定的化合物。本發(fā)明的一個方面是提供包含具有核酸內(nèi)切酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基氨基端片段的多肽片段，其中所述PA亞基來自SEQ ID NO :2的甲型流感2009大流行HlNl病毒或其變體，其中所述變體在SEQ ID NO :2的186氨基酸位置或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述變體包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至64位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至72位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。在本發(fā)明的另一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至69位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽片段是可溶的，優(yōu)選可溶于水溶液中。本發(fā)明多肽片段的最短長度由其切割多核苷酸鏈(例如鍋柄狀RNA或單鏈DNA)的能力來確定，即多肽的最短長度由其核酸內(nèi)裂解活性來確定。優(yōu)選地，核酸內(nèi)切酶活性不取決于多核苷酸類型，因此，它可以作用于DNA和RNA，優(yōu)選作用于單鏈DNA和RNA。優(yōu)選地，核酸內(nèi)切酶活性不取決于底物核苷酸中的特異性識別位點(diǎn)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽片段適于結(jié)晶，即優(yōu)選所述多肽片段可結(jié)晶。優(yōu)選地，可從本發(fā)明多肽片段得到的晶體適用于通過X射線晶體衍射對多肽片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定。優(yōu)選地，所述晶體大于25立方微米，并且優(yōu)選對輻射足夠穩(wěn)定以在優(yōu)選3.5 A或更好的分辨率下使得暴露于單色X射線時收集的衍射數(shù)據(jù)完整性大于85%。 在一個實施方案中，所述多肽片段可使用以下溶液結(jié)晶(i)蛋白質(zhì)水溶液，即結(jié)晶溶液，其中在濃度范圍為IOmM至3M、優(yōu)選IOmM至2M、更優(yōu)選20mM至IM且pH 3至pH 9、優(yōu)選pH 4至pH 9、更優(yōu)選pH 7至pH 9之緩沖體系(如HEPES或Tris-HCl)中蛋白質(zhì)濃度為 5 至 20mg/ml,如 5,5. 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、9、9· 5,10,10. 5、11、11· 5,12,12. 5、13、13. 5,14,14. 5,15,15. 5,16,16. 5,17,17. 5,18,18. 5,19,19. 5 或 20mg/ml,優(yōu)選 8 至 15mg/ml,最優(yōu)選10至15mg/ml ;和(ii)包含一種或更多種物質(zhì)的沉淀溶液/儲集溶液，所述物質(zhì)例如甲酸鈉、硫酸銨、硫酸鋰、乙酸鎂、乙酸錳、氯化鈉、甘油或乙二醇。任選地，蛋白質(zhì)溶液可包含一種或更多種鹽，例如單價鹽，如NaCl、KCl或LiCUt選NaCl，其濃度為IOmM至1M、優(yōu)選20mM至500mM、更優(yōu)選50mM至200mM ;和/或二價鹽，如MnCl2,CaCl2,MgCl2,ZnCl2 或 CoCl、優(yōu)選 MgCl2 和 MnCl2，其濃度為 O. ImM 至 50mM、優(yōu)選 O. 5mM至25mM、更優(yōu)選ImM至IOmM或ImM至5mM。優(yōu)選地，沉淀/儲集溶液包含濃度范圍為O. 5M至2M、優(yōu)選為IM至I. 8M的甲酸鈉，濃度范圍為IOmM至1M、優(yōu)選50mM至500mM、更優(yōu)選75mM至150mM并且pH優(yōu)選為4至8、更優(yōu)選為5至7的緩沖體系(如HEPES)，和/或濃度范圍為I %至20 %、優(yōu)選2%至8 %、更優(yōu)選2%至5%的乙二醇。結(jié)晶溶液中的PA多肽片段或其變體優(yōu)選為85%至100%純、更優(yōu)選90%至100%純、甚至更優(yōu)選95%至100%純。為了產(chǎn)生晶體，將適于結(jié)晶的蛋白質(zhì)溶液與等體積的沉淀溶液混合。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)晶介質(zhì)包含O. 05μ I至2μ I、優(yōu)選O. 8μ I至I. 2μ I的適于結(jié)晶的蛋白質(zhì)溶液，其與相似體積、優(yōu)選等體積的包含I. OmM至2. OmM甲酸鈉、80mM至120mM HEPES (pH 6. 5至DH 7. 5)和2%至5%乙二醇或甘油的沉淀溶液混合。在另一個實施方案中，沉淀溶液包含I. 6mM甲酸鈉、O. IM HEPES (pH 7. O)和5%乙二醇或甘油，優(yōu)選基本由它們組成或由它們組成；而結(jié)晶/蛋白質(zhì)溶液包含20mM HEPES(pH7. 5)、150mM NaCl、2. OmMMnCl2 和 2. OmM MgCl2 中的 10mg/ml 至 15mg/ml，優(yōu)選基本由它們組成或由它們組成。在另一個實施方案中，PA多肽片段可使用以下溶液與化合物(優(yōu)選與調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)PA多肽片段的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，優(yōu)選與表I或2的化合物)共結(jié)晶(i)蛋白質(zhì)水溶液，在濃度范圍為IOmM至3M、優(yōu)選IOmM至2M、更優(yōu)選20mM至IM且pH為pH 3至pH 9、優(yōu)選pH 4至pH 9、更優(yōu)選pH 7至pH 9的緩沖體系(如HEPES或Tris-HCl)中的PA多肽片段濃度為 5 至 20mg/ml，如 5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5、10、10· 5、11、11· 5、12、12. 5、13、13· 5、14、14· 5、15、15· 5、16、16· 5、17、17· 5、18、18· 5、19、19· 5 或 20mg/ml,優(yōu)選 8至15mg/ml,最優(yōu)選10至15mg/ml ;和(ii)包含一種或更多種物質(zhì)的沉淀溶液/儲集溶液，所述物質(zhì)例如甲酸鈉、硫酸銨、硫酸鋰、乙酸鎂、乙酸錳、氯化鈉、乙二醇、甘油或PEG。為了共結(jié)晶，將化合物(優(yōu)選調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)PA多肽片段的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，優(yōu)選表I或表 2的化合物)添加到蛋白質(zhì)水溶液中至終濃度為O. 5mM至5mM，優(yōu)選I. 5mM至5mM，即O. 5、I、I. 5、2、2. 5、3、4· 5 或 5mM。任選地，蛋白質(zhì)溶液可包含一種或更多種鹽，例如單價鹽，如NaCl、KCl或LiCUt選NaCl，其濃度范圍為IOmM至1M、優(yōu)選20mM至500mM、更優(yōu)選50mM至200mM ;和/或二價鹽，如 MnCl2、CaCl2、MgCl2、ZnCl2 或 CoCl，優(yōu)選 MgCl2 和 MnCl2，其濃度范圍為 O. ImM 至 50mM、優(yōu)選O. 5mM至25mM、更優(yōu)選ImM至IOmM或ImM至5mM。優(yōu)選地，沉淀/儲集溶液包含濃度范圍為O. IM至2. 5M、優(yōu)選O. IM至2. OM的硫酸銨,濃度范圍為IOmM至1M、優(yōu)選50mM至500mM、更優(yōu)選75mM至150mM并且pH為4至7、更優(yōu)選pH為5至6的緩沖體系(如Bis-Tris)，和/或濃度范圍為I %至30%、優(yōu)選15%至30 %、更優(yōu)選 20 % 至 25 % 的 PEG (如 PEG 3350)。蛋白質(zhì)溶液中的PA多肽片段或其變體優(yōu)選85 %至100 %純、更優(yōu)選90 %至100 %純、甚至更優(yōu)選95%至100%純。為進(jìn)行共結(jié)晶，可將包含PA多肽片段或其變體和化合物的蛋白質(zhì)水溶液與等體積的沉淀溶液混合。在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)溶液包含在20mM HEPES(pH 7. 5) U50mM NaCl、2. OmM MnCl2和2· OmM MgCl2以及終濃度為I. 5mM的4_[3_[ (4-氯苯基)甲基]-1-(苯甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-3)中的 10mg/ml 至 15mg/ml PA多肽片段，優(yōu)選基本由它們組成或由它們組成；而儲集溶液/沉淀溶液包含2. OM硫酸銨和O. IMBis-Tris (pH 5. 5)，優(yōu)選基本由它們組成或由它們組成(也參見表I)。在另一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)溶液包含在20mM HEPES(pH7. 5) U50mM NaCl、2. OmM MnCl2,2. OmM MgCl2和終濃度為I. 5mM的4_[4_[ (4-氯苯基)甲基]_1_(環(huán)己基甲基)-4-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-2)中的 10mg/ml 至 15mg/ml PA多肽片段，優(yōu)選基本由它們組成或由它們組成，優(yōu)選浸入到最初用核糖尿苷一磷酸(rUMP)生長的晶體中；而儲集溶液/沉淀溶液包含O. IM硫酸銨、O. IM Bis-Tris (pH 5. 5)和25%(w/v)PEG 3350，優(yōu)選基本由它們組成或由它們組成(也參見表I)。在另一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)溶液包含在20mM HEPES(pH7. 5) U50mM NaCl、2. OmM MnCl2和I. OmM MgCl2以及終濃度為5mM的核糖尿苷一磷酸(rUMP)中的10mg/ml至15mg/ml PA多肽片段，優(yōu)選基本上由它們組成或由它們組成；而儲集溶液/沉淀溶液包含O. IM硫酸銨、O. IM Bis-Tris (pH 5.5)和25% (w/v)PEG 3350，優(yōu)選基本上由它們組成或由它們組成(也參見表I)。用于PA多肽片段或其變體與例如4-[3-[(4_氯苯基)甲基]_1_(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-1)或[(2R，3R) -5，7- 二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯(EGCG)的共結(jié)晶的另一些優(yōu)選儲集溶液/沉淀溶液也可從表I中得到?？赏ㄟ^任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法使晶體生長，包括但不限于懸滴(hanging drop)和坐滴(sitting drop)技術(shù)、夾心滴(sandwich-drop)、透析以及微批量或微管批量設(shè)備。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是，改變上面公開的結(jié)晶條件來鑒定產(chǎn)生單獨(dú)或與化合物相復(fù)合之本發(fā)明PA多肽片段或其變體的晶體的其它結(jié)晶條件。這些改變包括但不限于調(diào)整pH、蛋白質(zhì)濃度和/或結(jié)晶溫度，改變所用鹽和/或沉淀劑的種類或濃度，使用不同的結(jié)晶方法，或者引入有助于結(jié)晶的添加劑例如去污劑(例如吐溫20(單月桂酯)、LDOA、Brij 30 (4月桂基醚))、糖(例如葡萄糖、麥芽糖)、有機(jī)化合物(例如二噁烷、二甲基甲酰胺)、鑭系元素離子或者多聚離子化合物。還可使用高通量結(jié)晶測定來幫助發(fā)現(xiàn)或優(yōu)化結(jié)晶條件?？墒褂梦⒔臃N(microseeding)來提高晶體的尺寸和質(zhì)量。簡言之，將微晶體破碎以產(chǎn)生晶種儲備溶液(stock seed solution)。對所述晶種儲備溶液進(jìn)行系列稀釋。使用針、玻璃棒或毛發(fā)線，將來自各稀釋液的小樣品添加到一組經(jīng)平衡的滴中，其中含有的蛋白質(zhì)濃度等于或小于不存在晶種時產(chǎn)生晶體所 需的濃度。目的是最后得到在滴中發(fā)揮晶體生長的晶核作用的單晶種。如本文所述獲得如圖I至5所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)、對所述坐標(biāo)進(jìn)行解讀的方法及其在了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并參考標(biāo)準(zhǔn)教科書，例如 J. Drenth, " Principles of protein X-ray crystallography 〃，第二版，Springer Advanced Texts in Chemistry, New York (1999)； 和 G. E. Schulz 和R. H. Schirmer, " Principles of Protein Structure " , Springer Verlag, NewYork(1985)。例如，通常使用冷凍至IOOK的低溫保護(hù)(例如用20%至30%甘油)的晶體首先獲得X射線衍射數(shù)據(jù)，例如使用同步加速器設(shè)備的線束或者旋轉(zhuǎn)陽極作為X射線源。然后，通過公知的方法解析相位問題，例如多波長異常衍射(multiwavelength anomalousdiffraction, MAD)、多重同晶置換(multiple isomorphous replacement, MIR)、單波長異常衍身寸(single wavelength anomalous diffraction, SAD)或者分子置換(molecularreplacement, MR)?？墒褂?SHELXD 解出亞結(jié)構(gòu)(Schneider 和 Sheldrick, 2002, ActaCrystallogr. D. Biol. Crystallogr. (PtlO Pt 2),1772-1779),使用 SHARP 計算相位(Vonrhein等，2006，Methods Mol. Biol. 364 :215-30)，用溶劑扁平化及非結(jié)晶對稱平均化進(jìn)行改進(jìn)(例如使用 RESOLVE (TerwiIIiger, 2000, Acta Cryst. D. Biol. Crystallogr. 56 965-972))?？墒褂美?ARP/wARP (Perrakis 等，1999，Nat. Struct. Biol. 6 :458-63)進(jìn)行模型自構(gòu)建并使用例如REFMAC進(jìn)行精修化(Murshudov, 1997, Acta Crystallogr. D. Biol.Crystallogr. 53 :240-255)。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽片段內(nèi)包含的PA片段氨基端對應(yīng)于(優(yōu)選地基本由其組成或由其組成)SEQ ID NO : 2的甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基的I至190位，優(yōu)選I至198位，優(yōu)選I至200位氨基酸或其變體。在一個優(yōu)選實施方案中，將本發(fā)明的多肽片段純化至適于結(jié)晶的程度，優(yōu)選其為85%至100%純、更優(yōu)選90%至100%純、最優(yōu)選95%至100%純。在另一個優(yōu)選實施方案中，將本發(fā)明的多肽片段純化至適于共結(jié)晶的程度，其優(yōu)選為85%至100%純、更優(yōu)選90%至100%純、最優(yōu)選95%至100%純。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽片段能夠與二價陽離子結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽片段與一個或更多個二價陽離子結(jié)合，優(yōu)選與兩個二價陽離子結(jié)合。在此情況下，二價陽離子優(yōu)選選自錳、鈷、鈣、鎂和鋅，并且更優(yōu)選錳或鈷，最優(yōu)選錳和/或鎂。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽片段以以與以下復(fù)合的形式存在(i)兩個錳陽離子，(ii)兩個鎂陽離子或(iii) 一個錳陽離子和一個鎂陽離子。在一個優(yōu)選實施方案中，二價陽離子與對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80和Aspl08的氨基酸(第二陽離子)和對應(yīng)于SEQID NO 2中氨基酸His41、Aspl08、Ilel20和Glull9的氨基酸(第一陽離子)配位。在一個優(yōu)選實施方案中，I位的二價陽離子為錳且2位為錳或鎂，即I位為錳且2位為鎂(參見圖6)，或者I位為錳且2位為錳(參見圖7至10、圖17和圖18)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽片段是這樣的多肽片段或其變體，其中N端與SEQ ID NO :2的PA亞基氨基酸序列的15位或更低位(例如15、14、13、12、11、10、9、8、
7、6、5、4、3、2或I位)上的氨基酸相同或相對應(yīng)；而C端與選自SEQ ID NO :2的PA亞基氨基酸序列的 186 至 200 位(例如 186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200位)上的氨基酸相同或相對應(yīng)，優(yōu)選C端與SEQ ID NO :2的PA亞基氨基酸序列的190至200、更優(yōu)選190至198位上的氨基酸相同或相對應(yīng)；其中所述變體在SEQ IDNO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸并且保留核酸內(nèi)切酶 活性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述變體包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52位至64位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體由以下組成SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至64位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸，以及任選的具有氨基酸序列MGSGMA (SEQ IDN03)的氨基端接頭。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至72位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體由以下組成SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至72位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸，以及任選的具有氨基酸序列MGSGMA (SEQ IDN03)的氨基端接頭。在本發(fā)明的另一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體包含SEQ ID NO : 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至69位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所述變體由以下組成SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至69位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸，以及任選的具有氨基酸序列MGSGMA(SEQID NO 3)的氨基端接頭。優(yōu)選地，所述多肽片段具有或者對應(yīng)于選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的5至190位、10至190位、15至190位、20至190位、5至198位、10至198位、15至198位、20至198位氨基酸及其變體，其中所述變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸并且保留核酸內(nèi)切酶活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽片段(變體)a)由以下組成SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸和任選的具有氨基酸序列MGSGMA (SEQ ID NO 3)的氨基端接頭，并且其結(jié)構(gòu)由以下來限定⑴圖I所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(ii)圖2所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iii)圖3所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iv)圖4所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或(V)圖5所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo),或者b)由以下組成SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至64位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸，和任選的具有氨基酸序列MGSGMA (SEQ ID NO 3)的氨基端接頭，并且其結(jié)構(gòu)由以下來限定(vi)圖15所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或(vii)圖16所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽片段的晶體結(jié)構(gòu)由圖I所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定且未與化合物共結(jié)晶(天然結(jié)構(gòu))。更優(yōu)選地，在與化合物共結(jié)晶后，優(yōu)選與調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)本發(fā)明多肽片段核酸內(nèi)切酶活性的化合物共結(jié)晶之后，所述多肽片段(變體)具有圖2至圖5、圖15或圖16所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)限定的晶體結(jié)構(gòu)。尤其優(yōu)選地，在與表I或表2的化合物共結(jié)晶之后，所述多肽片段(變體)具有如圖2至圖5、圖15或圖16所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定的結(jié)構(gòu)，S卩，與4-[3-[(4_氯苯基)甲基]-1-(苯甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-3)共結(jié)晶之后具有如圖2和圖3所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所限定的結(jié)構(gòu)，與4-[4-[(4_氯苯基)甲基]-1-(環(huán)己基 甲基)-4-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-2)共結(jié)晶之后具有如圖4所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所限定的結(jié)構(gòu)，與核糖尿苷一磷酸(rUMP)共結(jié)晶之后具有如圖5所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所限定的結(jié)構(gòu)，與4-[3-[ (4-氯苯基)甲基]-1-(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-1)共結(jié)晶之后具有如圖15所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所限定的結(jié)構(gòu)，或者與[(2R，3R)-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯(EGCG)共結(jié)晶之后具有如圖16所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所限定的結(jié)構(gòu)。鑒于以上內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的是，所述多肽片段(變體)的晶體結(jié)構(gòu)僅由圖I、圖2至圖5、圖15或圖16中所含其氨基酸和任選地其結(jié)合之二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，而不由圖2至圖5、圖15或圖16中還包含的用于共結(jié)晶的各化合物的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)限定，即圖2和圖3中化合物EMBL-R05-3具有殘基描述子(descriptor) ci3，圖4中化合物EMBL-R05-2具有殘基描述子ci2，圖5中的化合物rUMP具有殘基描述子U，圖15中化合物EMBL-R05-1具有殘基描述子cil，圖16中化合物EGCG具有殘基描述子tte。還優(yōu)選的是，具有由圖I所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)限定的結(jié)構(gòu)的所述多肽片段(變體)具有空間群C2的晶型，并且晶胞尺寸為a = 26. 36nm±0. 5nm, b = 6. 62nm±0. 3nm, c =6. 63nm±0. 3nm，a = 90。，β =96±2°，γ = 90。；具有由圖 2 至圖 5 所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)限定的結(jié)構(gòu)的所述多肽片段(變體)具有空間群PZPA的晶型，并且晶胞尺寸為a =5. 46±0· 3nm, b = 12. 25±0· 4nm, c = 13. 0±0· 3nm, α = 90° , β =90° , Y =90° ;具有由圖15所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)限定的結(jié)構(gòu)的所述多肽片段(變體)具有空間群Ρ6222的晶型，并且晶胞尺寸為 a = 7. 50nm±0. 3nm, b = 7. 50nm±0. 3nm, c = 12. 00nm±0. 5nm, α =90。，β = 90°，Y = 120° ;或具有由圖16所示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)限定的結(jié)構(gòu)的所述多肽片段(變體)具有空間群P6422的晶型，并且晶胞尺寸為a = 9. 99nm±0. 5nm, b = 9. 99nm±0. 5nm, c =
8.27nm±0. 3nm, a = 90° , β = 90° , γ = 120°。優(yōu)選地，多肽片段(變體)的晶體以2.8 A或更高、優(yōu)選2.6 A或更高、更優(yōu)選
2.5 A或更高、甚至更優(yōu)選2.4 Λ或更高、最優(yōu)選2.1 I或更高或者1.9 A或更高的分辨率衍射X射線。例如多肽片段(變體)的晶體以1.9、2.0、2. 1、2. 2、2. 3、2.4、2. 5、2.6、2. 7、2.8 Λ或更高的分辨率衍射X射線。
本發(fā)明的另一方面提供了編碼本發(fā)明的上述(分離的)PA多肽片段及其變體的分離的多核苷酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的多核苷酸編碼包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列之I至198位氨基酸的PA多肽片段。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的多核苷酸編碼包含SEQ ID N02所示氨基酸序列之I至198位氨基酸的PA多肽片段變體，其中52位至64位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所述分離的多核苷酸編碼包含SEQ ID N02所示氨基酸序列之I至198位氨基酸的PA多肽片段變體，其中52位至72位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。 在本發(fā)明的另一更優(yōu)選實施方案中，所述分離的多核苷酸編碼包含SEQ ID N02所示氨基酸序列的I至198位氨基酸的PA多肽片段變體，其中52位至69位氨基酸被替換為氨基酸甘氨酸。用于得到這些分離的核苷酸片段的分子生物學(xué)方為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(對于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，參見Sambrook等編，"Molecular Cloning A LaboratoryManual " , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork(1989)，其通過引用并入本文)。例如，可從經(jīng)甲型流感2009大流行HlNl病毒感染的細(xì)胞中分離RNA，并且使用隨機(jī)引物(例如隨機(jī)六聚體或十聚體)或者用于產(chǎn)生目的片段的特異性引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)產(chǎn)生cDNA。然后可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR使用片段特異性引物擴(kuò)增目的片段。編碼甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基片段的分離的核苷酸來自SEQ ID N0:1。在此情況下，“來自”是指SEQ ID NO : I編碼全長PA多肽，因此編碼優(yōu)選PA多肽片段的多核苷酸可根據(jù)各自所編碼PA多肽片段的需要在多核苷酸的3’和/或5’端包含缺失。在另一方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的重組載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解用于將目的多核苷酸序列整合入載體的技術(shù)(也參見Sambrook等，1989,見上)。這些載體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何載體，包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體例如λ噬菌體、病毒載體例如腺病毒或桿狀病毒、或者人工染色體載體例如細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)或Pl人工染色體(PAC)。所述載體可以是適于原核或真核表達(dá)的表達(dá)載體。所述質(zhì)?？砂瑥?fù)制起點(diǎn)(ori),多克隆位點(diǎn)和調(diào)節(jié)序列例如啟動子(組成型或誘導(dǎo)型)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、多聚腺苷酸化信號以及選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性或基于對突變或缺失進(jìn)行回補(bǔ)(complementation)的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。在一個實施方案中，所述目的多核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列有效連接。在另一個實施方案中，所述載體包含編碼幫助純化目的多肽片段之表位、肽或蛋白質(zhì)標(biāo)簽的核苷酸序列。這些表位、肽或蛋白質(zhì)標(biāo)簽包括但不限于血凝素(HA)、FLAG、myc標(biāo)簽、多聚His標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、NusA以及硫氧還蛋白標(biāo)簽，或者熒光蛋白標(biāo)簽例如(增強(qiáng)型)綠色熒光蛋白((E)GFP)、(增強(qiáng)型)黃色熒光蛋白((E)YFP)、來自珊瑚(Discosoma)物種的(DsRed)或者單體的(mRFP)紅色熒光蛋白(RFP)、青色熒光蛋白(CFP)等。在一個優(yōu)選實施方案中，可將表位、肽或蛋白質(zhì)標(biāo)簽從目的多肽片段上切下，例如，使用蛋白酶如凝血酶、因子Xa、PreScission、TEV蛋白酶等。優(yōu)選地，標(biāo)簽可用TEV蛋白酶切下。這些蛋白酶的識別位點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，TEV蛋白酶的七氨基酸的共有序列識別位點(diǎn)為Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser，其中X可以是任何氨基酸并且在本發(fā)明的情況下優(yōu)選為Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO 12)。在另一個實施方案中，所述載體包含導(dǎo)致目的多肽片段分泌到重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中或者細(xì)菌的周質(zhì)間隙中的功能性序列。所述信號序列片段通常編碼信號肽，該信號肽由引導(dǎo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌出來的疏水氨基酸構(gòu)成。所述蛋白質(zhì)或分泌到生長培養(yǎng)基中(革蘭氏陽性菌)，或分泌到位于細(xì)胞外膜與內(nèi)膜之間的周質(zhì)間隙中(革蘭氏陰性菌)。優(yōu)選地，在信號肽片段與外源基因之間編碼有加工位點(diǎn)，其可在體內(nèi)或體外被切割。在另一方面中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的分離的多核苷酸或本發(fā)明的重組載體的重組宿主細(xì)胞。所述重組宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞例如古細(xì)菌和細(xì)菌細(xì)胞、或者真核細(xì)胞例如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解將所述分離的多核苷酸或所述重組載體引入所述宿主細(xì)胞的方法。例如，細(xì)菌細(xì)胞可使用例如化學(xué)轉(zhuǎn)化(如氯化鈣法)或者電穿孔容 易地進(jìn)行轉(zhuǎn)化。酵母細(xì)胞可以例如使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法或電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。其它真核細(xì)胞可例如使用市售的基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑盒例如Lipofectamine (Invitrogen)、市售的基于脂類的轉(zhuǎn)染試劑盒例如Fugene (Roche Diagnostics)、基于聚乙二醇的轉(zhuǎn)染、磷酸I丐沉淀、基因槍(生物轟擊(biolistic))、電穿孔或者病毒感染進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述重組宿主細(xì)胞表達(dá)目的多核苷酸片段。在一個甚至更優(yōu)選實施方案中，所述表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明的可溶性多肽片段。這些多肽片段可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白質(zhì)純化方法進(jìn)行純化，任選地利用上述表位、肽或蛋白質(zhì)標(biāo)簽。在另一方面中，本發(fā)明涉及鑒定對甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶之PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的化合物的方法，其包括下列步驟a)構(gòu)建由以下結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義的活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型(i)如圖I所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，( )如圖2所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iii)如圖3所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iv)如圖4所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(V)如圖5所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(vi)如圖15所示的本發(fā)明多肽片段(變體)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或者(vii)如圖16所示的本發(fā)明多肽片段(變體)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。b)通過選自以下的方法來選擇潛在的調(diào)節(jié)化合物(i)將分子片段組裝成所述化合物，(ii)從小分子數(shù)據(jù)庫中選擇化合物，和(iii)對所述化合物進(jìn)行從頭配體設(shè)計；c)采用計算方法進(jìn)行所述化合物與所述活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型之間的擬合程序運(yùn)算，以提供所述化合物在所述活性位點(diǎn)的能量最低的構(gòu)型；以及d)評價所述擬合運(yùn)算的結(jié)果來定量所述化合物與活性位點(diǎn)的模型之間的關(guān)聯(lián)，從而評價所述化合物與所述活性位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的能力。在一個優(yōu)選實施方案中，在本發(fā)明方法中的步驟a)中構(gòu)建由以下結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義的活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型⑴如圖I所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(即氨基酸結(jié)構(gòu)坐標(biāo))和如圖I所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(ii)如圖2所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(即氨基酸結(jié)構(gòu)坐標(biāo))和如圖2所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iii)如圖3所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)和如3所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iv)如圖4所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)和如圖4所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(V)如圖5所示的本發(fā)明多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)和如圖5所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(vi)如圖15所示的本發(fā)明多肽片段(變體)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(即氨基酸結(jié)構(gòu)坐標(biāo))和如圖15所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，和/或(vii)如圖16所示的本發(fā)明多肽片段(變體)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(即氨基酸結(jié)構(gòu)坐標(biāo))和如圖16所示的二價陽離子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)化合物與甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基及其變體中的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，優(yōu)選結(jié)合。調(diào)節(jié)化合物可提高或降低(優(yōu)選降低)所述核酸內(nèi)裂解活性。在本發(fā)明該方面的一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)來自甲型流感2009大流行HlNl病 毒的RNA依賴性RNA聚合酶之PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的化合物降低所述活性，更優(yōu)選地所述化合物抑制所述活性。優(yōu)選地，與不具有所述化合物而其它反應(yīng)條件(即緩沖條件、反應(yīng)時間和溫度)相同的來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性相比，化合物使所述PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性降低50 %、更優(yōu)選60 %、甚至更優(yōu)選70 %、甚至更優(yōu)選80 %、甚至更優(yōu)選90 %且最優(yōu)選100%。尤其優(yōu)選地，化合物特異性降低或抑制來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性，但是不以相同程度降低或抑制(優(yōu)選根本不降低或抑制)其它核酸內(nèi)切酶、尤其是哺乳動物的核酸內(nèi)切酶的核酸內(nèi)裂解活性?；趫DI的(天然)核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，本發(fā)明允許使用分子設(shè)計技術(shù)來鑒定、選擇或設(shè)計潛在地對來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶之PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的化合物?；趫D2至圖5、圖15或圖16的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，本發(fā)明首次進(jìn)一步允許優(yōu)化鑒定、選擇和設(shè)計潛在地對來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶之PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的化合物。所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)由已與調(diào)節(jié)化合物共結(jié)晶的本發(fā)明多肽片段(多肽片段變體)得到，優(yōu)選與4-[3-[(4_氯苯基)甲基]-1-(苯甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-3)(參見圖2和圖3)、4_[4_[ (4-氯苯基)甲基]-1-(環(huán)己基甲基)-4-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-2)(參見圖4)、核糖尿苷一磷酸(rUMP)(參見圖5)、4-[3-[(4_氯苯基)甲基]-1-(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-1)(參見圖 15)或[(2R，3R)-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯(EGCG)(參見圖16)共結(jié)晶(還參見表I或表2)。換言之，本發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，不具有結(jié)合化合物的本發(fā)明多肽片段(變體)(即天然多肽片段(變體))的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(參見例如圖I)與具有結(jié)合化合物的本發(fā)明多肽片段(變體)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(參見例如圖2至圖5、圖15或圖16)不同，因為在化合物結(jié)合之后，所述多肽片段(變體)改變了其構(gòu)象。因此，這種新的三維信息允許對現(xiàn)有抑制劑的修飾進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計以改善其效力，或設(shè)計和優(yōu)化有效阻斷核酸內(nèi)切酶活性的新型抑制劑。
鑒于與制備和測試可能可調(diào)節(jié)核酸內(nèi)裂解活性的多種化合物相關(guān)的較高成本，這樣的預(yù)測模型是有價值的。為了使用針對甲型流感2009大流行HlNl的PA多肽片段(變體)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，必須將結(jié)構(gòu)坐標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S形狀。這通過使用能夠從一組結(jié)構(gòu)坐標(biāo)產(chǎn)生分子或其部分之三維圖示的市售軟件來完成。這樣的計算機(jī)程序的一個實例為MODELER (在 Insight II Homology 軟件包(Sali 和 Blundell，1993，J. Mol. Biol.，234，779-815 在 Insight II(97. O),Molecular Simulations Incorporated,San Diego,CA)中運(yùn)行)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用數(shù)種方法來根據(jù)調(diào)節(jié)2009流行性甲型HlNl流感PA亞基或甲型流感2009大流行HlNlPA亞基PA多肽變體之核酸內(nèi)裂解活性的能力篩選化學(xué)實體或片段。該過程可從對例如基于圖I至圖5、圖15或圖16之結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的三維計算機(jī)模型進(jìn)行肉眼觀察開始。然后可將選擇的片 段或化學(xué)化合物以多種方向放置于或?qū)尤牖钚晕稽c(diǎn)內(nèi)。可使用軟件例如Cerius、Quanta和Sybyl (Tripos Associates,St. Louis, MO)完成對接，然后是的能量最小化和具有標(biāo)準(zhǔn)分子動力學(xué)力場的分子動力學(xué)，例如0PLS-AA、CHARMM和AMBER?？稍诤线m化合物或片段的選擇過程中協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員的另一些專門化計算機(jī)程序包括，例如(i)AUTODOCK(GoodselI等，1990, Proteins Struct. , Funct. , Genet. ,8 195-202 ；AUT0D0CK 可得自 Scripps Research Institute,La Jolla, CA)以及(ii)DOCK(Kuntz 等，1982，J. Mol. Biol.，161 :269-288 頁；DOCK 可得自University of California, San Francisco, CA)。一旦選擇了合適的化合物或片段，則可將其設(shè)計或組裝成單個化合物或復(fù)合物。這種人工建模利用軟件例如Quanta或Sybyl進(jìn)行。在單個化合物或片段的連接中協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員的可用程序包括，例如(i) CAVEAT (Bartlett等，1989, MolecularRecognition in Chemical 和 Biological Problems, Special Publication, RoyalChem. Soc. 78 182-196 ；Lauri 和 Bartlett,1994，J.Comp. Aid. Mol. Des. 8 :51-66 ；CAVEAT 可得自 University of California, Berkley, CA), (ii) 3D Database 系統(tǒng)例如ISIS (MDL Information Systems, San Leandro, CA ;綜述于 Martin, 1992, J. Med. Chem. 35 2145-2154),和(iii)HOOK(Eisen 等，1994, Proteins Struct. , Funct. , Genet. 19 199-221 ;H00K 可得自 Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA)。本發(fā)明能夠進(jìn)行的另一種方法是在小分子數(shù)據(jù)庫中用計算機(jī)篩選可以與甲型流感2009大流行HlNlPA亞基的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)或甲型流感2009大流行HlNlPA多肽變體之活性位點(diǎn)以整體或部分結(jié)合的化合物。在此篩選中，這些化合物與活性位點(diǎn)的匹配度可由形狀互補(bǔ)性或者由估計的相互作用能量來判斷(Meng等，1992, J. Comp. Chem. 13 505-524)?；蛘撸糜诩仔土鞲?009大流行HlNlPA亞基或其甲型流感2009大流行HlNl多肽變體的核酸內(nèi)裂解活性的潛在調(diào)節(jié)劑(優(yōu)選核酸內(nèi)裂解活性的抑制劑)可基于圖I至圖5的PA多肽片段的3D結(jié)構(gòu)從頭設(shè)計。有本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的多種配體從頭設(shè)計方法。這些方法包括(i) LUDI (Bohm, 1992，J. Comp. Aid. Mol. Des. 6 :61-78 ;LUDI 可得自 MolecularSimulations Incorporated,San Diego,CA),(ii)LEGEND(Nishibata和Itai,Tetrahedron47 :8985-8990 ;LEGEND 可得自 Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA),(iii) LeapFrog (可得自 Tripos Associates, St. Louis, MO), (iv) SPROUT (Gi I let 等，1993，J. Comp. Aid. Mol. Des. 7 :127-153 ；SPROUT 可得自 University of Leeds, UK)，(v)GROUPBUILD (Rotstein 和 Murcko，1993，J. Med. Chem. 36 :1700-1710)，以及(vi) GROW (Moon和 Howe, 1991，Proteinsll :314-328)。此外，可支持本領(lǐng)域技術(shù)人員對核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的潛在調(diào)節(jié)劑和/或抑制劑(優(yōu)選核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的結(jié)合伴侶)進(jìn)行從頭設(shè)計和建模的數(shù)種分子建模方法(通過引用并入本文)已有描述，并且包括如Cohen等，1990，J. Med. Chem. 33 =883-894 ；Navia 和 Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 :202-210 ；Balbes 等，1994,綜述于Computational Chemistry,第 5 卷，Lipkowitz 和 Boyd 編，VCH, New York,第 37-380 頁；Guida, 1994，Curr. Opin. Struct. Biol. 4 :777-781。被設(shè)計或選擇用作與甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)相結(jié)合的分子可以進(jìn)一步通過計算進(jìn)行優(yōu)化，從而使其在結(jié)合狀態(tài)下優(yōu)選與目 標(biāo)區(qū)域不存在排斥性靜電相互作用。這些非互補(bǔ)性(例如靜電)相互作用包括排斥性電荷-電荷、偶極-偶極以及電荷-偶極相互作用。特別地，在結(jié)合狀態(tài)下結(jié)合化合物與結(jié)合口袋之間所有靜電相互作用之和優(yōu)選對結(jié)合焓無影響或有有利貢獻(xiàn)。本領(lǐng)域有可評價化合物形變能和靜電相互作用的特定計算機(jī)程序。合適的程序?qū)嵗?i)Gaussian 92修訂版 C(Frisch, Gaussian, Incorporated, Pittsburgh, PA), (ii)AMBER,4. 0 版(Koliman,University of California, San Francisco, CA)，(iii)QUANTA/CHARMM(MolecularSimulations Incorporated,San Diego,CA),(iv)OPLS-AA(Jorgensen,1998,Encyclopediaof Computational Chemistry, Schleyer 編，Wiley, New York,第 3 卷，第 1986-1989 頁)，以及(v) Insight II/Discover (Biosysm Technologies Incorporated, San Diego, CA)。這些程序可使用例如Silicon Graphics工作站、IRIS 4D/35或IBM RISC/6000工作站550型來執(zhí)行。其它硬件系統(tǒng)和軟件包是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一旦如上所述選擇和設(shè)計了目的分子，就可對其進(jìn)行一些原子或側(cè)鏈基團(tuán)的替換以改善或修飾其結(jié)合特性。一般來說，最初的替換是保守的，即，替換基團(tuán)與原始基團(tuán)的大小、形狀、疏水性和電荷大致相同。當(dāng)然，應(yīng)理解，應(yīng)避免本領(lǐng)域中已知改變構(gòu)象的組分。然后可通過與如上詳細(xì)所述相同的計算機(jī)方法來分析這些經(jīng)替換的化學(xué)化合物與甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的匹配效率。在本發(fā)明上述方法的一個實施方案中，甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20和His41或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Lys34或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Tyr24或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Arg84 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Phel05或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Tyrl30或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Ile38或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glul 19、Aspl08、Ilel20、His41和Argl24或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34 和 Tyr24 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24 和 Arg84 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glul 19、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84和Phel05或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05和Tyrl30或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30和Ile38或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38 和 Argl24 或其對應(yīng)氨基酸。而在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38 和 Glu26或其對應(yīng)氨基酸，或者SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Argl24 和 Glu26 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38 和 Lysl34或其對應(yīng)氨基酸，或者SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Argl24 和 Lysl34 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38 和 Leul06 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24 和 Leul06 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38 和 Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸611180、6111119、六8口108、116120、把841、1^834、了7124、六找84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24和Lysl37或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的？六亞基的氨基酸611180、6111119、六8口108、116120、出841、1^834、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Gly26 和 Lysl34 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24、Gly26和Lysl34或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 八亞基的氨基酸611180、6111119、48口108、116120、把841、1^834、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Leul06 和 Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸611180、6111119、六8 108、116120、^841、1^834、17^4、六找84、卩1^105、Tyrl30、Ile38、Argl24、Leul06和Lysl37或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26 和 Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24、Glu26和Lysl37或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 八亞基的氨基酸611180、6111119、48口108、116120、把841、1^834、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26 和 Leul06 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24、Glu26和Leul06或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Lysl34^P Leul06 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸611180、6111119、六8 108、116120、^841、1^834、17^4、六找84、卩1^105、Tyrl30、Ile38、Argl24、LyS134和Leul06或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Lysl34^P Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸611180、6111119、六8 108、116120、^841、1^834、17^4、六找84、卩1^105、Tyrl30、Ile38、Argl24、LyS134和Lysl37或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、 Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26、Lysl34 和 Leul06 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24、Glu26、Lysl34 和 Leul06 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸，或者 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Glu26或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含 SEQ ID NO 2 的 PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Lysl34或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Leul06或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Lysl37或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26 和 Lysl34 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34和 Leul06 或其對應(yīng)氨基酸。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 或其對應(yīng)氨基酸。在本發(fā)明上述方法的一個實施方案中，甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20和His41的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于 SEQ ID 勵2中氨基酸611180、6111119、48口108、116120和把841的？4亞基氨基酸6111、Glu、Asp、lie和His的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖 5 的 PA 亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Lys34的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20 和 His41 和 Lys34 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、Ile、His 和 Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Tyr24的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Tyr24的PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His和Tyr的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Arg84的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Arg84 的 PA 亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、Ile、His和Arg的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Phel05的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Phel05 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、 Asp、lie、His和Phe的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖 5 的 PA 亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Tyr130的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Tyr130 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、He, His 和 Tyr的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Ile38的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Ile38的PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His和He的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 Arg124的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Argl24 的 PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His和Arg的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34和Tyr24的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34 和 Tyr24 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、Ile、His、Lys 和 Tyr 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸611180、6111119、48口108、116120、把841、1^834、了7124和 Arg84 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24 和 Arg84 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr 和 Arg的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84 和 Phel05的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84 和 Phel05 的 PA 亞基氨基酸 Glu,Glu,Asp、lie、His、Lys> Tyr、Arg和Phe的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05和Tyr 130的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16 的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24> Arg84> Phel05 和 Tyr 130 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg>Phe和Tyr的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30和Ile38的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ IDNO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30和 Ile38 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg、Phe> Tyr 和 lie 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至圖5的PA亞基SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Asp 108、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38和Argl24的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或圖16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸 Glu80、Glull9、Asp 108、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130,Ile38 和 Argl24 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr、Arg、Phe> Tyr、He 和 Arg的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38和Glu26的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38 和Glu26 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg、Phe> Tyr> He 和 Glu 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38和Lysl34的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO :2中氨基酸611180、6111119、六8 108、116120、^841、1^834、丁7『24、六找84、卩1^105、丁71'130、11638 和Lysl34 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr、Arg、Phe> Tyr> He 和 Lys 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24, Arg84、Phel05、Tyr130,Ile38和Leul06的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID N0:2中氨基酸611180、6111119、六8 108、116120、^841、1^834、丁7『24、六找84、卩1^105、丁71'130、11638 和Leul06 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr、Arg、Phe> Tyr> He 和 Leu 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130,Ilel38和Lys 137的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO:2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130,Ile38 和 Lys137 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys、Tyr、Arg、Phe、Tyr、lie 和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Gly26和Lysl34的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO :2 中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30> Ile38、Glu26 和 Lysl34 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg、Phe> Tyr、lie、Glu和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖 I 至 5 的 PA 亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Leul06 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖 15 或 16 的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Leul06 和 Lysl37 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr、Arg、Phe> Tyr、lie、Leu 和 Lys 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel 20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26 和 Lysl37 的PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、Ile、His、Lys、Tyr、Arg、Phe、Tyr、Ile、Glu 和 Lys 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、 Glu26和Leul06的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO:2中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26 和 Leul06 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg、Phe> Tyr> lie、Glu和Leu的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Lysl34和Leul06的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30> Ile38、Lysl34 和 Leul06 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys>Tyr、Arg、Phe、Tyr、Ile、Lys和Leu的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖 I 至 5 的 PA 亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Lysl34 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Lysl34 和 Lysl37 的 PA 亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、Ile、His、Lys、Tyr、Arg、Phe、Tyr、lie、Lys 和 Lys 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26、Lysl34和Leul06的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26、Lysl34 和 Leul06 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg、Phe> Tyr> lie、Glu、Lys和Leu的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的 PA 亞基 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl 30、Ile38、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 的PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys> Tyr> Arg、Phe> Tyr> lie、Glu、Lys> Leu 和 Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在又一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38、Argl24、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖 15 或 16 的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl24、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 的PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Lys、Tyr、Arg、Phe、Tyr> lie、Arg、Glu、Lys、Leu 和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Glu26的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15 或 16 的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和Glu26的PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His和Glu的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41和Lysl34的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 611180、6111119、48口108、116120、把841和1^8134的？4亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖 I 至 5 的 PA 亞基 SEQ ID NO :2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和Leul06的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Leul06 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His和Leu的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glul 19、Aspl08、Ilel20、His41和Lysl37的PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO :2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26和Lysl34的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15 或 16 的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26和Lysl34的PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、lie、His、Glu和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34 和 Leul06 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖 15 或 16 的分別對應(yīng)于 SEQ ID NO 2 中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34 和 Leul06 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、Ile、His、Glu、Lys 和 Leu 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。在另一個實施方案中，所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO 2中氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)于SEQ ID NO 2中氨基酸Glu80、Glul 19、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 的 PA 亞基氨基酸 Glu、Glu、Asp、lie、His、Glu、Lys、Leu和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，二價陽離子的結(jié)合需要甲型流感2009大流行HlNlPA亞基的活性位點(diǎn)中SEQ ID NO 2的氨基酸His41、Glu80、Aspl08、Glull9和Ilel20(參見，例如圖I和6)，而在圖2至5(也參見圖7至10以及表I和2)所示的結(jié)構(gòu)中化合物(即抑制劑)的結(jié)合需要甲型流感2009大流行HlNlPA亞基的活性位點(diǎn)中SEQ ID NO 2的氨基酸Tyr24、Lys34、Ile38、Arg84、Phel05和Tyrl30，并且這些氨基酸的構(gòu)象從未連接結(jié)構(gòu)(unligated structure)改變(參見圖I和6)。另外,本發(fā)明人確定了還需要甲型流感2009大流行HlNlPA亞基的活性位點(diǎn)中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基Leul06、Lysl34、Lysl37和Glue26以與測試化合物接觸(參見表I和2、圖2至5以及圖7至10)。也參見圖15至19。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在圖16和18所示的結(jié)構(gòu)中化合物(即抑制劑)相互作用需要甲型流感2009大流行HlNlPA亞基的活性位點(diǎn)中的氨基酸Argl24?；衔?配體相互作用的殘基和活性位點(diǎn)的可塑性的三維信息對為改善現(xiàn)有抑制劑的效力而對其進(jìn)行的修飾優(yōu)化設(shè)計非常重要。另外，因而，設(shè)計、鑒定和選擇與這些氨基酸相互作用的新型抗病毒化合物是高度優(yōu)選的。如果根據(jù)本文上述方法的計算機(jī)建模表明化合物與甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的活性位點(diǎn)結(jié)合，則可合成所述化合物并且任選地，所述化合物或其可藥用鹽可以與一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體一起配制。因而，上述方法還可包括以下步驟 (e)合成所述化合物并且任選地將所述化合物或其可藥用鹽與一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體一起配制。任選地，所述化合物或其可藥用鹽或其制劑調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的能力可在體內(nèi)或體外進(jìn)行測試，其還包括進(jìn)一步的以下步驟(f)將所述化合物與本發(fā)明的PA多肽片段或其變體或者本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞相接觸，并確定所述化合物的以下能力(i)結(jié)合活性位點(diǎn)和/或(ii)調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的能力。這些化合物與活性位點(diǎn)的匹配度可通過形狀互補(bǔ)性或估計的相互作用能來判斷(Meng等，1992，J. Comp. Chem. 13 =505-524)。合成所述化合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知或者這些化合物可以是市售的。本發(fā)明的另一個方面是提供一種化合物，其能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)本發(fā)明的甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。優(yōu)選地，所述化合物能夠通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)本發(fā)明的PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)所述PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明的又一方面是提供一種化合物，其能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)本發(fā)明的甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。優(yōu)選地，所述化合物能夠通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)本發(fā)明的PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)(優(yōu)選地降低、更優(yōu)選地抑制)所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明的又一個方面是提供一種化合物，其能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)另一些病毒(優(yōu)選正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒)的PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性。優(yōu)選地，所述化合物能夠通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)另一些病毒(優(yōu)選地正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒)的PA亞基的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)所述PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性。
優(yōu)選地，上述PA亞基或其變體或者PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)具有如上所述的結(jié)構(gòu)。因而，優(yōu)選地，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20和His41或其相應(yīng)氨基酸。更優(yōu)選地，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glul 19、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130 和 Ile38 或其相應(yīng)氨基酸，或者包含 SEQ ID NO 2 的 PA 亞基的氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38 和 Argl24 或其相應(yīng)氨基酸。
還更優(yōu)選地，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Glu26、Lysl34、Leul06 和 Lysl37 或其相應(yīng)氨基酸。最優(yōu)選地，所述活性位點(diǎn)包含SEQ ID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glul 19、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Glu26、Lysl34、Leul06和Lysl37或其相應(yīng)氨基酸，或者包含SEQ ID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20、His41、Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38、Argl 24、Glu26、Lysl34、Leul06和Lysl37或其相應(yīng)氨基酸。優(yōu)選地，上述PA亞基或其變體或者PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)由上述的PA亞基的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限義?？梢匀菀椎卦u估化合物關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)前述PA亞基或其變體或者PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)的能力和/或調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)PA亞基或其變體或者PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的能力。例如，在不存在或存在不同量的測試化合物的情況下將經(jīng)純化的PA亞基或PA亞基多肽片段與其底物(如鍋柄狀RNA或單鏈DNA)接觸并孵育一定的時間，例如5、10、15、20、30、40、60或90分鐘。選擇反應(yīng)條件以使得PA亞基或PA亞基多肽片段在沒有測試化合物的情況下有核酸內(nèi)裂解活性。之后，通過例如凝膠電泳分析底物的降解/核酸內(nèi)裂解切割?；蛘?，此類測試可包含標(biāo)記的底物分子，當(dāng)?shù)孜锓肿颖缓怂醿?nèi)裂解地切割時提供信號，但如果底物分子完整則不提供信號。例如，底物多核苷酸鏈可用突光報告分子和突光淬滅劑標(biāo)記，從而只要底物多核苷酸鏈?zhǔn)峭暾模敲礋晒鈭蟾娣肿泳蜁淮銣?。如果底物多核酸鏈被切割，那么熒光報告分子和淬滅劑分離，從而熒光報告分子發(fā)出可被例如ELISA閱讀器檢測到信號。另一些合適的方法在下文描述。優(yōu)選地，所述化合物可通過上述方法鑒定。更優(yōu)選地，所述化合物通過上述方法鑒定。可由上述方法鑒定的化合物可以調(diào)節(jié)甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性?？捎缮鲜龇椒ㄨb定的化合物可以調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)本發(fā)明的甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。還可以的是，可由上述方法鑒定的化合物也可以調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)另一些病毒(優(yōu)選正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒)的PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明的化合物可以是任何試劑，包括但不限于肽、擬肽、多肽、蛋白質(zhì)(包括抗體)、脂質(zhì)、金屬、核苷酸、核苷、核酸、小有機(jī)或無機(jī)分子、化學(xué)化合物、元素、糖、同位素、碳水化合物、成像劑、脂蛋白、糖蛋白、酶、分析探針、聚胺及其組合和衍生物。術(shù)語“小分子”指分子量為50至約2，500道爾頓、優(yōu)選200 800道爾頓的分子。另外，根據(jù)本發(fā)明的測試化合物可任選地包含可檢測標(biāo)記。這些標(biāo)記包括但不限于酶標(biāo)記、放射性同位素或放射活性化合物或元素、熒光化合物或金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。在本發(fā)明化合物的一個優(yōu)選實施方案中，所述化合物不是4-取代的2- 二氧代丁酸、4-取代的4- 二氧代丁酸、4-取代的2，4- 二氧代丁酸、2，6- 二酮哌嗪或其衍生物、取代的2，6-二酮哌嗪或其衍生物、吡嗪-2，6-二酮或取代的吡嗪-2，6-二酮如行1^丨1^(^、^異輕戍酸或N-輕酰胺(N-hydroxymide)。尤其地，根據(jù)本發(fā)明的化合物不是式I的化合物
Voh
HOH 式IR1 = Me>Et>PhR2 =?；被柞；?、磺?；诒景l(fā)明化合物的另一個優(yōu)選實施方案中，化合物不是4-[3-[(4_氯苯基)甲基]-1-(苯基甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸、4-[4-[ (4-氯苯基)甲基]-1_(環(huán)己基甲基)-4-哌啶基]-2_羥基-4-氧代-2- 丁烯酸、4-[3-[(4_氯苯基)甲基]-1-(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸、核糖尿苷一磷酸(rUMP)、脫氧胸苷一磷酸(dTMP)或2. 4- 二氧代-4-苯基丁酸(DPBA)。在本發(fā)明化合物的又一個優(yōu)選實施方案中，所述化合物不是兒茶素，優(yōu)選地不是(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)如[(21 ，31 )-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯、(-)_表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、(-)_表沒食子兒茶素(EGC)、(-)_表兒茶素(EC)或沒食子酸(GA)。在本發(fā)明之化合物的另一個優(yōu)選實施方案中，所述化合物不是苯乙基苯基酞亞胺、源自反應(yīng)酮或雷特格韋的苯乙基苯基酞亞胺類似物(也是二酮丁酸衍生物)。在又一個方面中，本發(fā)明提供一種(體外)方法，其用于鑒定調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)來自甲型流感2009大流行HlNl病的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，所述方法包括下列步驟(i)將根據(jù)本發(fā)明的所述多肽片段或其變體或者根據(jù)本發(fā)明的所述重組宿主細(xì)胞與測試化合物接觸，和(ii)分析所述測試化合物調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力。優(yōu)選地，所述化合物通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)所述PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。
在又一個方面中，本發(fā)明提供一種(體外)方法，其用于鑒定結(jié)合核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)，(和)優(yōu)選地調(diào)節(jié)(更優(yōu)選降低、最優(yōu)選抑制)來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，所述方法包括下列步驟(i)將根據(jù)本發(fā)明的所述多肽片段或其變體或者根據(jù)本發(fā)明的所述重組宿主細(xì)胞與測試化合物接觸，和(ii)分析所述測試化合物結(jié)合核酸內(nèi)裂解位點(diǎn)，(和)優(yōu)選地調(diào)節(jié)(更優(yōu)選降低、最優(yōu)選抑制)所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力。在一個實施方案中，甲型流感2009大流行HlNlPA多肽片段或其變體和測試化合物之間的相互作用可以以下拉測定(pull down assay)的形式進(jìn)行分析。例如，可將根據(jù)本發(fā)明的PA多肽片段或其變體純化并固定在珠子上。在一個實施方案中，固定在珠子上的PA多肽片段可與下列物質(zhì)接觸例如(i)另一種經(jīng)純化的蛋白質(zhì)、多肽片段或肽，(ii)蛋白 質(zhì)、多肽片段或肽的混合物或者(iii)細(xì)胞或組織提取物，并且蛋白質(zhì)、多肽片段或肽的結(jié) 合可通過將聚丙烯酰胺凝膠電泳與考馬斯染色或Western印跡聯(lián)合進(jìn)行驗證。未知的結(jié)合伴侶可通過質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定。在另一個實施方案中，甲型流感2009大流行HlNlPA多肽片段或其變體和測試化合物之間的相互作用可采用基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的實驗的形式進(jìn)行分析。在一個實施方案中，可將根據(jù)本發(fā)明的PA多肽片段或其變體固定在ELISA板的表面并與測試化合物接觸。對于例如蛋白質(zhì)、多肽、肽和表位標(biāo)簽化的化合物，可以通過對測試化合物或表位標(biāo)簽特異的抗體來驗證測試化合物的結(jié)合。這些抗體可以直接偶聯(lián)酶或用偶聯(lián)所述酶(與合適的底物組合)的第二抗體進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(例如，辣根過氧化物酶)或顯色反應(yīng)(堿性磷酸酶)來檢測。在另一個實施方案中，不能通過抗體檢測的化合物結(jié)合可通過直接偶聯(lián)測試化合物的標(biāo)記來驗證。這些標(biāo)記可包括酶標(biāo)記、放射性同位素或放射性化合物或元素、熒光化合物或金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。在另一個實施方案中，可將測試化合物固定在ELISA板上并與根據(jù)本發(fā)明的PA多肽片段或其變體接觸。所述多肽的結(jié)合可通過如上述的PA多肽片段特異性抗體和化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)來驗證。在又一個實施方案中，經(jīng)純化的甲型流感2009大流行HlNlPA多肽片段或其變體可與肽陣列一起孵育，并且PA多肽片段與對應(yīng)特定肽序列的特異性肽點(diǎn)的結(jié)合可通過以下進(jìn)行分析例如PA多肽特異性抗體、針對融合至PA多肽片段的表位標(biāo)簽的抗體或者通過由PA多肽片段偶聯(lián)的熒光標(biāo)簽發(fā)出的熒光信號。在另一個實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞與測試化合物接觸。這可通過將測試蛋白質(zhì)或多肽共表達(dá)并通過例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或免疫共沉淀驗證相互作用來實現(xiàn)。在另一個實施方案中，可將直接標(biāo)記的測試化合物添加至重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中。測試化合物穿透膜并結(jié)合PA多肽片段的能力可例如通過所述多肽的免疫沉淀以及驗證標(biāo)記的存在來驗證。在另一個實施方案中，評估測試化合物調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的能力。例如，在不同量的測試化合物存在或不存在的情況下使經(jīng)純化的PA亞基多肽片段與其底物(如鍋柄狀RNA或單鏈DNA)接觸并孵育一定時間，例如5、10、15、20、30、40、60或90分鐘。選擇反應(yīng)條件以使PA亞基多肽在沒有測試化合物的情況下有核酸內(nèi)裂解活性。之后，通過例如凝膠電泳分析底物的降解/核酸內(nèi)裂解切割?；蛘?，此類測試可包含標(biāo)記的底物分子，當(dāng)?shù)孜锓肿颖缓怂醿?nèi)裂解切割時提供信號，而如果底物分子完整則不提供信號。例如，底物多核苷酸鏈可用突光報告分子和突光淬滅劑標(biāo)記，從而只要底物多核苷酸鏈?zhǔn)峭暾?，那么突光報告分子就被淬滅。如果底物多核酸鏈被切割，那么突光報告分子和淬滅劑分離，從而突光報告分子發(fā)出可被例如ELISA閱讀器檢測到信號。這個實驗設(shè)置可應(yīng)用于多孔板形式并且適于根據(jù)化合物調(diào)節(jié)、降低或抑制甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力來高通量篩選所述化合物。優(yōu)選地，測試化合物抑制甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力在上述方法中進(jìn)行分析。在一個優(yōu)選實施方案中，關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)且調(diào)節(jié)、降低和/或抑制甲型流感2009大流行HlNl PA亞基多肽片段或其變體之核酸內(nèi)裂解活性的化合物的上述鑒定方法以高通量形式進(jìn)行。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法使用根據(jù)本發(fā)明的PA多肽片段或其變體和標(biāo)記的測試化合物在如上述的多孔微量滴定板中進(jìn)行。 在一個優(yōu)選實施方案中，測試化合物來自合成或天然化合物的文庫。例如，合成化合物文庫可購自 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、ChemBridgeCorporation (San Diego, CA)或 Aldrich (Milwaukee, WI)。天然化合物文庫例如可得自TimTec LLC(Newark, DE)?；蛘?，可使用細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物的天然化合物文庫。另外，可使用組合化學(xué)合成產(chǎn)生單種化合物或混合物形式的測試化合物。在另一個實施方案中，可以以體內(nèi)形式測試所鑒定化合物對甲型流感2009大流行HlNl病毒的生命周期的抑制作用?？梢栽谒b定化合物存在或不存在的情況下，用甲型流感2009大流行HlNl病毒感染對易受流感病毒感染的細(xì)胞系，如293T人胚腎細(xì)胞、Madin-Darby狗腎細(xì)胞或雞胚成纖維細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，可將已鑒定的化合物以多種濃度添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中。病毒蝕斑的形成可被用作甲型流感2009大流行HlNl病毒的感染能力的讀出值，并且可將經(jīng)鑒定化合物處理的細(xì)胞與未用其處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。在本發(fā)明的又一個實施方案中，應(yīng)用于任何上述方法的測試化合物是小分子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述小分子來自文庫，例如小分子抑制劑文庫。在另一個實施方案中，所述測試化合物是肽或蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述肽或蛋白質(zhì)來自肽文庫或蛋白質(zhì)文庫。在用于計算和體外鑒定關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)且調(diào)節(jié)、降低和/或抑制本發(fā)明甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體之核酸內(nèi)裂解活性的化合物的上述方法的另一個實施方案中，所述方法還包括將所述化合物或其可藥用鹽與一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體一起配制的步驟。如上文所述，本發(fā)明的一個方面是提供一種化合物，其能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)本發(fā)明的甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。優(yōu)選地，所述化合物能夠通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)本發(fā)明的PA亞基或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)所述PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明的另一個方面是提供一種化合物，其能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)根據(jù)本發(fā)明的甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。優(yōu)選地，所述化合物能夠通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)根據(jù)本發(fā)明的PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)、優(yōu)選地降低、更優(yōu)選地抑制所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明的又一個方面是提供一種化合物，其能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)另一些病毒(優(yōu)選為正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒)的PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性。優(yōu)選地，所述化合物能夠通過關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)另一些病毒(優(yōu)選為正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒)的PA亞基的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)來調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)所述PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性。可容易地評估化合物關(guān)聯(lián)(優(yōu)選結(jié)合)前述PA亞基或其變體或者PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性位點(diǎn)和/或調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)PA亞基或其變體或者PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)裂解活性的能力。例如，在不同量的測試化合物存在或不存在的情況下使經(jīng)純化的PA亞基或PA亞基多肽片段與其底物(如鍋柄狀RNA或單鏈DNA)接觸并孵育一定的時間，例如5、10、15、20、30、40、60或90分鐘。選擇反應(yīng)條件使得PA亞基或PA亞基多肽片段在沒有測試化合物的情況下有核酸內(nèi)裂解活性。之后，通過 例如凝膠電泳分析底物的降解/核酸內(nèi)裂解切割?；蛘撸祟悳y試可包含標(biāo)記的底物分子，當(dāng)?shù)孜锓肿颖缓怂醿?nèi)裂解切割時提供信號，而如果底物分子完整則不提供信號。例如，底物多核苷酸鏈可用熒光報告分子和熒光淬滅劑標(biāo)記，從而只要底物多核苷酸鏈?zhǔn)峭暾?，那么熒光報告子就會被淬滅。如果底物多核酸鏈被切割，那么熒光報告子和淬滅劑分離，從而突光報告子發(fā)出可被例如ELISA閱讀器檢測到信號。另一些合適的方法在下文描述。優(yōu)選地，所述化合物可通過上述(體外)方法進(jìn)行鑒定。更優(yōu)選地，所述化合物通過上述(體外)方法進(jìn)行鑒定?？捎缮鲜?體外)方法鑒定的化合物可以調(diào)節(jié)甲型流感2009大流行HlNlPA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性?？捎缮鲜?體外)方法鑒定的化合物可以調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)根據(jù)本發(fā)明的甲型流感2009大流行HlNlPA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。還可以的是，可由上述(體外)方法鑒定的化合物可以調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低、更優(yōu)選抑制)另一些病毒(優(yōu)選正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒)的PA亞基的核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明化合物可以是以上計算機(jī)(in silico)篩選方法中所述的任何試劑。在本發(fā)明化合物的一個優(yōu)選實施方案中，化合物不是4-取代的2- 二氧代丁酸、4-取代的4- 二氧代丁酸、4-取代的2，4-二氧代丁酸、2，6-二酮哌嗪或其衍生物、取代的2，6-二酮哌嗪或其衍生物、吡嗪_2，6- 二酮或取代的吡嗪_2，6- 二酮如flutimide、N-異羥戊酸或N-羥酰胺。尤其地，根據(jù)本發(fā)明的化合物不是式I的化合物
權(quán)利要求
1.多肽片段，其包含具有核酸內(nèi)切酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基的氨基端片段，其中所述PA亞基來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的SEQ ID NO :2或者是其變體，其中所述變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽片段，其是可溶的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的多肽片段，其是可結(jié)晶的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的多肽片段，其中所述氨基端片段對應(yīng)于SEQIDNO 2的甲型流感2009大流行HlNl病毒RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基的至少I至190位氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的多肽片段，其中所述多肽片段被純化至適于結(jié)晶的程度。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的多肽片段，其結(jié)合了兩個二價陽離子，其中所述二價陽離子優(yōu)選為錳和/或鎂。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的多肽片段，其中N端與SEQID NO :2的PA亞基氨基酸序列的第I位氨基酸一致或?qū)?yīng)，并且C端與選自SEQ ID NO 2的PA亞基氨基酸序列190至198位的氨基酸一致或?qū)?yīng)，或者是其變體，其中所述變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸并且保留核酸內(nèi)切酶活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的多肽片段，所述多肽片段 (a)由以下組成SEQID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，以及任選地具有氨基酸序列MGSGMA(SEQ ID NO 3)的氨基端接頭，并且所述多肽片段具有以下所限定的結(jié)構(gòu)(i)如圖I所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(ii)如圖2所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iii)如圖3所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iv)如圖4所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo),或(V)如圖5所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo),或者 (b)由以下組成SEQID NO 2所示氨基酸序列的I至198位氨基酸，其中52至64位氨基酸替換為氨基酸甘氨酸，以及任選地具有氨基酸序列MGSGMA (SEQ ID NO 3)的氨基端接頭，并且所述多肽片段具有以下所限定的結(jié)構(gòu)(vi)如圖15所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或(vii)如圖16所示的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽片段，其中所述多肽片段具有以下所限定的結(jié)構(gòu)(i)具有空間群C2的晶型，并且晶胞尺寸為a = 26. 36nm±0. 5nm、b = 6. 62nm±0. 3nm、c =.6.63nm±0. 3nm、a =90°、β = 96±2。、γ =90°，(ii)至(v)具有空間群 P2PA 的晶型，并且晶胞尺寸為 a = 5· 46±0· 3nm、b = 12. 25±0· 4nm、c = 13. 0±0· 3nm、α = 90°、β= 90°、γ = 90°，(vi)具有空間群Ρ6222的晶型，并且晶胞尺寸為a = 7. 50nm±0. 3nm、b = 7. 50nm±0. 3nm、c = 12. 00nm±0. 5nm、a = 90°、β = 90°、Y = 120。，或(vii)具有空間群P6422的晶型，并且晶胞尺寸為a = 9. 99nm±0. 5nm、b = 9. 99nm±0. 5nm、c =.8. 27nm±0. 3nm、a = 90°、β = 90°、Y = 120°。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多肽片段，其中所述晶體以2.6I或更高、優(yōu)選2.1產(chǎn)或更高或者1.9 I或更高的分辨率衍射X射線。
11.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求I至 ο中任一項所述的分離的多肽片段。
12.重組載體，其包含權(quán)利要求11所述的分離的多核苷酸。
13.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11所述的分離的多核苷酸或權(quán)利要求12所述的重組載體。
14.用于鑒定化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性，所述方法包括下列步驟 (a)構(gòu)建由以下限定的活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型(i)如圖I所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(ii)如圖2所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iii)如圖3所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(iv)如圖4所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(V)如圖5所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，(vi)如圖15所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或者(vii)如圖16所示的權(quán)利要求8的多肽片段的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)， (b)通過選自以下的方法來選擇潛在的調(diào)節(jié)化合物 (i)將分子片段組裝成所述化合物， (ii)從小分子數(shù)據(jù)庫中選擇化合物，和 (iii)對所述化合物進(jìn)行從頭配體設(shè)計； (c)采用計算方法進(jìn)行所述化合物與所述活性位點(diǎn)的計算機(jī)模型之間的擬合程序運(yùn)算，以提供所述化合物在所述活性位點(diǎn)的能量最低的構(gòu)型；以及 (d)評價所述擬合運(yùn)算的結(jié)果來定量所述化合物與所述活性位點(diǎn)的模型之間的關(guān)聯(lián)，從而評價所述化合物與所述活性位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的能力。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述活性位點(diǎn)包含SEQID NO :2的PA亞基的氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20和His41或與其對應(yīng)的氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述活性位點(diǎn)還包含SEQID NO :2的PA亞基的氨基酸 Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130, Ile38 和 Argl24 或與其對應(yīng)的氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述活性位點(diǎn)還包含SEQID NO 2的PA亞基的氨基酸Glu26、Lysl34、Leul06和Lysl37或與其對應(yīng)的氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQIDNO :2之氨基酸Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20和His41的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15 或 16 的分別對應(yīng) SEQ ID NO :2 之氨基酸 Glu80、Glull9、Aspl08、Ilel20 和 His41 的 PA亞基氨基酸Glu、Glu、Asp、Ile和His的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQIDNO :2 之氨基酸 Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyrl30、Ile38 和 Argl24 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)SEQ ID NO 2之氨基酸Lys34、Tyr24、Arg84、Phel05、Tyr130、Ile38 和 Argl24 的 PA 亞基氨基酸 Lys、Tyr、Arg、Phe、Tyr、lie 和 Arg 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述活性位點(diǎn)由根據(jù)圖I至5的PA亞基SEQ ID NO :2之氨基酸Glu26、Lysl34、Leul06和Lysl37的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定，或者由根據(jù)圖15或16的分別對應(yīng)SEQ ID NO 2之氨基酸Glu26、Lysl34、Leul06和Lysl37的PA亞基氨基酸Glu、Lys、Leu和Lys的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來限定。
21.根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項所述的方法，其還包括以下步驟 (e)合成所述化合物，并且任選地將所述化合物或其可藥用鹽與一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體一起配制。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其還包括以下步驟 (f)使所述化合物與權(quán)利要求I至10中任一項所述的多肽片段或其變體或者權(quán)利要求13所述的重組宿主細(xì)胞接觸，并且測定所述化合物調(diào)節(jié)所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力。
23.鑒定化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)來自甲型流感2009大流行HlNl病毒的RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基或其變體的核酸內(nèi)切酶活性，所述方法包括以下步驟 (i)使權(quán)利要求I至10中任一項所述的多肽片段或其變體或者權(quán)利要求13所述的重組宿主細(xì)胞與測試化合物接觸，和 (ii)分析所述測試化合物調(diào)節(jié)所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中對所述測試化合物抑制所述PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的能力進(jìn)行分析。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述方法以高通量形式進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述測試化合物是小分子。
27.根據(jù)權(quán)利要求23至26中任一項所述的方法，其中所述測試化合物是肽或蛋白質(zhì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項所述的方法，其中所述方法還包括將所述化合物或其可藥用鹽與一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體一起配制的步驟。
29.化合物，其能夠調(diào)節(jié)、優(yōu)選抑制權(quán)利要求I至10中任一項所述的PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其中所述化合物可通過權(quán)利要求14至22中任一項所述的方法或通過權(quán)利要求23至28中任一項所述的方法鑒定。
31.藥物組合物，其包含權(quán)利要求29或30所述的化合物或其可藥用鹽以及一種或更多種可藥用賦形劑和/或載體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物可通過權(quán)利要求21或28所述的方法生產(chǎn)。
33.針對SEQID NO :2的甲型流感2009大流行HlNl病毒PA亞基或其變體的活性位點(diǎn)的抗體，其中所述變體在SEQ ID NO 2的186位氨基酸或與其對應(yīng)的氨基酸位置上包含氨基酸絲氨酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的抗體，其中所述抗體識別SEQID NO :2所示氨基酸序列的5至15個氨基酸長度的多肽片段，其中所述多肽片段包含選自以下的一個或更多個氨基酸殘基Lys34、Glu26、Ile38、Tyr24、His41、Glu80、Arg84、Leul06、Aspl08、Glull9、Ilel20、Tyr130,Lysl34、Phel05、Lysl37和 Argl24。
35.權(quán)利要求29或30的化合物、權(quán)利要求31或32的藥物組合物或者權(quán)利要求33或34的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、改善或預(yù)防由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)和 / 或沙粒病毒科(Arenviridae)病毒通過病毒感染而引起的疾病病癥，優(yōu)選由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染而引起的疾病病癥。
36.4- [3- [ (4-氯苯基)甲基]-I-(苯基甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-3)、4- [4- [ (4-氯苯基)甲基]_1_ (環(huán)己基甲基)_4_哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-2)、4-[3-[(4-氯苯基)甲基]-I-(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-1)或[(2R，3R)-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5-三羥基苯甲酸酯(EGCG)在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、改善或預(yù)防由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染而引起的疾病病癥。
37.權(quán)利要求29或30的化合物、權(quán)利要求31或32的藥物組合物或者權(quán)利要求33或34的抗體,其用于治療、改善或預(yù)防由正粘病毒科、布尼亞病毒科和/或沙粒病毒科病毒通過病毒感染而引起的疾病病癥，優(yōu)選由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染而引起的疾病病癥。
38.4- [3- [ (4-氯苯基)甲基]-I-(苯基甲基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-3)、4-[4-[(4-氯苯基)甲基]_1_ (環(huán)己基甲基)_4_哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2- 丁烯酸(EMBL-R05-2)、4_ [3- [ (4-氯苯基)甲基]-I-(苯基甲基磺基)-3-哌啶基]-2-羥基-4-氧代-2-丁烯酸(EMBL-R05-1)或[(2R，3R)-5，7-二羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)色滿-3-基]3，4，5_三羥基苯甲酸酯(EGCG)，其用于治療、改善或預(yù)防由甲型流感2009大流行HlNl病毒通過病毒感染而引起的疾病病癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含具有核酸內(nèi)切酶活性的病毒RNA依賴性RNA聚合酶PA亞基之氨基端片段的多肽片段，其中所述PA亞基來自甲型流感2009大流行H1N1病毒或其變體。本發(fā)明還涉及(i)適于使用X射線晶體衍射對所述多肽片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定的多肽片段晶體，以及(ii)使用所述多肽的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來篩選和設(shè)計對多肽片段中的核酸內(nèi)裂解(endonucleolytically)活性位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)的化合物的計算方法。此外，本發(fā)明涉及鑒定(優(yōu)選以高通量形式鑒定)與具有核酸內(nèi)切酶活性的PA多肽片段結(jié)合并且優(yōu)選抑制所述核酸內(nèi)裂解活性的化合物的方法。本發(fā)明還涉及能夠調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)本發(fā)明PA亞基多肽片段或其變體的核酸內(nèi)切酶活性的化合物，以及包含所述化合物的藥物組合物，其用于治療由正粘病毒(Orthomyxoviridae)科、布尼亞病毒(Bunyaviridae)科和/或沙粒病毒科(Arenviridae)病毒通過病毒感染引起(優(yōu)選由甲型流感2009大流行H1N1病毒的病毒感染引起)的疾病病癥。優(yōu)選地，所述化合物可通過本文公開的方法進(jìn)行鑒定，或者所述藥物組合物可通過本文公開的方法生產(chǎn)。
文檔編號A61K31/33GK102803288SQ201180014380
公開日2012年11月28日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者斯蒂芬·庫薩克, 伊娃·科瓦林斯基, 克洛艾·蘇維塔 申請人:歐洲分子生物學(xué)實驗室(Embl)