專利名稱：體內(nèi)功效延長的生長激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基連接的生長激素化合物及制備和使用這類化合物的方法。這些生長激素綴合物對蛋白水解性降解的抗性提高且作用特征延長，并且可用于治療。
背景技術(shù)：
生長激素是一種由哺乳動物垂體前葉分泌的多肽激素。依物種而定，生長激素是一種由大約190個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，對應(yīng)分子量約為22kDa。生長激素與細胞表面受體即生長激素受體(GHR)結(jié)合，并通過生長激素受體發(fā)出信號。生長激素在促進生長、保持正常身體組成、合成代謝和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用。它還對中間代謝具有直
接作用，例如葡萄糖攝取降低、脂解作用(lipolysis)增加、氨基酸攝取和蛋白質(zhì)合成增力口。該激素還對其它組織發(fā)揮作用，包括脂肪組織、肝、腸、腎、骨骼、結(jié)締組織和肌肉。重組人生長激素(hGH)已有生產(chǎn)且可市售獲得，例如健豪寧(Genotropin ) (PharmaciaUpjohn)、Nutropin 和普蘭品(Protropin ) (Genentech)、優(yōu)猛范(Humatrope ) (EliLilly)、Serostim (Serono)、諾地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、NutropinDepot (Genentech和Alkermes)。另外,在N末端具有額外甲硫氨酸殘基的類似物還以例如速邁個(Somatonorm ) (Pharmacia Upjohn/Pfizer)銷售。生長激素與蛋白質(zhì)生長激素家族的其它成員催乳素(PRL)和胎盤催乳激素(PL)有共同的拓撲結(jié)構(gòu)。生長激素被歸類為4螺旋束蛋白質(zhì)(

圖1)，顯示具有兩個保守二硫鍵的“上-上-下-下(up-up-down-down)”拓撲結(jié)構(gòu)。具體而言，野生型人生長激素(hGH)由191個氨基酸殘基組成，并在53、165、182和189位上具有4個半胱氨酸殘基，其通過形成分別連接C53與C165和C182與C189的2個分子內(nèi)二硫鍵而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)(圖1)。通過X射線晶體學(xué)實驗性地測定了以下的hGH結(jié)構(gòu)游離形式(Chantalet L.等，Proteinand Peptide Letters 3,333-340, (1995))和與其結(jié)合蛋白(人GHR(hGHR)的胞外結(jié)構(gòu)域)的復(fù)合物(Devos, A.M.等，Science 255, 306-312, (1992))。這些結(jié)構(gòu)已保藏在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中，并且是可公開獲取的(PDB登錄代碼分別為IH⑶和1HWG)。因此，根據(jù)已發(fā)表的hGH結(jié)構(gòu)，可鑒定出對于hGH與hGHR結(jié)合重要的殘基。此外，通過核磁共振(NMR)波譜法研究了 hGH 的動力學(xué)性質(zhì)(Kasimova M. R.等.J. Mol. Biol. 318,679-695, (2002))。X射線和NMR數(shù)據(jù)結(jié)合可區(qū)分結(jié)構(gòu)化良好和定義明確的hGH的區(qū)域與結(jié)構(gòu)化較少并且是動態(tài)的區(qū)域。預(yù)期hGH的較少結(jié)構(gòu)化的動態(tài)區(qū)特別易遭蛋白酶剪切，該區(qū)域的適當(dāng)穩(wěn)定可導(dǎo)致蛋白水解穩(wěn)定性改進。已對hGH進行大量誘變以試圖產(chǎn)生具有所需化學(xué)或生物性質(zhì)的hGH類似物。具體而言，已描述了用于若干目的的半胱氨酸突變體。US 2003/0162949公開了 GH超基因家族成員的半胱氨酸變體。提供用于產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的位點特異性的生物活性綴合物的通用方法。所述方法包括將半胱氨酸殘基加到蛋白質(zhì)的非必需區(qū)或采用定點誘變用半胱氨酸殘基取代蛋白質(zhì)中的非必需氨基酸，然后通過所加入的半胱氨酸殘基，將半胱氨酸反應(yīng)性聚合物或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)性部分與蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)。WO 02/055532描述了經(jīng)遺傳工程改造的具有至少一個共價連接的非多肽部分的hGH突變體，特別是其中所引入的半胱氨酸殘基被用于聚乙二醇化的hGH突變體。US 5，951，972描述了有生理活性的衍生化的天然和重組的哺乳動物和人蛋白質(zhì)和多肽，其中蛋白質(zhì)內(nèi)至少一個天然存在的或摻入的半胱氨酸殘基用各種取·代基衍生化。詳細研究了 hGH的蛋白酶剪切。由殘基128-154組成的長環(huán)具有例如以下幾種蛋白酶的推定切割位點凝血酶、纖維蛋白溶酶、膠原酶、枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。因此，hGH的這個部分顯示特別易受蛋白酶剪切影響(Lewis,U. J. Ann. Rev.Physiol. 46，33-42，(1984))。已報道的降解hGH的酶包括凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和激肽釋放酶。已對大鼠組織中的hGH降解進行了研究(Garcia-Barros等 J. Endocrinol.1nvest. 23,748-754，(2000))。 發(fā)現(xiàn)在大鼠甲狀腺中，有利于在大型和親脂性氨基酸殘基處切割的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶首先切割Y143和S144之間的肽鍵，產(chǎn)生2鏈分子，接著在Y42和S43之間切割，釋放N端肽F1-Y42。再通過胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶在F146和D147之間切割并再通過羧肽酶的作用，加工2鏈分子中的裂解環(huán)(split loop) o已報道了產(chǎn)生對蛋白水解性降解穩(wěn)定的hGH類似物的幾種方法。Alam等人(J. Biotech 迎，183-190，(1998))通過特異性點突變，設(shè)計了抗凝血酶和纖維蛋白溶酶的hGH突變體。凝血酶特別在R134和T135之間切割hGH，雙重突變體R134D，T135P產(chǎn)生抗凝血酶切割的hGH變體，而三重突變體R134D，T135P，K140A產(chǎn)生纖維蛋白溶酶抗性。此外，后一種hGH突變體具有在7天時間內(nèi)抗人血漿蛋白酶解的抗性。EP 534568描述了通過使R134突變成丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或組氨酸而對蛋白水解性降解穩(wěn)定的hGH突變體。WO 2004/022593/Nautilus描述了通用的高通量定向進化方法，以產(chǎn)生蛋白水解穩(wěn)定性提高的修飾細胞因子，包括GH變體。WO 2006/048777/Nautilus特別描述了蛋白水解穩(wěn)定性改進的修飾hGH類似物。類似物在 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191位含有1_5個突變。半胱氨酸殘基的引入可能導(dǎo)致形成不需要的二硫鍵連接的二聚體，在WO 2006/048777的范圍明確不包括氨基酸殘基被半胱氨酸取代；在冊2006/048777(第65頁)中闡明“明確避免氨基酸被半胱氨酸殘基置換，因為這種改變可能導(dǎo)致形成分子間二硫鍵”。顯然需要開發(fā)抗蛋白水解性降解的hGH化合物。這種穩(wěn)定化合物對蛋白酶剪切應(yīng)顯示出穩(wěn)定性提高，同時保持所需的hGH的生物學(xué)性質(zhì)。這種GH分子應(yīng)具有高的穩(wěn)定性、較慢的清除率和/或延長體內(nèi)半衰期。此外，通過使基團與肽綴合(其適當(dāng)改變肽的性質(zhì))來修飾肽的性質(zhì)和特性是眾所周知的。這類綴合一般需要肽中的某一官能團與綴合基團中的另一官能團反應(yīng)。通常，氨基例如N端氨基或賴氨酸中的e-氨基與合適的酰化試劑組合使用?；蛘?，聚乙二醇(PEG)或其衍生物可與蛋白質(zhì)連接。有關(guān)綜述參見Exp. Opion. Ther. Patent. 14,859-894，(2004)。已表明PEG與生長激素的連接可對生長激素的血漿半衰期具有積極作用，見WO03/044056。較早前描述了使用羧肽酶修飾肽的C端。WO 92/05271公開了使用羧肽酶和親核化合物使C端羧基酰胺化，WO 98/38285公開了特別適于該目的的羧肽酶Y的變體。EP 243 929公開了使用羧肽酶將多肽、報道基團或細胞毒性劑摻入蛋白質(zhì)或多肽的C端。WO 2005/035553描述了通過在肽的C端酶促摻入官能團而選擇性綴合肽的方法?；罨u素衍生物和馬來酰亞胺代表了將綴合物摻入肽的巰基的一些最常用的官倉泛團(G. T. Hermanson in Bioconjugate Techniques 2. Ed. 2008, Elsevier)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶先前被用來改變肽的性質(zhì)。在食品工業(yè)，特別是在乳品工業(yè)，可獲得例如使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶使肽交聯(lián)的許多技術(shù)。其它文獻公開了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改變生理活性肽的性質(zhì)。EP 950665、EP 785276 和 Sato，Adv. Drug Delivery Rev. 54，487-504， (2002)公開了在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在時包含至少一個Gln的肽與胺官能化PEG或類似配體之間的直接反應(yīng)，而Wada，Biotech. Lett. 23，1367-1372，(2001)公開了 3 -乳球蛋白通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與脂肪酸的直接綴合。以W02005/070468公布的國際專利申請公開了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶摻入柄(handle)，其中綴合基團可與柄連接。生長激素是一種關(guān)鍵激素，不僅僅參與調(diào)節(jié)身體生長，而且還參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)的代謝。生長激素的主要作用是促進生長。人生長激素是具有以下序列的191個氨基酸殘基蛋白質(zhì)FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMG RLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEG SCGF(SEQ ID NO 1)給予人生長激素及其緊密相關(guān)的變體被用來治療各種生長激素缺乏相關(guān)疾病。由于是多肽，生長激素經(jīng)胃腸外即借助針給予。此外，生長激素的特征還在于相對短的半衰期，因此需要頻繁給藥，給患者帶來相當(dāng)?shù)奶弁春筒环奖恪Ｒ虼?，仍然需要提供具有改進的藥理學(xué)性質(zhì)(例如半衰期延長)的生長激素化合物。本發(fā)明提供具有改進的藥代動力學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)的新的生長激素化合物綴合物以及其生產(chǎn)方法。發(fā)明概述皮下給予的藥物化合物的生物利用度可與吸收速率有關(guān)。化合物通過皮下毛細血管的緊密連接的能力可能部分與其物理和化學(xué)性質(zhì)以及化合物的分子大小或流體力學(xué)體積有關(guān)。具有40kDa PEG的蛋白質(zhì)綴合物例如聚乙二醇化hGH(PEG-hGH)的表觀分子量為150-250kDa。具有共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子的分子量為87kDa，而具有非共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子將因時間與白蛋白部分解尚，因此分子量為22kDa。預(yù)期耗費在解離狀態(tài)的時間至少部分取決于白蛋白結(jié)合部分的親和力。因此具有非共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子的吸收速率可比PEG-hGH的吸收速率快。當(dāng)使用對白蛋白具有較低親和力的白蛋白結(jié)合部分時，可獲得的吸收速率升高。另外，供白蛋白結(jié)合部分與hGH連接的接頭和/或間隔基的物理和化學(xué)性質(zhì)可影響化合物的官能度。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，具有單個Cys突變和/或額外二硫鍵的生長激素化合物(GH)可通過分隔GH和白蛋白結(jié)合殘基的親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基選擇性連接，所述親水間隔基通常具有mLogP < 0-或cLogP < 0. 5的化學(xué)部分以獲得具有改進性質(zhì)的GH綴合物，例如高的體外效力，或者例如體內(nèi)半衰期延長，或者例如可能與延長體內(nèi)作用特征聯(lián)合的抗蛋白水解性降解抗性提高。通過使白蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由親水間隔基與單個Cys突變連接可保持生物活性，并且可獲得一個或多個上述改進。當(dāng)白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有額外二硫鍵的生長激素(例如與hGH的N端、40位或141位)連接時，也可獲得所述改進。生長激素化合物還可包含單個Cys突變和額外的二硫鍵兩者，在此方面，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與單個Cys突變連接。在寬的方面，本發(fā)明涉及包含生長激素化合物(GH)的生長激素綴合物或其藥學(xué)上接受的鹽，所述生長激素化合物具有a)單個Cys突變，
b)額外的二硫鍵，或者c)單個Cys突變和額外的二硫鍵，其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與所述GH連接。在本發(fā)明的一個實施方案中，穩(wěn)定的hGH化合物具有一個或多個額外的二硫鍵。二硫鍵在半胱氨酸對之間形成，半胱氨酸對的一個或兩個通過點突變引入到野生型hGH序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，穩(wěn)定的hGH化合物具有額外的半胱氨酸。通過點突變將半胱氨酸引入野生型hGH序列。在本發(fā)明的又一個實施方案中，穩(wěn)定的hGH化合物具有一個或多個額外的二硫鍵和一個或多個額外的半胱氨酸。一個或多個額外的二硫鍵在額外的半胱氨酸對之間形成，而額外的半胱氨酸通過點突變引入到野生型hGH序列。此外，本發(fā)明基于這樣的觀測結(jié)果，即通過親水間隔基在人生長激素(hGH)中引入白蛋白結(jié)合殘基可選擇性地進行，其中保持大部分的活性。優(yōu)選通過親水間隔基將白蛋白結(jié)合殘基引入具有SEQ ID NO:1序列的hGH中的對應(yīng)于所引入半胱氨酸的位置上和/或位置谷氨酰胺40上和/或位置谷氨酰胺141上和/或N端。使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)、特別是得自茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraenae)或利迪鏈霉菌(StreptomycesIydicus)的TGase允許通過親水間隔基在40位或141位選擇性引入白蛋白結(jié)合殘基,而將剩余的11個谷氨酰胺殘基保持不改變，盡管事實上谷氨酰胺是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物(GH)通過親水間隔基與一個白蛋白結(jié)合殘基連接。通常，白蛋白結(jié)合殘基通過未水間隔基與hGH的N端或18、30、40、42、62、69、88、95、98、99、100、101、102、108、135、141或154位連接。在其它實施方案中，2個白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與單個Cys突變和上述位置的任一個(例如HGH的N端、40位或141位)連接。與聚乙二醇化hGH相比，本發(fā)明的生長激素化合物綴合物具有較快的皮下吸收，因此，出現(xiàn)較少脂肪萎縮(Iipoatrophy)或無脂肪萎縮。此外，與PEG大不相同，白蛋白結(jié)合殘基和親水間隔基是生物可降解的。本發(fā)明的又一個目的是提供用于改進GH性質(zhì)的方法，所述方法通過按照本發(fā)明方法綴合所述蛋白質(zhì)來進行。
在其它方面，本發(fā)明涉及包含單個Cys突變、額外二硫鍵的分離的生長激素化合物(GH)或包含單個Cys突變、額外二硫鍵的生長激素化合物。在本發(fā)明的又一個目的中，這類化合物是可溶的。定義在本發(fā)明上下文中，本文所用術(shù)語“生長激素化合物”意指哺乳動物源的生長激素(例如人、?；蜇i生長激素)和重組生長激素(例如重組人、?；蜇i生長激素)和這類生長激素的變體以及突變體。本文所用的“GH”和“生長激素化合物”可互換使用。當(dāng)GH是哺乳動物源的生長激素的變體(例如hGH和重組hGH)時，要理解所述變體是通過以下而獲得的化合物通過生長激素(例如hGH)序列中的一個或多個氨基酸殘基被另一個天然或非天然的氨基酸取代；和/或通過將一個或多個天然或非天然的氨基酸添加至生長激素(例如hGH)序列中；和/或通過從生長激素(例如hGH)序列中缺失一個或多個氨基酸殘基，其中這些步驟的任一個可任選隨后對以一個或多個氨基酸殘基進行進一步衍生化。通常，GH與hGH具有至少80%同一性，且通常具有hGH生長激素活性的至少10%，如本文測定(I)(實 施例46)中所測定的。在本發(fā)明上下文中，本文所用術(shù)語“白蛋白結(jié)合殘基”意指與人血清白蛋白非共價結(jié)合的殘基。與生長激素化合物(GH)連接的白蛋白結(jié)合殘基通常對人血清白蛋白具有低于約10 ii M或甚至低于約I U M的結(jié)合親和力。已知各種白蛋白結(jié)合殘基，其中有含有12-40個碳原子的線性和分支的親脂部分、具有環(huán)戊烷并菲骨架的化合物和/或具有10-45個氨基酸殘基的肽等?？赏ㄟ^以下文獻所述的表面等離振子共振測量白蛋白結(jié)合性質(zhì)J. Biol.Chem. 277(38)，35035-35042，(2002)。本文所用術(shù)語“親水間隔基”意指將生長激素化合物與白蛋白結(jié)合殘基分隔開的間隔基，其具有包含至少5個非氫原子(其中30-50%的這些非氫原子是N或0)的化學(xué)部分。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)氨基作用”和相關(guān)術(shù)語意欲說明這樣的反應(yīng)，其中谷氨酰胺側(cè)鏈中的酰胺氮與另一種化合物的氮，特別是來自另一種含氮親核體的氮交換。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(E. C. 2. 3. 2. 13)亦稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，并催化以下通用反應(yīng)
0 0
Q—U—NH- + Q1—NH2Q-^-N-Q1 + NH3
1HQ-C(0)-NH2(胺受體)可表示含有谷氨酰胺殘基的肽或蛋白質(zhì)，Q’ _NH2(胺供體)表示含胺親核體?；蛘撸琎-C(O)-NH2和Q’-NH2可分別表示胺受體和含有賴氨酸的肽或蛋白質(zhì)。然而，在本發(fā)明中，Q-C(0) -NH2表示含有谷氨酰胺殘基的生長激素，Q’ -NH2表示上述含胺親核體。有用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的實例包括微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，例如來源于茂原鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)、肉桂鏈霉菌(Streptomycescinnamoneum)和灰肉鏈霉菌(Streptomyces griseocarneum)(全部公開于US 5，156，956,其通過引用結(jié)合到本文中)及來源于淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces Iavendulae)(公開于US 5，252，469,其通過引用結(jié)合到本文中)和拉達卡鏈霉菌(Streptomyces ladakanum) (JP 2003/199569,其通過引用結(jié)合到本文中)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。應(yīng)當(dāng)注意的是以前的(輪枝鏈霉菌屬(Streptoverticillium)的成員目前包括在鏈霉菌屬(Streptomyces)中(Kaempfer,1. Gen. Microbiol. 137,1831-1892, (1991))。已自枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)(公開于US 5，731，183,其通過引用結(jié)合到本文中)和自各種粘菌(Myxomycetes)分離出其它有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的其它實例公開于WO96/06931(例如來源于Bacilus Iydicus的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)和WO 96/22366，兩者均通過引用結(jié)合到本文中。有用的非微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包括豚鼠肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和各種海產(chǎn)來源如扁魚真鯛(Pagrus major)(公開于EP-0555649,其通過引用結(jié)合到本文中)和日本牡販長牡販(Crassostrea gigas)(公開于US 5，736，356,其通過引用結(jié)合到本文中)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“不可接近的”意欲表示某物不存在或從其不能被觸及的意義而言實際上不存在。當(dāng)表明待綴合的蛋白質(zhì)的官能團不可接近的時，意欲表示該蛋白質(zhì)中不存在所述官能團，或若存在的話在某種程度上其被阻止參與反應(yīng)。舉例而言，所述官 能團可埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)深處，因而被屏蔽而不能參與反應(yīng)。要認(rèn)識到的是，官能團是否可接近視反應(yīng)條件而定?？稍O(shè)想的是，例如在變性劑存在下或在高溫下，蛋白質(zhì)可解折疊而暴露出本來不可接近的官能團。應(yīng)該理解，“不可接近的”意指“在選擇用于特定目的反應(yīng)的反應(yīng)條件下不可接近的”。術(shù)語“烷烴”或“烷基”意欲表示飽和、線性、分支和/或環(huán)狀烴。除非用另一碳原子數(shù)目規(guī)定，否則術(shù)語意欲表示具1-30(包括端值)個碳原子的烴，例如1-20(包括端值)個、例如1-10(包括端值)個、例如1_5(包括端值)個。術(shù)語烷基和亞烷基分別是指相應(yīng)的自由基和_■價自由基。術(shù)語"C^6烷基"是指具有1-6個碳原子的直鏈或分支飽和烴。所述基團實例包括但不限于甲基、2-丙基、1-丁基、2- 丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基和正己基。術(shù)語"C3,環(huán)烷基"通常是指環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基和環(huán)癸基。術(shù)語“烯烴”意欲表示包含至少一個碳碳雙鍵的線性、分支和/或環(huán)狀烴。除非用另一碳原子數(shù)目規(guī)定，否則術(shù)語意欲表示具2-30 (包括端值)個碳原子的烴，例如2-20 (包括端值)個、例如2-10 (包括端值)個、例如2-5 (包括端值)個。術(shù)語烯基和亞烯基分別是指相應(yīng)的自由基和~■價自由基。術(shù)語“炔烴”意欲表示包含至少一個碳碳三鍵的線性、分支和/或環(huán)狀烴，其可任選包含一個或多個碳碳雙鍵。除非用另一碳原子數(shù)目規(guī)定，否則術(shù)語意欲表示具2-30(包括端值)個碳原子的烴，例如2-20(包括端值)個、例如2-10(包括端值)、例如2-5 (包括端值)個。術(shù)語炔基和亞炔基分別是指相應(yīng)的自由基和二價自由基。 術(shù)語“同素環(huán)狀芳族化合物”意欲表示芳族烴，例如苯和萘。術(shù)語“雜環(huán)化合物”意欲表示包含5、6或7個環(huán)原子的環(huán)狀化合物，所述環(huán)原子中的1、2、3或4個為選自N、0和/或S的雜原子。實例包括雜環(huán)芳族化合物，例如噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪以及其部分或完全氫化的等同物，例如哌唳、卩比唑燒(pirazolidine)、卩比咯燒、卩比咯啉(pyroline)、咪唑燒、咪唑啉、哌嗪和嗎啉。術(shù)語“雜烷烴”、“雜烯烴”和“雜炔烴”意欲表示其中一個或多個雜原子或基團已插入到所述部分的結(jié)構(gòu)中的如上所定義的烷烴、烯烴和炔烴。雜基團和原子的實例包括 _0-、-S-、-S (0)-、-S (0) 2-、-C (0) - -C (S)_ 和-N (R*)其中 Rh'表不氧或 C1-C6-燒基。雜
烷烴實例包括
權(quán)利要求
1.一種包含生長激素化合物(GH)的生長激素綴合物或其藥學(xué)上接受的鹽，所述生長激素化合物(GH)具有 a)單個Cys突變, b)額外的二硫鍵，或 c)單個Cys突變和額外的二硫鍵， 其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與所述GH連接。
2.權(quán)利要求1的綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述生長激素綴合物具有下式(I) A-W-B-GH (I) 其中 GH表示生長激素化合物 B表不未水間隔基 W是連接A和B的化學(xué)基團，和 A表不白蛋白結(jié)合殘基。
3.前述權(quán)利要求中任一項的綴合物，其中所述親水間隔基連接至 a)生長激素化合物的N端或Gln40或Glnl41，或者 b)存在于生長激素化合物中的單個Cys突變的硫殘基，所述Cys突變選自hGH(SEQIDNO 1)的以下任一個T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C, G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C 和G190C,例如以下的任一個T3C、P5C、S7C、Dl 1C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C 和 G126C。
4.前述權(quán)利要求1-3中任一項的綴合物，其中所述GH具有額外二硫鍵，其介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO 1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、I73C/S132C、I73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或V185C/S188C。
5.權(quán)利要求2-4中任一項的綴合物，其中A選自
6.權(quán)利要求2-5中任一項的綴合物，其中W具有下式 -W7-Y-, 其中 Y為-(CH2) I7-C3_10-環(huán)烷基-W8-或價鍵，17 為 0-6， W7 選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C (O)NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC(O) NH-, -NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH =CH-, -CH = CHC(O)-、-(CH2)s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中 s3 為 O 或 1， W8 選自-C(O)NH-、-NHC (O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C (O)NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC (O) NH-、-NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH =CH-、-CH = CHC (O) -、- (CH2) s4-、-C (0) -、-C (0) 0-、-OC (0)-或價鍵；其中 s4 為 O 或 I。
7.權(quán)利要求2-6中任一項的綴合物，其中B具有下式 -X1-X2-X3-X4-其中 X1 為-'^-[(CHROn-W1-1KCH^ElL-KCHRtHU-， X2 為-[(CHR3) I3-W4] m4_ {[ (CH2) n3E2] m5- [ (CHR4) I4-ff5] J n4_，X3 為 _[(CHR5)I5-W6]m7-,X4 為 F-D1-(CH2) I6-D2-， I1、12、13、14、15和16獨立選自0-16，例如選自0-6 ml、m3、m4、m6和m7獨立選自0-10,例如選自0-6 m2和m5獨立選自0-25，例如選自0-10 nl、n2、n3和n4獨立選自0-16，例如選自0-10 F為芳基、雜芳基、批咯烷_2，5- 二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) 20H 或 C^6-烷基取代， R1、R2、R3、R4 和 R5 獨立選自氫、-C(0)0H、-C(O)NH2, -S(O)OH、-S(0)20H、-NH-C(=NH)-NH2、CV6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O) OH, -C(O)NH2、-S (O) OH、-S (O) 20H、-CN 或-OH 取代， D1、D2、E1和E2獨立選自-0_、-N(R6)-、-N(C(0)R7)-或價鍵;其中R6和R7獨立表示氫或C^6-烷基， W1-W5 獨立選自-C (O) NH-、-NHC (O)-、-C (O) NHCH2-、-CH2NHC (O)-、-C(O)NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC (O) NH-、-NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH =CH-, -CH = CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中 s2 為 O 或 1， W6 選自-C(O)NH-、-NHC (O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C (O)NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC (O) NH-、-NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH =CH-、-CH = CHC (O) -、- (CH2) sl-、-C (0) -、-C (0) 0-、-OC (0) -、-NHC (0) C1^6-烷基、-C (O)NHCV6-烷基或價鍵；其中Si為O或1，(^_6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2，5-二酮、-NHC (O)CH*CH2C00H或_NHC(0)CH2CH*C00H取代；其中㈩表示CH的碳原子與X4的連接點。
8.權(quán)利要求7的綴合物，其中Dl和D2獨立選自-O-或-N(R6)-或價鍵。
9.權(quán)利要求7或8的綴合物，其中El和E2獨立選自-O-或-N(Re)-或價鍵。
10.權(quán)利要求2-9中任一項的綴合物，其中W1-W8獨立選自-C(O)NH-、-NHC(O) -、-CH2NHC(O) -、-C(O)NHS (O)2_、-S (O)2NHC(O) -、-NHC(O) C卜6_ 烷基或-C(O)NHCV6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2，5- 二酮、-NHC (O) CH*CH2C00H或_NHC(0)CH2CH*C00H取代；其中(*)表示CH的碳原子與X4的連接點。
11.權(quán)利要求7-10中任一項的綴合物，其中R1、R2>R3> R4和R5獨立選自氫、-C(O)OH,-C (O) NH2、-S (O) 20H 或 CV6-烷基；其中烷基任選被-C (O) OH,-C (O) NH2 或-S (O) 20H 取代。
12.權(quán)利要求7-11中任一項的綴合物，其中X4為價鍵，W6選自吡咯烷-2，5-二酮、-NHC (O) CH*CH2C00H或-NHC (O) CH2CH*C00H，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點。
13.權(quán)利要求2-12中任一項的綴合物，其中B選自
14.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述化合物選自
15.一種下式(III)的化合物 A-W-Bl-U (III) 其中A表不白蛋白結(jié)合殘基， BI表/」、殺水間隔基， W是連接A和BI的化學(xué)基團，U表示綴合部分 其中綴合部分U， a)包含芳基、雜芳基、取代的馬來酰亞胺或吡咯烷-2，5-二酮例如-NHC(O)CH2CH2-吡咯烷_2，5- 二酮或由芳基、雜芳基、取代的馬來酰亞胺或吡咯烷_2，5- 二酮例如-NHC(O)CH2CH2-吡咯烷-2，5- 二酮組成， b)包含Dl-(CH2)I6-D2，其中Dl和D2獨立選自_0_、_N(R6)-、-NC (O) R7-或價鍵；其中R6和R7獨立表示氫或CV6-烷基，c)包含離去基團或由離去基團組成，所述離去基團例如Cl、Br、1、-OH、-OS(O)2Me、-OS (O)2CF3、-OTs， d)包含烯丙基胺(H2C= CH-CH2-NH2)例如-C(O)NHCH2-CH = CH2或由烯丙基胺(H2C =CH-CH2-NH2)例如-C(O)NHCH2-CH = CH2 組成，或者 e)包含胺例如-NH2或由胺例如-NH2組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有功效延長特征的生長激素化合物。通過使白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與生長激素變體連接來獲得這種效果。還描述了制備這類化合物和使用這類化合物的方法。這些生長激素化合物基于其改變的特征，認(rèn)為所述特征特別可用于治療。
文檔編號A61P5/00GK103002918SQ201180015252
公開日2013年3月27日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者C.貝倫斯, N.L.約翰森, H.S.安德森, L.諾斯科夫-勞里森, J.布哈特 申請人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司