專利名稱：再生牙齒單元的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可控制其大小及形狀的再生牙齒單元的制造方法等。
背景技術(shù)：
牙齒是ー種具有最外層為牙釉質(zhì)，內(nèi)層為牙本質(zhì)的硬組織，并于其內(nèi)側(cè)有產(chǎn)生牙本質(zhì)的成牙質(zhì)細(xì)胞，中心部為牙髓的器官。牙齒常會因齲齒或牙周病而缺損，而牙齒的有無大大影響外觀及品嘗食物的味道，因此為了保持健康或高質(zhì)量的生活，目前正逐漸重視牙齒的再生技術(shù)。牙齒是由胚胎期發(fā)育過程的誘導(dǎo)而形成，且是以多種細(xì)胞株為基礎(chǔ)而構(gòu)造的功能単位。因此，牙齒并非由成年人體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞株的干細(xì)胞如造血干細(xì)胞或間葉干細(xì)胞等干細(xì)胞的干細(xì)胞系統(tǒng)所發(fā)育，僅以目前再生醫(yī)療使用的干細(xì)胞移植(干細(xì)胞移植療法)，無法 再生牙齒。此外還研究了，通過鑒定出在牙齒發(fā)育過程中具有特定表達(dá)的基因，從而人為誘導(dǎo)牙胚的牙齒再生法，但僅通過特定基因，并無法完全地誘導(dǎo)牙齒的再生。因此近年來開始研究用自牙胚分離得到的組織或細(xì)胞，再構(gòu)建牙胚，將其培養(yǎng)后獲得由牙齒與牙周組織所構(gòu)成的再生牙齒單元，通過移植該再生牙齒單元至口腔內(nèi)而獲得再生牙齒的方法。迄今為止，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過使用間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞，其中這些細(xì)胞中至少ー種細(xì)胞是來自牙胚的細(xì)胞，然后將實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞形成的第I細(xì)胞團(tuán)塊與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞形成的第二細(xì)胞團(tuán)塊以緊密接觸的方式，放置于由膠原蛋白凝膠等所形成的支持載體的內(nèi)部，然后于支持載體的內(nèi)部培養(yǎng)第I和第2細(xì)胞團(tuán)塊，可產(chǎn)生能有效誘導(dǎo)細(xì)胞分化和具有特定的細(xì)胞配置及方向性的再生牙胚或再生牙齒單元(例如參照專利文獻(xiàn)I)。另外還發(fā)現(xiàn)，利用口腔內(nèi)上皮細(xì)胞或其初代培養(yǎng)細(xì)胞作為上皮細(xì)胞時(shí)(例如參照專利文獻(xiàn)2)，利用來自羊膜的細(xì)胞作為間葉細(xì)胞時(shí)(例如參照專利文獻(xiàn)3)，以及將全能干細(xì)胞經(jīng)分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞利用為間葉細(xì)胞時(shí)(例如參照專利文獻(xiàn)4)，均可同樣獲得具有特定的細(xì)胞配置和取向的再生牙胚或再生牙齒單元。進(jìn)ー步研究表明，制作再生牙胚時(shí)，通過調(diào)整再生牙胚所含牙釉結(jié)的數(shù)目，可控制形成的再生牙齒的數(shù)目(例如參照專利文獻(xiàn)5)。由于牙齒因部位或個(gè)人差異其大小或形狀均有所不同，因此在制作再生牙胚或再生牙齒單元時(shí)，控制其大小或形狀十分重要。特別是再生適合缺損牙齒部位的牙齒時(shí)，若制作出的牙齒不具有與缺損牙齒相同的大小及形狀，則將無法發(fā)揮其必要的功能。作為制作具有期望大小或形狀的再生牙齒的方法，有人提出將含有形成牙乳頭與牙本質(zhì)的來自牙髓的間葉細(xì)胞，及有助于形成牙釉質(zhì)的上皮細(xì)胞的牙胚細(xì)胞混合物，接種于通過固化由聚甘醇酸-聚醋酸共聚物等形成的生物可降解性的聚合物而形成的結(jié)構(gòu)架上，再移植至動(dòng)物體內(nèi)的形成牙齒的方法。在該方法中，曾嘗試使用一定形狀的結(jié)構(gòu)架，控制牙齒的形狀。然而，由于再生牙齒來自由上皮細(xì)胞層與間葉細(xì)胞層所形成的牙胚，而牙胚的發(fā)育伴隨著在上皮細(xì)胞層與間葉細(xì)胞層間所產(chǎn)生的長時(shí)間的上皮/間葉相互作用，而使用結(jié)構(gòu)架無法獲得充分的細(xì)胞間的相互作用，因此也有不希望使用結(jié)構(gòu)架的意見(例如參照非專利文獻(xiàn)I)。另外由于牙齒的形成速度比結(jié)構(gòu)架的分解速度快，可以預(yù)料形成的牙齒可能會將結(jié)構(gòu)架卷入，因此細(xì)胞配置及牙齒形狀的再現(xiàn)性必然不高。另ー方面，制作再生牙齒單元時(shí)，亦可使用將再生牙胚移植至動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。在體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，由于可接受來自動(dòng)物細(xì)胞的各種細(xì)胞激素的作用以及來自周圍的營養(yǎng)供給，移植物易形成組織學(xué)上正常的組織，亦可加速牙齒及牙周組織的培養(yǎng)。體內(nèi)移植，例如可以為目前廣泛使用的腎被膜下移植。然而將再生牙胚于例如腎被膜下等體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，有時(shí)會因被膜壓カ及移植空間而限制再生牙齒的大小或形狀。具體而言，再生牙胚受到來自側(cè)面的壓力，牙齒咬合面的形狀容易被破壞。另外在生物體內(nèi)培養(yǎng)也難以控制牙齒的伸長。特別是再生牙齒長成超過所需的長度時(shí)，無法直接將其移植至頜骨上。將再生牙胚在動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)的方法中，由于幾乎沒有機(jī)械性的刺激，無法充分使 牙周膜產(chǎn)生及發(fā)育。牙周膜具有維系牙根與牙槽骨的功能，以及減緩來自牙齒的壓力、感覺牙齒咬合等功能，因此為使再生牙齒具有與原有的牙齒相同的功能，牙周膜是ー個(gè)的重要因素。先前技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :國際公開第2006 129672號手冊專利文獻(xiàn)2 :特開2008-29756號公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :特開2008-206500號公報(bào)專利文獻(xiàn)4 :特開2008-200033號公報(bào)專利文獻(xiàn)5 :特開2008-29757號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I =Hu et al. Tissue Engineering Volume 12，Number 8，2006，2069-207
發(fā)明內(nèi)容
[發(fā)明要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是解決于體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)所伴隨的問題。具體而言，其目的在于提供一種即使在體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚，也不會因壓カ及空間而限制牙齒形狀，同時(shí)可控制牙齒伸長的方法。另一目的在于提供一種可于牙根周圍形成充分的牙周膜的方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種即使牙齒缺損部位較大時(shí)，亦可移植再生牙齒的方法。[解決問題的手段]為解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，通過將再生牙胚配置于間隔構(gòu)件內(nèi)，可防止來自所述生物體組織的壓カ所造成的變形，另外也可控制牙齒長度不會伸長到超過需要的長度。另外本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，通過自該動(dòng)物的外部給予機(jī)械性的刺激，可使牙周膜在牙根周圍充分生長發(fā)育。
本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)ー步發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，通過將多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚并排培養(yǎng)，可獲得包含多個(gè)再生牙胚或再生牙齒的再生牙齒單元，且可無需經(jīng)過分離等步驟而直接將牙齒移植至較大的牙齒缺損部位。亦即本發(fā)明涉及ー種在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚的再生牙齒單元的制造方法，其包含下述步驟準(zhǔn)備間隔構(gòu)件；將在所述間隔構(gòu)件內(nèi)的所述再生牙胚配置于所述哺乳動(dòng)物的體內(nèi)；在所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)所述再生牙胚；
其中，所述間隔構(gòu)件具有可防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值的構(gòu)造，且具有可使置于其內(nèi)部的再生牙胚能夠與間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物為非人類的哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔構(gòu)件進(jìn)一歩具有能夠防止所述哺乳動(dòng)物的體內(nèi)組織對所述再生牙胚施加過多壓カ的構(gòu)造。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其特征在干，將所述再生牙胚置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)并配置于所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的步驟，是能夠使再生牙胚的未來為咬合面的部位配置在所述間隔構(gòu)件的內(nèi)壁附近，井面向所述間隔構(gòu)件內(nèi)壁，且使未來為根尖的部位配置為朝向所述間隔構(gòu)件的所述內(nèi)壁的相反方向的更大空間伸長的步驟。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將所述再生牙胚置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)并配置于所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，是以填滿所述間隔構(gòu)件內(nèi)部的支持載體來支持所述再生牙胚的方式進(jìn)行配置。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙胚的培養(yǎng)及維持，是通過實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的第I細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第2細(xì)胞集合體在支持載體內(nèi)緊密接觸配置而進(jìn)行的，其中間葉細(xì)胞與上皮細(xì)胞至少一方需是來自牙胚。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，在培養(yǎng)所述再生牙胚時(shí)，進(jìn)ー步還包含自所述哺乳動(dòng)物的外部給予機(jī)械性的刺激的步驟。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述機(jī)械性的刺激是大約20000Hz到大約40000Hz的振動(dòng)。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔構(gòu)件具有能夠使再生牙齒單元發(fā)育成期望大小的再生牙齒單元的內(nèi)部空間。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔構(gòu)件大致呈筒狀，所述筒的高度比期望的再生牙齒單元的厚度大，且所述筒的內(nèi)徑約為再生牙齒單元長度的最大容許值。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔構(gòu)件呈圓筒狀。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙胚由多個(gè)分別單獨(dú)制備的再生牙胚組成。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙胚包含多個(gè)分別單獨(dú)制備的再生牙胚，且在所述間隔構(gòu)件內(nèi)使多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚以相互鄰接的方式配置。在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙胚包含多個(gè)分別單獨(dú)制備的再生牙胚，且使多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚在間隔構(gòu)件內(nèi)，以調(diào)整使各再生牙胚的未來為咬合面部位的中心，與未來為根尖部位的中心的連結(jié)軸線方向?yàn)榇笾缕叫械姆绞竭M(jìn)行配置。另外，根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及ー種再生牙胚組合物，即通過將其配置于間隔構(gòu)件內(nèi)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以制造再生牙齒單元的再生牙胚組合物，其特征在干，所述間隔構(gòu)件具有能夠防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值，且使置于其內(nèi)部的再生牙胚能夠與間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。
在本發(fā)明的再生牙胚組合物的另ー個(gè)實(shí)施方案中，其特征在于所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。另外，根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及ー種間隔構(gòu)件，即在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，將再生牙胚置于其中進(jìn)行培養(yǎng)以制造再生牙齒單元的間隔構(gòu)件，其特征在干具有能夠防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值，且使置于其內(nèi)部的再生牙胚能夠與間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。在本發(fā)明的間隔構(gòu)件的另ー個(gè)實(shí)施方案中，配置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)部的再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。另外，根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及ー種方法，即ー種包含在哺乳動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚步驟的再生牙齒單元的制造方法，其中，培養(yǎng)所述再生牙胚時(shí)，自所述哺乳動(dòng)物外部給予機(jī)械性的刺激。另外，在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述機(jī)械性的刺激是大約20000Hz到大約40000Hz的振動(dòng)。另外，在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙胚的培養(yǎng)及維持，是通過實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的第I細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第2細(xì)胞集合體在支持載體內(nèi)緊密接觸配置而進(jìn)行的，其中間葉細(xì)胞與上皮細(xì)胞至少ー方需是來自牙胚。另外，在本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及ー種動(dòng)物缺損牙齒的修復(fù)方法，其包含將再生牙齒單元移植至所述缺損部位的步驟，其中再生牙齒單元是用上述再生牙齒單元制造方法所制造的。在本發(fā)明的動(dòng)物缺損牙齒的修復(fù)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述動(dòng)物是非人類的哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的動(dòng)物缺損牙齒的修復(fù)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述再生牙齒單元包含調(diào)整齒冠-齒根方向?yàn)榇笾缕叫械亩鄠€(gè)牙齒。另外，根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及ー種再生牙齒單元，其是用上述的再生牙齒單元的制造方法所制造。根據(jù)本發(fā)明另ー個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及ー種再生牙齒單元，即為了修補(bǔ)動(dòng)物ロ腔內(nèi)缺損的牙齒，用上述再生牙齒單元的制造方法制造的、用以移植至缺損部位的再生牙齒單元。在本發(fā)明的再生牙齒單元的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙齒單元包含調(diào)整齒冠-齒根方向?yàn)榇笾缕叫械亩鄠€(gè)牙齒。在本發(fā)明的再生牙齒單元的另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述再生牙齒單元包含調(diào)整齒冠-齒根方向?yàn)榇笾缕叫械?、且牙周組織為一體化地形成的多個(gè)牙齒。[發(fā)明的效果]根據(jù)本發(fā)明，即使在動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚，亦不會受到來自所述動(dòng)物的組織 等的過多壓力，能夠使牙齒生長成自然的形狀。另外亦可防止牙齒伸長到超過需要的長度。另外根據(jù)本發(fā)明，即使在動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚，亦可獲得具有充分的牙周膜組織的再生牙齒。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，對于較大的骨頭缺失部位，無需一次一顆的移植單個(gè)的再生牙齒，可一次移植包含多個(gè)再生牙齒的再生牙齒單元。此外，根據(jù)本發(fā)明另ー個(gè)實(shí)施方案，由于含多個(gè)再生牙齒的牙槽骨是一體化地形成的，因此可整體地移植通過ー體化的牙槽骨穩(wěn)固支撐的一體化物，不會在移植時(shí)或移植后出現(xiàn)多個(gè)再生牙齒的方向參差不齊的問題。


圖I是根據(jù)本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法，在配置于小鼠腎被膜下的間隔構(gòu)件內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的再生牙胚的照片。圖2是使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元的顯微CT影像。圖3是未使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元的顯微CT影像。圖4顯示的是在CT影像上測定及計(jì)算的使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(控制)、未使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(非控制)、及天然牙齒的牙冠部的長徑/短徑比的結(jié)果。圖5顯示的是在CT影像上測定的使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(控制)、及未使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(非控制)的長度。圖6是在體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚同時(shí)給予機(jī)械性刺激制作的再生牙齒單元、與未給予刺激而制作的再生牙齒單元的肥染色照片。圖7顯示的是在CT影像上測定的在體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚同時(shí)給予機(jī)械性刺激而制作的再生牙齒單元，與未給予刺激而制作的再生牙齒單元的牙周膜的寬度。圖8顯示的是將用本發(fā)明的方法制造的再生牙齒單元移植至頜骨的情形。圖9是將用本發(fā)明的方法制造的再生牙齒單元移植至頜骨后0天、第14天、第30天的CT影像。圖10是將用本發(fā)明的方法制造的再生牙齒單元移植至頜骨后第30天的HE染色照片。圖11是簡要顯示置于間隔構(gòu)件內(nèi)的再生牙胚配的狀態(tài)的平面圖及側(cè)面圖。
圖12是顯示置于間隔構(gòu)件內(nèi)的多個(gè)再生牙胚的狀態(tài)的示意圖。圖13是顯示置于間隔構(gòu)件內(nèi)的多個(gè)再生牙胚的狀態(tài)的實(shí)體照片。圖14是移植于腎被膜下60天后的含多顆牙齒的再生牙齒單元的實(shí)體照片。圖15是移植于腎被膜下60天后的含多顆牙齒的再生牙齒單元的CT影像。(a)為CT外觀影像，(b)的左側(cè)為齒列方向的CT剖面影像，(b)的右側(cè)為頰舌方向的CT剖面影像。圖16是將含多顆牙的再生牙齒單元移植至口腔后第I天的CT影像。
具體實(shí)施方式

根據(jù)本發(fā)明牙齒制造方法的第一個(gè)實(shí)施方案，即ー種包含在哺乳動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)配置于間隔構(gòu)件內(nèi)的再生牙胚步驟的再生牙齒單元的制造方法，其特征在于所述間隔構(gòu)件具有能夠防止所述非人類的哺乳動(dòng)物的體內(nèi)組織對所述再生牙胚施加過多壓力、且防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值的構(gòu)造，以及具有使置于其內(nèi)部的再生牙胚能夠與間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。這里的“能夠連通”是指間隔構(gòu)件內(nèi)部與外部之間，可經(jīng)由間隔構(gòu)件，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)胞激素等物質(zhì)通過。亦即具有物質(zhì)的供給通路。本說明書中的“牙齒”是指具有連續(xù)的內(nèi)部牙本質(zhì)層及外部牙釉質(zhì)層的組織，亦指具有牙冠或牙根且具備方向性的組織。牙齒的方向性可根據(jù)牙冠及牙根的位置而確定。可以基于形狀及組織染色等直觀地辨認(rèn)牙冠及牙根。牙冠是指具有牙釉質(zhì)層與牙本質(zhì)層構(gòu)造的部分，而牙根則不具有牙釉質(zhì)層。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過如組織染色等容易地確定出牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)。另外，牙釉質(zhì)可通過存在有成釉細(xì)胞而確定，而成釉細(xì)胞的存在則可通過有無牙釉蛋白來確認(rèn)。另ー方面，牙本質(zhì)可通過存在有成牙質(zhì)細(xì)胞而確定，而成牙質(zhì)細(xì)胞的存在則可通過有無牙本質(zhì)涎蛋白而確認(rèn)。運(yùn)用所屬領(lǐng)域公知的方法例如原位雜交、抗體染色等，能夠很容易地確認(rèn)牙釉蛋白及牙本質(zhì)涎蛋白。本說明書中，“牙胚”是未來被定義為牙齒的牙齒的初期胚，即指牙齒發(fā)育階段ー般所使用的牙蕾期(Bud stage)至鐘形期(Bell stage)，特別是指未發(fā)現(xiàn)有被視為牙齒硬組織特征的牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)的蓄積的組織。另ー方面，本說明書中，“牙芽”是指比“牙胚”發(fā)育階段靠后的組織，即被視為牙齒硬組織特征的牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)開始蓄積之后，至牙齒自牙齦萌發(fā)出并表現(xiàn)一般牙齒功能之前的階段的組織。本說明書中“再生牙胚”是指通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，人工形成的牙胚。本說明書中，“再生牙齒單元”是指由牙齒與支持牙齒的牙周組織所構(gòu)成的単元，其是通過培養(yǎng)再生牙胚，使再生牙胚所含的各種細(xì)胞分化的結(jié)果所得。再生牙齒單元中的牙齒部分，具有自上述牙芽至牙齒階段的構(gòu)造。另外，牙周組織包含牙周膜與牙槽骨。換而言之，在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚，可獲得再生牙齒單元，將再生牙齒單元移植至口腔內(nèi)并使其融合為一體，或萌出、成長即可獲得再生牙齒。本說明書中，間隔構(gòu)件是指設(shè)置的ー個(gè)能夠覆蓋再生牙胚的器具，從而在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，能夠使得再生牙胚的伸長不超過所需的長度。另外，所述間隔構(gòu)件在例如腎被膜下等生物體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，可起到防止再生牙胚受到膜的壓カ及來自生物體內(nèi)的組織的過多壓力的作用。只要能達(dá)到這些目的，所述間隔構(gòu)件的形狀可為任何ー種形狀。
亦即，只要能夠確保允許具有期望的再生牙齒單元尺寸(主要為長度和厚度)的再生牙齒單元生長的內(nèi)部空間，間隔構(gòu)件的形狀可為任意形狀。再生牙齒單元的長度是指，自再生牙齒單元的牙齒部分的未來為咬合面的部位，至未來為牙根尖的部位的長度。當(dāng)在未來為根尖的部位的周圍形成牙周組織時(shí)，就是指到其前端(距離未來為咬合面部位最遠(yuǎn)的部位)的距離。再生牙齒單元長度的大概的最大容許值是指在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚后，所獲得的再生牙齒單元的長度的可被容許的最大值。所述大概的最大容許值可根據(jù)移植再生牙胚的對象及部位，由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)丶右源_定。再生牙齒單元的厚度一般是指再生牙齒單元牙冠部分的厚度，但當(dāng)在未來為根尖的部位的周圍形成牙周組織時(shí)，也可指具有牙周組織的部分的厚度。如同人類的牙齒，牙冠部的剖面一般并非為標(biāo)準(zhǔn)的正方形或長方形，而是通過長徑與短徑來規(guī)定。根據(jù)常識，既然可一定程度地控制再生牙胚的伸長方向，因此在間隔構(gòu)件的內(nèi)部配置再生牙胚組合物時(shí)的再生牙胚組合物本身的方向，或者其在間隔構(gòu)件內(nèi)部的相對位置，可依照期望的伸長的方向任意調(diào)整。因此，為獲得期望尺寸的再生牙胚，在設(shè)計(jì)間隔構(gòu)
件立體的大小時(shí)可考慮再生牙胚組合物伸長的方向。一般而言，間隔構(gòu)件的內(nèi)部空間必須比期望的再生牙齒單元稍大些。換言之，間隔構(gòu)件的內(nèi)部空間，需具有防止再生牙齒單元伸長至超過最大容許值的作用。以下針對間隔構(gòu)件的形狀為上下開ロ的圓筒狀(環(huán)狀的)的情況進(jìn)行說明。根據(jù)本說明書所公開的內(nèi)容，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠較容易地設(shè)計(jì)具有期望形狀的間隔構(gòu)件。形狀為上下開ロ的圓筒狀(環(huán)狀的)時(shí)，通過上下的開ロ，可充分確保來自間隔構(gòu)件外部的營養(yǎng)供給通路，從而能夠形成再生牙齒單元。另外，使用所述圓筒狀(環(huán)狀的)的間隔構(gòu)件時(shí)，若將再生牙胚的伸長方向設(shè)定為圓筒環(huán)的橫向(例如為圓筒徑向)，則圓筒的縱向(亦即為圓筒的高度)，可按照能夠獲得期望的再生牙齒單元咬合面的厚度，并且不超過最大容許值的要求來設(shè)定。另外，為防止再生牙齒單元伸長至超過需要的長度，可將圓環(huán)的內(nèi)徑設(shè)定為期望的再生牙齒單元長度的大概的最大容許值。在使用所述圓筒狀的間隔構(gòu)件時(shí)，若以環(huán)的內(nèi)徑方向作為伸長方向來配置再生牙胚，則縱向(高度方向)即為再生牙齒單元的牙冠寬度，筒的高度在培養(yǎng)人類牙齒時(shí)為例如3-15mm，優(yōu)選為5_12mm，培養(yǎng)小鼠牙齒時(shí)為例如0. 4-2. 0mm，優(yōu)選為0. 6-1. 8mm，其內(nèi)徑(內(nèi)直徑)在培養(yǎng)人類牙齒時(shí)為10-30mm，優(yōu)選為15_26mm，培養(yǎng)小鼠牙齒時(shí)為0. 9-2. 0mm，優(yōu)選為 I. 2-1. 9mm。進(jìn)而在利用大致呈圓筒狀的間隔構(gòu)件時(shí)，通過將再生牙胚未來為咬合面的部位以面向間隔構(gòu)件內(nèi)壁的方式配置在內(nèi)壁附近，且將未來為根尖的部位配置為朝向筒的內(nèi)徑方向，再生牙胚就不會受到來自生物體組織的過多的壓力，且可防止再生牙胚伸長至超過需要的長度，并且能夠與外部連通，可確保物質(zhì)供給路徑。再生牙胚的咬合面不會因壓カ而損壞，能夠以自然的形狀生長，牙齒會沿筒的直徑方向伸長，一般能夠在到達(dá)相對的側(cè)壁之前、或到達(dá)之后，在未達(dá)最大容許值的長度時(shí)停止伸長。再生牙胚可通過間隔構(gòu)件壁而避免來自筒的水平方向的壓力，同時(shí)，通過間隔構(gòu)件的上ロ及下ロ的邊沿，一般也能避免來自上下方向的壓カ。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在生物體內(nèi)制造再生牙齒單元時(shí)，為達(dá)到本說明書期望的目的，或?yàn)檫_(dá)到一些情況下需要的其他目的，可不限于圓筒狀，可使用任意的期望形狀的間隔構(gòu)件而不用局限于圓筒狀。例如可以為那些具有橢圓或多角形底面的，或球狀物來取代圓筒，但并不限定于此。本發(fā)明的間隔構(gòu)件具有能夠使配置于其內(nèi)部再生牙胚與間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。由于再生牙胚需要接受來自哺乳動(dòng)物體內(nèi)組織的營養(yǎng)等供給，或者受到動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞激素的作用，因此必須確保使這些物質(zhì)到達(dá)間隔構(gòu)件內(nèi)的再生牙胚的供給路徑。為了使其為可連通的構(gòu)造，間隔構(gòu)件的形狀，可形成大小及個(gè)數(shù)不限的足夠供給物質(zhì)的孔。例如，在間隔構(gòu)件為圓筒狀時(shí)可以有ー個(gè)局部大孔，在其為網(wǎng)狀時(shí)可以有無數(shù)個(gè)遍及整個(gè)間隔構(gòu)件的小孔。另外，如果間隔構(gòu)件的材質(zhì)是能夠使物質(zhì)滲透的材料，也可以沒有孔。本說明書中的哺乳動(dòng)物并沒有特別限定，只要能夠在生物體內(nèi) 培養(yǎng)再生牙胚也可為非哺乳動(dòng)物。例如可以為牛、馬、豬、犬、貓、以及小鼠，優(yōu)選為豬和小鼠，特別優(yōu)選的是與牙胚組織為同種類的動(dòng)物。當(dāng)移植到與牙胚組織不同種的動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選是使用改造得到的有免疫缺陷的動(dòng)物。為使動(dòng)物細(xì)胞的器官或組織盡可能的正常發(fā)育，作為體內(nèi)適合生長的部位，優(yōu)選是腎被膜下、腸系膜、皮下等。移植后的培養(yǎng)時(shí)間因移植時(shí)牙齒的大小以及將要發(fā)育成的牙齒的大小而異，一般可為3天-400天。例如移植至腎被膜下時(shí)，雖然因依移植時(shí)牙胚的大小及需要再生的牙齒的大小而異，但優(yōu)選是約為7天-60天。對于間隔構(gòu)件的材質(zhì)并沒有特別限定，只要具有能夠防止來自體內(nèi)組織的壓カ的充分的硬度即可，例如可為金、銀、鐵、銅、鋁、聚こ烯、樹脂、牙科用樹脂、牙科粘固粉等。另外，在本發(fā)明的再生牙齒單元的制造方法中，將再生牙胚配置于間隔構(gòu)件內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，優(yōu)選的是通過在間隔構(gòu)件內(nèi)填滿支持載體，再將再生牙胚配置于所述支持載體內(nèi)進(jìn)行的。支持載體只要能滿足能夠使細(xì)胞在其內(nèi)部進(jìn)行培養(yǎng)即可，并沒有特別限定，但優(yōu)選的是例如凝膠狀、纖維狀、固體狀的支持載體，通過使用這樣的支持載體，可進(jìn)ー步防止體內(nèi)的再生牙胚受到過多的壓力。本發(fā)明所使用的支持載體可舉出例如膠原蛋白、瓊脂糖膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、CellMatrix(商品名)、Mebiolgel (商品名)>Matrigel (商品名)、彈性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白(Iaminin)、細(xì)胞外基質(zhì)混合物、聚こ醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/こ醇酸共聚物(PLGA)等。其中，優(yōu)選的是具有適當(dāng)?shù)挠捕燃氨３至Φ哪z原蛋白、瓊脂糖膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、Ce I IMatr ix、Mebiol ge I、Matrige I、細(xì)胞外基質(zhì)混合物、弾性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白。例如可使用液態(tài)的支持載體，于其中放入再生牙胚后再將其硬化。例如，以膠原蛋白溶液填充滿間隔構(gòu)件內(nèi)部，再在將再生牙胚放入膠原蛋白溶液中之后，通過在37°C的CO2恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，可使膠原蛋白凝膠化。接著，可將再生牙胚連同間隔構(gòu)件一起，配置于哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。另外，本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案是ー種牙齒的制造方法，即包含在哺乳動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚的步驟的牙齒的制造方法，其特征在干，在培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，自哺乳動(dòng)物的外部給予機(jī)械性的刺激。通過給予的機(jī)械性的刺激，可促進(jìn)再生牙齒單元的牙周膜的形成。機(jī)械性的刺激可舉出例如震動(dòng)、壓迫、摩擦等，但并不局限于這些方式。例如可給予接近聲波頻率(例如約 20000Hz-40000Hz)的震動(dòng)。如上所述，在本發(fā)明的使用間隔構(gòu)件制造再生牙齒單元的方法中，優(yōu)選的是在生物體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，自哺乳動(dòng)物的外部給予機(jī)械性的刺激。接下來將說明本發(fā)明的方法中所使用的再生牙胚。再生牙胚可以是那些由任ー種方法制作得到的，例如它可以通過包含以下步驟的方法制作得到使實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的第I細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第2細(xì)胞集合體緊密接觸，然后再在支持載體內(nèi)部培養(yǎng)第I和第2細(xì)胞集合體。在本說明書中，為了方便區(qū)別兩種細(xì)胞集合體，將實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體稱為第I細(xì) 胞集合體，但其實(shí)也可以將實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體稱為第I細(xì)胞集合體，哪一個(gè)細(xì)胞集合體被稱為第I細(xì)胞集合體并不重要。本發(fā)明中“間葉細(xì)胞”是指來自間葉組織的細(xì)胞及培養(yǎng)該細(xì)胞所得的細(xì)胞，“上皮細(xì)胞”是指來自上皮組織的細(xì)胞及培養(yǎng)該細(xì)胞所得的細(xì)胞。另外，本發(fā)明中“牙周組織”是指在牙齒的外層形成的牙槽骨和牙周膜。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過例如組織染色很容易地確定牙槽骨和牙周膜的形態(tài)。“使實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的第I細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第2細(xì)胞集合體緊密接觸而配置”的步驟，例如可參照專利文獻(xiàn)I至5，本說明書參照了該各個(gè)文獻(xiàn)的公開內(nèi)容并進(jìn)行了組合概括。上述的第I細(xì)胞集合體及第2細(xì)胞集合體，分別實(shí)質(zhì)上僅由間葉細(xì)胞或僅由上皮細(xì)胞構(gòu)成。“實(shí)質(zhì)上僅由間葉細(xì)胞構(gòu)成”在本發(fā)明中是指，一個(gè)細(xì)胞集合體可達(dá)到與僅由間葉細(xì)胞構(gòu)成時(shí)ー樣的功能的、且盡量不含有形成間葉細(xì)胞以外的細(xì)胞的狀態(tài)?！皩?shí)質(zhì)上僅由上皮細(xì)胞構(gòu)成”的也是同樣的情況。細(xì)胞集合體是指細(xì)胞呈緊密接觸的狀態(tài)，可以是組織，也可以是由零散的細(xì)胞所制備的細(xì)胞團(tuán)塊。使用組織時(shí)，優(yōu)點(diǎn)是可容易地獲得細(xì)胞配置或形狀正確的牙齒，但可獲得的量有限。由于細(xì)胞團(tuán)塊也可以使用培養(yǎng)的細(xì)胞，相比之下較易獲得，所以優(yōu)選使用細(xì)胞團(tuán)塊。根據(jù)本發(fā)明的方法，即使使用細(xì)胞團(tuán)塊，也可獲得細(xì)胞配置或形狀正確的再生牙齒。構(gòu)成細(xì)胞集合體的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞至少一方是來自牙胚。借此能夠在體內(nèi)再現(xiàn)細(xì)胞的配置，且能夠有效地形成具有特定構(gòu)造及方向性的牙齒。優(yōu)選的是間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞兩者均來自牙胚。就細(xì)胞分化階段的幼小性及均質(zhì)性而言，所述牙胚優(yōu)選為來自牙蕾期至帽狀期的牙胚。也可使用來自體內(nèi)其他間葉組織的細(xì)胞作為來自牙胚以外的間葉細(xì)胞。優(yōu)選為不含血液細(xì)胞的骨髓細(xì)胞或間葉細(xì)胞，進(jìn)ー步優(yōu)選為ロ腔內(nèi)間葉細(xì)胞及頜骨內(nèi)部的骨髓細(xì)胞、來自顱神經(jīng)嵴細(xì)胞的間葉細(xì)胞、可分化成這些間葉細(xì)胞的間充質(zhì)祖細(xì)胞及其干細(xì)胞等。使用來自羊膜的細(xì)胞作為間葉細(xì)胞的例子可參照專利文獻(xiàn)3，使用由全能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞的例子在專利文獻(xiàn)4中有記載，通過全面地引用它們，在本說明書中對它們的公開內(nèi)容進(jìn)行了概括。也可使用來自體內(nèi)其他的上皮組織的細(xì)胞作為來自牙胚以外的上皮細(xì)胞。優(yōu)選為皮膚或口腔黏膜或牙齦的上皮細(xì)胞，進(jìn)ー步優(yōu)選為由諸如皮膚及黏膜等的未成熟的上皮原始細(xì)胞分化的例如角質(zhì)化或錯(cuò)角化的上皮細(xì)胞，例如非角質(zhì)化的上皮細(xì)胞及其干細(xì)胞等。使用口腔內(nèi)上皮細(xì)胞及其初代培養(yǎng)細(xì)胞作為上皮細(xì)胞的例子可參考專利文獻(xiàn)2，通過全面地引用，在本說明書中對它的公開內(nèi)容進(jìn)行了概括。牙胚及其他組織可從哺乳動(dòng)物的靈長類(例如人類、猴子)、有蹄類(例如豬、牛、馬)、小型嚙齒類哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔子)、以及犬、貓等各種動(dòng)物的頜骨中采集。牙胚及組織的采集可直接使用通常使的采集組織的條件，在無菌狀態(tài)下取出，再保存在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐屑纯?。另外，人類的牙胚的例子包括?臼齒也就是所謂的智齒的牙胚以及胎兒牙胚。就利用自體組織而言，優(yōu)選是使用智齒的牙胚。另外，使用小鼠牙胚時(shí)，優(yōu)選是使用胎兒齡10天至16天的牙胚。
制備來自牙胚的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞時(shí)，首先進(jìn)行的是，將從周圍組織分離的牙胚，按照形狀分成牙胚間葉組織和牙胚上皮組織。此時(shí)為容易進(jìn)行分離，可使用酶，例如分散酶(dispase)、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等。本發(fā)明中細(xì)胞團(tuán)塊是指聚集的來自間葉組織或上皮組織的細(xì)胞，可通過聚集分散間葉組織或上皮組織后獲得的細(xì)胞，或聚集由該細(xì)胞初代或傳代培養(yǎng)所得細(xì)胞而制備。為了分散細(xì)胞，可使用例如分散酶、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。為獲得足夠的細(xì)胞數(shù)，在制備細(xì)胞團(tuán)塊前，對分散細(xì)胞進(jìn)行初代或傳代培養(yǎng)時(shí)，所用的培養(yǎng)基可使用通常用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如可使用Dulbecco's改良培養(yǎng)基(DMEM)等。為促進(jìn)細(xì)胞增殖可添加血清，或血清替代物，例如FGF、EGF、PDGF等細(xì)胞增長因子或轉(zhuǎn)鐵蛋白等已知的血清成分。另外，添加血清時(shí)的濃度，可依據(jù)當(dāng)時(shí)的培養(yǎng)狀態(tài)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行變更，但通常10%左右。有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)，可使用通常的培養(yǎng)條件，例如在約37°C的并具有5%的CO2濃度的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。另外也可適當(dāng)?shù)靥砑渔溍顾氐瓤股亍槭辜?xì)胞聚集，例如可將細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心處理。為了確保間葉細(xì)胞團(tuán)塊和上皮細(xì)胞團(tuán)塊在緊密接觸時(shí)的細(xì)胞相互作用，優(yōu)選的是分別使其保持高密度的狀態(tài)。高密度狀態(tài)是指ー種具有與構(gòu)成組織時(shí)相同密度的程度，例如為5 X IO7個(gè)細(xì)胞/ml-1 X IO9個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選的是I X IO8個(gè)細(xì)胞/ml-1 X IO9個(gè)細(xì)胞/ml，特別優(yōu)選的是2X IO8個(gè)細(xì)胞/ml-8X108個(gè)細(xì)胞/ml。使細(xì)胞團(tuán)塊具有高密度的方法并沒有特別限定，例如可通過將細(xì)胞離心處理后，使其聚集沉淀的方法進(jìn)行。優(yōu)選的是用離心處理的方法，因?yàn)殡x心分離作用能夠很容易地形成高密度且不會破壞細(xì)胞活性。離心處理能夠以可提供300Xg-1200Xg的離心カ的旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)行，優(yōu)選是以500Xg-1000Xg的離心カ離心分離3分鐘-10分鐘。低于300Xg的離心處理，會有細(xì)胞密度無法充分提高的傾向，反之，高于1200Xg的離心處理，則有可能使細(xì)胞受損。通過離心分離制備高密度的細(xì)胞團(tuán)塊時(shí)，一般先在用作細(xì)胞離心分離的試管等容器內(nèi)，配制好細(xì)胞懸浮液后，再進(jìn)行分離，然后盡可能去除上清液，留下呈沉淀的細(xì)胞。此時(shí)，優(yōu)選的是目標(biāo)細(xì)胞以外的成份(例如培養(yǎng)基、緩沖液)小于等于細(xì)胞的量，特別優(yōu)選的是不含目標(biāo)細(xì)胞以外的成分。將這種高密度的細(xì)胞集合體以后述方法放入支持載體內(nèi)使其緊密接觸，細(xì)胞緊密的接觸，能夠有效地發(fā)揮細(xì)胞間的相互作用?？梢允褂门c上述配置于間隔構(gòu)件內(nèi)的支持載體一祥的支持載體。為培養(yǎng)第I和第2細(xì)胞集合體所使用的支持載體，優(yōu)選的是具有能夠保持細(xì)胞集合體緊密接觸的狀態(tài)、不便細(xì)胞分散的保持力。緊密接觸狀態(tài)是指上述的高密度的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞集合體，在間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞的接觸面附近，也保持者相同程度的高密度狀態(tài)。能夠保持緊密接觸狀態(tài)的支持載體，例如在使用膠原蛋白時(shí)，為提供適當(dāng)?shù)挠捕?，所用的最終濃度為2mg/ml-3mg/ml,亦即根據(jù)JIS-K6503-1996方法(使用12. 7mm直徑的柱塞,測定下壓4mm所需要的荷重)測得的能夠形成120g-250g的凝膠強(qiáng)度的濃度。其他類型的支持載體，如果通過類似的評價(jià)方法測得具有近似的強(qiáng)度，也可作為本發(fā)明的支持載體優(yōu)選使用。另外可通過混合I種或多種支持載體，也可獲得具有相當(dāng)于目標(biāo)凝膠強(qiáng)度的硬度的支持載體。將第I和第2細(xì)胞集合體配置于支持載體內(nèi)的方法并沒有特別限定，當(dāng)細(xì)胞集合體為細(xì)胞團(tuán)塊時(shí)，例如上述通過離心分離得到的沉淀物，能夠通過微量注射器等插入支持載體內(nèi)進(jìn)行配置。當(dāng)細(xì)胞集合體為組織時(shí)，可通過使用注射器的針尖等將其配置干支持載體內(nèi)的任意位置上。本發(fā)明中，并未限制用支持載體使第I和第2細(xì)胞集合體緊密接觸的方法，例如，可先將其中一種細(xì)胞集合體配置于支持載體內(nèi)之后，再將另ー種細(xì)胞集合體以壓放在前述細(xì)胞集合體的上方的方式配置，從而使二者緊密接觸。更具體地說，通過適當(dāng)?shù)刈兏С州d 體內(nèi)上述注射器針尖的位置，能夠?qū)ⅸ`種細(xì)胞集合體壓放在另ー種細(xì)胞集合體上。當(dāng)使用上皮組織或間葉組織作為細(xì)胞集合體時(shí)，優(yōu)選的是，使該組織在原始牙胚中與間葉組織或上皮組織接觸的面，與另ー種細(xì)胞集合體接觸。另外優(yōu)選的是，在配置后包含固化支持載體的步驟。這樣能夠使細(xì)胞進(jìn)ー步聚集而達(dá)到更高密度的狀態(tài)。例如在使用膠原凝膠時(shí)，通過在培養(yǎng)溫度下靜置數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘可進(jìn)行固化。這種情況下，細(xì)胞集合體內(nèi)細(xì)胞以外的成份越少，越可實(shí)現(xiàn)更高密度的狀態(tài)。本發(fā)明中，“在支持載體內(nèi)部培養(yǎng)第I和第2細(xì)胞集合體的步驟”是例如專利文獻(xiàn)I至4及特開2008-29757號公報(bào)所記載的內(nèi)容，通過全面地引用這些文獻(xiàn)，在本說明書對這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容進(jìn)行了概括。培養(yǎng)時(shí)間因配置于支持載體內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞集合體的狀態(tài)、培養(yǎng)條件、動(dòng)物種類等而異，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x擇。為了能夠使其在移植至口腔內(nèi)時(shí)萌發(fā)成具有功能性的牙齒，優(yōu)選是至少培養(yǎng)I天，更優(yōu)選是3天或更長時(shí)間。通過延長培養(yǎng)時(shí)間，可進(jìn)一步促進(jìn)再生牙胚的形成，諸如牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)的蓄積、牙冠的形成、以及牙根的形成。為獲得期望的狀態(tài)，培養(yǎng)時(shí)間可以是例如6天以上、30天以上、50天以上、100天以上或300天以上，在培養(yǎng)過程中，也可改變培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。在支持載體內(nèi)部培養(yǎng)的步驟，可對僅包含第I和第2細(xì)胞集合體的支持載體進(jìn)行培養(yǎng)，也可在存在其他動(dòng)物細(xì)胞等情況下進(jìn)行培養(yǎng)。単獨(dú)培養(yǎng)支持載體吋，培養(yǎng)條件可使用通常用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的條件。另外在培養(yǎng)時(shí)可添加來自哺乳動(dòng)物的血清，亦可添加已知的能夠有效促進(jìn)這些細(xì)胞增殖與分化的各種細(xì)胞激素，例如這些細(xì)胞激素可以為FGF、BMP等。就細(xì)胞集合體的氣體交換或營養(yǎng)供給而言，以及不與其他動(dòng)物細(xì)胞接觸或混合、且能夠使整個(gè)過程在體外進(jìn)行的觀點(diǎn)而言，優(yōu)選的是在支持載體內(nèi)部的培養(yǎng)，是ー種器官培養(yǎng)。器官培養(yǎng)一般是使多孔性膜漂浮在適合動(dòng)物細(xì)胞増殖的培養(yǎng)基上，再將包含第I和第2細(xì)胞集合體的支持載體裝載在該膜上進(jìn)行培養(yǎng)。此處所使用的多孔性膜優(yōu)選的是具有大量的約0. 3-5 Ii m大小的孔,例如可以為Cell Culture Inserts(商品名)或IsoporeFilters (商品名)。根據(jù)本發(fā)明的牙齒的制造方法，在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)配置再生牙胚再進(jìn)行培養(yǎng)前，優(yōu)選的是先在體外對再生牙胚進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。通過預(yù)培養(yǎng)能夠使細(xì)胞間的結(jié)合和細(xì)胞間的相互作用更加強(qiáng)固，從而可縮短整個(gè)生長周期。根據(jù)本發(fā)明的方法所得的牙齒，具有內(nèi)側(cè)為牙本質(zhì)，外側(cè)為牙釉質(zhì)的牙齒所特有的細(xì)胞配置(構(gòu)造)，優(yōu)選的是具有牙尖(牙冠)和牙根位于正確的位置上的方向性，從而能夠充分發(fā)揮牙齒的功能。因此，可被廣泛利用為牙齒的替代物。另外，在為了闡明牙齒的發(fā)育過程的研究中，也可作為ー個(gè)有用的研究工具使用。而且，通過延長培養(yǎng)周期，除了牙齒本身以外，也能夠形成在頜骨支持固定牙齒的諸如牙槽骨或牙周膜等牙周組織。這樣可進(jìn)ー步提高移植后的牙齒的實(shí)用性。另外，亦可僅分離牙周組織加以利用。 [牙齒缺損部位的修復(fù)方法]根據(jù)本發(fā)明的口腔內(nèi)牙齒缺損部位的修復(fù)方法，其包含將以本發(fā)明的再生牙齒單元制造方法所制造的再生牙齒單元，移植到缺損部位的步驟。根據(jù)本方法，能夠制造和移植適合缺損部位大小和形狀的再生牙齒單元。根據(jù)本發(fā)明的再生牙齒單元的制造方法，在體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，由于牙齒在體內(nèi)不會受到壓カ而破損，能夠長成自然的形狀，因此能夠很容易制造適合缺損部位形狀的牙齒。另外，為移植到缺損部位，期望制作與缺損牙齒具有相同長度的再生牙齒，根據(jù)本發(fā)明的牙齒的制造方法，能夠控制牙齒長度的最大值。當(dāng)牙齒長度超過最大容許值時(shí)，無法直接移植該牙齒，而比最大容許值短時(shí)，則移植后能夠使其生長為期望長度的再生牙齒。根據(jù)本發(fā)明的口腔內(nèi)牙齒缺損部位的修復(fù)方法，再生牙齒單元可在牙齒發(fā)育的任ー個(gè)階段進(jìn)行移植。若已發(fā)現(xiàn)形成了牙冠，則優(yōu)選的是，使牙冠配置在口腔內(nèi)側(cè)。若處于未發(fā)現(xiàn)形成牙冠的階段時(shí)，則優(yōu)選的是，使相當(dāng)于牙冠部位的上皮細(xì)胞層或再生牙胚的上皮細(xì)胞層配置在口腔內(nèi)側(cè)。另外，再生牙胚的上皮間葉細(xì)胞層的開放部分，優(yōu)選的是配置于ロ腔內(nèi)側(cè)的相反側(cè)。這樣，可使牙齒尖(牙冠)位于口腔內(nèi)側(cè)，與周圍的牙齒具有同樣的方向性。缺損部位是指例如因拔牙等得到的、位于牙齦中的部位，并沒有特別限定其形狀。缺損部位和目標(biāo)牙齒的種類并沒有特別限定，只要能夠嵌入再生牙胚或牙齒即可。缺損部位一般位于頜骨、口腔的牙槽骨等。另外，牙齒的散失伴隨著牙槽骨量的減少時(shí)，對于缺損部位，可通過臨床所用的眾所周知的嵌入植入物的方法如GTR法(引導(dǎo)組織再生組織再生誘導(dǎo)法)，嘗試促進(jìn)牙周組織的再生。將牙胚或牙齒配置于孔部后，根據(jù)ー般的處理方法，優(yōu)選是進(jìn)行縫合。根據(jù)本發(fā)明的口腔內(nèi)牙齒缺損部位修復(fù)的方法，優(yōu)選的是，移植對象與提供制造牙齒使用的牙胚的動(dòng)物是同種類的，進(jìn)ー步優(yōu)選的是與提供牙胚的個(gè)體為同一個(gè)個(gè)體。動(dòng)物例如可以為人類、牛、馬、豬、犬、貓、小鼠等哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的是非人類的哺乳動(dòng)物。作為本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，再生牙胚可使用多個(gè)再生牙胚。優(yōu)選的是，多個(gè)再生牙胚中的每個(gè)再生牙胚都是分別單獨(dú)制備的再生牙胚。単獨(dú)制備的再生牙胚是指為未來可形成単一牙齒而制備的再生牙胚。再生牙胚的制作方法如上所述。如專利文獻(xiàn)I所記載的単獨(dú)制備的再生牙胚，能夠在制作包含多個(gè)個(gè)牙胚的再生牙胚后分離出來。然而，一般更優(yōu)選的是，可如專利文獻(xiàn)5中的記載，通過調(diào)節(jié)再生牙胚所含的牙釉節(jié)的數(shù)目，能夠?qū)⑵渲谱餍纬晌磥淼膮g一牙齒。另外，所述單獨(dú)制備的再生牙胚，可根據(jù)缺損部位的大小或?qū)⒁偕难例X的大小適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)其大小而制作。例如在制作再生牙胚時(shí)，使所述間葉細(xì)胞集合體與所述上皮細(xì)胞集合體接觸而配置時(shí)，可以使各細(xì)胞集合體大致形成圓柱狀，這種情況下，通過控制該柱的軸向的接觸長度，能夠形成在單一方向上具有期望長度的牙齒。例如通過使所述間葉細(xì)胞集合體與所述上皮細(xì)胞集合體的接觸長度，為期望的再生牙齒牙冠寬度的±25%，能夠制作具有所述期望長度的再生牙齒。為在培養(yǎng)后能制作出具有期望大小和形狀的再生牙齒，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞集合體的長度等。通過依次配置如上所述的單獨(dú)制備的再生牙胚并對其進(jìn)行培養(yǎng)，能夠制作包含多個(gè)再生牙齒的再生牙齒單元。優(yōu)選的是，調(diào)整再生牙胚的未來為咬合面部位的中心與未來為根尖部位的中心的連結(jié)軸線方向?yàn)榇笾缕叫械呐渲?。未來為咬合面部位的中心，與未來為根尖部位的中心的連結(jié)軸線方向，與再生牙齒的牙冠與牙根的連結(jié)軸線方向大概一致，本說明書中將該方向稱為“牙冠-牙根方向”。通過調(diào)整該軸線方向?yàn)榇笾缕叫卸渲茫色@得含有與天生的牙齒具有相似的牙冠-牙根方向 的多個(gè)牙齒的再生牙齒單元。另外，在配置多個(gè)再生牙胚時(shí)，優(yōu)選的是將它們配置在同一平面上。通過配置在同一平面，能夠獲得齒列整齊的再生牙齒單元。另外，當(dāng)希望齒列具有可以沿著牙齦曲線而排列的狀態(tài)時(shí)，則可以不配置在同一平面上，而是配置在沿著牙齦曲線的曲面上。在配置多個(gè)再生牙胚時(shí)，并未特別限定再生牙齒及再生牙胚的數(shù)目，可以根據(jù)牙齒缺損部位的形狀、大小或所期望的再生牙齒的顆數(shù)而選擇，優(yōu)選的是配置2-6顆，更優(yōu)選的是配置2-4顆。在依次配置多個(gè)再生牙胚時(shí)，優(yōu)選的是，使再生牙胚彼此鄰接而配置。使其鄰接而配置是指再生牙胚彼此相互接觸或幾乎接觸而配置。將再生牙胚配置為彼此鄰接時(shí)，可獲得齒列方向的牙齒間很小或沒有空隙的再生牙齒單元。另外，將多個(gè)再生牙胚鄰接配置并培養(yǎng)時(shí)，通過延長培養(yǎng)時(shí)間，可獲得牙周組織相互連接而成為一體的形狀的再生牙齒單元。因此，具有一體化形成的牙周組織的再生牙齒單元，可無需分離單個(gè)的再生牙齒，直接移植至牙齒缺損部位。如上所述的包含多個(gè)再生牙齒的一體化形成的再生牙齒單元，與ー個(gè)個(gè)移植單個(gè)的再生牙齒單元的情形相比，能夠使移植更簡便，而且，一體化的牙周組織能夠?yàn)閱蝹€(gè)的牙齒提供強(qiáng)固的支持。另外，一體化形成的包含多個(gè)再生牙齒的再生牙齒單元，與一個(gè)個(gè)移植單個(gè)的再生牙齒單元的情形相比，在移植時(shí)可無需擔(dān)心移植時(shí)或移植后齒列方向的紊亂。作為本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案，可將所述的多個(gè)再生牙胚配置于如上所述的間隔構(gòu)件內(nèi)并進(jìn)行培養(yǎng)。所述間隔構(gòu)件，如上所述，優(yōu)選的是根據(jù)將要并排的再生牙胚的數(shù)目采用適當(dāng)?shù)男螤睢Ｔ谂帕卸鄠€(gè)再生牙胚時(shí)，優(yōu)選的是，采用能夠獲得多個(gè)牙胚的齒列方向的牙冠的總寬度，或齒列方向的牙周組織的長度的形狀。因此，使用筒狀物為間隔構(gòu)件時(shí)，優(yōu)選使用接近橢圓或長方形的形狀作為底面的筒狀物。因此，通過使用間隔構(gòu)件，制作包含多個(gè)再生牙齒的再生牙齒單元時(shí)，具有插入體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，仍能夠維持再生牙胚的排列狀態(tài)的優(yōu)點(diǎn)，例如，能夠維持再生牙胚的方向或再生牙胚之間的間隔，以及再生牙胚的排列平面。
本說明書中所使用的用語，是為了說明特定的實(shí)施方案，并沒有試圖限定本發(fā)明。本說明書中所使用的“包含” ー詞，除了根據(jù)上下文有明顯不同的理解的情況以夕卜，是指存在所述的事項(xiàng)(成分、步驟、要素、數(shù)字等)，且不排除存在其他的事項(xiàng)(成分、步驟、要素、數(shù)字等)。只要沒有特別的定義，在此所用的全部用語(包含技術(shù)用語和科學(xué)用語)，都與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所廣泛理解的意思是ー樣的。在此所用的用語，只要沒有明示不同的定義，應(yīng)解釋為與本說明書及相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中一致的意思，不應(yīng)被解釋為理想化，或過度形式化的意思。本發(fā)明的實(shí)施方案有時(shí)需參照示意圖進(jìn)行說明，在這種情況下，，為了能清楚地進(jìn)行說明，示意圖可能會被夸張地描繪。使用第一、第二等用語是為了描述各種要素，應(yīng)該理解這些要素并不被這些用語所限定。使用這些用語僅是為了將ー種要素與其他要素區(qū)別開，例如可以將第一要素記作 第二要素，同樣的，可將第二要素記作第一要素，這樣也未超出出本發(fā)明的范圍。[實(shí)施例]以下，參照實(shí)施例針對本發(fā)明作更進(jìn)一歩的詳細(xì)說明。然而，本發(fā)明可通過各種的實(shí)施例而具體化，不應(yīng)被理解為被限定于這里所記載的實(shí)施例。<實(shí)施例I :使用間隔構(gòu)件在體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚>移植于腎被膜下時(shí)，為了避免腎被膜壓カ的影響，使用間隔構(gòu)件進(jìn)行再生牙胚的體內(nèi)培養(yǎng)。切斷微量吸管尖(HRI-110NEW,Molecular Bio Products, SanDiego, CA, USA)以制作內(nèi)徑(內(nèi)部直徑)為1.3_，高1.3_的圓環(huán)狀(筒狀)的間隔構(gòu)件，并在內(nèi)部填滿膠原蛋白溶液后使用。為了促進(jìn)再生牙胚向牙根方向伸長，將再生牙胚配置為使其牙冠側(cè)接近間隔構(gòu)件的壁面，并于37°C的C02保溫箱(三洋電機(jī)，大阪，日本)中進(jìn)行培養(yǎng)，使膠原蛋白凝膠硬化。接下來，將含有再生牙胚的間隔構(gòu)件移植至7周大的C57BL/6小鼠的兩側(cè)腎被膜下。通過在腎臟被膜上切割2-3mm的切ロ，剝離腎被膜與腎實(shí)質(zhì)，再在它們之間插入含再生牙胚的間隔構(gòu)件來進(jìn)行腎被膜下的移植。比較例是將器官培養(yǎng)7天的再生牙胚，在不不使用間隔構(gòu)件情況下，移植至腎被膜下。移植時(shí)的照片如圖I所示。另外，移植時(shí)間隔構(gòu)件與再生牙胚的位置關(guān)系示意圖如圖11所示。在移植3周后，拍攝了顯微CT影像，并使用集成影像處理軟件分析了影像數(shù)據(jù)。在牙冠部將最大徑定義為長徑，與長徑垂直的最大徑定義為短軸，井分別測量其長度，并計(jì)算其比例。使用間隔構(gòu)件進(jìn)行培養(yǎng)的例子如圖2所示，未使用間隔構(gòu)件而進(jìn)行培養(yǎng)的例子如圖3所示。使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)的再生牙齒單元，接近正常牙齒的形態(tài)，反之未使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)的再生牙齒單元，長徑相對于短徑極其的長，為扁平形狀。對7例使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)的組(控制組)和未使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)的組(非控制組)的長短徑進(jìn)行了測量，長徑/短徑比的計(jì)算結(jié)果如圖4(右側(cè))所示。使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)組(控制組實(shí)施例)的再生牙齒單元的長徑/短徑比為I. 46±0. 16mm，未使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)的組(非控制組比較例)為2. 30±0. 35mm。圖4(左側(cè))顯示了對成年小鼠的下頜第一、第二、第三臼齒(Ml、M2、M3)的牙冠部的被定義為長徑的最大徑、定義為短徑的與長徑垂直的最大徑的測量結(jié)果，并顯示了長徑/短徑比例的計(jì)算結(jié)果。Ml、M2、M3的長徑/短徑比分別為I. 61±0. 05mm(n = 5)、I. 09±0. 04mm (n = 5)、I. 12±0. 04mm (n = 5)。根據(jù)上述結(jié)果可知，體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，未使用間隔構(gòu)件的再生牙齒單元為扁平形狀，而使用間隔構(gòu)件的再生牙齒單元不會形成扁平形狀，且二者的長徑/短徑比具有明顯的不同。另外，體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，使用間隔構(gòu)件的再生牙齒單元的長徑/短徑比與天然牙齒的相當(dāng)(Student，s t—test,*p < 0. 0001)。摘出移植至腎被膜下30天、第60天的再生牙齒單元，拍攝顯微CT影像，使用集成影像處理軟件分析并測定長度。在顯微CT影像上測量牙齒的牙尖至根尖的長度，其中不包含形成牙槽骨的區(qū)域。測量結(jié)果如圖5所示。在未使用間隔構(gòu)件的非控制組，牙尖-根尖在第30天的長度為1.07±0. 20mm(n = 6)，第60天的長度為I. 70±0. 26mm(n = 6)，牙齒長度的有顯著地 增加。另ー方面，在使用間隔構(gòu)件的控制組，在第30天的長度為1.01±0. 19mm(n = 13)，第60天為I. 02±0. Ilmm(n = 10),未發(fā)現(xiàn)長度因移植天數(shù)的增加而增加(Student’s-t test,*p < 0. 0001)。根據(jù)上述結(jié)果可知，體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，通過使用間隔構(gòu)件，可任意調(diào)節(jié)再生牙齒的長度。<實(shí)施例2 :給予機(jī)械性刺激的再生牙胚的體內(nèi)培養(yǎng)>按照實(shí)施例I的方法，使用間隔構(gòu)件進(jìn)行器官培養(yǎng)的再生牙胚隨著間隔構(gòu)件移植至腎被膜下，自移植至腎被膜下第7天開始給予機(jī)械性的刺激，即以聲波電動(dòng)牙刷(頻率31, OOOHz =Doltz (商標(biāo))，松下公司)在小鼠背部皮膚給予3. 9X IO4Pa的壓カ(5分鐘/天)。對照組沒有給予機(jī)械性的刺激，在移植30天后將它們作為比較對象取出。對取出的再生牙齒單元用與實(shí)施例I相同的方法拍攝顯微CT影像，使用3D影像分析軟件測定牙周膜腔的寬度(有時(shí)僅簡稱作“牙周膜的寬度”)。具體而言，3D影像上的再生牙齒單元的牙根表面與形成的牙槽骨的距離為牙周膜腔的寬度，在長徑/短徑的剖面圖，分別測定6個(gè)點(diǎn)。然后將再生牙齒以4%的多聚甲醛(Paraformaldehyde=PFA)固定，再以10%こニ胺四こ酸(EDTA)脫鈣，以石蠟包埋。然后，制作厚度為Sym的連續(xù)切片，并進(jìn)蘇木精-曙紅01E)染色，進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。組織學(xué)評價(jià)的結(jié)果如圖6所示。圖中B代表牙槽骨，D為牙本質(zhì)，P為牙周膜，圖中靠近字母P的線條表示牙周膜的寬度。另外圖中右下角的比例尺表示IOOy m。給予刺激的組形成的牙周膜較無刺激的組要厚，并能夠在牙周膜區(qū)域觀察到細(xì)胞有規(guī)則的排列。另外在CT影像上測定的牙周膜的寬度的結(jié)果如圖7所示。有刺激組的牙周膜的寬度為108. 5±30. 6iim(n = 33)，無刺激組的牙周膜的寬度為68.7±14. lum(n = 12)(Student，s_t test,*p < 0. 0001)。從上述結(jié)果可知，再生牙胚進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，通過自外部給予機(jī)械性的刺激，可獲得具有充分牙周膜組織的再生牙齒單元。<實(shí)施例3 :體內(nèi)培養(yǎng)所得的再生牙齒單元的頜骨移植>拔除4周大的C57BL/6小鼠下頜的第一臼齒，并給予3天治愈期。然后，在相同部位進(jìn)行牙銀的切開與剝離，使用牙科用的微型馬達(dá)(Viva-Mate Plus,中西公司，東京，日本)切削牙槽骨，形成近中遠(yuǎn)徑Imm,頰舌徑0. 8mm的移植窩。將按照實(shí)施例1，使用間隔構(gòu)件在腎被膜下培養(yǎng)30天，并且按照實(shí)施例2，在培養(yǎng)期間給予機(jī)械性刺激所制作的再生牙齒單元，埋入頜骨移植窩內(nèi)，并以8-0尼龍手術(shù)縫合線(Bearmedic,千葉,日本)縫合牙銀。
圖8是顯示的是形成的移植窩以及移植再生牙齒單元的情況。在移植再生牙齒單元至小鼠后的0天、第14天、第30天，用與上述相同的方法進(jìn)行顯微CT攝影，并評價(jià)移植物與作為接受者的牙槽骨結(jié)合的情況。之后將含移植物的頜骨以4% PFA固定，再以10%蟻酸鈉-檸檬酸鹽脫鈣溶液進(jìn)行脫鈣，以石蠟包埋后，制作厚度為8 y m的連續(xù)切片，并以HE染色進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。圖9為CT影像，圖10為HE染色影像。如圖9所示，在移植第14天可發(fā)現(xiàn)移植物與接受者的下頜第二白齒牙槽骨間有部分的結(jié)合，在移植第30天可發(fā)現(xiàn)移植物幾乎完全與牙槽骨結(jié)合。圖中箭頭系表示再生牙齒單元。如圖10所示，在移植第30天的組織影像顯示，再生牙齒與下頜第二白齒的牙槽間隔的牙槽骨能夠融合，并且再生牙齒單元通過與骨結(jié)合能夠與移植部位的牙槽骨整合為ー體。另外根據(jù)組織分析，盡管因移植會出現(xiàn)再生牙齒的牙髓一部分鈣化的偶發(fā)癥狀(16例中有3例)，再生牙齒單元的牙周膜在移植后仍能維持，且未發(fā)現(xiàn)黏連(Dental ankylosis)(16例中0例)。圖中箭頭是表示通過骨結(jié)合而整合成一體，比例尺是表示100 u m,BT代表再生牙齒，NT代表天然的下頜第二白齒。自前述結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明的制造方法所制造的再生牙齒單元，移植至頜骨后生長良好。<實(shí)施例4 :制作含有多個(gè)牙齒的再生牙齒單元>以制作可移植至牙齒大型缺損部位的含有多個(gè)牙齒的再生牙齒單元為目的，將多個(gè)再生牙胚移植至腎被膜下，使用間隔構(gòu)件進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。切斷微量吸管尖(HRI-110NEW,Molecular Bio Products, SanDiego, CA, USA)以形成筒狀，筒的剖面形狀為長徑為3mm,短徑為2mm,高度為I. 3mm的圓角矩形,將其用作為間隔構(gòu)件，并在內(nèi)部填滿膠原蛋白溶液后使用。使4個(gè)再生牙胚相互接觸而配置，使筒的高度方向?yàn)槲磥淼脑偕例X的厚度方向，圓角矩形的短徑方向?yàn)檠例X的伸長方向，圓角矩形的長徑方向?yàn)檠例X的齒列方向。此時(shí)為促進(jìn)向牙根方向伸長，使再生牙胚的未來成為牙冠側(cè)稍微接近間隔構(gòu)件剖面的圓角矩形的ー個(gè)長邊側(cè)壁面，并在37°C的CO2恒溫箱(三洋電機(jī)，大阪，日本)中進(jìn)行培養(yǎng)，使膠原蛋白硬化。在間隔構(gòu)件內(nèi)配置多個(gè)再生牙胚的狀態(tài)的示意圖如圖12所示，其照片如圖13所示。圖12和圖13是自筒的軸向觀察所見的筒狀間隔構(gòu)件的圖或照片。接下來，將含再生牙胚的間隔構(gòu)件移植至7周大的C57BL/6小鼠的兩側(cè)腎被膜下。移植至腎被膜下是通過在腎被膜上切割5_的切ロ，剝離腎被膜與腎實(shí)質(zhì)，再在其間插入含多個(gè)再生牙胚的間隔構(gòu)件而進(jìn)行的。移植至腎被膜下60天后，自腎臟取出，獲得ー個(gè)具有多個(gè)牙齒的塊狀多齒再生牙齒單元。腎被膜下移植60天后的多個(gè)牙齒的再生牙齒單元的實(shí)體照片如圖14所示。顯微CT(日本理學(xué)株式會社，東京，日本)分析時(shí)，能夠觀察到各牙齒周圍的牙周腔膜、牙槽骨的牙槽間隔。移植至腎被膜下60天后的多個(gè)牙齒的再生牙齒單元的CT外觀影像及CT剖面圖如圖15所示。由此可知，作為本發(fā)明的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案，將分別能成長為單個(gè)牙齒的單個(gè)的牙胚進(jìn)行配置和培養(yǎng)時(shí)，通過將其未來為咬合面的方向并排排列，能夠獲得ー個(gè)處于這種狀態(tài)的再生牙齒單元與天然的牙齒ー樣，多顆單個(gè)牙齒的牙冠-牙根方向相同，且多顆牙齒能夠排成一列形成齒列。另外，作為本發(fā)明的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案，表明通過配置多個(gè)再生牙胚所制作的再生牙齒單元，其所含的多個(gè)牙齒具有正常的組織構(gòu)造，且能夠一體化地形成覆蓋其牙根部分的牙槽骨。<實(shí)施例5 :含多齒的再生牙齒單元的無齒頜模型移植>拔除4周大的C57BL/6小鼠下頜第一、第二以及第三臼齒，產(chǎn)生了ー個(gè)無齒顎模型，并給予3天治愈期間。然后，在相同部位進(jìn)行牙齦的切開與剝離，使用牙科用的微馬達(dá)(Viva-Mate Plus,中西公司，東京，日本)切削牙槽骨,形成近中遠(yuǎn)徑為頰舌徑為
I.2mm的移植窩。將在小鼠腎被膜下制作的再生牙齒單元，埋入頜骨移植窩內(nèi)，并以8-0尼龍縫線(Bearmedic,千葉，日本)縫合牙銀。對移植了含多個(gè)牙的再生牙齒單元的無齒頜模型小鼠進(jìn)行顯微CT攝影。含多個(gè)牙的再生牙齒單元移植至口腔內(nèi)后第I天的CT影像如圖16所示。通過觀察本實(shí)施例，表明含多個(gè)牙的再生牙齒單元的牙槽骨與接受者的牙槽骨能夠通過骨結(jié)合而整合成一體。這表明，即使牙齒的缺損部位較大時(shí)，也能夠一次移植適合其形狀的含多個(gè)牙齒的再生牙齒單元，而移植的再生牙齒單元的牙周組織，與被移植的個(gè)體的頜骨顯示有良好的骨結(jié)合。另外在移植后50天的CT影像上觀察到，移植的再生牙齒單元的牙周組織，與被移植的個(gè)體的頜骨進(jìn)行了骨整合。
權(quán)利要求
1.再生牙齒單元的制造方法，其是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚以制造再生牙齒單元的方法，其包含以下步驟 準(zhǔn)備間隔構(gòu)件； 將所述再生牙胚置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)并配置于所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)； 在所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)所述再生牙胚； 其中， 所述間隔構(gòu)件具有能夠防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值、且使配置于其內(nèi)部的再生牙胚能夠與所述間隔構(gòu)件的外部連通的構(gòu)造。
2.如權(quán)利要求I所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是非人類的哺乳動(dòng)物。
3.如權(quán)利要求I或2中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述間隔構(gòu)件進(jìn)一歩具有能夠防止所述哺乳動(dòng)物的體內(nèi)的組織對所述再生牙胚施加過多壓カ的構(gòu)造。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中， 將所述再生牙胚置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)并配置于所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的步驟，是將所述再生牙胚的未來為咬合面的部位以面向所述間隔構(gòu)件內(nèi)壁的方式配置在所述間隔構(gòu)件的內(nèi)壁附近，且將未來為根尖的部位配置為朝向所述間隔構(gòu)件的所述內(nèi)壁的相反方向的更大空間伸長的步驟。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中， 將所述再生牙胚置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)并配置于所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的步驟，是以填滿所述間隔構(gòu)件內(nèi)部的支持載體來支持所述再生牙胚的方式進(jìn)行配置。
6.如權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述再生牙胚的培養(yǎng)和維持，是通過實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的第I細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第2細(xì)胞集合體在支持載體內(nèi)部緊密接觸配置而進(jìn)行的，其中間葉細(xì)胞與上皮細(xì)胞至少一方是來自牙胚。
7.如權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，在培養(yǎng)所述再生牙胚時(shí)，進(jìn)一歩包含自所述哺乳動(dòng)物的外部給予機(jī)械性的刺激的步驟。
8.如權(quán)利要求7的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述機(jī)械性的刺激是大約20000Hz-大約 40000Hz 的振動(dòng)。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述間隔構(gòu)件具有能夠產(chǎn)生期望大小的再生牙齒単元的內(nèi)部空間。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述間隔構(gòu)件大致呈筒狀，所述筒的高度比期望的 再生牙齒單元的厚度大，且所述筒的內(nèi)徑約為所述再生牙齒單元的長度的最大容許值。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述間隔構(gòu)件為圓筒狀。
12.如權(quán)利要求I至11中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。
13.如權(quán)利要求I至12中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚，且在所述間隔構(gòu)件內(nèi)使多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚以相互鄰接的方式配置。
14.如權(quán)利要求I至13中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚，且使多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚在所述間隔構(gòu)件內(nèi)，以調(diào)整使各再生牙胚的未來為咬合面部位的中心，與未來為根尖部位的中心的連結(jié)軸線方向?yàn)榇笾缕叫械姆绞竭M(jìn)行配置。
15.再生牙胚組合物，其用于通過置于間隔構(gòu)件，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以制造再生牙齒單元，其特征在于，所述間隔構(gòu)件具有能夠防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值，且使置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)部的再生牙胚能夠與所述間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。
16.如權(quán)利要求15所述的再生牙胚組合物，其中所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。
17.間隔構(gòu)件，其是用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，將再生牙胚置于其中進(jìn)行培養(yǎng)以制造再生牙齒單元的間隔構(gòu)件，其特征在于，所述間隔構(gòu)件具有能夠防止所述再生牙胚的伸長超過最大容許值，且使置于其內(nèi)部的再生牙胚能夠與該間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。
18.如權(quán)利要求17所述的間隔構(gòu)件，其中，配置于所述間隔構(gòu)件內(nèi)部的再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。
19.再生牙齒單元的制造方法，其包含在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，培養(yǎng)再生牙胚的步驟，其中，培養(yǎng)所述再生牙胚時(shí)，自所述哺乳動(dòng)物外部給予機(jī)械性的刺激。
20.如權(quán)利要求19所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述機(jī)械性的刺激是大約20000Hz-大約 40000Hz 的振動(dòng)。
21.如權(quán)利要求19或20所述的再生牙齒單元的制造方法，其中，所述再生牙胚的培養(yǎng)和維持，是通過使實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成的第I細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第2細(xì)胞集合體在支持載體內(nèi)部緊密接觸配置而進(jìn)行的，其中間葉細(xì)胞與上皮細(xì)胞至少ー方是來自牙胚。
22.如權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法，其中所述再生牙胚包含多個(gè)分別単獨(dú)制備的再生牙胚。
23.動(dòng)物缺損牙齒的修復(fù)方法，其包含將根據(jù)權(quán)利要求第1-14、19-22中任一項(xiàng)所述的再生牙齒單元的制造方法所制造的再生牙齒單元，移植至所述缺損的部位的步驟。
24.如權(quán)利要求23的動(dòng)物缺損牙齒的修復(fù)方法，其中所述動(dòng)物是非人類的哺乳動(dòng)物。
25.如權(quán)利要求23-24中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物缺損牙齒的修復(fù)方法，其中所述再生牙齒単元包含齒冠-齒根方向被調(diào)整為大致平行的多個(gè)牙齒。
26.再生牙齒單元，其是根據(jù)權(quán)利要求1-14、19-22中任ー項(xiàng)的再生牙齒單元的制造方法所制造。
27.再生牙齒單元，其根據(jù)權(quán)利要求1-14、19-22中任ー項(xiàng)的再生牙齒單元的制造方法而制造，用于移植至缺損部位以修復(fù)動(dòng)物口腔內(nèi)缺損的牙齒。
28.如權(quán)利要求26或27所述的再生牙齒單元，其包含齒冠-齒根方向被調(diào)整為大致平行的多個(gè)牙齒。
29.如權(quán)利要求26或27所述的再生牙齒單元，其包含齒冠-齒根方向被調(diào)整為大致平行的、且牙周組織為一體化地形成的多個(gè)牙齒。
全文摘要
在本發(fā)明公開的再生牙齒單元的制造方法中，再生牙胚在體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，不會因空間或壓力而限制牙齒的形狀，并且能夠控制牙齒的伸長。即使在牙齒的缺損部位較大的情況下，所述方法也能夠進(jìn)行再生牙齒的移植。本發(fā)明公開的一種方法包含在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，在間隔構(gòu)件內(nèi)配置再生牙胚并培養(yǎng)的步驟。其中所述間隔構(gòu)件具有能夠防止所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的組織對所述再生牙胚施加過多壓力、以及防止再生牙胚的伸長超過最大容許值的構(gòu)造。而且，所述間隔構(gòu)件具有能夠使置于其內(nèi)部的再生牙胚與間隔構(gòu)件外部連通的構(gòu)造。另外，公開的另一種方法包含在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，在間隔構(gòu)件內(nèi)配置并培養(yǎng)多個(gè)再生牙胚的步驟。
文檔編號A61L27/00GK102869390SQ20118001776
公開日2013年1月9日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者辻孝, 中尾一久, 大島正充 申請人:株式會社器官再生工學(xué)