專利名稱：使用PTEN-Long前導(dǎo)序列進(jìn)行分子的跨膜遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)案主張2010年2月17日遞交的第61/338，377號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案的優(yōu)先權(quán)，所述案以全文引用的方式并入本文中。本文所揭示的工作是根據(jù)來自國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)的批準(zhǔn)號(hào)CA082783，在政府的支持下完成的。因此，美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。在本申請(qǐng)案中，各種公開案在括號(hào)中以第一作者和年份來提及。這些參考的完整引用可在緊靠權(quán)利要求書前面的說明書結(jié)尾找到。這些公開案的揭示內(nèi)容在此以全文引用的方式并入本申請(qǐng)案中，以更詳細(xì)地描述本發(fā)明所涉及的技術(shù)現(xiàn)狀。
背景技術(shù)：
PTEN腫瘤抑制劑(參見W098/34624，其以全文引用的方式并入本文中)是使重要的第二信使磷酯酰肌醇 3，4, 5-三磷酸(phosphatidylinositol 3, 4, 5-triphosphate)脫去磷酸的細(xì)胞質(zhì)磷酸酶(馬哈馬(Maehama)和狄克遜(Dixon) 1998)。此活性下調(diào)了許多由PIP3激活A(yù)kt而起始的致瘤信號(hào)，這些信號(hào)包括抗細(xì)胞凋亡途徑、細(xì)胞周期進(jìn)程和漸增的細(xì)胞新陳代謝(蘇黎世(Sulis)和帕森斯(Parsons) 2003)。從許多不同腫瘤類型中PTEN在遺傳上或功能上的頻繁損失來看，PTEN在癌癥中的作用是顯而易見的(波奴(Bonneau)和隆基(Longy) 2000)。起初在神經(jīng)膠質(zhì)癌中發(fā)現(xiàn)沒有PTEN，從那以后，它已經(jīng)在前列腺、乳房、子宮內(nèi)膜、黑素細(xì)胞、腎和肺的腫瘤發(fā)生中有所涉及。PTEN中的種系突變也與遺傳性癌癥易感綜合征，如考登氏綜合征(Cowden’s Syndrome)有關(guān)(英格(Eng) 2003)。PTEN損失的小鼠模型簡(jiǎn)述了 PTEN在雜合小鼠中和在許多不同組織類型中的組織特異性基因剔除中作為腫瘤抑制劑的作用(迪克里斯托夫(Di Cristofano),帕斯(Pesce)等人1998 ;垮比艾多(Kwabi-Addo),吉利(Giri)等人2001 ;帕特克里(Petrocelli)和斯林格蘭多(Slingerland) 2001 ;尤(丫011)，凱斯特林(Castrillon)等人 2002 ;弗瑞瑟(Fraser)，朱(Zhu)等人 2004)。PTEN蛋白含有N末端雙特異性磷酸酶結(jié)構(gòu)域和C末端C2磷脂結(jié)合域，接著是具有調(diào)節(jié)重要性的非結(jié)構(gòu)化尾(unstructured tail)，這種重要性是由于在其中發(fā)現(xiàn)了磷酸化部位(李(Lee),楊(Yang)等人1999 ;瓦斯科斯(Vazquez),拉馬斯瓦米(Ramaswamy)等人2000 ;托雷斯(Torres)和普利多(Pulido) 2001 ;瓦斯科斯(Vazquez)，格羅斯曼(Grossman)等人2001)。PTEN蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中，然而，越來越多的證據(jù)表明在細(xì)胞核中存在PTEN，細(xì)胞核是由通過NEDD4-1使蛋白質(zhì)單泛素化而調(diào)節(jié)的位置(貝克(Baker) 2007 ；王(Wang),特羅特曼(Trotman)等人 2007)。在起始密碼子AUG處發(fā)生的翻譯起始之前進(jìn)行5’ UTR的核糖體掃描。盡管核糖體決定適當(dāng)起始密碼子的實(shí)際方式仍未完全被理解，但是mRNA本身和指示起始前復(fù)合物將在何處減慢掃描并且開始翻譯的序列都具有某些特性。典型的“科扎克序列(Kozaksequence)" CCACCATCG (其中加下劃線的ATG是起始密碼子)已顯示為對(duì)起始最有利的序列情形(科扎克(Kozak ) 1991)。mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)有可能通過起始前復(fù)合物掃描的實(shí)際減慢也促進(jìn)起始，這需要螺旋酶在讀取之前溶解二級(jí)結(jié)構(gòu)(科扎克(Kozak) 1990)。在某些轉(zhuǎn)錄物中，翻譯起始可從非AUG密碼子開始發(fā)生。這通常只包含從轉(zhuǎn)錄物翻譯的總蛋白的較小部分并且結(jié)果是在N末端變化的混合種類的蛋白質(zhì)?？圃?Kozak)描述了從非AUG密碼子開始的翻譯起始效率并且發(fā)現(xiàn)了 GUG和CUG都能在試管內(nèi)起始翻譯，但效率低得多(科扎克(Kozak) 1989)。進(jìn)一步研究已顯示甲硫氨酸的有效性可通過一種尚不明朗的機(jī)制來改變翻譯起始的混亂性，但是可能涉及由營(yíng)養(yǎng)敏感性激酶使43S起始前復(fù)合物的成分eIF2磷酸化(荷西(Hershey) 1991 ;漢恩(Hann) 1994)。許多蛋白質(zhì)已顯示從替代性的起始密碼子開始翻譯。轉(zhuǎn)錄因子c-myc具有替代性的上游CUG起始密碼子，當(dāng)所述起始密碼子被翻譯時(shí)，添加14個(gè)氨基酸到蛋白質(zhì)的N末端(漢恩(Hann)和以色曼(Eisenman) 1984)。這種替代性的同功體(isoform)已顯示在伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)中選擇性地被破壞(漢恩(Hann),金(King)等人1988)。在組織培養(yǎng)中，當(dāng)甲硫氨酸處于低濃度時(shí)，較長(zhǎng)形式的myc主要在高細(xì)胞密度下轉(zhuǎn)錄(漢恩(Hann),斯隆布朗(Sloan-Brown)等人1992)。進(jìn)一步研究已揭示較長(zhǎng)形式的c-myc是生長(zhǎng)抑制性的并且具有與典型的c-myc蛋白質(zhì)不同組的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)(漢恩(Hann),迪 克斯特(Dixit)等人1994)。(弗洛爾凱維奇(Florkiewicz)和索瑪(Sommer) 1989)(普拉茨(Prats),克伽德(Kaghad)等人 1989。)另外，已知蛋白質(zhì)的實(shí)際亞細(xì)胞定位可由替代性的起始密碼子來指示。在小鼠的情況下，從上游CUG密碼子起始的原癌基因int-2替代物編碼核定位，而AUG密碼子編碼信號(hào)肽以定位到分泌途徑(阿克蘭德(Acland)，狄克遜(Dixon)等人1990)。類似現(xiàn)象在人類FGF3中有描述，其中從AUG翻譯的蛋白質(zhì)以分泌途徑為目的地，而從上游CUG翻譯的蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞核(凱富(Kiefer)，艾克蘭德(Acland)等人1994)。此外，在一些真核細(xì)胞蛋白質(zhì)，如TEF-I和PRPS-3中，蛋白質(zhì)完全從CUG密碼子起始(泰勒(Taira),艾扎瑟(Iizasa)等人 1990 ；肖(Xiao),大衛(wèi)德森(Davidson)等人 1991)。以分泌為目的的蛋白質(zhì)通過稱為信號(hào)肽的一段疏水性氨基酸而靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(布羅布(Blobel),沃特(Walter)等人1979)。通常在蛋白質(zhì)的N末端處發(fā)現(xiàn),信號(hào)肽在翻譯時(shí)結(jié)合信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)，并且使核糖體停止并易位到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在所述粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處核糖體結(jié)合SRP受體。一旦核糖體停泊，即釋放SRP-SRP受體復(fù)合物，并且通過Sec61易位子穿過ER的內(nèi)腔而重新開始翻譯。然后，在可溶性蛋白質(zhì)從Sec易位子釋放蛋白質(zhì)的情況下，裂解出信號(hào)肽。在蛋白質(zhì)跨越膜的情況下，跨膜螺旋體充當(dāng)ER易位的信號(hào)肽。這些蛋白質(zhì)在高爾基體中通過糖基化而廣泛地被修飾并且穿梭到分泌泡囊中的質(zhì)膜(艾伯特(Alberts)2002)。存在許多在癌癥中已顯示出重要性的分泌型蛋白質(zhì)。舉例來說，fct信號(hào)傳導(dǎo)途徑已顯示在肺癌中有變化。fct是卷曲蛋白受體家族的分泌型配體。Wnt激活卷曲蛋白引起散亂，使得包含APC的□-連環(huán)蛋白(catenin)降解復(fù)合物離解，從而允許□-連環(huán)蛋白的水平上升并且易位到細(xì)胞核，在所述細(xì)胞核中□-連環(huán)蛋白可與TCF轉(zhuǎn)錄因子相互作用并且反式激活TCF轉(zhuǎn)錄因子。APC中的失活突變和□_連環(huán)蛋白中的激活突變?cè)谶z傳性和偶發(fā)性結(jié)腸癌中已有詳細(xì)描述。另外，許多細(xì)胞外配體拮抗劑(如SFRP和Wnt-5a)競(jìng)爭(zhēng)相同的卷曲蛋白受體(如Wnt)。SFRP和Wnt-5a兩者都顯示是腫瘤抑制劑；SFRP基因剔除小鼠產(chǎn)生淋巴腫瘤并且在黑素瘤中已檢測(cè)到fct-5a的后生沉默。
如本文所揭示，新穎的經(jīng)差異性翻譯的蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列，即PTEN-long，能夠類似于HIV TAT充當(dāng)細(xì)胞穿透肽。

發(fā)明內(nèi)容
一種組合物，其包含(i)肽，包含SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子，和(ii)貨物分子，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽。一種將貨物分子遞送到細(xì)胞中的方法，其包括使所述細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含(i)肽，包含SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I中所述氨基酸殘基的一部分，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子，和(ii )貨物分子，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述接觸在允許貨物分子進(jìn)入細(xì)胞中的條件下進(jìn)行。
一種治療個(gè)體的腫瘤的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的腫瘤。一種治療個(gè)體的癌癥的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的癌癥。一種治療個(gè)體的代謝障礙的方法，其中所述代謝障礙的特征在于代謝酶缺乏，所述方法包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到所述代謝酶上，所述代謝酶的量能有效地治療所述個(gè)體的代謝障礙。一種治療個(gè)體的糖尿病的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的糖尿病。一種治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的心血管疾病。


圖I. PTEN-Iong構(gòu)建體的圖。表達(dá)構(gòu)建體，其顯示組合，產(chǎn)生所述組合以驅(qū)使PTEN從內(nèi)生性起始部位或替代性起始部位開始表達(dá)。典型的PTEN用黑色顯示，而UTR中翻譯的區(qū)域用灰色顯示。 圖2.智人PTEN mRNA的圖。PTEN mRNA編碼所示的典型的ATG起始密碼子框內(nèi)和上游的173個(gè)氨基酸(SEQ ID N0:9)。翻譯從典型的ATG上游，在CTG處核苷酸-519上開始。圖3. PTEN直系同源物的N末端的比對(duì)。在維克特NTI (Vector NTI)(英杰生命科技有限公司(Invitrogen))上使用BL0SUM62得分矩陣比對(duì)來自指定物種的PTEN蛋白序列。使用ORFinder (NCBI)，從典型的的AUG起始密碼子開始，在-519 (智人)和-520 (小家鼠)處使用CUG替代性起始密碼子而從公開的mRNA翻譯智人(SEQ IDNO: 15)和小家鼠(SEQ ID NO: 13)的延長(zhǎng)的N末端序列(阿斯泰里斯(asterix))。來自智人(NM_000314)和小家鼠(NM_008960)的mRNA序列。從貝勒醫(yī)學(xué)院(Baylor College)的蜜蜂基因組計(jì)劃(Honey Bee Genome Project)獲得意蜂(Apis mellifera)序列(SEQ ID NO: 10)。從線蟲數(shù)據(jù)庫(kù)(Wormbase)下載秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans) PTEN的蛋白序列(SEQID NO: 11) (Daf-18)。從 NCBI 下載黃牛(Bos Taurus) (XM_613125) (SEQ ID NO: 12)和黑猩猩(Pan troglodytes) (SEQ ID NO: 14) (XP_521544)。一致序列是 SEQ ID NO: 16。圖4. PTEN-long存在的證據(jù)。A)使用兩種不同PTEN抗體對(duì)不同細(xì)胞系進(jìn)行的調(diào) 查。MCFlOA和HEK293是PTEN的野生型。BT549和HCC1937是剔除PTEN的并且ZR-75-1在PTEN中有突變(L136);B)使用PTEN的單克隆抗體對(duì)不同細(xì)胞系進(jìn)行的進(jìn)一步調(diào)查，所述單克隆抗體識(shí)別PTEN和PTEN-Long ；C) Wt ES細(xì)胞表達(dá)大量的PTEN-Long。PTEN-Long在這些細(xì)胞中對(duì)穩(wěn)定的PTEN shRNA表達(dá)敏感并且在PTEN基因剔除細(xì)胞中完全不存在。大部分的pAkt水平逆向地追隨PTEN水平；D)PTEN siRNA在HEK293細(xì)胞中使PTEN和PTEN-Long的基因表達(dá)阻斷(knockdown)。E)在剔除PTEN的PC3細(xì)胞系中質(zhì)粒的外源表達(dá)。PTENorf從起始密碼子AUG開始僅僅編碼ORF (泳道2)。ATR (ATR=替代性翻譯的區(qū)域)的添加能夠微弱地翻譯PTEN-Long (泳道3)。上游起始部位突變?yōu)锳TG使蛋白質(zhì)的補(bǔ)體轉(zhuǎn)變成為完整的PTEN-Long(泳道5和6)。ATG起始密碼子突變?yōu)锳TA消除了 55kDa色帶(泳道4和6)。E)抗體增加到由5’ATR編碼的氨基酸并且用于來自HEK293的細(xì)胞溶解產(chǎn)物以及剔除PTEN的U87細(xì)胞系中，所述細(xì)胞系過度表達(dá)PTENorf或編碼5’ ATR的質(zhì)粒(ATG/ATG)。PTEN-Long在只過度表達(dá)5’ATR的細(xì)胞中可見。在U87細(xì)胞中觀察到的背景色帶出現(xiàn)在墨點(diǎn)的底部。圖5.信號(hào)肽預(yù)測(cè)。翻譯PTEN 5’ UTR序列并且輸入到SignalIP3. O中。真核信號(hào)肽的隱馬爾可夫模型(hidden markov model)用于預(yù)測(cè)。N區(qū)域表示信號(hào)肽的帶正電荷的N末端序列。H區(qū)域是信號(hào)肽的疏水性核心。C區(qū)域是由脯氨酸標(biāo)記的略帶極性的區(qū)域，所述脯氨酸常破壞疏水性核心的螺旋結(jié)構(gòu)。裂解可能性可預(yù)測(cè)釋放信號(hào)肽的裂解部位，從而允許蛋白質(zhì)釋放到ER的內(nèi)腔中(達(dá)爾貝(Dalbey)和海涅(Heijne)2002)。預(yù)測(cè)裂解在位置21處發(fā)生。所示序列是SEQ ID NO: 17。圖6.伴刀豆球蛋白A (Concanavalin A)下拉。溶解HEK293細(xì)胞并且使用伴刀豆球蛋白瓊脂糖來下拉糖基化蛋白。由SDS-PAGE解析洗脫液并且進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN (6H2. I)分析。在下拉/輸入中可觀察到PTEN-Iong的富集。注意較長(zhǎng)PTEN色帶的富集。PTEN具有多個(gè)潛在的O-糖基化部位，但是只有一個(gè)N-糖基化部位。我們使用植物凝集素伴刀豆球蛋白A，其在下拉分析法中結(jié)合糖部分，以判定HEK293細(xì)胞中PTEN補(bǔ)體的一部分是否被糖基化。我們能夠純化PTEN的混合物，所述混合物有約50%的PTEN-long，PTEN-long的大量增濃超過正常PTEN。這顯示了 PTEN-Long被糖基化并且細(xì)胞質(zhì)的55kDa形式的PTEN被糖基化或PTEN-Long在細(xì)胞外裂解。
圖7. PTEN和PTEN-P結(jié)合類肝素。使小鼠的肝臟提取物穿過Iml HiTrap肝素瓊脂糖(安瑪西亞(Amersham))柱。用500mM NaCl洗漆所述柱,并且用IM NaCl的連續(xù)柱體積洗脫蛋白質(zhì)。通過使用PTEN單克隆抗體針對(duì)PTEN進(jìn)行SDS-PAGE來分析洗脫份(fraction)。先前已顯示，PTEN對(duì)于帶較高負(fù)電荷的物質(zhì)具有親和力，PTEN的這種特性使它偏好高度陰離子性的PtdIns (3，4，5)P3 (達(dá)斯(Das),狄克遜(Dixon)等人2003)。由于類肝素是帶最大負(fù)電荷的生物分子之一，因此我們假設(shè)類肝素實(shí)際上介導(dǎo)PTEN與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合。使用來自小鼠肝臟的蛋白質(zhì)提取物，我們發(fā)現(xiàn)PTEN以高親和力結(jié)合類肝素。此外，使用IMNaCl對(duì)來自肝素瓊脂糖柱的PTEN進(jìn)行連續(xù)洗脫，也洗脫P(yáng)TEN-long。圖8.蛋白酶保護(hù)分析法。使HEK293細(xì)胞再懸浮于漸增濃度的蛋白酶K中。將最終濃度為O. 2%的曲拉通(Triton)加入含有最高濃度的蛋白酶K的反應(yīng)物中。用PMSF使反應(yīng)停止，且在拉米利緩沖液(Iaemlli buffer)中制得細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在8%聚丙烯酰胺凝膠上由SDS-PAGE解析溶解產(chǎn)物并且進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN (6H2. 1)、AKT、E_鈣粘蛋白(E-cadherin)分析。PTEN免疫墨點(diǎn)的較大色帶指定為PTEN-long。這些數(shù)據(jù)顯示E-鈣粘蛋白和PTEN-long主要在細(xì)胞表面上。
圖9.來自條件培養(yǎng)基的肝素親和純化的PTEN和PTEN-long的高鹽洗脫?？稍跅l件培養(yǎng)基的親和純化之后，從HiTrap肝素(安瑪西亞(Amersham))柱洗脫P(yáng)TEN和PTEN-long。針對(duì)PTEN尾的單克隆抗體(如上)和對(duì)5’ ATR中翻譯的氨基酸具特異性的抗體都識(shí)別質(zhì)量約為55KDa的蛋白質(zhì)色帶。圖10.來自人類血清的PTEN的純化。用蛋白質(zhì)A/G預(yù)先清除來自AB血液的人類血清的抗體并且對(duì)其進(jìn)行肝素瓊脂糖處理。由SDS-PAGE解析洗脫液并且進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN分析或單獨(dú)進(jìn)行二次處理以控制重鏈污染。圖IIA-11C. PTEN-Iong的抗血管生成活性。(A)在發(fā)育中的視網(wǎng)膜中在血管和毛細(xì)管的子組中表達(dá)PTEN-long。這種表達(dá)模式與典型形式的PTEN的表達(dá)模式形成鮮明對(duì)t匕，并且與在這些區(qū)域中發(fā)生的PTEN-long誘導(dǎo)血管退化的作用一致。當(dāng)此血管退化過程按照右上方的全部視網(wǎng)膜溶解產(chǎn)物的西方墨點(diǎn)分析(western blot)由高氧誘導(dǎo)(B),以及通過在低氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞中PTEN-long的損失誘導(dǎo)(C)時(shí)，這種相關(guān)性由PTEN-long的標(biāo)記上調(diào)而加強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)指示PTEN-long例如在糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及過度增生性血管病癥中作為抗血管生成療法的適用性。箭頭指示⑶34和PTEN-Iong陽(yáng)性組織(血管)。圖12. PTEN-Long的促細(xì)胞凋亡活性。在MCF-IOA乳腺上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如所指示，用純化的PTEN-Iong處理所述細(xì)胞24小時(shí)?？ㄋ沟鞍酌? (caspase 3)裂解指示細(xì)胞凋亡活性。圖13.用PTEN-Long處理小鼠。經(jīng)過PTEN-long或空載體對(duì)照處理十天，由測(cè)徑器測(cè)量而測(cè)定的腫瘤尺寸的圖。在pcDNA3. IHis V5載體中用ATG/ATG PTEN-long轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制成細(xì)胞質(zhì)的溶解產(chǎn)物并且穿過V5抗體珠粒且用V5肽洗脫。下文顯示V5珠粒純化洗脫液的西方墨點(diǎn)分析。初始觀察PTEN-long可用于治療腫瘤。使用注射到scid小鼠的乳腺脂肪墊中的U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(I百萬個(gè))來形成異種移植物。在移植后約兩周起始處理。圖14.用PTEN-Long處理小鼠的結(jié)果。圖顯示了用對(duì)照和PTEN-long注射液處理14天的小鼠的存活分?jǐn)?shù)(以天計(jì))。
圖15.將 PTEN(缺乏 5’ UTR 的 PTENorf )、PTEN_long 以及在氨基酸 305 處具有 G-R突變(類似于PTENorf中的G129R突變)的PTEN-Iong的指定構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。使用來自這些細(xì)胞的純化蛋白質(zhì)，顯示了 PTEN-long是活性磷酸酶并且PTEN-longG305R突變體(在PTEN中是G129R)降低磷酸酶活性。圖16.磷酸酶活性為PTEN-Iong活性所必需，這在使用PTEN-long (G305R)突變體的實(shí)驗(yàn)中有顯不?；赑TEN文獻(xiàn),可知在C2結(jié)構(gòu)域內(nèi)部形成的截?cái)嗍沟鞍踪|(zhì)不穩(wěn)定；且基于PTEN晶體結(jié)構(gòu)，可相信C2結(jié)構(gòu)域與磷酸酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用對(duì)磷酸酶活性至關(guān)重要。因此，在C末端針對(duì)PTEN-Iong活性的最小結(jié)構(gòu)域需要C2結(jié)構(gòu)域，但不需要尾。在N末端預(yù)測(cè)的裂解部位在氨基酸21處，且因此蛋白質(zhì)的功能區(qū)域在此區(qū)域內(nèi)。就此而言，重要的是應(yīng)注意當(dāng)用PTEN或用PTEN-long平行處理U87腫瘤時(shí)，PTEN處理觀察不到顯著效果，只有PTEN-long處理才觀察到。圖17.在具有His和V5標(biāo)簽的pcDNA3. I表達(dá)載體中用ATG/ATG-PTEN long轉(zhuǎn)染的 293細(xì)胞的PTEN-long的純化。在Ni+柱洗脫之后，在凝膠過濾柱中解析洗脫液。0D280用藍(lán)線顯示。在洗脫份7-18中增濃PTEN-long。此實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)量大約是lmg。箭頭指示PTEN-long和改變的遷移中的PTEN-long產(chǎn)物。圖18A-18B. (A)使用細(xì)胞死亡作為讀出結(jié)果而顯示的LNCaP前列腺癌細(xì)胞對(duì)PTEN-long純化的蛋白質(zhì)的劑量反應(yīng)(蛋白質(zhì)由ARVYS純化)。IX等于每毫升O. 33微克。在不含生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中處理細(xì)胞。24小時(shí)后，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞并且溶解于拉米利樣品緩沖液中。對(duì)指定蛋白質(zhì)進(jìn)行西方墨點(diǎn)分析。(B)用PTEN-long、PTEN-long(G305R)或空白對(duì)照(Mock control)處理的U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,如PARP的裂解以及絲氨酸473處pAKT信號(hào)的下調(diào)所指示。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)PTEN-long可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且減少PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)。圖19A-19C. AKTA純化的PTEN-Iong蛋白能夠經(jīng)五天的時(shí)段減小腫瘤尺寸，如通過使用測(cè)徑器以及使用與精諾真(xenogen)動(dòng)物活體成像系統(tǒng)相結(jié)合的熒光素酶指示器所測(cè)量。每天給予小鼠約O. 05mg PTEN-long,持續(xù)5天。使用注射到乳腺脂肪墊中的I百萬個(gè)U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞來形成異種移植物，所述細(xì)胞由于經(jīng)FUW-熒光素酶-neo感染而表達(dá)熒光素酶。在用精諾真成像系統(tǒng)成像前10分鐘，向小鼠腹膜內(nèi)注射熒光素。(A)在處理前(左圖)和處理第五天(右圖)對(duì)4只小鼠進(jìn)行熒光素酶測(cè)量。(B)在處理前和5天處理期間用測(cè)徑器測(cè)量，以cm2為單位。(C)由精諾真系統(tǒng)檢測(cè)光子，如圖中所成像。顯示群組中四只小鼠的標(biāo)準(zhǔn)誤差。對(duì)第O天到第5天檢測(cè)的光子進(jìn)行史都登氏t檢驗(yàn)(Student t_test)。圖20.在一項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，在用 PTEN (orf-403 氨基酸；n=5)、PTEN_long (G305R ；n=5)或野生型PTEN-long (n=4)處理之前,使U87腫瘤生長(zhǎng)到I. 5cm2。在5天處理之后，平均變化發(fā)光對(duì)PTEN-Iong處理的小鼠而言顯示顯著減少，但對(duì)PTEN或PTEN-long (G305R)處理的群組而言沒有減少。發(fā)光減少與腫瘤尺寸減小相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)顯示PTEN-long需要5’ ATR和磷酸酶活性來發(fā)揮功能。圖21A-21C. PTEN-Iong處理的U87異種移植物的分析顯示激活細(xì)胞凋亡和抑制PI3K信號(hào)傳導(dǎo)。如上所述，處理腫瘤5天。(A)在5天指定處理之后收集野生型PTEN-long和G305R處理的腫瘤并且溶解用于西方分析。PTEN-Iong的野生型蛋白質(zhì)能夠減少F0X0和AKT的磷酸化并且激活卡斯蛋白酶3的裂解。(B)將如所指示處理5天的代表性腫瘤固定于福爾馬林(formalin)和包埋的石蠟中。將切片針對(duì)抗體進(jìn)行染色，所述抗體檢測(cè)裂解的卡斯蛋白酶3，即細(xì)胞凋亡標(biāo)記物。PTEN-long處理的細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比有顯著增長(zhǎng)，P=O. 0419，史都登氏t檢驗(yàn)。(C)裂解的卡斯蛋白酶3染色的代表性圖像。圖22A-22B.在用PTEN-Iong處理5天的相同腫瘤中，血管數(shù)目大大減少。在5天指定處理之后收集野生型PTEN-long和G305R處理的腫瘤并且固定于福爾馬林和包埋的石蠟中。將切片針對(duì)抗體進(jìn)行染色，所述抗體檢測(cè)CD31，即作為血管內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物。(A)PTEN-Iong處理的細(xì)胞的每個(gè)視場(chǎng)(40 X物鏡)的血管數(shù)目有顯著減少，P=O. 007579，史都登氏t檢驗(yàn)。(B)⑶31染色的代表性圖像。圖23A-23B.在6個(gè)組(每組n=3)中形成U87異種移植物，并且通過肌肉內(nèi)(頂)、腹膜內(nèi)(IP)、腫瘤內(nèi)(IT)、皮下(SC)、靜脈內(nèi)(IV)注射而用PTEN-long處理4天。(A)由測(cè)徑器測(cè)量從第O天到第4天腫瘤尺寸(CM2)的平均變化。(B)右側(cè)顯示精諾真成像的代表性圖像。由此數(shù)據(jù)我們可以得出結(jié)論，與未經(jīng)處理的小鼠相比，所有注射方法都引起腫瘤生長(zhǎng)，并且只有頂處理的群組顯示退化量顯著減少。 圖24A-24C.對(duì)來自乳房、大腦和前列腺的6個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行異種移植實(shí)驗(yàn)。以上是在4個(gè)乳癌細(xì)胞系中繪制的變化(A、B和D)。經(jīng)過指定天數(shù)的處理，由測(cè)徑器測(cè)量的腫瘤表面積(cm2)的圖。(C)在只處理24小時(shí)之后即可看到HCT-1143細(xì)胞中的變化。在所有四個(gè)細(xì)胞系中，處理后腫瘤尺寸有明顯減小。圖25. PTEN-Iong與細(xì)胞結(jié)合。將PTEN-long蛋白加入冰上的U87細(xì)胞培養(yǎng)基中持續(xù)10分鐘，固定，隨后用識(shí)別其的抗體染色用于PTEN-long分析。圖26.邁爾斯分析法(Miles Assay):由PTEN-long抑制血管滲透性的誘導(dǎo)。這種抑制可通過預(yù)先培育純化蛋白與PTEN抗體(6H2. I)而逆轉(zhuǎn)。PTEN-Iong能夠通過VEGF來抑制血管滲透性的誘導(dǎo)。這種誘導(dǎo)可通過預(yù)先培育PTEN-Iong與針對(duì)PTEN產(chǎn)生的抗體(但不是對(duì)照IgG)來恢復(fù)。圖27.在起始的白氨酸(L)突變?yōu)榧琢虬彼?M)以產(chǎn)生更有效翻譯的形式之后，PTEN-Long的576氨基酸閱讀框架(單字母編碼)(SEQ ID NO:5)。起初描述的PTEN的403氨基酸閱讀框架從加下劃線的密碼子起始。圖28.用于在細(xì)菌中表達(dá)的PTEN-Iong的MSES型式(SEQ ID N0:6)，其中前21個(gè)氨基酸已被移除。C末端的V5-His抗原決定基標(biāo)簽(SEQ 10N0:7)與C末端融合(斜體)。精氨酸(R)系列和153氨基酸PTEN-Long前導(dǎo)序列的最后一個(gè)氨基酸加下劃線。圖29.細(xì)胞質(zhì)(C)和細(xì)胞核(N)部分的西方墨點(diǎn)分析指示MSES PTEN-long進(jìn)入細(xì)胞的兩個(gè)區(qū)室中。BAF180和微管蛋白的抗體用于控制細(xì)胞分部分離。V5抗原決定基用于測(cè)量所有PTEN構(gòu)建體的進(jìn)入。PTEN-Iong抗體用于測(cè)量PTEN long的進(jìn)入和R6的缺失。圖30. PL-p53的產(chǎn)生。稱為Pl的PTEN long MSES 153氨基酸前導(dǎo)序列(加下劃線)與人類P53393氨基酸序列(單字母編碼)(SEQ ID NO:8)融合。添加V5HIS抗原決定基標(biāo)簽(斜體)(SEQ ID NO: 7)到p53的C末端。圖31A-31D. PL-p53進(jìn)入細(xì)胞核中并且抑制腫瘤生長(zhǎng)。將Pfp53加入MDA-MB-468和H1299細(xì)胞的培養(yǎng)基中(lmg/ml)，從而被細(xì)胞核吸收(圖31A和31B)。用染色質(zhì)重塑因子BAF180和細(xì)胞質(zhì)因子微管蛋白的抗體來監(jiān)控細(xì)胞核(N)和細(xì)胞質(zhì)(C)的分離。對(duì)于MDA-MB468細(xì)胞，p53抗體檢測(cè)空白處理的樣品中的內(nèi)生突變體p53，所述內(nèi)生突變體p53在處理的樣品中增加。對(duì)于H1299細(xì)胞，只有在處理的樣品中才看到與Ρ^ρ53融合的V5抗原決定基。相對(duì)于空白處理的RFP對(duì)照，用O. 05毫克/天處理MDA-MB-468細(xì)胞10天顯著減少腫瘤生長(zhǎng)(圖31C)。隨著時(shí)間將Ρ^ρ53加入H1299細(xì)胞中顯示在隨后的時(shí)間點(diǎn)PUMA和P21的快速吸收和誘導(dǎo)(圖32D)。圖32.用細(xì)菌表達(dá)的MSES PTEN-Long(Long)、RFP (紅色熒光蛋白空白對(duì)照)、IgG對(duì)照以及阻斷吸收到細(xì)胞中的抗PTEN抗體138G6處理的小鼠的葡萄糖耐量測(cè)試。
具體實(shí)施例方式一種組合物，其包含(i)肽，包含SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子，和(ii)貨物分子，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽非共價(jià)地連接到所 述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、脂質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽、多肽或蛋白質(zhì)并且其中用于運(yùn)送貨物分子的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且是DNA。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且是RNA。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且是siRNA或反義寡核苷酸。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且編碼人類P53蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且編碼腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P16。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARID1A。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKB1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且是人類P53蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且是腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P16。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARID1A。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKB1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且是酶。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述酶是代謝酶。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是多肽或蛋白質(zhì)并且是抗原。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肉毒桿菌毒素或其片段。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是BCL2或硫氧還蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是診斷劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述診斷劑是不透輻射的造影劑、順磁性造影劑、超順磁性造影劑、熒光團(tuán)或計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)造影劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中,貨物分子是治療劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中,所述治療劑是生物活性小分子。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述治療劑是細(xì)胞毒性分子或化學(xué)治療劑或放射治療劑。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子通過聚合連接子而連接到用于運(yùn)送的所述肽上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述聚合連接子是聚乙二醇。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且具有聞達(dá)160kDa的分子量。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含具有SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基的肽經(jīng)過衍生化，所述肽用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽包含具有SEQIDNO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。在一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物包含具有SEQ ID N0:8中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。一種將貨物分子遞送到細(xì)胞中的方法，其包括使所述細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含(i)肽，包含SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I中所述氨基酸殘基的一部分，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子，和(ii )貨物分子，其中所述 貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述接觸在允許貨物分子進(jìn)入細(xì)胞中的條件下進(jìn)行。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、脂質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽、多肽或蛋白質(zhì)并且其中用于運(yùn)送貨物分子的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到所述貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且是DNA。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且是RNA。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且是siRNA或反義寡核苷酸。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且編碼人類P53蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是核酸并且編碼腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P16。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARID1A。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKB1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且是人類P53蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且是酶。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述酶是代謝酶。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且是腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P16。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARID1A。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCAl0在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKB1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是多肽或蛋白質(zhì)并且是抗原。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肉毒桿菌毒素或其片段。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是BCL2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是硫氧還蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是診斷劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述診斷劑是不透輻射的造影劑、順磁性造影劑、超順磁性造影劑、熒光團(tuán)或計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)造影劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中,貨物分子是治療劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中,所述治療劑是生物活性小分子。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述治療劑是細(xì)胞毒性分子或化學(xué)治療劑或放射治療劑。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述肽包含具有SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述細(xì)胞是在人類個(gè)體中。在一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物包含具有SEQ ID N0:8中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。一種治療個(gè)體的腫瘤的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的腫瘤。一種組合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQIDN0:1的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子用于治療個(gè)體的腫瘤，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽， 所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的腫瘤。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是p53。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是pl6。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARID1A。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCAl。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKBI。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是p53并且組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID N0:8中所述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ IDNO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽非共價(jià)地連接到貨物分子上。一種治療個(gè)體的癌癥的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的癌癥。一種組合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQIDN0:1的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子用于治療個(gè)體的癌癥，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的腫瘤。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是p53。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是pl6。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARID1A。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCAl。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKBl。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是p53并且組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID N0:8中所述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ IDNOil的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ IDNO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽非共價(jià)地連接到貨物分子上。 一種治療個(gè)體的代謝障礙的方法，其中所述代謝障礙的特征在于代謝酶缺乏，所述方法包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到所述代謝酶上，所述代謝酶的量能有效地治療所述個(gè)體的代謝障礙。一種組合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQIDN0:1的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到代謝酶上，所述代謝酶用于治療個(gè)體的代謝障礙，其中所述代謝障礙的特征在于代謝酶缺乏。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽共價(jià)地連接到代謝酶上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到代謝酶上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQIDNO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到代謝酶上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽非共價(jià)地連接到代謝酶上。一種治療個(gè)體的糖尿病的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的糖尿病。一種組合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQIDN0:1的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子用于治療個(gè)體的糖尿病。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、脂質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽，所述肽包含具有SEQ ID NO: 4中所述序列的氨基酸殘基。在一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:6中所述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且所述蛋白質(zhì)是腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P53。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是pl6。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARIDIA。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCAl。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKBI。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P53并且組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是BCL2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是硫氧還蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID N0:1的氨基酸殘基22-173的一部分的肽共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ IDNO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽非共價(jià)地連接到貨物分子上。一種治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的心血管疾病。一種組合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ IDNO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子用于治療個(gè)體的心血管疾病。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、脂質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是肽，所述肽包含具有SEQ ID NO: 4中所述序列的氨基酸殘基。在一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:6中所述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是蛋白質(zhì)并且所述蛋白質(zhì)是腫瘤抑制蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P53。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是pl6。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARF。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是VHL。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是SMAD4。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是ARIDIA。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BAF180。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是BRCA2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是RB。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是LKB1。在一項(xiàng)實(shí)施例中，腫瘤抑制蛋白是P53并且組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是BCL2。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是硫氧還蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施例中，心血管疾病從動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病、冠狀動(dòng)脈疾病、末梢血管病、充血性心力衰竭、心肌梗死和局部缺血/再灌注損傷組成的組中選擇。在一項(xiàng)實(shí)施例中，心血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，心血管疾病是心肌梗死。在一項(xiàng)實(shí)施例中，心血管疾病是心肌梗死并且在心肌梗死期間給予組合物。在一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物以可有效地防止細(xì)胞死亡的
量給予。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ IDNOil的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸22-173的一部分的肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽通過二硫鍵而共價(jià)地連接到貨物分子上。在一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的肽非共價(jià)地連接到貨物分子上。如本文所使用的“用于運(yùn)送貨物分子”的肽是充當(dāng)細(xì)胞穿透肽的肽，即，介導(dǎo)連接 到那里(“貨物分子”)的分子穿過生物膜而運(yùn)送的肽。如本文所使用的“貨物分子”是穿過生物膜而運(yùn)送的相關(guān)分子，例如，從細(xì)胞外空間運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)空間，所述貨物分子共價(jià)地或非共價(jià)地連接到本文所描述的運(yùn)送肽中的一個(gè)。在貨物分子是肽、多肽或蛋白質(zhì)的實(shí)施例中，運(yùn)送肽可通過肽鍵而共價(jià)地連接到所述貨物分子上，從而形成融合蛋白。特定而言，SEQ ID NO:4中所述的PTEN多肽從貨物分子的定乂中排除。如本文所使用的“siRNA”是雙鏈(ds) RNA，通常約19_25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，通常在每個(gè)末端具有3’突出物(overhang) (2個(gè)核苷酸)。一種將siRNA共價(jià)地連接到用于運(yùn)送貨物分子的肽上的方法是通過在siRNA有義鏈的5’末端處的二硫鍵來完成。如本文所使用的“心血管疾病”意謂影響哺乳動(dòng)物心臟和/或心臟供血和/或其他血管組分的正常生理功能的病理狀態(tài)，包括動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病、冠狀動(dòng)脈疾病、末梢血管病、充血性心力衰竭、心肌梗死和局部缺血/再灌注損傷。如本文所使用的“化學(xué)治療劑”是在所屬領(lǐng)域中用于治療癌癥的烷化劑、抗代謝物、蒽環(huán)類藥物(anthracycline)、植物堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑。如本文所使用的“放射治療劑”是在所屬領(lǐng)域中用于治療癌癥的放射性同位素。如本文所使用的“小分子”是低分子量有機(jī)化合物，所述化合物不是聚合物并且具有小于IKDa并且更通常是小于SOODa的分子量。在實(shí)施例中，腫瘤是癌細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，癌細(xì)胞是個(gè)體的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、前列腺、卵巢、子宮、子宮內(nèi)膜、乳房、黑素細(xì)胞、腎、肺、結(jié)腸、頭、頸或胰臟的腫瘤。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是腫瘤抑制蛋白。如本文所使用的“腫瘤抑制蛋白”是由腫瘤抑制基因編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)具有阻抑或抑制效果或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，或者有時(shí)兩種都有。腫瘤抑制蛋白的非限制性實(shí)例包括P53、pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180、BRCAl、BRCA2、RB 和 LKBl。在一項(xiàng)實(shí)施例中，貨物分子是p53蛋白或編碼p53的核酸(TP53腫瘤蛋白p53，智人-安卓基因(Entrez Gene)，基因ID :7157)或其活性片段，或其單核苷酸多形體或其片段。本文所描述的用于運(yùn)送貨物分子的肽序列就屬性而言是細(xì)胞穿透肽，但是細(xì)胞穿透肽通常具有30個(gè)或少于30個(gè)氨基酸。使用細(xì)胞穿透肽將RNA (包括siRNA)遞送到細(xì)胞中在馬度帕拉(Mathupala)等人，治療專利專家觀點(diǎn)(Expert Opin Ther Pat. ) 2009年2月；19(2) :137-140中有描述，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。使用細(xì)胞穿透肽遞送疫苗在布魯克(Brook)等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochim Biophys Acta. ) 2010年I月；1805 (I) : 25-34中有描述，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。納米顆粒、脂質(zhì)體和其他納米載體的遞送在朱利安娜(Juliano)等人，納米醫(yī)學(xué)與納米生物技術(shù)的威利跨學(xué)科評(píng)論(Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. )2009 年 5 月;I (3) : 324-35中有描述，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。使用細(xì)胞穿透肽遞送化學(xué)治療劑和抗癌劑在巴特勒(Bitler)等人，抗癌藥物發(fā)明的最新專利(Recent Pat Anticancer DrugDiscov. ) 2009年12月2日，Epub中有描述，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中?！爸委煛闭系K或疾病應(yīng)意謂減慢、停止或逆轉(zhuǎn)障礙的進(jìn)程和/或改善、減輕或移除障礙的癥狀。因此，治療障礙涵蓋了逆轉(zhuǎn)障礙的進(jìn)程，包括直到障礙本身消除的點(diǎn)。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，所述方法用于將預(yù)防有效量的貨物分子遞送給個(gè)體。如本文所使用的物質(zhì)的“預(yù)防有效”量是有效預(yù)防或推遲所述物質(zhì)所給予的個(gè) 體的指定病理學(xué)病狀發(fā)作的量。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，所述方法用于將治療有效量的貨物分子遞送給個(gè)體。如本文所使用的物質(zhì)的“治療有效”量是有效治療、改善或減輕所述物質(zhì)所給予的患病個(gè)體的指定病理學(xué)病狀的癥狀或病因的量。在一項(xiàng)實(shí)施例中，治療或預(yù)防有效量是從每次給藥約I毫克藥劑/個(gè)體到約I克藥劑/個(gè)體。在另一實(shí)施例中，治療或預(yù)防有效量是從約10毫克藥劑/個(gè)體到500毫克藥劑/個(gè)體。在另一實(shí)施例中，治療或預(yù)防有效量是從約50毫克藥劑/個(gè)體到200毫克藥劑/個(gè)體。在另一實(shí)施例中，治療或預(yù)防有效量是約100毫克藥劑/個(gè)體。在另一實(shí)施例中，治療或預(yù)防有效量從50毫克藥劑/個(gè)體、100毫克藥劑/個(gè)體、150毫克藥劑/個(gè)體、200毫克藥劑/個(gè)體、250毫克藥劑/個(gè)體、300毫克藥劑/個(gè)體、400毫克藥劑/個(gè)體和500毫克藥劑/個(gè)體中選擇。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，使用所屬領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的各種方法和遞送系統(tǒng)中的任一種來給予個(gè)體包含肽和貨物分子的組合物。舉例來說，可以靜脈內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、通過腦脊髓液、通過移植物、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)、心肌內(nèi)或皮下給藥。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物通過直接引入腫瘤中而給予個(gè)體。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，將組合物注射到實(shí)體腫瘤中。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物通過導(dǎo)管而直接引入腫瘤中。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物通過直接引入供給腫瘤的血管中而給予個(gè)體。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，將組合物注射到供給腫瘤的血管中。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，組合物通過導(dǎo)管而直接引入供給腫瘤的血管中。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，將組合物靜脈內(nèi)給予個(gè)體。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，將組合物皮下給予個(gè)體。術(shù)語(yǔ)PTEN指代由SEQ ID N0:4定義的多肽。PTEN-Iong 有時(shí)另外稱為 PTEN-beta、PTEN-β、PTEN_S。用于本文所描述的組合物的可注射藥物遞送系統(tǒng)包括溶液、懸浮液、凝膠、微球體和聚合可注射液，并且可包含賦形劑，如改變?nèi)芙舛鹊脑噭?例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚己內(nèi)酯和PLGA)。可植入系統(tǒng)包括桿狀物和盤狀物，并且可含有賦形劑，如非限制性實(shí)例PLGA和聚己內(nèi)酯。用于本發(fā)明組合物的口服遞送系統(tǒng)包括藥片和膠囊。這些系統(tǒng)可含有賦形劑，如粘合劑(例如羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、其他纖維素材料和淀粉)、稀釋劑(例如乳糖和其他糖、淀粉、磷酸二鈣和纖維素材料)、崩解劑(例如淀粉聚合物和纖維素材料)以及潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鹽和滑石)。用于本發(fā)明組合物的經(jīng)粘膜遞送系統(tǒng)包括貼片、藥片、栓劑、子宮環(huán)、凝膠和乳膏，并且可含有賦形劑，如增溶劑和增強(qiáng)劑(例如丙二醇、膽汁鹽和氨基酸)以及其他媒劑(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及親水性聚合物，如羥丙基甲基纖維素和透明質(zhì)酸)。舉例來說，用于本發(fā)明組合物的經(jīng)皮遞送系統(tǒng)包括水性和非水性凝膠、乳膏、多重乳液、微乳液、脂質(zhì)體、軟膏、水性和非水性溶液、洗劑、氣霧劑、烴類基質(zhì)和粉末，并且可含有賦形劑，如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)以及親水性聚 合物(如聚卡波菲(polycarbophil)和聚乙烯卩比咯燒酮)。在一項(xiàng)實(shí)施例中，醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑是脂質(zhì)體或經(jīng)皮增強(qiáng)劑。用于本發(fā)明組合物的可重構(gòu)遞送系統(tǒng)的溶液、懸浮液和粉末包括媒劑，如懸浮劑(例如膠、黃原膠(zanthan)、纖維素和糖)、保濕劑(例如山梨糖醇)、增溶劑(例如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(例如月桂基硫酸鈉、斯潘(Span)、吐溫(Tween)和十六烷基吡啶)、防腐劑和抗氧化劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯、維生素E和C以及抗壞血酸)、防結(jié)塊劑、涂布劑以及螯合劑(例如EDTA)。如本文所使用的“5’ATR”是5’替代性翻譯的區(qū)域，如下文實(shí)驗(yàn)部分中所描述。在一項(xiàng)實(shí)施例中，本文所描述的組合物另外包含醫(yī)藥載劑。如本文所使用的“醫(yī)藥載劑”是醫(yī)藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或媒劑，用于將本發(fā)明組合物遞送給動(dòng)物或人類。載劑可以是液體、氣霧劑、凝膠或固體并且按腦中所計(jì)劃的給藥方式來選擇。在本文所描述的方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞并且是實(shí)體腫瘤細(xì)胞。如本文所使用的“實(shí)體腫瘤”包括癌性和非癌性實(shí)體腫瘤。癌性實(shí)體腫瘤包括(但不限于)膽道癌；腦癌，包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和成髓細(xì)胞瘤；乳癌；子宮頸癌；絨膜癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；胃癌；上皮內(nèi)贅瘤，包括鮑溫氏病(Bowen’s disease)和帕哲氏病(Paget’sdisease);肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)和淋巴細(xì)胞性淋巴瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；口腔癌，包括鱗狀細(xì)胞癌；卵巢癌，包括由上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；結(jié)腸直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨肉瘤；皮膚癌，包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌；睪丸癌，包括胚組織腫瘤(精原細(xì)胞瘤、非精原細(xì)胞瘤[畸胎瘤、絨膜癌])、基質(zhì)腫瘤和生殖細(xì)胞腫瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓質(zhì)癌；以及腎癌，包括腺癌和威爾氏腫瘤(Wilms tumor);但不包括非實(shí)體組織的腫瘤，如白血病和其他血液科贅瘤，包括急性淋巴細(xì)胞性白血病和骨髓性白血??；多發(fā)性骨髓瘤；AIDS相關(guān)白血病和成人T細(xì)胞白血病淋巴瘤。序列表的SEQ ID NO: I是PTEN-long蛋白的前導(dǎo)序列和信號(hào)序列(殘基1-21)。序列表的SEQ ID N0:2是PTEN-long蛋白的前導(dǎo)序列和信號(hào)序列(殘基1_21)的類似物。在本文所描述的方法和組合物的任一實(shí)施例中，可使用SEQ ID N0:2在敘述SEQID NO: I 的地方代替 SEQ ID NO: I。
SED ID NO: 3 是 PTEN-long 上的抗原決定基。SEQ ID N0:4 是 PTEN (即，不是 PTEN-long)的多肽。SED ID N0:6 是 MSES PTEN-long。SEQ ID N0:8是PTEN_long-p53融合蛋白。在本文所描述的方法和組合物的任一實(shí)施例中，可使用SEQ ID NO:8的氨基酸1-153在敘述SEQ ID NO: I的地方代替SEQ IDNO: I。在以上描述的任一方法的一項(xiàng)實(shí)施例中，包含SEQ ID NO: I的氨基酸22-173或SEQ ID NO: I的一部分的肽是包含SEQ ID NO: I的氨基酸22-173的一部分的肽，所述肽保留穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子的能力。當(dāng)本說明書中提供范圍時(shí)，應(yīng)了解，所述范圍包括在那個(gè)范圍內(nèi)的所有整數(shù)和O. I 個(gè)單位，以及其任何子范圍。舉例來說，范圍77%到90%包括77. 0%、77· 1%、77· 2%,77. 3%、77. 4%, 77. 5%, 77. 6%, 77. 7%, 77. 8%, 77. 9%,80. 0%、80· 1%、80· 2%,80. 3%,80. 4%,80. 5%、80. 6%,80. 7%,80. 8%,80. 9% 和 90. 0%,以及范圍 80% 到 81. 5% 等。本文所描述的各種要素的所有組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。參考以下實(shí)驗(yàn)詳情來更好地理解本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域中的技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)至IJ，詳細(xì)描述的具體實(shí)驗(yàn)只是用來說明如上文的權(quán)利要求書中更詳細(xì)描述的本發(fā)明內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)詳情第一系列實(shí)齡PTEN腫瘤抑制劑是癌癥中最常改變的基因之一。它發(fā)揮磷酯酰肌醇3，4，5_三磷酸的脂質(zhì)磷酸酶的功能，繼而抑制從磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)和Akt進(jìn)行致癌基因信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)PTENmRNA的檢查揭示5’未翻譯區(qū)域(UTR)在770bp的PTEN的開放閱讀框架(ORF)內(nèi)。在此UTR ORF內(nèi)，在典型的AUG起始密碼子上游的513個(gè)堿基對(duì)的弱科扎克序列內(nèi)有替代性的CUG起始密碼子。盡管典型的PTEN ORF的表達(dá)產(chǎn)生以約55kDa遷移的蛋白質(zhì)，但是含有5’ UTR的PTEN cDNA的表達(dá)能產(chǎn)生稱為PTEN-long的70kDa的第二蛋白質(zhì)。起始部位的突變指示55KDa PTEN由典型的的起始密碼子翻譯而產(chǎn)生，而PTEN-Iong從上游替代性的起始密碼子起始。具有不同PTEN抗體的免疫墨點(diǎn)分析顯示了在多個(gè)細(xì)胞系中PTEN-long的內(nèi)生性存在。小鼠ES細(xì)胞中的基因表達(dá)阻斷和基因剔除研究確認(rèn)了此較大蛋白質(zhì)確實(shí)是PTEN。添加的N末端蛋白序列編碼信號(hào)肽和裂解部位，從而指示PTEN-long進(jìn)入分泌途徑中。PTEN-long優(yōu)先結(jié)合植物凝集素伴刀豆球蛋白A，從而顯示它被糖基化。此外，PTEN-long可通過使用PTEN抗體和硫酸類肝素兩者進(jìn)行親和純化而從條件培養(yǎng)基中純化。PTEN-long在活體內(nèi)蛋白酶保護(hù)分析法中也對(duì)降解敏感，而正常的PTEN并不如此，從而指示PTEN-long位于細(xì)胞膜的外部。試劑、細(xì)胞系和抗體-蛋白酶K和伴刀豆球蛋白A從希格瑪公司(Sigma)(密蘇里州，圣路易斯)購(gòu)買。肝素瓊脂糖和HiTrap肝素HP柱從安瑪西亞公司(Amersham)(新澤西州，皮斯卡塔韋)購(gòu)買。PTEN抗體從賽信通公司(Cell Signaling)(馬薩諸塞州，丹弗斯)和加德公司(Cascade)(馬薩諸塞州，溫徹斯特)購(gòu)買。Akt抗體從賽信通公司(CellSignaling)(馬薩諸塞州，丹弗斯)獲得，并且E I丐粘蛋白抗體從密理博公司(UpstateMillipore)(馬薩諸塞州，比爾里卡)獲得。由萊貿(mào)生物科技公司(ZymedLaboratories)(力口利福尼亞州，南舊金山)產(chǎn)生針對(duì)抗原決定基PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD (SEQ ID NO: 3)(在PTEN的新翻譯中發(fā)現(xiàn))的多克隆親和純化的抗體。二級(jí)抗體從皮亞斯公司(Pierce)(伊利諾伊州，羅克福德)購(gòu)買。HEK293、ZR-75-1、SKBR-3、MDAMB-361、BT549 和 PC3 從 ATCC (弗吉尼亞洲，馬納薩斯)獲得并且根據(jù)所提供的指南來培養(yǎng)。質(zhì)粒和構(gòu)建體-如先前所報(bào)導(dǎo)，通過將PTEN cDNA (作為U90351而存放在NCBI)克隆到pCEP4 (英杰生命科技有限公司(Invitrogen))的NotI部位來產(chǎn)生編碼PTEN和5’未翻譯區(qū)域的完整開放閱讀框架的PCEP4-PTEN (李(Li)，辛普森(Simpson)等人1998)。通過接合編碼在用于克隆的最初NotI限制部位上游的序列的適體而在此質(zhì)粒上進(jìn)一步延伸5’ UTR0所述適體編碼位于典型的起始部位的-513處第一個(gè)可能替代性CTG起始密碼子上游至多10個(gè)堿基對(duì)。假定的替代性起始部位突變?yōu)锳TG的適體也用于產(chǎn)生第二組表達(dá)構(gòu)建體，在所述構(gòu)建體中將有效地表達(dá)較長(zhǎng)形式。此外，還使典型的起始密碼子突變?yōu)锳TA，從而產(chǎn)生總共4種不同構(gòu)建體(圖5. I)。這4種變種，以及最初PTEN的開放閱讀框架也亞克隆到MSCV (加利福尼亞州，山景城，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司(Clontech))逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，用于通過感染而穩(wěn)定地表達(dá)。蛋白酶保護(hù)分析法-在不含胰蛋白酶的冰冷PBS中收集HEK293細(xì)胞，并且將 5X IO5個(gè)細(xì)胞的等分試樣與漸增濃度(0.5 μ g/ml到lOyg/ml)的蛋白酶K 一起培育30分鐘。將含0.1%曲拉通的對(duì)照包括在內(nèi)，以驗(yàn)證蛋白酶K使指定蛋白質(zhì)降解的能力。用5mM PMSF使反應(yīng)停止。將細(xì)胞溶解于2 X拉米利樣品緩沖液(125nM Tris pH 6. 8，20%甘油，O. 05%溴酚藍(lán)，4%SDS，10%2-巰基乙醇)中并且進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN、Akt和E鈣粘蛋白分析。從小鼠肝臟中純化PTEN-將來自C57BL6小鼠的肝臟在液氮中迅速冰凍，弄碎并且再懸浮于 TNN 緩沖液(50mM Tris pH 7. 4,150mM NaCl,0. 5%NP-40,5mM EDTA，3% 甘油，ImMDTT，1X哺乳動(dòng)物蛋白酶混合抑制劑[希格瑪公司(Sigma)])中。將懸浮液用研缽均化并且在4°C下以40. OOORPM離心I小時(shí)。用O. 45微米和O. 22微米過濾器相繼過濾上清液。用TNN預(yù)先平衡丙烯葡聚糖凝膠(sephacryl) 200尺寸排斥柱(安瑪西亞公司(Amersham))并且以O(shè). 3ml/h的速率施加此樣本，接著施加緩沖液。收集2ml洗脫份并且匯集低分子量樣品并施加到預(yù)先平衡的HiTrap肝素HP柱(安瑪西亞公司(Amersham))上。用3柱床體積的TNN洗滌所述柱并且逐步用3X柱床體積的O. 3M、0. 5M和IM NaCl TNN溶液洗脫蛋白質(zhì)。以O(shè). 5ml增量收集洗脫份并且進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN分析。從培養(yǎng)基中純化PTEN肝素-在15cm培養(yǎng)皿中的10%FBS DMEM中使HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到匯合。將所述細(xì)胞與15ml不含F(xiàn)BS的DMEM —起培育整夜。從20個(gè)培養(yǎng)盤中收集培養(yǎng)基并且通過O. 45微米過濾器過濾。在4 下使用4ml/min的流速用AktaPrime (安瑪西亞生物科學(xué)公司(AmershamBioscience))以DMEM平衡Iml肝素HP柱。隨后使條件培養(yǎng)基以 lml/min 穿過所述柱。用 10 體積的 BC200 (200mM NaCl, 50mM Tris pH 7. 4, ImMEDTA, O. 2%曲拉通X-100)洗滌所述柱。用5ml的IMNaCl以lml/min洗脫Iml洗脫份中的蛋白質(zhì)。由280nm下的OD來確定各洗脫份的蛋白質(zhì)濃度。用20%三氯乙酸使各洗脫份的一半沉淀，用真空干燥的冷丙酮洗滌。在20μ I拉米利溶解緩沖液中重構(gòu)蛋白質(zhì)并且使用PTEN和PTEN-long的抗體進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰。從血清中純化PTEN-來自AB血漿的人類血清從希格瑪公司(Sigma)獲得。通過O. 45微米過濾器過濾Iml血清并且使用蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖預(yù)先清除抗體而用于I小時(shí)培育。將肝素-瓊脂糖與預(yù)先清除的血清以及瓊脂糖對(duì)照一起培育整夜并且在第二天用BC150 (150mM NaCl, 25mM Tris pH 7. 4，1%NP_40，O. 25% 脫氧膽酸鈉，ImM EDTA)洗滌。用拉米利樣品緩沖液洗脫蛋白質(zhì)并且進(jìn)行免疫墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN分析或二次處理(只對(duì)于重鏈污染)。伴刀豆球蛋白A下拉-用 BC500(500mM NaCl, 20mM Tris pH 7. 4，1% 曲拉通X-100，ImM MnCl2, ImM CaCl2, IX蛋白酶抑制劑混合物)溶解次匯合的HEK293細(xì)胞。使細(xì)胞溶解產(chǎn)物離心并且過濾。在4°C下用20微升伴刀豆球蛋白A瓊脂糖(希格瑪公司(Sigma))進(jìn)行下拉，持續(xù)I小時(shí)。用BC500洗滌樹脂并且用拉米利樣品緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。結(jié)果PTEN mRNA具有上游替代性起始部位存放在NCBI中的PTEN mRNA (李(Li)和孫(Sun) 1997 ;斯泰克(Steck),波斯豪 斯(Pershouse)等人1997)含有外延的5’ UTR0 5’ UTR區(qū)域中約770bp的相連序列在起始密碼子的框內(nèi)。在此區(qū)域中沒有甲硫氨酸被編碼，但是，有在典型的起始密碼子的-519處開始的若干個(gè)替代性的起始CUG密碼子。根據(jù)scansite (scansite. mit. edu)和prosite(www. ebi. ac. uk/ppsearch),此序列的翻譯沒有揭示可鑒別的結(jié)構(gòu)域。此完整區(qū)域的翻譯將添加173個(gè)氨基酸到PTEN中，從而使它的分子量增加到約70，000道爾頓(圖2)。其他PTEN直系同源物的比對(duì)揭示智人UTR的翻譯序列可在來自各種物種的PTEN的開放閱讀框架中找到。黑猩猩、黃牛、意蜂和秀麗隱桿線蟲都含有與智人5’ UTR的翻譯產(chǎn)物同源的蛋白序列(圖3)。此外，智人5’UTR和小家鼠PTEN 5’UTR的比對(duì)顯示了廣泛的核苷酸同源性(未圖示)。與智人5’ UTR的翻譯相比，小家鼠5’ UTR對(duì)于522個(gè)堿基對(duì)在典型起始密碼子的框內(nèi)翻譯并且揭示了高度同源的蛋白序列(圖5. 3)。5’UTR的同源性和來源于智人5’UTR的氨基酸序列在其他物種的翻譯蛋白質(zhì)中的實(shí)際存在指示了此序列的進(jìn)化重要性。PTEN mRNA可從替代性的上游部位起始翻譯。PTEN ORF的過度表達(dá)產(chǎn)生了 55kDa的單個(gè)蛋白質(zhì)色帶。包含5’UTR產(chǎn)生了約70kDa的第二個(gè)較大蛋白質(zhì)色帶。PTEN免疫墨點(diǎn)中的較大蛋白質(zhì)色帶也內(nèi)生地存在于許多細(xì)胞系中并且可由不同單克隆抗體檢測(cè)(圖4)。此較大蛋白質(zhì)色帶也存在于小鼠野生型ES細(xì)胞中并且在PTEN基因剔除小鼠ES細(xì)胞中不存在并且在穩(wěn)定地表達(dá)PTEN shRNA的小鼠ES克隆體中減少(圖4)。使用siRNA在HEK293細(xì)胞中使人類PTEN蛋白的基因表達(dá)阻斷還引起70kDa蛋白質(zhì)的基因表達(dá)阻斷。在剔除PTEN的PC3細(xì)胞系中編碼PTEN的ORF的質(zhì)粒的表達(dá)使得55kDa蛋白質(zhì)產(chǎn)生。當(dāng)也編碼5’ UTR的質(zhì)粒被過度表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生70kDa蛋白質(zhì)。上游假定的起始密碼子從CTG突變?yōu)锳TG (圖1，“ATG/ATG”)主要使免疫墨點(diǎn)模式轉(zhuǎn)變成70kDa形式(圖4)。55kDa色帶也被確認(rèn)為通過突變而源于ATG起始密碼子(圖4，“CTG/ATA”)。因此，5’UTR足以起始較長(zhǎng)形式的PTEN的翻譯。因此，5’UTR被稱為替代性翻譯的區(qū)域的5’ ATR并且檢測(cè)到的較大蛋白質(zhì)被稱為“PTEN-long”。產(chǎn)生針對(duì)從5’ATR翻譯的氨基酸的經(jīng)親和純化的多克隆抗體并且所述多克隆抗體用于確認(rèn)過度表達(dá)研究中重組PTEN-long的產(chǎn)生，以及HEK293細(xì)胞中內(nèi)生形式的產(chǎn)生(圖4)。從HEK293細(xì)胞的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物免疫墨點(diǎn)分析和PC3細(xì)胞的過度表達(dá)研究中，似乎存在多種形式的PTEN-long，從而指示了潛在的翻譯后修飾、無文獻(xiàn)記載的剪接形式或甚至是5’ ATR中的替代性起始密碼子。PTEN-Iong編碼N末端信號(hào)肽PTEN-long的N末端序列含有一段較長(zhǎng)的丙胺酸，所述丙胺酸可指示跨膜序列或信號(hào)肽。使用SignalIP 3. O對(duì)翻譯序列進(jìn)行的分析以高度可能性(>95%)預(yù)測(cè)所述序列含有信號(hào)肽(圖5)。信號(hào)肽在特征方面包含堿性氨基酸，接著是疏水段。假定的疏水性跨膜螺旋體被脯氨酸破壞并且接著被略帶極性的序列破壞。所述序列也預(yù)測(cè)被裂解，從而指示蛋白質(zhì)應(yīng)釋放到ER的內(nèi)腔中。分泌蛋白質(zhì)和細(xì)胞外蛋白質(zhì)的特點(diǎn)之一是添加復(fù)合糖部分到高爾基體中，一種稱為糖基化的過程。糖可通過N-糖基化而在一致序列N-X-S/T (X不能是脯氨酸)處添加到天冬酰胺中(古帕塔(Gupta)和布魯納克(Brunak)2002);絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基組還可以是O-糖基化的目標(biāo)(尤萊紐斯(Julenius),摩爾加德(Molgaard)等人2005)。PTEN具有多個(gè)O-糖基化部位，但是只有一個(gè)N-糖基化部位。在下拉分析法中使用結(jié)合糖部分 的植物凝集素伴刀豆球蛋白A，以判定HEK293細(xì)胞中PTEN補(bǔ)體的一部分是否被糖基化。從這些細(xì)胞中純化PTEN-Iong約為50%的PTEN混合物(圖6)。這顯示了 PTEN-Long被糖基化并且細(xì)胞質(zhì)的55kDa形式的PTEN被糖基化或PTEN-Long在細(xì)胞外裂解。PTEN-Iong結(jié)合類肝素并且在細(xì)胞表面上被發(fā)現(xiàn)PTEN結(jié)合許多蛋白聚糖,如多配體蛋白聚糖(syndecan)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)，所述蛋白聚糖被發(fā)現(xiàn)連接到膜的外葉上。這些蛋白聚糖是兩種類肝素化程度最高的細(xì)胞外分子(布來諾(Blero)，張(Zhang)等人2005)。先前已顯示，PTEN對(duì)帶較高負(fù)電荷的物質(zhì)具有高親和力，PTEN的這種特性使它偏好高度陰離子性的PIP3(達(dá)斯(Das)，狄克遜(Dixon)等人2003)。由于類肝素是帶最大負(fù)電荷的生物分子之一，因此有可能的是，類肝素可介導(dǎo)PTEN與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合。使用來自小鼠肝臟的蛋白質(zhì)提取物，發(fā)現(xiàn)PTEN以高親和力結(jié)合類肝素。此外，使用IM NaCl對(duì)來自肝素瓊脂糖柱的PTEN進(jìn)行連續(xù)洗脫，也洗脫 PTEN-Iong (圖 7)。粘著于細(xì)胞膜外表面上的PTEN-Iong應(yīng)對(duì)蛋白酶降解敏感。在蛋白酶保護(hù)分析法中，將活細(xì)胞與蛋白酶一起培育并且只有細(xì)胞外蛋白質(zhì)被降解，這是因?yàn)橹|(zhì)膜對(duì)蛋白酶是不可滲透的并且用以保護(hù)所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。通過與PBS —起輕輕攪動(dòng)而從附著培養(yǎng)物中移除HEK293細(xì)胞并且使所述細(xì)胞與漸增濃度的蛋白酶K 一起懸浮。用PMSF使反應(yīng)停止并且用拉米利緩沖液溶解細(xì)胞。PTEN-long顯示了對(duì)蛋白酶K和E-鈣粘蛋白(一種已知細(xì)胞外蛋白質(zhì))處理的敏感性(圖8)。另一方面，PTEN顯示適度的蛋白酶敏感性，這指示了55kDa物質(zhì)的某個(gè)部分也在細(xì)胞外(因?yàn)樗惶腔?或在使細(xì)胞質(zhì)PTEN暴露于蛋白酶K的分析法期間發(fā)生了一定程度的細(xì)胞溶解。包括使用膜滲透性曲拉通的對(duì)照來證實(shí)PTEN在暴露于蛋白酶K時(shí)可降解。有待了解的是，這是PTEN所特有的還是以55kDa遷移并且保留PTEN抗體的C末端抗原決定基的PTEN-long裂解形式。此資料指示PTEN-long在細(xì)胞表面上?？扇苄訮TEN-Iong分泌到培養(yǎng)基中細(xì)胞表面上PTEN-long的存在不排除一部分蛋白質(zhì)是可溶的并且釋放到細(xì)胞環(huán)境中的可能性。使用肝素瓊脂糖從針對(duì)HEK293細(xì)胞調(diào)節(jié)的無血清培養(yǎng)基中親和純化PTEN-long。柱洗脫揭示培養(yǎng)基中存在以50kDa分子量遷移的PTEN(圖9)。使用PTEN-Iong特異性抗體的免疫墨點(diǎn)分析揭示相同的50kDa物質(zhì)，從而指示這種蛋白質(zhì)保留從替代性起始部位翻譯的序列和來自PTEN單克隆抗體的C末端抗原決定基的序列。這強(qiáng)有力地暗示了所觀察到的55kDa的PTEN部分實(shí)際上是從上游起始密碼子處開始裂解的翻譯產(chǎn)物。通過在用ATG/ATG構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中過度表達(dá)PTEN-long來進(jìn)一步確認(rèn)PTEN分泌到培養(yǎng)基中。使用這些細(xì)胞來產(chǎn)生無血清條件培養(yǎng)基整夜并且使用PTEN單克隆抗體6H2. I使PTEN從Iml培養(yǎng)基中免疫沉淀。較大PTEN色帶和較低的55kDa色帶成功地從培養(yǎng)基中免疫沉淀。由于蛋白質(zhì)被過度表達(dá)，因此對(duì)蛋白質(zhì)的適當(dāng)處理可能不會(huì)發(fā)生，這使得完整大小的70kDa PTEN分泌出。PTEN在人類血清中被發(fā)現(xiàn)生理分泌物質(zhì)的最佳來源之一是血清。肝素瓊脂糖用于對(duì)來自人類血清的PTEN進(jìn)行親和純化。使人類血清短暫離心并且過濾以移除顆粒物質(zhì)。隨后用BC150以1:5稀釋所述血清并且用蛋白質(zhì)A/G充分地預(yù)先清除以移除IgG。將所述血清與少量肝素瓊脂糖一起分批培育。用拉米利緩沖液洗脫肝素瓊脂糖并且對(duì)洗脫液進(jìn)行墨點(diǎn)點(diǎn)潰而用于PTEN分 析并且只用于二級(jí)抗體處理以排除重鏈污染。PTEN和PTEN-long都在人類血清中被發(fā)現(xiàn)(圖 10)。PTEN-Iong的抗血管生成活性PTEN-Iong的抗血管生成作用顯示如下(I )PTEN_long通常在小鼠的發(fā)育中的視網(wǎng)膜中較弱地表達(dá)但在新生仔發(fā)育期間在經(jīng)歷衰退/細(xì)胞死亡的血管中有高水平的表達(dá)(圖11); (2) PTEN-Iong在腫瘤的凋亡性血管中被發(fā)現(xiàn)。此外，用部分地從轉(zhuǎn)染細(xì)胞純化的PTEN-Iong處理上皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞遷移并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖12)。純化的PTEN-Iong也可誘導(dǎo)與U87、HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞或培養(yǎng)中的293細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的激活相關(guān)的細(xì)胞死亡，如由卡斯蛋白酶3裂解所測(cè)量。PTEN-Iong的活體內(nèi)抗腫瘤和抗血管生成活性圖13顯示了用PTEN-long處理小鼠。(A)用成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87注射小鼠(n=5)以在乳腺脂肪墊的2個(gè)部位(左側(cè)和右側(cè))處形成異種移植物。在腫瘤移植之后，用PTEN-Iong直接注射一個(gè)腫瘤并且不注射對(duì)側(cè)腫瘤(w/PTEN-long)。也用來源于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的空白純化蛋白質(zhì)的制劑(空載體)注射5只小鼠的對(duì)照組。再次，不注射對(duì)側(cè)腫瘤(w/空載體)。第1-11天和第13-14天處理小鼠。在指定天數(shù)用測(cè)徑器測(cè)量最大直徑(cm)。當(dāng)腫瘤體積> Icm時(shí)，處死小鼠。(B)通過將PTEN-long表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中來制備蛋白質(zhì)并且使用V5親和樹脂部分地純化，接著用V5肽洗脫。圖14顯示了用PTEN-long對(duì)照注射液處理14天的小鼠的存活分?jǐn)?shù)(以天計(jì))。視網(wǎng)膜染色在p7鼠類視網(wǎng)膜中對(duì)PTEN-Iong和血管的染色揭示PTEN-long選擇性地染色玻璃體血管，所述玻璃體血管在鼠類視網(wǎng)膜血管發(fā)育中的此時(shí)刻開始退化。PTEN-Iong抗體針對(duì)以下抗原決定基N-PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD-C (SEQ ID NO:3)。用BSl-植物凝集素進(jìn)行血管染色。純化在一種純化PTEN-Iong的方法中，用ATG/ATG PTEN-Iong轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并且使細(xì)胞溶解產(chǎn)物穿過Ni+親和柱。在使用咪唑洗脫緩沖液的AKTA純化器上使用Ni+柱一致地純化 PTEN-long。腫瘤退化在用PTEN (orf403氨基酸)或PTEN-long注射之前轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞的異種移植物。在注射后7天，與過度表達(dá)PTEN的群組(n=4，總數(shù)是4)相比，過度表達(dá)PTEN-long的群組中的乳腺血管減少。這表明PTEN-long可影響腫瘤環(huán)境。通過PTEN-long前導(dǎo)序列的跨膜遞送圖18和圖21顯示了 PTEN-Iong(而非PTEN)當(dāng)應(yīng)用于完整細(xì)胞時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化的能力。實(shí)魁
貨物分子肽通過肽鍵而共價(jià)地連接到第二肽上，所述第二肽包含連續(xù)氨基酸殘基，所述連續(xù)氨基酸殘基具有SEQ ID NO: I的殘基22-173中所述序列。當(dāng)使細(xì)胞膜與此組合物接觸時(shí)，貨物分子肽穿過細(xì)胞膜而運(yùn)送并且遞送到細(xì)胞中。貨物分子蛋白通過肽鍵而共價(jià)地連接到肽上，所述肽包含連續(xù)氨基酸殘基，所述連續(xù)氨基酸殘基具有SEQ ID NO: I的殘基22-173中所述序列。當(dāng)使細(xì)胞膜與此組合物接觸時(shí)，貨物分子蛋白穿過細(xì)胞膜而運(yùn)送并且遞送到細(xì)胞中。貨物分子蛋白可以是人類P53，或其活性片段或活性變體。貨物分子肽共價(jià)地連接到核酸上，所述核酸包含連續(xù)氨基酸殘基，所述連續(xù)氨基酸殘基具有SEQ ID NO: I的殘基22-173中所述序列。當(dāng)使細(xì)胞膜與此組合物接觸時(shí)，貨物分子核酸穿過細(xì)胞膜而運(yùn)送并且遞送到細(xì)胞中。核酸可通過二硫鍵而共價(jià)地連接到肽。核酸可以是siRNA。討論有規(guī)律地觀察到來自細(xì)胞溶解產(chǎn)物和組織的PTEN免疫墨點(diǎn)中的第二個(gè)較大蛋白質(zhì)色帶。確認(rèn)較大色帶是PTEN的證據(jù)包括較大蛋白質(zhì)色帶由不同PTEN單克隆抗體檢測(cè)到；當(dāng)用針對(duì)PTEN的siRNA處理細(xì)胞或在小鼠中基因剔除PTEN基因座時(shí)不存在較大蛋白質(zhì)。觀察到PTEN的5’ UTR對(duì)于超過700個(gè)堿基對(duì)在PTEN的典型起始密碼子的框內(nèi)。此外，在PTEN上游有CUG密碼子522個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)如果被翻譯，則可計(jì)入PTEN免疫墨點(diǎn)中的較大蛋白質(zhì)色帶的尺寸中。盡管與強(qiáng)科扎克序列無關(guān)，但是它保留-I胞嘧啶和+1鳥嘌呤核苷序列。當(dāng)被翻譯并且添加到PTEN ORF中時(shí)，應(yīng)產(chǎn)生約70kDa的蛋白質(zhì)，這是觀察到的較大PTEN色帶的分子量。此序列的翻譯已存在于其實(shí)際編碼序列內(nèi)的許多PTEN直系同源物中。也檢查小鼠5’ UTR,因?yàn)橐延^察到小鼠組織溶解產(chǎn)物中的類似色帶。小鼠5’ UTR核苷酸序列與智人5’UTR高度同源并且類似地在起始密碼子的框內(nèi)。兩個(gè)潛在的替代性起始密碼子存在于-522和-516處，并且從那些部位開始的此序列的翻譯揭示氨基酸序列90%以上與智人序列同源。此假定蛋白的保守性是顯著的并且顯示了對(duì)此序列的進(jìn)化重要性。為了更好地描述此序列，將其重新命名為5’ATR或PTEN的替代性翻譯的區(qū)域，以描述其翻譯潛力。構(gòu)建質(zhì)粒，其中PTEN的開放閱讀框架與5’ ATR 一起克隆，并且將此重組PTEN的表達(dá)與單獨(dú)的典型的產(chǎn)生403個(gè)氨基酸的開放閱讀框架進(jìn)行比較。與只含有PTEN的典型ORF的表達(dá)質(zhì)粒(產(chǎn)生以55kDa遷移的單個(gè)色帶)相比，包含5’ATR會(huì)產(chǎn)生以約70kDa遷移的第二個(gè)較高PTEN蛋白質(zhì)色帶。較大蛋白質(zhì)只占翻譯的總蛋白質(zhì)的較小部分；然而，假定起始部位突變?yōu)锳TG使蛋白質(zhì)比率向主要的較大形式轉(zhuǎn)變。來自5’ATR的蛋白序列的保守性指示它不只是進(jìn)化的人造品。N末端含有一段脂肪族氨基酸，預(yù)測(cè)所述脂肪族氨基酸為跨膜序列。使用Prosite和Signal 3. OIP預(yù)測(cè)PTEN-Iong的N末端是具有緊隨其后的蛋白酶裂解部位的信號(hào)肽。活體內(nèi)蛋白酶保護(hù)分析法用于測(cè)試PTEN-Iong是否位于細(xì)胞的細(xì)胞外表面上。隨著細(xì)胞外蛋白酶的量逐漸增加，PTEN-long顯示不斷降解，而PTEN并不如此，從而指示至少一些PTEN-long在細(xì)胞外并且至少部分連接到細(xì)胞膜的外葉上?？紤]牽涉到在細(xì)胞膜外葉上的活性脂質(zhì)磷酸酶，這是最令人感興趣的結(jié)果。結(jié)合外膜的蛋白聚糖的兩個(gè)家族(磷脂酰肌醇蛋白聚糖和多配體蛋白聚糖)先前在PTEN蛋白復(fù)合物中識(shí)別。PTEN存在于細(xì)胞表面上不排除可溶的分泌型PTEN的可能性。多配體蛋白聚糖和磷脂酰肌醇蛋白聚糖是兩種類肝素化程度最高的蛋白聚糖。類肝素是帶較高負(fù)電荷的葡糖胺聚糖并且PTEN已顯示對(duì)陰離子具有親和力，從而部分地解釋了選擇帶較高負(fù)電荷的PIP3作為其受質(zhì)。從小鼠肝臟中純化PTEN的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)揭示PTEN和PTEN-Iong都可以使用 肝素瓊脂糖柱來純化。此外，使用肝素瓊脂糖柱，從針對(duì)HEK293細(xì)胞調(diào)節(jié)的無血清培養(yǎng)基中純化約50kDa的蛋白質(zhì)。由對(duì)PTEN具特異性的單克隆抗體和針對(duì)PTEN-long中存在的獨(dú)特氨基酸殘基的多克隆抗體來識(shí)別純化蛋白。先前PTEN-long抗體只識(shí)別約70kDa的蛋白質(zhì)色帶。兩種抗體都可以識(shí)別這一個(gè)色帶的觀察結(jié)果指示蛋白水解處理可能發(fā)生并且通過免疫墨點(diǎn)觀察到的蛋白質(zhì)是保留兩種抗體的抗原決定基的PTEN片段。PTEN和PTEN-long也可以使用肝素親和純化而從人類血清中純化。在過去10年內(nèi)積累了大量呈現(xiàn)PTEN序列的文獻(xiàn)。此處證實(shí)PTEN新形式的存在，所述新形式從替代性部位開始翻譯并且分泌到外葉和細(xì)胞外空間中。活體內(nèi)結(jié)果顯示PTEN-long是新的抗腫瘤化合物，所述化合物通常存在于人類血清中并且具有抗血管生成和促細(xì)胞凋亡特性。第二系列實(shí)驗(yàn)產(chǎn)牛MSES PTEN-Long出于在大腸桿菌中純化的目的，改變PTEN-Long開放閱讀框架以刪除前21個(gè)氨基酸，從而移除真核信號(hào)肽序列，所述真核信號(hào)肽序列基于其前四個(gè)氨基酸而被稱為MSES型式(圖28)。在大腸桿菌中使用具有IPTG的可誘導(dǎo)性表達(dá)載體來誘導(dǎo)具有PTEN-Long所特有的替代性翻譯區(qū)域的153個(gè)氨基酸和PTEN-Long與PTEN之間共享的403個(gè)氨基酸的此蛋白質(zhì)，并且使用鎳和肝素親和柱從提取物中純化。出于檢查六個(gè)精氨酸重復(fù)對(duì)于細(xì)胞進(jìn)入的重要性的目的，框內(nèi)刪除此序列(R6)并且如上純化蛋白質(zhì)。MSES PTEN-Long 講入細(xì)胞中將純化的MSES PTEN-Long野生型或R6突變型蛋白質(zhì)加入在培養(yǎng)中以I微克/毫升的濃度生長(zhǎng)的MDA-MB-468人類細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在平行的相同條件下，還用缺少替代性翻譯區(qū)域的最初403氨基酸PTEN或從只表達(dá)RFP蛋白的細(xì)胞制備的空白處理試劑來處理細(xì)胞。在分離細(xì)胞以用于細(xì)胞分部分離之前，在37°C下培育細(xì)胞30分鐘。我們分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分。通過使用分別控制細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分的微管蛋白和BAF180進(jìn)行西方墨點(diǎn)分析來測(cè)量分部分離的有效性。只有野生型PTEN-Long進(jìn)入細(xì)胞中并且存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。重要的是，刪除R6的PTEN和PTEN-Long都不能進(jìn)入細(xì)胞中。這些資料指示有效的細(xì)胞進(jìn)入需要R6序列，而并不需要初始21個(gè)氨基酸。產(chǎn)牛PTEN-Long-p53 融合蛋白以上研究表明圖2中的構(gòu)建體的前153個(gè)氨基酸可用于將另一蛋白序列遞送到細(xì)胞中。為提出這個(gè)問題，MSES PTEN-Long構(gòu)建體的初始153個(gè)氨基酸(稱為Pten-Long前導(dǎo)子的PJ與人類P53的393個(gè)氨基酸融合，以產(chǎn)生PfP53融合蛋白(圖30)。V5_His抗原決定基標(biāo)簽與C末端融合以用于純化和檢測(cè)的目的。P,-p53進(jìn)入細(xì)胞中，激活基因表達(dá)并且抑制腫瘤生長(zhǎng)在大腸桿菌中使用IPTG誘導(dǎo)PfP53融合蛋白并且使用鎳和肝素親和柱從細(xì)菌溶解產(chǎn)物中純化。在收集細(xì)胞用于分部分離之前，將Pfp53蛋白與MDA-MB-468或Hl299人類癌細(xì)胞一起培育I小時(shí)，以判定融合蛋白是否可進(jìn)入細(xì)胞中?？稍诮?jīng)處理而非空白處理的H1299細(xì)胞和MDA-MB-468細(xì)胞的細(xì)胞核中檢測(cè)到增加的p53并且與PUMA和p21(p53轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)目標(biāo))的表達(dá)增加相關(guān)聯(lián)(圖31)。MDA-MB-468異種移植物的每日處理使得經(jīng)過 10天腫瘤體積減小，但是從表達(dá)RFP (紅色熒光蛋白)的大腸桿菌制備的空白處理對(duì)照并不如此。用細(xì)菌表達(dá)的MSES PTEN-Long處理的小鼠的葡萄糖耐暈測(cè)試用細(xì)菌表達(dá)的MSES PTEN-Long (Long)、RFP (紅色熒光蛋白空白對(duì)照)、IgG對(duì)照和阻斷吸收到細(xì)胞中的抗PTEN抗體138G6處理小鼠。PTEN-long相對(duì)于其他處理降低葡萄糖水平，而抗PTEN抗體138G6相對(duì)于IgG對(duì)照增加葡萄糖(圖32)。此資料顯示PTEN-long可減少血糖。在用葡萄糖處理之前腹膜內(nèi)注射小鼠。參考文獻(xiàn)阿克蘭德P. 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權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含(i)肽，包含SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子，和(ii)所述貨物分子，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的妝。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、月旨質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是肽、多肽或蛋白質(zhì)并且其中用于運(yùn)送所述貨物分子的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸并且是DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸并且是RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸并且是SiRNA或反義寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸并且編碼人類p53蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且是人類p53蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸并且編碼腫瘤抑制蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述腫瘤抑制蛋白從pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
14.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且是腫瘤抑制蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述腫瘤抑制蛋白從pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
16.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且是酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述酶是代謝酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述貨物分子是多肽或蛋白質(zhì)并且是抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述貨物分子是肉毒桿菌毒素或其片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述貨物分子是診斷劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述診斷劑是不透輻射的造影劑、順磁性造影劑、超順磁性造影劑、熒光團(tuán)或計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)造影劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述貨物分子是治療劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述治療劑是生物活性小分子。
24.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒性分子或化學(xué)治療劑或放射治療劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述貨物分子通過聚合連接子而連接到用于運(yùn)送的所述肽上。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述聚合連接子是聚乙二醇。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且具有高達(dá)160kDa的分子量。
29.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述肽是經(jīng)過衍生化，所述肽包含具有SEQIDNO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述肽包含具有SEQID N0:1中所述序列的連續(xù)氣基酸殘基。
31.一種將貨物分子遞送到細(xì)胞中的方法，其包括使所述細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含(i)肽，包含SEQ ID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基22-173，或SEQ IDN0:1中所述氨基酸殘基的一部分，用于穿過生物膜而運(yùn)送所述貨物分子，和(ii )所述貨物分子，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID N0:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述接觸在允許所述貨物分子進(jìn)入所述細(xì)胞中的條件下進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、月旨質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是肽、多肽或蛋白質(zhì)并且其中用于運(yùn)送所述貨物分子的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是核酸并且是DNA。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是核酸并且是RNA。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是核酸并且是SiRNA或反義寡核苷酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是核酸并且編碼人類p53蛋白。
42.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且是人類p53蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是核酸并且編碼腫瘤抑制蛋白。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白從pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
45.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且是腫瘤抑制蛋白。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白從pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
47.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且是酶。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述酶是代謝酶。
49.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述貨物分子是多肽或蛋白質(zhì)并且是抗原。
50.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述貨物分子是肉毒桿菌毒素或其片段。
51.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述貨物分子是診斷劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述診斷劑是不透輻射的造影劑、順磁性造影劑、超順磁性造影劑、熒光團(tuán)或計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)造影劑。
53.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述貨物分子是治療劑。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述治療劑是生物活性小分子。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述治療劑是細(xì)胞毒性分子或化學(xué)治療劑或放射治療劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述肽包含具有SEQID NO: I中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。
57.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述細(xì)胞是在人類個(gè)體中。
59.—種治療個(gè)體的腫瘤的方法,其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物,所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的腫瘤。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述貨物分子是腫瘤抑制蛋白。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白從p53、pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白是p53。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
64.根據(jù)權(quán)利要求59到63中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
66.根據(jù)權(quán)利要求59到63中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID N0:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
67.根據(jù)權(quán)利要求59到63中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID N0:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
68.一種治療個(gè)體的癌癥的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的癌癥。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述貨物分子是腫瘤抑制蛋白。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白從p53、pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白是p53。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
73.根據(jù)權(quán)利要求69到72中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
75.根據(jù)權(quán)利要求73中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID N0:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
76.根據(jù)權(quán)利要求69到72中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
77.一種治療代謝障礙的方法，其中所述代謝障礙的特征在于代謝酶缺乏，所述方法包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到所述代謝酶上，所述代謝酶的量能有效地治療所述個(gè)體的代謝障礙。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽共價(jià)地連接到所述代謝酶上。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述代謝酶上。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述代謝酶上。
81.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽非共價(jià)地連接到所述代謝酶上。
82.—種治療個(gè)體的糖尿病的方法，其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物，所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的糖尿病。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、月旨質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述貨物分子是肽，所述肽包含具有SEQIDNO: 4中所述序列的氨基酸殘基。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中所述組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:6中所述。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且所述蛋白質(zhì)是腫瘤抑制蛋白。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白從p53、pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180, BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白是p53。
89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
90.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述貨物分子是BCL2。
91.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述貨物分子是硫氧還蛋白。
92.根據(jù)權(quán)利要求82到91中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
93.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
94.根據(jù)權(quán)利要求92中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID ΝΟ:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
95.根據(jù)權(quán)利要求82到89中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
96.—種治療個(gè)體的心血管疾病的方法,其包括給予所述個(gè)體一定量的組合物,所述組合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173，或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分，所述肽結(jié)合到貨物分子上，所述貨物分子的量能有效地治療所述個(gè)體的心血管疾病。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中所述貨物分子是肽、多肽、蛋白質(zhì)、納米顆粒、月旨質(zhì)體、噬菌體、病毒載體、質(zhì)粒DNA、核酸、肽核酸或嗎啉代化合物。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述貨物分子是肽，所述肽包含具有SEQIDNO: 4中所述序列的氨基酸殘基。
99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中所述組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:6中所述。
100.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述貨物分子是蛋白質(zhì)并且所述蛋白質(zhì)是腫瘤抑制蛋白。
101.根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白從p53、pl6、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180、BRCA1、BRCA2、RB 和 LKBl 組成的組中選擇。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述腫瘤抑制蛋白是p53。
103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中所述組合物包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
104.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中所述貨物分子是BCL2。
105.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中所述貨物分子是硫氧還蛋白。
106.根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中所述心血管疾病從動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病、冠狀動(dòng)脈疾病、末梢血管病、充血性心力衰竭、心肌梗死和局部缺血/再灌注損傷組成的組中選擇。
107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述心血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化。
108.根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述心血管疾病是心肌梗死。
109.根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述組合物在所述心肌梗死期間給予。
110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中所述組合物以可有效地防止細(xì)胞死亡的量給予。
111.根據(jù)權(quán)利要求96到110中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID ΝΟ:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
112.根據(jù)權(quán)利要求111所述的方法，其中包含SEQID NO: I的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸22-173的一部分的所述肽通過肽鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
113.根據(jù)權(quán)利要求111中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID ΝΟ:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽通過二硫鍵共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
114.根據(jù)權(quán)利要求96到110中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含SEQID ΝΟ:1的氨基酸殘基22-173或SEQ ID NO: I的氨基酸殘基22-173的一部分的所述肽非共價(jià)地連接到所述貨物分子上。
全文摘要
提供一種組合物，用于穿過生物膜而遞送貨物分子，所述組合物包含(i)肽，包含具有SEQ ID NO:1中所述序列的連續(xù)氨基酸殘基，用于穿過生物膜而運(yùn)送貨物分子，和(ii)貨物分子，其中所述貨物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸殘基的肽。還提供了穿過生物膜而遞送貨物分子的方法。還提供了治療腫瘤、癌癥、代謝障礙和心血管障礙的方法。
文檔編號(hào)A61K38/02GK102844043SQ201180018210
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月17日
發(fā)明者雷蒙·帕森斯 申請(qǐng)人:紐約哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)