專利名稱：抗體的制作方法
抗體技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明主要涉及抗體、CXCR4生物學(xué)及相關(guān)治療的領(lǐng)域。更特別地，它提供了結(jié)合到CXCR4的抗體。這種抗-CXCR4抗體用于疾病和與CXCR4有聯(lián)系的病況的診斷和治療，例如，癌癥和病毒感染(尤其是HIV)的治療，炎癥和免疫疾病的治療，例如通過腫瘤血管成像來監(jiān)測或預(yù)測腫瘤的生長和進展，抑制或減弱轉(zhuǎn)移的形成和抑制或減少血管再生。本發(fā)明的基于抗體的組合物和方法也擴展至對免疫軛合物和其它治療性制品、試劑盒和方法的使用。
背景技術(shù)：
擁有大于800個成員，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)代表了涉及信號傳送的細胞表面分子最大的家族，占由人類基因編碼的總基因的超過2%。GPCR超家族的成員共享一個公共的膜拓撲結(jié)構(gòu)一個細胞外N端，一個細胞內(nèi)C端和七個跨膜(TM)螺旋，它們由三個細胞內(nèi)環(huán)和三個細胞外環(huán)連接。根據(jù)它們共享的拓撲結(jié)構(gòu)，GPCRs也被稱為七跨膜(7TM)受體。這些受體控制主要的生理學(xué)功能，包括神經(jīng)傳遞、從內(nèi)外分泌腺體釋放激素和酶、免疫應(yīng)答、心肌和平滑肌收縮以及血壓調(diào)節(jié)。它們的機能失調(diào)可引起一些最普遍的人類疾病。新興的實驗和臨床數(shù)據(jù)顯示，GPCRs在癌癥的進展和轉(zhuǎn)移中具有極其重要的作用。因此，一些 GPCRs有可能是抗癌藥物的適宜靶標(biāo)。
趨化因子尤其是在各種疾病和病癥(包括癌癥、病毒感染、哮喘和過敏性疾病，以及自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化)的免疫和炎癥應(yīng)答中起到重要作用。根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)，將趨化因子分類為C-C趨化因子(包括半胱氨酸-半胱氨酸模序) 或C-X-C趨化因子(包括半胱氨酸-X-半胱氨酸模序)。因此將結(jié)合這種趨化因子的受體分別分類為CCR或CXCR家族的成員。
CXCR4(又稱為融合素，HM89，LESTR，HUMSTR)是對基質(zhì)細胞衍生因子-1 (SDF-1，又稱為CXCL12和PBSF)特異性的α -趨化因子受體，所述SDF-1是具有對淋巴細胞具有有力趨化活性的分子。這種受體是HIV分離物可用于感染CD4+T細胞的若干趨化因子之一。若干正常組織表達CXCR4。無論是就mRNA而言還是就功能性蛋白而言，在其中已展示表達的細胞的值得注意的例子，包括造血細胞/骨髓祖細胞；免疫系統(tǒng)的細胞，例如T細胞、前B 細胞、漿細胞、樹狀突細胞、NK細胞；其它血細胞，例如單核細胞、肥大細胞、血小板；神經(jīng)系統(tǒng)細胞，例如神經(jīng)細胞、星形細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞；其它細胞，例如內(nèi)皮細胞、血管平滑肌、 胃腸道上皮細胞和某些其它細胞。
CXCR4在各種腫瘤中表達且在癌癥的病理生理學(xué)中，尤其是在癌癥轉(zhuǎn)移中起到?jīng)Q定性作用(Dorsam and Gutkind, 2007, G-protein-coupled receptors and cancer. Nat Rev Cancer 7:79-94)。已在幾乎所有的被研究腫瘤中發(fā)現(xiàn)CXCR4表達。還值得關(guān)注是， SDF-1在肝臟、肺臟、骨髓、淋巴結(jié)中以及在腦中，，即癌癥通常轉(zhuǎn)移到的位置，以特別高的水平表達(在腦中的表達水平稍低)。試劑(例如靶向CXCR4的抗體)的潛在適應(yīng)癥包括癌癥(例如轉(zhuǎn)移癌)例如乳腺、前列腺、胰腺、食道、結(jié)腸直腸、肝臟和肺臟(SCLC和NSCLC)，還有惡性或者轉(zhuǎn)移黑色素瘤、腦部腫瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、頭-頸癌、某些白血病、淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤、兒童腫瘤(例如成神經(jīng)細胞瘤)、腎癌、成血管細胞瘤。過度表達的CXCR4已經(jīng)在若干癌癥中被發(fā)現(xiàn)，包括肺臟腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、宮頸癌、乳頭狀甲狀腺癌、骨肉瘤和其它惡性腫瘤?？?CXCR4抗體也能用于病毒感染如HIV或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的治療,且用于治療免疫疾病如自身免疫性疾病、炎性疾病，以及抑制血管再生和血管形成。
由于它們復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，GPCRs被看做是用于產(chǎn)生特異性抗體的“困難靶標(biāo)”。它們既不能從溶解細胞的膜片段中容易地純化，也不能在不同的表達系統(tǒng)中作為正確折疊的可溶性蛋白被重組生產(chǎn)。
與產(chǎn)生抗GPCPs 抗體有關(guān)的困難闡述于 Hoogenboom et al. Eur. J. Biochem 260, 774-784(1999)中。此外，Sui et al. Eur. J. Biochem 270，4497-4506 (2003)說明與試圖獲得抗GPCPs趨化因子受體CXCR4的人類抗體有關(guān)的問題，且報道即使使用結(jié)合退后選擇的導(dǎo)航方法，也不能鑒別特異性抗體。因此，在GPCPs領(lǐng)域中，產(chǎn)生特異性抗體仍然是主要挑戰(zhàn)。
Northwest Biotherapeutics Inc.公司正開發(fā)單克隆抗CXCR4抗體,其中一些正處于后期預(yù)臨床研發(fā)階段。表明CXCR4抗體的潛在功效的數(shù)據(jù)通過NWB等在動物模型中收集。后續(xù)開發(fā)可能包括在I期臨床試驗制備中選擇性抗體的人類化和毒性研究。
MDX-1338是來自Medarex的抗人類CXCR4特異性的完全人類單克隆抗體。體外研究顯示，MDX-1338以低納摩爾級的親和力結(jié)合到CXCR4-表達細胞。MDX-1338阻斷結(jié)合到CXCR4表達細胞的CXCL12配體，且抑制CXCL12誘導(dǎo)遷移和低納摩爾EC5tl值的鈣通量。 MDX-1338是一個IgG4，因此缺乏ADCC和CDC活性。MDX-1338在一系列CXCR4表達細胞系中誘導(dǎo)凋亡，且在多種AML和淋巴 瘤異種移植模型中也有抗腫瘤活性。
另外，在靶向CXCR4/SDF-1的不同發(fā)展階段存在大量小分子化合物和多肽。
發(fā)明者已經(jīng)認識到識別CXCR4的附加抗體的鑒別(將有利于擴大治療性選項的數(shù)量。然而，如以上討論的，GPCPs (如CXCR4)的性質(zhì)意味著這種抗體的研發(fā)面臨真實挑戰(zhàn)。
特別是，需要在其天然細胞膜結(jié)合形式中識別CXCR4的抗CXCR4人類抗體。盡管通常認為人類抗體具有優(yōu)勢，但眾所周知的是，具有足夠高親和力和適當(dāng)功能性以使其成為成功人類治療的候選者的人類抗體的研發(fā)絕非那么簡單。對于GPCPs，由于復(fù)雜性及其跨膜性質(zhì)，更是如此。發(fā)明內(nèi)容
通過提供用于安全和有效治療腫瘤、病毒感染和其中涉及CXCR4+細胞的其它疾病和病況如炎癥或者免疫病癥的新治療組合物和方法，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的某些局限。本發(fā)明提供結(jié)合到CXCR4的抗體、優(yōu)選結(jié)合到CXCR4的一個或多個胞外域內(nèi)的表位的抗體，特別是人類抗體。這種抗體可有效治療腫瘤和病毒感染以及其中涉及CXCR4+細胞的其它疾病和病況如炎癥或免疫病癥。本發(fā)明的組合物和方法也擴展至使用這種特別抗體種類的免疫軛合物和化合物的用途。
本發(fā)明抗體一個特別優(yōu)點是抗體不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯調(diào)亡。這不同于臨床領(lǐng)域的前導(dǎo)抗體(例如，在WO 2008/060367中描述的Medarex抗體)，所述前導(dǎo)抗體誘導(dǎo)這種調(diào)亡。由于CXCR4在大量的正常細胞上表達，凋亡誘導(dǎo)的這種缺乏是阻止過多不需要的細胞死亡的真正治療性優(yōu)點，因此這種抗體具有有利的安全性。
本文描述的本發(fā)明抗體的另外的或替代的優(yōu)選性質(zhì)在于該抗體是拮抗性抗體。因此，優(yōu)選的是不誘導(dǎo)明顯凋亡的性質(zhì)也與抗體為拮抗性抗體的性質(zhì)相結(jié)合，即，它們例如通過阻斷或抑制受體-配體相互作用和/或阻斷或抑制來自CXCR4受體的下游信號事件，例如阻斷或抑制通過CXCR4的配體誘導(dǎo)或介導(dǎo)的信號來阻斷或抑制CXCR4的功能。這種性質(zhì)對治療中使用抗體很重要，這與它們僅僅用于標(biāo)記CXCR4表達細胞，例如用于診斷形成對比。
在這點上，眾所周知，CXCR4在廣范圍的健康/正常細胞上表達，且CXCR4和其配體SDF-1在研發(fā)中都很重要。然而，如以上討論的，也顯示出CXCR4在幾乎所有惡性腫瘤中過度表達，并對它們的生長有所貢獻。甚至更重要的或許是，SDF-1通常在最有可能攜帶轉(zhuǎn)移酶的那些組織中強烈的表達，例如在淋巴結(jié)、骨髓、肺臟、肝臟等中，且廣泛接受的是腫瘤細胞沿著SDF-1梯度遷移。因此，本發(fā)明抗體的主要目的是限制腫瘤生長且通過抑制CXCR4 的功能、例如通過阻止或抑制受體-配體相互作用來阻止轉(zhuǎn)移的形成。人們還相信CXCR4 涉及血管再生，因此，對CXCR4功能的阻斷或抑制也可用于影響血管再生和腫瘤血管形成。
對功能的阻斷或抑制，尤其是通過阻斷或抑制受體-配體相互作用，在使用本發(fā)明抗體來治療炎癥和自身免疫性疾病中也很重要。另外，主要目標(biāo)不是殺死CXCR4+細胞， 而是下調(diào)它們的活性(在自身免疫性疾病中)且阻止或降低CXCR4+細胞向炎癥的位置的遷移(可用于炎癥和自身免疫性疾病)。
拮抗活性(阻斷或抑制CXCR4的功能)在使用本發(fā)明抗體來治療感染如病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染中也很重要，在所述感染中，CXCR4起到功能性作用。這些病毒感染的例子是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，且尤其是HIV感染，其中已經(jīng)表明一些菌株(CXCR4熱帶株)用 CXCR4受體感染宿主細胞。因此，例如，通過阻斷或抑制CXCR4+細胞被HIV感染，阻斷或抑制CXCR4受體能限制HIV的傳播。
然而，如上所述，認為本發(fā)明抗體的作用的主要方式在于，通過它們的拮抗性質(zhì) (有利地與它們不誘導(dǎo)CXCR4+細胞明顯凋亡的能力相結(jié)合)，在一些實施方案中本發(fā)明抗體能夠誘導(dǎo)CXCR4+細胞的選擇性消除(殺死)。這種選擇性消除可以通過諸如ADCC、⑶C、 或誘導(dǎo)有絲分裂障礙(尤其在分裂細胞如腫瘤細胞中)的機制來進行，但沒有表現(xiàn)涉及誘導(dǎo)明顯凋亡。
本發(fā)明者已經(jīng)制備了結(jié)合到CXCR4的CXCR4-特異性抗體。
例如，抗體結(jié)合到CXCR4+細胞，例如用CXCR4轉(zhuǎn)染的細胞和天然表達CXCR4的細胞。具體而言，所述抗體結(jié)合到用CXCR4轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞，用CXCR4轉(zhuǎn)染的DT40細胞和天然地表達CXCR4的拉莫斯(Ramos) (B-細胞))、Jurkat (T-細胞白血病)和CCRF-CEM (人類T-細胞白血病)(見實施例2、3和4)。
重要地是，抗體沒有明顯地結(jié)合到CXCR4-細胞，S卩，不表達CXCR4的細胞。具體而言，抗體沒有明顯地結(jié)合到非-CXCR4-轉(zhuǎn)染細胞，或天然不表達CXCR4的細胞。
抗體也抑制已知將與CXCR4結(jié)合的配體的結(jié)合，例如，天然配體SDF-1a (這里也稱為SDF-1)和/或與CXCR4結(jié)合的其它配體(例如非天然配體)，如AMD-3100 (對CXCR4具有極高特異性且抑制CXCR4的化合物)(見實施例3)。
因此，本文描述的抗體與CXCR4特異性結(jié)合，使它們成為診斷和治療本文討論的病況的合適的候選者。
與CXCR4結(jié)合的本發(fā)明的優(yōu)選抗體分子的氨基酸和/或DNA序列(其包括互補決定區(qū)(⑶Rs)的Vi^PVl結(jié)構(gòu)域)在本文所列的不同SEQ ID NO.中說明。
因此，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合的抗體，且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)。優(yōu)選地，抗體是拮抗性抗體，其阻斷或抑制CXCR4的一個或多個功能，例如，阻斷或抑制SDF-1 (或者其它CXCR4配體，如AMD-3100)與CXCR4結(jié)合，響應(yīng)于SDF-1 (或其它 CXCR4配體)而阻斷或抑制CXCR4+細胞O遷移，阻斷或抑制通過向CXCR4+細胞添加SDF-1 而誘導(dǎo)的Ca2+通量，或阻斷或抑制來源于XCCR4受體的任何其它下游信號事件。
優(yōu)選地，將抗體分離。另外，優(yōu)選地，抗體是人類和/或CXCR4優(yōu)選是人類。優(yōu)選地，抗體與CXCR4的胞外域中的表位相結(jié)合。因此，關(guān)于“與CXCR4結(jié)合”的任何描述包括 “與CXCR4胞外域中的表位的結(jié)合”的優(yōu)選實施方案。本發(fā)明抗體的其它優(yōu)選性質(zhì)是誘導(dǎo) CXCR4表達細胞的ADCC (CXCR4+細胞)的一種或多種能力，誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的⑶C的能力以及至少與人類CXCR4相結(jié)合，更優(yōu)選是與人類和猴類CXCR4結(jié)合或與人類和小鼠CXCR4 結(jié)合，更優(yōu)選是與人類、小鼠和猴類CXCR4結(jié)合的能力。當(dāng)觀察交叉物種反應(yīng)性時，甚至更優(yōu)選的是抗體以相似的親和力與人類和猴類或者人類和小鼠CXCR4結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體顯示了抗腫瘤活性,例如,體內(nèi)腫瘤細胞的生長抑制。
因此，發(fā)明優(yōu)選地提供分離的人類抗體，該抗體與人類CXCR4胞外域中的表位相結(jié)合，且優(yōu)選地具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)。這樣，在本文敘述的所有實施方案中，不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)是優(yōu)選特征。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其包括重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，該重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :1、 7、13、或19氨基酸序列、或與這些序列中任何一個大體同源的序列。
替代或另外地，在本發(fā)明的一個實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4 表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，該重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO :2、8、14、或20氨基酸序列、或與這些序列中任何一個大體同源的序列。
替代或另外地，在本發(fā)明的一個實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4 表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO :3、9、15或21氨基酸序列、或與這些序列中任何一個大體同源的序列。
替代或另外地，在本發(fā)明的一個實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4 表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，該輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO :4、10、16、22或88氨基酸序列、或與這些序列中任何一個大體同源的序列。
替代或另外地，在本發(fā)明的一個實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4 表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，該輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO :5、11、17、23、或89氨基酸序列、或與這些序列中任何一個大體同源的序列。
替代或另外地，在本發(fā)明的一個實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4 表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO :6、12、18、24或90氨基酸序列、或與這些序列中任何一個大體同源的序列。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其包含一個或多個重鏈⑶R結(jié)構(gòu)域，其中所述重鏈⑶R結(jié)構(gòu)域選自由
(a)重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，該重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :1、7、13、或19氨基酸序列、或與其大體同源的序列，
(b)重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，該重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :2、8、14、或20氨基酸序列、或與其大體同源的序列，和
((c)重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :3、9、15或21氨基酸序列、或與其大體同源的序列，所組成的組。
在某些實施方案中，本發(fā)明也提供與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其包含一個或多個輕鏈CDR結(jié)構(gòu)域，其中所述輕鏈CDR結(jié)構(gòu)域選自由
(a)輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，該輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :4、10、16、22或88氨基酸序列、或與其大體同源序列，
(b)輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，該輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :5、11、17、23或89氨基酸序列、或與其大體同源的序列，和
(c)輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，該輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :6、12、18、24或90氨基酸序列、或與其大體同源序列，所組成的組。
在某些優(yōu)選實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含以下兩者
(a)包含SEQ ID NO 3氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3，和
(b)包含SEQ ID NO 6氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3。
更優(yōu)選地，還存在包含SEQ ID NO :1氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈 ⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 4氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO :2氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDR2，和/或包含SEQ ID NO 5氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2。
在某些優(yōu)選實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體包含以下兩者
(a)包含SEQ ID NO 9氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3，和
(b)包含SEQ ID NO 12氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3。
更優(yōu)選地，還存在包含SEQ ID NO :7氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈 ⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO :10氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 8氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDR2，和/或包含SEQ ID NO 11氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2。
在某些優(yōu)選實施方案中，與CXCR4相結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達的細胞明顯凋亡性質(zhì)的抗體包括以下兩者
(a)包含SEQ ID NO 15氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3
(b)包含SEQ ID NO 18氨基酸序列、或一條與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3。
更優(yōu)選地，還存在包含SEQ ID NO :13的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 16的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈 ⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO :17的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在某些優(yōu)選實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡性質(zhì)的抗體包含以下兩者
(a)包含SEQ ID NO 21的氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R3，和
(b)包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶R3。
更優(yōu)選地，還存在包含SEQ ID NO :19氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈 ⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 22氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 20氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，和 /或包含SEQ ID NO :23氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在某些優(yōu)選實施方案中，與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡性質(zhì)的抗體包含以下兩者
(a)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R3，和
(b)包含SEQ ID NO 90的氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶R3。
更優(yōu)選地，還存在包含SEQ ID NO :1氨基酸序列、或與其大 體同源序列的重鏈 ⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO 88氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或包含SEQ ID NO :2氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，和/ 或包含SEQ ID NO :89氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO 1氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :2氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2，和包含SEQ ID NO :3氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在又一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO :4氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :5氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2， 和包含SEQ ID NO :6氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列、或與其大體同源序列的 ⑶R2，和包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在又一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列、 或與其大體同源序列的輕鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2，和包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO :13的氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :14的條氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在又一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列、 或與其大體同源序列的輕鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :17的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2，和包含SEQ ID NO 18的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO :19的氨基酸序列、或與其大體同源序列的重鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列、或與其大體同源序列的 ⑶R2，和包含SEQ ID NO :21的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在又一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列、 或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :23的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2，以及包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
在又一個優(yōu)選實施方案中，單獨或組合地存在包含SEQ ID NO :88的氨基酸序列、 或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R1，包含SEQ ID NO :89的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R2，以及包含SEQ ID NO 90的氨基酸序列、或與其大體同源序列的⑶R3。
或者，在某些實施方案中，本發(fā)明提供與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :3的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 6的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。
所述抗體可選擇地進一步包含含有SEQ ID NO :2氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 5的氨基酸序列、或與其大體同源序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或還包含含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 4的基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈 ⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :9的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :12的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈CDR3。
所述抗體可選擇地進一步包含含有SEQ ID NO 8的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :11的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 7的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDRlJP /或含有SEQ ID NO 10的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所 述抗體包含含有SEQ ID NO :15的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :18的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。
所述抗體可選擇地進一步包含含有SEQ ID NO :14的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :17的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO :13氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :16的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :21的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :24的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。
所述抗體可選擇地進一步包含含有SEQ ID NO :20的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :23的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 19的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :22的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :3的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :90的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :89的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :88的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
或者，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :2的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 5的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 3的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 6的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 4的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :8的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :11的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 9的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :12的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 7的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :10的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :14的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :17的氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO :15的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :18氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含 有SEQ ID NO :13的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 16的氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
或者，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :20的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :23的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 21的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :24的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO :19的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :22的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
或者，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :2的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :89的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 3的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :90的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :88的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
或者，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合其具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，所述抗體包含含有SEQ ID NO :1的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 4氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
所述抗體優(yōu)選進一步包含含有SEQ ID NO :3的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域， 和/或含有SEQ ID NO 6的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 5的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體,該抗體包含含有SEQ ID NO :7的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 10的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
所述抗體優(yōu)選進一步包含含有SEQ ID NO :9的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :12的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 8的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :11的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO :13的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :16的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO :15的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :18的氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO :14的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :17的氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO :19的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :22氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 21的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :24的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO :20的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :23的氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體,該抗體包含含有SEQ ID NO :1的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :88的氨基酸序列，或與其大體同源的序列的輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域。
所述抗體任選進一步包含含有SEQ ID NO 3的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :90的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，和/或進一步包含含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :89的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明某些優(yōu)選的抗體包含一個或多個⑶R，所述⑶R選自由SEQ ID NO :1,2,3, 4、5和6，或與任何 一個前述SEQ ID NO大體同源的序列組成的組。
本發(fā)明某些優(yōu)選的抗體包含一個或多個⑶R，所述⑶R選自由SEQ ID NO =7,8,9, 10，11和12，或與任何一個前述SEQ ID NO大體同源的序列組成的組。
本發(fā)明某些優(yōu)選的抗體包含一個或多個⑶R，所述⑶R選自由SEQ ID N0:13、14、 15、16、17和18，或與任何一個前述SEQ ID NO大體同源的序列組成的組。
本發(fā)明某些優(yōu)選的抗體包含一個或多個⑶R，所述⑶R選自由SEQ ID NO :19、20、21、22、23和24，或與任何一個前述SEQID NO大體同源的序列組成的組。
本發(fā)明某些優(yōu)選的抗體包含一個或多個⑶R，所述⑶R選自由SEQ ID NO :1、2、3、 88、89和90，或與任何一個前述SEQ ID NO大體同源的序列組成的組。
某些優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO :4、5和6 ;或10、11和12 ;或16、17和18 ;或22、 23和24 ;或88、89和90中的兩條或者多條輕鏈⑶R，或與任何一個前述SEQ ID NO大體同源的序列。
尤其優(yōu)選的結(jié)合分子包含SEQ ID NO :4、5和6 ;或10、11和12 ;或16、17和18 ;或22、23和24;或88、89和90中的三條輕鏈⑶R，或與任何一個前述SEQID NO大體同源的序列(即，上述每一條輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)。
其它某些優(yōu)選的抗體包括SEQ ID N0:l、2和3 ;或7、8和9 ;或13，14和15 ;或19， 20和21中的兩條或者多條重鏈⑶R，或與任何一個前述SEQ ID NO大體同源的序列。
尤其優(yōu)選的結(jié)合分子包含SEQ ID N0:l、2和3 ;或7、8和9 ;或13、14和15 ;或19、 20和21中的三條重鏈⑶R，或與任何一個前述SEQ ID NO大體同源的序列(即，上述每一條重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)。
某些更尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO :4、5和6中的3條輕鏈⑶R，或與任何一個這些序列大體同源的序列(即，上述每一條輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3的一條，或與其大體同源的序列)，且包含SEQ ID NO :1、2和3中的三條重鏈⑶R，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)。
某些更尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO :10、11和12中的三條輕鏈⑶R，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)，且包含SEQ ID NO :7、8和9的三條重鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3的一條，或與其大體同源的序列)。
某些更尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO : 16、17和18的三條輕鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)，且包含SEQ ID NO :13、14和15的三條重鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3的一條，或與其大體同源的序列)。
某些更尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID N0:22、23和24的三條輕鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)，且包含SEQ ID NO 19,20和21的三條重鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(例如，上述每一條重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)。
某些更尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID N0:88、89和90的三條輕鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)，且包含SEQ ID NO :1、2和3的三條重鏈，或與這些序列中任何一條大體同源的序列(即，上述每一條重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3中的一條，或與其大體同源的序列)。
某些尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO 1的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 2的重鏈 ⑶R2結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO :3的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列， 和/或包含SEQ ID NO 4的輕鏈CDRl，SEQ ID NO 5的輕鏈CDR2，以及SEQ ID NO 6的輕鏈CDR3，或與任何一條上述序列大體同源的序列。
某些尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO 7的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 8的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO 9的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列，和 / 或包含 SEQ ID NO 10 的輕鏈 CDRl，SEQ ID NO 11 的輕鏈 CDR2，和 SEQ ID NO 12 的輕鏈CDR3，或與任何一條上述序列大體同源的序列。
某些尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO 13的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 14的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO 15的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列，和 / 或包含 SEQ ID NO 16 的輕鏈 CDRl，SEQ ID NO 17 的輕鏈 CDR2，和 SEQ ID NO 18的輕鏈CDR3，或與任何一條上述序列大體同源的序列。
某些尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO 19的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 20的重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO 21的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列，和/或包含SEQ ID NO 22的輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 23的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域， 和SEQ ID NO 24的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列。
某些尤其優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO 1的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 2的重鏈 ⑶R2結(jié)構(gòu)域，以及SEQ ID NO 3的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列，和/或包含SEQ ID NO 88的輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO 89的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，以及SEQ ID NO :90的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，或與任何一條上述序列大體同源的序列。
在另一實施方案中，發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的可變重((VH) CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的VH CDR3。
在本實施方案的一個優(yōu)選方面，一個或多個上述輕鏈可變區(qū)CDR選自
⑴具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的VL CDRl
(ii)具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的VL⑶R3。更優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū) CDR的兩條或三條選自以上集合。在本實施方案中還提供包含與一個或多個上述序列大體同源的序列的抗體。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含至少一條含有三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO : 7的氨基酸序列的可變重((VH) CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的VH CDR3。
在本實施方案的一個優(yōu)選方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自
⑴具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的VL CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 11的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的VL⑶R3。更優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū) CDR中的兩條或三條選自以上的集合。在本實施方案中還提供含有與一個或多個與上述序列大體同源的序列的抗體。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含至少一條含有三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列的可變重(VH) CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有 SEQ ID NO 15 的氨基酸序列的 VH CDR3。
在本實施方案的一個優(yōu)選方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自
⑴具有SEQ ID NO 16的氨基酸序列的VL CDRl
(ii)具有SEQ ID NO 17的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的VL⑶R3。更優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū) CDR的兩條或者三條選自集合。在本實施方案中還提供含有與一條或者多條與上述序列大體同源的序列的抗體。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含至少一條含有三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 19的氨基酸序列的可變重(VH) CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 20的氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有 SEQ ID NO 21 的氨基酸序列的 VH CDR3。
在本實施方案的一個優(yōu)選方面，一個或多個所述輕鏈可 變區(qū)CDR選自
⑴具有SEQ ID NO 22的氨基酸序列的VL CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO :24的氨基酸序列的VL⑶R3。更優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū) CDR的兩條或者三條選自集合。在本實施方案中還提供含有與一條或者多條上述序列大體同源的序列的抗體。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含至少一條含有三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 1氨基酸序列的可變重(VH) CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的VH CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的VH CDR3。
在本實施方案一個優(yōu)選的方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自
⑴具有SEQ ID NO 88的氨基酸序列的VL CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 89的氨基酸序列的VL CDR2，和
(iii)具有SEQ ID NO :90的氨基酸序列的VL⑶R3。更優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū) CDR的兩條或者三條選自集合。在本實施方案中還提供含有與一條或者多條上述序列大體同源的序列的抗體。
本發(fā)明某些進一步優(yōu)選的實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO :1、2或3中的一條、兩條或者三條重鏈⑶R、或與SEQ ID NO :1、2或3中一條或多條大體同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :4、5或6中一條、兩條或三條輕鏈CDR、或與SEQ ID N0:4、5或6中一條或者多條大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明某些進一步優(yōu)選的實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO :7、8或9中一條、兩條或者三條重鏈⑶R、或與SEQ ID NO :7、8或9中一條或者多條大體同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :10、11或12中一條、兩條或者三條輕鏈CDR、或與SEQ ID N0:10、ll或12 中一條或者多條大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明某些進一步優(yōu)選的實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO :13、14或15中一個、兩個或者三個重鏈⑶R、或與SEQ ID NO :13、14或15中一條或者多條大體同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :16、17或18—個、兩個或者三個輕鏈CDR、或與SEQ ID NO :16、 17或18中一條或者多條大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明某些進一步優(yōu)選的實施方案提供了與CXCR4相結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO 19,20或21中一個、兩個或者三個重鏈⑶R、或與SEQ ID NO 19,20或21中一條或者多條大體同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO :22、23或24中一個、兩個或者三個輕鏈CDR、或與SEQ ID NO: 22,23或24中一條或者多條大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明某些進一步優(yōu)選的實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO :1、2或3中一個、兩個或者三個重鏈⑶R、或與SEQ ID NO :1、2或3中一條或者多條大體同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或含有SEQ ID NO 88,89或90中一個、兩個或者三個輕鏈CDR、或與SEQ ID NO :88、89或90 中一條或者多條大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
在優(yōu)選的實施方案中，一個、兩個或三個輕鏈⑶R為SEQ ID NO :4、5和6，或者88、 89和90所定義，和/或一個、兩個或三個重鏈⑶R為SEQ ID NO :1、2和3所定義。
本發(fā)明某些進一步優(yōu)選的實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID N0:69、71、73或75的氨基酸序列、 或與其大體同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或具有SEQ ID N0:70、72 、74、76或103的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
進一步優(yōu)選實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO :69、71、73或75的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域， 和含有三個輕鏈⑶R的VL結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的所述輕鏈⑶R具有SEQ ID NO 4、5和6 ;或10、 11 和 12 ;或 16、17 和 18 ;或22、23 和 24 ;或88、89 和 90。
進一步優(yōu)選實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO :69的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的 VH結(jié)構(gòu)域，和/或具有SEQ ID NO 70的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
進一步優(yōu)選實施方案提供了與CXCR4相結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO :71的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域、或與其大體同源的序列，和/或具有SEQ ID NO -J2的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域、或與其大體同源的序列。
進一步優(yōu)選實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO :73的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的 VH結(jié)構(gòu)域，和/或具有SEQ ID NO 74的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
進一步優(yōu)選實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO :75氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VH 結(jié)構(gòu)域，和/或一個具有SEQ ID NO 76氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
進一步優(yōu)選實施方案提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO :69的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VH 結(jié)構(gòu)域，和/或具有SEQ ID NO :103的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
特別優(yōu)選的抗體包含具有SEQ ID NO :69的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的 VH結(jié)構(gòu)域，和/或具有SEQ ID NO :103或70的氨基酸序列、或與其大體同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
在又一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體,該抗體包含SEQ ID NO :35的氨基酸序列(在此也將所述抗體稱為C-9P21 scFv)，SEQ ID NO :46的氨基酸序列(在此也將所述抗體稱為B_lM22scFv)， SEQ ID NO :57的氨基酸序列(在此也將所述抗體稱為C_lI24scFv)，SEQ ID NO :68的氨基酸序列(在此也將所述抗體稱為D-lK21scFv)，或SEQ ID NO :101的氨基酸序列(在此也將所述抗體稱為9N10scFV)，或包含與CXCR4結(jié)合且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的任何所述序列的片段，或與任何一個以上序列大體同源的序列。
特別優(yōu)選的是基于C-9P21或C-9N10序列的抗體
本發(fā)明通過單克隆抗體C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10來舉例說明，它們的單鏈形式示于表1、2、3、4和5中(分別為SEQ ID NO :35、46、57、68和101)?？贵wC-9P21、 B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10的全長IgG結(jié)構(gòu)已經(jīng)制得并且它們的序列分別示于表6、7、8、9 和 10 中。C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21 和 9N10 抗體的 CDR 結(jié)構(gòu)域、VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域示于表I到5和圖1到5中。本發(fā)明的優(yōu)選方面為包含這些⑶R結(jié)構(gòu)域或VH和VL結(jié)構(gòu)域 (或與其大體同源的序列)的抗體。特別優(yōu)選的是基于C-9P21或9N10序列的抗體。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案是包含SEQ ID NO :35或由其組成的C-9P21抗體的 scFv形式，其優(yōu)選由SEQ ID N0:34編碼。更優(yōu)選地，該抗體包含圖1所示氨基酸序列或由其組成并且該抗體優(yōu)選由圖1所示核酸序列編碼。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是包含SEQ ID NO :46或由其組成的B-1M22抗體的 scFv形式，其優(yōu)選由SEQ ID NO 45編碼。更優(yōu)選地，該抗體包含圖2所示氨基酸序列或由其組成，并且該抗體優(yōu)選由圖2所示核酸序列編碼。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是包含SEQ ID N0:57或由其組成的C-1I24抗體的 scFv形式，其優(yōu)選由SEQ ID NO 56編碼。更優(yōu)選地，該抗體包含圖3所示氨基酸序列或由其組成，并且該抗體優(yōu)選由圖3所示核酸序列編碼。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是包含SEQ ID N0:68或由其組成的D-1K21抗體的 scFv形式，其優(yōu)選由SEQ ID NO 67編碼。更優(yōu)選地，該抗體包含圖4所示氨基酸序列或由其組成，并且該抗體優(yōu)選由圖4所示核酸序列編碼。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是包含SEQ ID NO :101或由其組成的9N10抗體的 scFv形式，它優(yōu)選由SEQ ID NO :100編碼。更優(yōu)選地，該抗體包含圖5所示氨基酸序列或由其組成，并且該抗體優(yōu)選由圖5所示核酸序列編碼。
其它優(yōu)選實施方案是C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10抗體的IgG形式， 優(yōu)選為全長IgG形式。最優(yōu)選的是這些抗體中任何一種的IgG形式。
因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是全長IgG抗體，該抗體包含SEQ ID NO: 108 (氨基酸)的重鏈和/或SEQ ID NO :109 (氨基酸)的輕鏈。同樣優(yōu)選的是包含由SEQID NO :106編碼的重鏈和/或由SEQ ID NO :107編碼的輕鏈的IgG抗體。當(dāng)然可以理解完整的IgG抗體包含兩條大體相同的重鏈和兩條大體相同的輕鏈。
本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案是含有SEQ ID NO :112(氨基酸)重鏈和/或SEQ ID NO :113(氨基酸)輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是含有由SEQ ID NO :110編碼的重鏈和/或由SEQ ID NO :111編碼的輕鏈的IgG抗體。
本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案是含有SEQ ID NO :116(氨基酸)重鏈和/或SEQ ID NO :117(氨基酸)輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是含有由SEQ ID NO :114編碼的重鏈和/或由SEQ ID NO :115編碼的輕鏈的IgG抗體。
本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案是含有SEQ ID NO :120(氨基酸)重鏈和/或SEQ ID NO :121(氨基酸)輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是含有由SEQ ID NO :118編碼的重鏈和/或由SEQ ID NO :119編碼的輕鏈的IgG抗體。
本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案是含有SEQ ID NO :108(氨基酸)重鏈和/或SEQ ID N0:125(氨基酸)輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是含有由SEQ ID N0:106編碼的重鏈和/或由SEQ ID NO :123編碼的輕鏈的IgG抗體
特別優(yōu)選的是基于C-9P21或9N10序列的抗體。
本發(fā)明另一實施方案中，VH CDRl具有或者包含SEQ ID NO :126 (S/G Y X3M/1 H/ S)或 SEQ ID NO 127 (X1 Y X3 M H)或 SEQ ID NO 128(S Y X3 M H)的氨基酸序列。
在這些實施方案中，X1可能是S或G,優(yōu)選是S。X3可能是任何氨基酸，優(yōu)選是G或 W或Y或A，更優(yōu)選是W。本實施方案的優(yōu)選VH CDRl序列是SEQ ID NO :1、7、13或19。特別優(yōu)選的VH⑶Rl具有或者包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
本發(fā)明另一實施方案中，VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO 129 (X1 I X3 X4 DG S X8 X9 X10 Y A D S V K G)的氨基酸序列。在這些實施方案中ΧρΑ ;和Xltlim是任何氨基酸。優(yōu)選這些X殘基中的一個或多個、最優(yōu)選全部選自夂是^或R(優(yōu)選R)，&是 S或N (優(yōu)選N)，X4是Y或S (優(yōu)選S)，X8是N或S (優(yōu)選S)，X9是K或T (優(yōu)選Τ)和Xltl是 Y或S(優(yōu)選S)。因此，優(yōu)選的VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO 130(V/R I S/N Y/S D G S N/S K/T Y/S Y A D S V K G)的氨基酸序列。例如，本實施方案優(yōu)選的VH⑶R2具有或包含SEQ ID NO 2或14。SEQ ID NO 2是特別優(yōu)選的。
在本發(fā)明的另一實施方案中，VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO :131 IX3 P X5 X6 G X8 X9 N Y A Q K F Q G)的氨基酸序列。在這些實施方案中和X9可以是任何氨基酸。優(yōu)選這些X殘基中的一個或多個、更優(yōu)選全部選自七是1 或G(優(yōu)選R)，X3 是N或I (優(yōu)選N)，X5是N或I (優(yōu)選N)，X6是S或F (優(yōu)選S)，X8是G或T (優(yōu)選G)以及X9 是T或A(優(yōu)選T)。因此，優(yōu)選的VH CDR2具有或者包含SEQ ID NO 132(R/G I N/1 P N/ I S/F G G/T T/A N Y A Q K F Q G)的氨基酸序列。例如，本實施方案的優(yōu)選VH⑶R2具有或包含SEQ ID NOs :8和20。SEQ ID NO 20是特別優(yōu)選的。
由于本發(fā)明抗體的不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的能力(關(guān)于CXCR4抗體前面沒有被描述的能力)，認為本發(fā)明抗體可以結(jié)合到已知抗-CXCR4抗體的不同表位(例如， 保護CXCR4+細胞以免凋亡的表位或不參與凋亡機制或不觸發(fā)凋亡，但仍參與配體對CXCR4 結(jié)合的表位)。
因此，還提供用于與CXCR4結(jié)合的可以與任何本文所述抗體競爭的抗體((例如C-9P21、C1I24、D-1K21、B-1M22 或 9N10)。
本文所使用的術(shù)語“競爭抗體”是指作為“參考抗體”的與幾乎、大體上或基本上相同、或甚至相同的表位相結(jié)合的抗體?！案偁幙贵w”包括具有重疊表位特異性的抗體。因此，競爭抗體能夠有效地與一個用于結(jié)合到CXCR4的參考抗體競爭。優(yōu)選地，競爭抗體能結(jié)合到作為參考抗體的相同表位。或者，競爭抗體優(yōu)選具有與參考抗體相同的表位特異性。
本文所使用的“參考抗體”是可以結(jié)合到人類CXCR4胞外域的表位的抗體，該抗體具有本文定義的一個或多個CDR序列，優(yōu)選本文定義的VH和VL結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選本文定義的 SEQ ID NO 69 的 VH 和 SEQ ID NO 70 的 VL，或 SEQ ID NO 71 的 VH 和 SEQ ID NO 72 的 VL,或 SEQ ID NO 73 的 VH 和 SEQ ID NO 74 的 VL，或 SEQ ID NO 75 的 VH 和 SEQ ID NO 76的VL，或SEQ ID NO 69的VH和SEQ ID NO :103的VL。更優(yōu)選的參考抗體選自C-9P21、 B-1M22、C-1I24、D-1K21和 9N10。
因為已經(jīng)提供了諸如C-9P21、B-1M22，、C-1I24、D-1K21和9N10的參考抗體，所以一個或多個競爭抗體的識別是一個簡單明了的技術(shù)性問題。由于競爭抗體的識別是通過與參考抗體比較而確定，所以應(yīng)理解實際上確定任何一個或兩個抗體所結(jié)合的表位，無論如何對于識別競爭抗體都是不需要的。然而，如果希望，表位作圖可用標(biāo)準技術(shù)來進行。
舉例而言，此處提及以下識別和定義表位的方法。CXCR4的氨基酸序列是已知的， 因此合成肽可以用于表位作圖，例如，用Pepscan測定。定向誘變在表位作圖中也是一個有力的工具，且能用于評估在免疫復(fù)合物形成中單個氨基酸的作用。蛋白質(zhì)足跡法依賴于表位在作為抗體-抗原復(fù)合物被結(jié)合時被保護以免分裂的事實。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 和血細胞凝集和狹縫印跡也可以用于表位作圖。抗原與抗體的結(jié)晶作用可以用于非線性表位作圖。這些方法的執(zhí)行方案被廣泛使用，且技術(shù)人員意識到其將成為表位作圖適宜的替代方法。
利用任何一種能評估抗體競爭的免疫篩選試驗都能容易地確定競爭抗體的識別。 所有這些實驗在本領(lǐng)域是常 規(guī)的，且在本文進一步詳細地描述。美國專利No. 6，342，219、 No. 6，524，583,No. 7，056，509,No. 6，887，468,No. 6，342，221、Νο· 6，676，941、Νο· 6，703，020 和No. 6，416，758中的每一個均以引用方式并入本文，目的在于包括對關(guān)于怎樣識別競爭抗體的本教示內(nèi)容的更進一步補充。
例如，在待檢查的測試抗體來自不同來源的動物、或甚至不同的同種型的情況下， 可以采用簡單競爭試驗，其中在參考和測試抗體被混合(或預(yù)-吸附)，且應(yīng)用于含CXCR4 組合物，優(yōu)選應(yīng)用于表達CXCR4的細胞、展示CXCR4的噬菌體、或含固定化CXCR4的生物芯片。基于ELISA的方法尤其適用于這種簡單競爭研究。
在某些實施方案中，可以在應(yīng)用到抗原組合物之前將參考抗體(例如C-9 Ρ21、 C1I24、D1K21、B-1M22或9Ν10)與不同數(shù)量的測試抗體(例如I IOU 100或I 1000) 預(yù)混合一段時間。在其它實施方案中，參考抗體和不同數(shù)量的測試抗體可以在暴露于抗原組合物期間被簡單混合。無論如何，通過使用物種或同種型二級抗體，將僅能夠檢測結(jié)合的參考抗體，其結(jié)合將被“競爭”結(jié)合的測試抗體的存在所減弱。
在進行參考抗體和任何測試抗體(不考慮物種和同種型)之間的抗體競爭研究中，可以首先用可檢測的標(biāo)記(如生物素或酶的或放射的標(biāo)記)標(biāo)記參考物(如C-9P21、 C1I24、D1K21、B-1M22或9N10)來實現(xiàn)后續(xù)識別。在這些情況下，可將標(biāo)記的參考抗體與待檢測的測試抗體以各種比例(例如1: 10、1 100或1: 1000)預(yù)混合或培育，且然后 (任選在一段適當(dāng)時間之后)分析標(biāo)記的參考抗體的反應(yīng)性并將其與對照值(其中在培育中不包括潛在競爭測試抗體)進行比較。
該試驗可以是基于抗體結(jié)合的一系列免疫檢測中的任何一種，且可以通過檢測它們的標(biāo)記來檢測參考抗體，例如通過以下方式在生物素化抗體的情況下使用鏈霉親和素， 或者將顯色底物與酶標(biāo)記(例如帶有過氧化物酶的3，3’5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物) 一起使用，或者僅檢測放射性標(biāo)記。與用于結(jié)合到CXCR4的參考抗體競爭的抗體將有效或明顯降低參考抗體對CXCR4的結(jié)合，這由結(jié)合標(biāo)記的減少而證明。
在缺乏完全無關(guān)抗體的情況下，(標(biāo)記的)參考抗體的反應(yīng)性為對照高值。當(dāng)競爭出現(xiàn)并減少標(biāo)記抗體的結(jié)合時，可通過培育標(biāo)記的參考(例如C-9 P21、C1I24、D1K21、 B-1M22或9N10)抗體與未標(biāo)記的完全相同類型的抗體來獲得對照低值。在測試試驗中，在測試抗體存在下標(biāo)記抗體反應(yīng)性明顯降低，這表明測試抗體與用于結(jié)合到CXCR4的標(biāo)記抗體競爭。
明顯降低是“可重復(fù)的”，即，一直認為，在結(jié)合中減弱。就本申請而言，“明顯降低”定義為在大約1: 10到1: 100之間的任何比例下，至少約20%、更優(yōu)選至少約25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或 65%、甚至更優(yōu)選至少約 70%、約 75%或約 80% 的可重復(fù)的降低(在ELISA或其它適宜試驗中，參考抗體對CXCR4的結(jié)合)。具有甚至更嚴格競爭活性的抗體將表現(xiàn)出在約1: 10到1: 100之間的任何比率下，至少約82%、約 85%、約88%、約90%、約92%或約95%的可重復(fù)的降低(在ELISA或其它適宜試驗中， 參考抗體對CXCR4的結(jié)合)。盡管并不需要實踐本發(fā)明，但當(dāng)然不排除完全或幾乎完全的競爭，例如表現(xiàn)出參考抗體對CXCR4的結(jié)合可重復(fù)地降低約99 %、約98 %、約97 %、約96 % 的。
上述方法僅僅是合適競爭試驗的例子。技術(shù)人員將認識到其它合適的方法和變型。下面描述替代性競爭試驗 。
在用流式細胞儀進行替代性競爭試驗之前，一定數(shù)量的測試抗體應(yīng)該被標(biāo)記(例如通過生物素化)。確定生物素化產(chǎn)物的功能性(細胞結(jié)合性的保留)以及提供針對固定量 CXCR4+細胞的次最大結(jié)合的本發(fā)明生物素化抗體的最小濃度?？偣睮O6個細胞從指數(shù)增長培養(yǎng)物中收獲，且用各種抗體濃度以適宜的溫度培育適宜的時間，如4°C下培育I小時。洗滌細胞且用適宜的檢測抗體以適宜的溫度培育適宜的時間，例如，再在4°C下培育I小時。 洗滌后，用流式細胞儀分析所述細胞。對于每一個測試抗體，從資料中，通過針對抗體濃度繪制中值熒光強度(MFI)，由數(shù)據(jù)產(chǎn)生飽和曲線。
對于替代性競爭試驗，CXCR4+細胞如上制備，且利用固定濃度的標(biāo)記(生物素化的)抗體(bio-Abl)和遞增濃度的未標(biāo)記競爭抗體的混合物進行一式兩份的處理。固定濃度是針對如上確定的固定量腫瘤細胞產(chǎn)生合理熒光信號的抗體的最小濃度。理論上，固定濃度(nM)應(yīng)該低于待測試抗體在平衡(Kd)下的親和力。在該情況下，所述方法能用于評估競爭抗體的親和力(Schodin and Kranz, 1993, Binding affinity and inhibitory properties of a single-chain anti—T cell receptor antibody. J Biol Chem 268 25722-7)。抗體混合物用靶標(biāo)細胞以適宜的溫度培育適宜的時間，例如，4°C下培育I小時。 洗滌細胞并且通過用FITC-標(biāo)記鏈霉親和素培育來展現(xiàn)生物素化抗體的細胞結(jié)合。從每一個測試樣品的中值熒光讀數(shù)減去背景熒光(PBS-5%FCS)后，根據(jù)以下公式計算每個Ab2濃度“c”的抑制百分數(shù)
% 抑制=(l-MFIbio_Abl+Ab2,,c7MFIbio_Abl)xl00
進行計算。
考慮了可與CXCR4結(jié)合和可與任何本文所述抗體競爭的任何抗體，但優(yōu)選抗體在下文陳述。因此，在一些優(yōu)選實施方案中，提供以下內(nèi)容
與人類CXCR4的胞外域的表位結(jié)合且優(yōu)選具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其中所述抗體
(a)包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，
其中所述輕鏈可變區(qū)包含
(i)具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的可變輕(VL)⑶Rl，·
(ii)具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(iv)具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的可變重(VH) CDRl，
(V)具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
與人類CXCR4的胞外域的表位結(jié)合且優(yōu)選具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其中所述抗體
(a)包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的可變輕(VL) CDRl，
(ii)具有SEQ ID NO 11的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(iv)具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的可變重(VH)CDRl，
(V)具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
與人類CXCR4的胞外域的表位結(jié)合且優(yōu)選具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其中所述抗體
(a)包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 16的氨基酸序列的可變輕(VL)CDRl
(ii)具有SEQ ID NO 17的氨基酸序列的VL CDR2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO 18的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(iv)具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列的可變重(VH) CDRl,
(V)具有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
與人類CXCR4的胞外域的表位結(jié)合且優(yōu)選具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其中所述抗體
(a)包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 22的氨基酸序列的可變輕(VL)CDRl,
(ii)具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的VL⑶R2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO 24的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(iv)具有SEQ ID NO 19的氨基酸序列的可變重(VH) CDRl,
(V)具有SEQ ID NO 20的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
與人類CXCR4的胞外域的表位結(jié)合且優(yōu)選具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的抗體，其中所述抗體
(a)包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含
⑴具有SEQ ID NO 88的氨基酸序列的可變輕(VL) CDRl,
(ii)具有SEQ ID NO 89的氨基酸序列的VL⑶R2，和/或
(iii)具有SEQ ID NO 90的氨基酸序列的VL CDR3，和/或
其中所述重鏈可變區(qū)包含
(iv)具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的可變重(VH)CDRl
(V)具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列的VH CDR2，和/或
(vi)具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的VH CDR3，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
在一個實施方案中，抗體
(a)具有 SEQ ID NO 69 的 VH 結(jié)構(gòu)域和 SEQ ID NO 70 的 VL結(jié)構(gòu)域，或
(b)具是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
在一個實施方案中，抗體
(a)具有 SEQ ID NO :71 的 VH 結(jié)構(gòu)域和 SEQ ID NO 72 的 VL結(jié)構(gòu)域，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
在一個實施方案中，抗體
(a)具有 SEQ ID NO 73 的 VH 結(jié)構(gòu)域和 SEQ ID NO 74 的 VL結(jié)構(gòu)域，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
在一個實施方案中，抗體
(a)具有 SEQ ID NO 75 的 VH 結(jié)構(gòu)域和 SEQ ID NO 76 的 VL結(jié)構(gòu)域，或
(b)是可與用于結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
在一個實施方案中，抗體
(a)具有SEQ ID NO 69的VH結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO :103的VL結(jié)構(gòu)域，或
(b)是可與結(jié)合到CXCR4的抗體(a)競爭的抗體。
優(yōu)選地，抗體(b)具有本為所述的一個或者多個CDR序列、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選地，抗體(b)可結(jié)合到與抗體(a)相同的表位。
大體同源的序列的某些例子是指與所公開的氨基酸序列具有至少70%同一性的序列。在某些實施方案中，結(jié)合到CXCR4且具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)的本發(fā)明抗體包含至少一條輕鏈可變區(qū)，該可變區(qū)包括與SEQ ID NO :70、72、74、76或103的氨基酸序列存在至少約75%、更優(yōu)選至少約80%、更優(yōu)選至少約85%、更優(yōu)選至少約90% 或95 %且最優(yōu)選至少約97 %、98 %或99 %的同一性的氨基酸序列；和/或至少一條重鏈可變區(qū)，該可變區(qū)包括與SEQ ID N0:69、71、73或75的氨基酸序列存在至少約75%、更優(yōu)選的至少約80%、更優(yōu)選至少約85%、更優(yōu)選至少約90%或95%、且最優(yōu)選的至少約97%、 98 %或99 %的同一性的氨基酸序列。
大體同源序列的其它優(yōu)選例子是指含有對所公開氨基酸的保守氨基酸取代的序列。
大體同源序列的其它優(yōu)選例子是在一個或多個所公開CDR區(qū)中含有至多I個、2 個、3個或4個、優(yōu)選至多I個或2個改變的氨基的序列。此類改變可能是保守的或非保守的氨基酸取代，或它們的組合。
在所有此類實施方案中，優(yōu)選的改變是保守的氨基酸取代。
在所有實施方案中，包含大體同源序列的抗體保留與CXCR4結(jié)合的能力，且優(yōu)選地保留本文所述的一種或多種其它性質(zhì)中的，例如，不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)和/或拮抗的性質(zhì)。
本發(fā)明的其它實施方案提供結(jié)合蛋白，該蛋白與CXCR4結(jié)合且優(yōu)選具有本文所述的一種或多種其它性質(zhì)，例如，具有不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡的性質(zhì)和/或拮抗的性質(zhì)，且包含本發(fā)明的抗體，本發(fā)明的VH或VL結(jié)構(gòu)域，或本發(fā)明的一個或多個CDR。在優(yōu)選的實施方案中，這種結(jié)合蛋白是抗體。
本發(fā)明的優(yōu)選抗體包含至少一條含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一條含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)。這些⑶R的示例性和優(yōu)選序列在本文描述。
如本文所用，除非另外說明或與科學(xué)術(shù)語進行區(qū)分，否則簡明術(shù)語“CXCR4”意思是 CXC趨化因子受體4 (也稱為融合素，HM89、LESTR或HUMSTR)。
CXCR4可以是游離CXCR4 (如重組或純化CXCR4)，但優(yōu)選其為以天然形式存在，例如，存在于細胞表面上。
本發(fā)明的抗體或結(jié)合蛋白也可與CXCR4片段結(jié)合，特別是包含全部或者部分 CXCR4的胞外域或由全部或者部分CXCR4的胞外域組成的片段，或可結(jié)合到包含CXCR4或 CXCR4片段的實體。事實上，本發(fā)明抗體的表位位于CXCR4的胞外域。
“CXCR4”也可以指CXCR4的任何形式，特別是當(dāng)CXCR4在哺乳動物物種間是保守的時。因此，本發(fā)明抗體或者抗體片段可以例如與人、猴(例如食蟹猴或普通獼猴/恒河猴)、小鼠(鼠科動物)、牛(?？苿游?、大鼠、倉鼠、雪貂、豚鼠和/或兔CXCR4結(jié)合。優(yōu)選地， 本發(fā)明抗體或抗體片段將至少與人CXCR4結(jié)合。因此，除非另外說明，否則本文引用的任何 “CXCR4”表示的意思是“人CXCR4”。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或者抗體片段至少與人和猴(例如食蟹猴或普通獼猴/恒河猴)CXCR4結(jié)合。在其它優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明的抗體或抗體片段將至少與人和小鼠CXCR4結(jié)合。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段至少與人、猴和小鼠CXCR4結(jié)合。
如本文所用，在本發(fā)明抗體或抗體片段的背景下，術(shù)語“與CXCR4結(jié)合”或 “抗-CXCR4”是指具有以下能力中一種或多種、優(yōu)選具有以下能力中的一種以上，且最優(yōu)選具有是以下全部能力的抗體或抗體片段
(a)例如，通過流式細胞儀或者免疫組化評估能夠與在細胞(例如，用CXCR4轉(zhuǎn)染的細胞或者天然表達CXCR4的細胞)表面上表達的CXCR4結(jié)合；
(b)例如,通過在非還原條件下在蛋白質(zhì)印跡(Western blot)中與CXCR4結(jié)合來評估能夠與構(gòu)像依賴((如非線性)的CXCR4表位結(jié)合；
(c)能夠至少與人CXCR4結(jié)合，更優(yōu)選與人和猴CXCR4結(jié)合或與人和小鼠CXCR4結(jié)合，最優(yōu)選與人、猴和小鼠CXCR4結(jié)合；
(d)能夠與人和猴CXCR4能夠或以相似親和力與人和小鼠CXCR4結(jié)合，例如其中 Kd為IOnM或更小，優(yōu)選為5nM或更小，更優(yōu)選為3nM或更小，或2nM或更小，例如InM或更小，如本文另外所討論；
本發(fā)明的優(yōu)選抗體或抗體片段還具有以下功能性質(zhì)中的一種或多種，優(yōu)選具有以下功能性質(zhì)中的一種以上，且最優(yōu)選具有全部以下功能性質(zhì)
(e)不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的明顯凋亡；
(f)阻斷或抑制CXCR4與其一個或多個配體結(jié)合，例如，阻斷或抑制CXCR4與至少 SDF-1或CXCR4的替代性配體(例如，化合物AMD-3100)結(jié)合，且優(yōu)選地抑制CXCR4與至少 SDF-1和AMD-3100兩者結(jié)合；
(g)阻斷或抑制來自CXCR4受體的下游信號事件，例如，抑制對CXCR4配體(如 SDF-1)的CXCR4-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答，例如優(yōu)選地抑制對CXCR4配體(如SDF-1)的鈣離子釋放應(yīng)答，或阻斷或抑制CXCR4+細胞的配體(例如SDF-1)誘導(dǎo)遷移；
(h)誘導(dǎo)如本文另外所述的CXCR4+細胞的ADCC ；
⑴誘導(dǎo)體外抗腫瘤效應(yīng)；
(j)給藥到有腫瘤的動物時對腫瘤定位；
(k)誘導(dǎo) CXCR4+ 細胞的 CDC ；
(I)誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)，尤其是體內(nèi)或體外抗-HIV效應(yīng)；
(m)關(guān)于CXCR4受體不呈現(xiàn)競爭活性；
在與CXCR4+細胞結(jié)合的背景下，應(yīng)理解本發(fā)明抗體可與CXCR4+細胞結(jié)合且不明顯與CXCR4—細胞結(jié)合(如實施例2所示)。
術(shù)語“不明顯與CXCR4—細胞結(jié)合”應(yīng)理解為抗體與CXCR4—細胞的任何結(jié)合不阻止用于診斷或治療的所述抗體的使用。因此與CXCR4_細胞的“非明顯”結(jié)合包括這樣的情形， 即抗體與0乂0 4_細胞的結(jié)合明顯弱于其與一種或多種CXCR4+細胞的結(jié)合，或所述結(jié)合可以被認為是處于背景)水平，例如，與陰性對照實驗中觀察到的水平相當(dāng)或者并無明顯不同。
出于治療或者診斷的目，主要考慮的是抗體與一個或多個類型CXCR4+細胞的結(jié)合必須比與任何CXCR4_細胞(抗體可能在治療和診斷應(yīng)用期間與其接觸)的結(jié)合更強。
本發(fā)明抗體可以稱為“CXCR4-特異性的”。術(shù)語“CXCR4-特異性的”應(yīng)該解釋為抗體與CXCR4表達細胞的結(jié)合具有足夠特異性以允許用于治療和診斷的所述抗體的使用。 如本文所述的CXCR4-特異性抗體具有與CXCR4(如在細胞表面)結(jié)合但不與非-CXCR4蛋白明顯結(jié)合(如不與CXCR4-細胞明顯結(jié)合)的能力。技術(shù)人員可以通過將與靶標(biāo)CXCR4+ 細胞(例如，用CXCR4轉(zhuǎn)染且表達CXCR4的細胞，或天然表達CXCR4的細胞，如Ramos細胞、 Jurkat細胞、CCRF-CEM細胞、Raji細胞)的結(jié)合強度和與一個或多個類型的CXCR4-細胞 (如未用CXCR4轉(zhuǎn)化的野生型細胞，如HEK293T細胞或DT40細胞)的結(jié)合強度，容易地確定任何給定抗體是否為CXCR4-特異性的。本領(lǐng)域描述了取決于表達CXCR4的細胞類型，CXCR4具有發(fā)展稍微不同的結(jié)構(gòu)的趨勢(參見例如Baribaud等人，2001年)。因此，當(dāng)它們可以與一個或多個用CXCR4轉(zhuǎn)染或天然表達CXCR4的細胞類型結(jié)合時，本發(fā)明抗體被視為具有與細胞表面上CXCR4結(jié)合的能力。優(yōu)選的抗體具有在多種細胞類型上與CXCR4結(jié)合的能力并因此具有結(jié)合CXCR4多種結(jié)構(gòu)的能力。例如，本文所述的C-9P21、9N10和C-1124抗體顯示了此類能力。
例如，技術(shù)人員將了解，用實施例2和3中所述的流式細胞儀和適宜的試驗，可以對比CXCR4—細胞評價與CXCR4+細胞的結(jié)合。
本領(lǐng)域所熟知的免疫組化技術(shù)可用于對抗體與細胞或樣品的結(jié)合進行評分。這種試驗可用于測試具體抗體的特異性，或檢測CXCR4在組織樣品中的表達。簡而言之，例如抗體可例如在一個高密度陣列的人體組織上測試，該組織包括陽性對照物(已知是CXCR4-陽性的細胞)和陰性對照(已知是CXCR4-陰性的細胞)。膜染色強度可以4級標(biāo)準(0，1,2, 3)通過肉眼觀察評估。對于CXCR4+組織，優(yōu)選的抗體得分為微弱或強烈(如O以上的分數(shù))，優(yōu)選的是強烈免疫組化得分。
如上所述，本發(fā)明抗體具有不誘導(dǎo)CXCR4+細胞(CXCR4表達細胞)明顯凋亡的性質(zhì)。所謂術(shù)語“不誘導(dǎo)CXCR4+細胞明顯凋亡”是指在抗體存在下誘導(dǎo)的凋亡水平與抗體缺乏下誘導(dǎo)的凋亡水平相當(dāng)或者無明顯不同，例如，在生長介質(zhì)單獨存在下處于陰性對照情況或背景水平之下。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明抗體不誘導(dǎo)超出凋亡的天然水平、或背景水平、 或?qū)φ账降目蓽y量或明顯的凋亡增加。這現(xiàn)有技術(shù)抗體如WO 2008/060367(如F7)中描述的Medarex抗體形成對比,所述Medarex抗體誘導(dǎo)與在抗體缺乏時觀察到的凋亡相比的可測量和明顯的凋亡(見本文例10)。優(yōu)選地，在抗體濃度彡O. 4 μ g/ml時，例如在濃度為或至少 O. 4 μ g/ml、I μ g/ml>2 μ g/ml>3 μ g/ml>4 μ g/ml>5 μ g/ml>6 μ g/ml、7 μ g/ml、 8 μ g/ml、9 μ g/ml、10 μ g/ml、11 μ g/ml、12 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、30 μ g/ ml>40 μ g/ml>50 μ g/ml、75 μ g/ml 以及 100 μ g/ml (優(yōu)選呈 IgG 如 IgGl 形式)時,本發(fā)明抗體不誘導(dǎo)明顯凋亡。更優(yōu)選地，當(dāng)在體外CXCR4+Ramos細胞系上進行評價時(例如利用例10中描述的試驗評定)，本發(fā)明抗體不誘導(dǎo)明顯凋亡。優(yōu)選地，在濃度彡O. 14μ g/lxlO5 個細胞時，例如在濃度為或至少O. 14μ g/lxlO5細胞、O. 25μ g/lxlO5個細胞、O. 5 μ g/lxlO5 個細胞、I μ g/lxlO5個細胞、2μ g/lxlO5個細胞、3μ g/lxlO5個細胞、3. 5μ g/lxlO5個細胞、4μ g/lxlO5 個細胞、5μ g/lxlO5 個細胞、10μ g/lxlO5 個細胞、15μ g/lxlO5 個細胞、 20 μ g/lxlO5個細胞、25 μ g/lxlO5個細胞、30 μ g/lxlO5個細胞和35 μ g/lxlO5個細胞時，本發(fā)明抗體不誘導(dǎo)明顯凋亡，更優(yōu)選地，細胞為RAMOS細胞。優(yōu)選地，當(dāng)以治療可用濃度使用， 例如抗體濃度彡O. 4 μ g/ml,例如濃度為或至少O. 4 μ g/ml > I μ g/ml>2 μ g/ml >3 μ g/ml、 4 μ g/ml>5 μ g/ml、6 μ g/ml、7 μ g/ml>8 μ g/ml>9 μ g/ml、10 μ g/ml、11 μ g/ml、12 μ g/ml、 15 μ g/ml >20 μ g/ml、25 μ g/ml >30 μ g/ml >40 μ g/ml >50 μ g/ml >75 μ g/ml 和 100 μ g/ml 時， 本發(fā)明抗體不誘導(dǎo)明顯凋亡(優(yōu)選呈IgGjn IgGl形式，優(yōu)選地，抗體濃度是血清中的抗體濃度)。舉例來說，不誘導(dǎo)CXCR4+細胞明顯凋亡的抗體是不會導(dǎo)致大于10%的細胞在試驗中與抗體一起培育時凋亡的抗體，所述試驗將凋亡細胞確定為那些對膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)染色陽性的細胞。優(yōu)選的試驗如實施例10所描述，且涉及使用高達10 μ g/ml濃度的 Ramos細胞和IgGl抗體。或者，不誘導(dǎo)CXCR4+細胞明顯凋亡的抗體是這樣一種抗體，在該抗體中，高于背景或?qū)φ账降娜魏蔚蛲龅脑黾邮浅^試驗中(將調(diào)亡細胞定義為那些對膜聯(lián)蛋白V結(jié)合為陽性的細胞)所述背景或?qū)φ账降淖畲?0%的增加。優(yōu)選試驗如例 10所述，且涉及使用高達10 μ g/ml的濃度的Ramos細胞和IgGl抗體。
凋亡的誘導(dǎo)可使用熟知的標(biāo)準方法來測定，例如測定膜聯(lián)蛋白V染色(涉及膜聯(lián)蛋白染色的示例性方法，見實施例10)。簡而言之，細胞(如Ramos細胞)可以與抗體(如 IgG2形式的抗體)培育適宜的時間，如24小時或48小時，并且，在細胞收獲和膜聯(lián)蛋白V 染色之后，可通過FACS分析(如，用EasyCyte)測量效果。膜聯(lián)蛋白V染色指示凋亡細胞， 而死亡細胞可通過例如PI染色進行來識別(并與凋亡細胞區(qū)分)。
抗體C-9P21、B-1M22、C-1I24和9N10已經(jīng)顯示能夠抑制通過CXCR4的配體誘導(dǎo)信號，例如抑制對CXCR4配體的CXCR4-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答，特別是抑制響應(yīng)于CXCR4配體如SDF-1的鈣離子釋放(見實施例6)。因此，本發(fā)明抗體優(yōu)選地能夠抑制對CXCR4配體如 SDF-1的CXCR4-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答，特別是抑制響應(yīng)于CXCR4配體如SDF-1的鈣離子釋放。 特別地，抗體優(yōu)選能夠 抑制SDF-1誘導(dǎo)的鈣通量。適宜的試驗方法是已知的并且在例6中公開了一個試驗。
對本文所述的各種CXCR4介導(dǎo)的事件例如如來自CXCR4的下游信號事件，通過 CXCR4的配體誘導(dǎo)信號，對CXCR4配體的CXCR4介導(dǎo)細胞應(yīng)答，鈣離子釋放，配體誘導(dǎo)的遷移等的“阻斷”或“抑制”意思是對比在本發(fā)明抗體缺乏下，在所述抗體存在下，所討論的性質(zhì)以可測量或明顯的方式降低。例如，對比在所述抗體缺乏下的結(jié)合，在所述抗體存在下，所述性質(zhì)可以降低至少10%、20%、30%、或40%，更優(yōu)選至少45%、50%、55%、60%、65%、 70 %或75 %，甚至更優(yōu)選至少80 %。對于某些性質(zhì)，預(yù)期降低至少85 %、90 %或95 %。
在阻斷或抑制鈣離子釋放(鈣通量)的情況下，伴隨本發(fā)明抗體上升到至少70%、 75%、80%或95%抑制，常常發(fā)現(xiàn)鈣離子釋放至少20%或30%的抑制(見實施例6)。用于達到這種抑制的抗體的示例性濃度是4 μ g/ml、10 μ g/ml或100 μ g/ml。在本發(fā)明的某些實施方案中，能夠?qū)е麦w外CXCR4+細胞(例如CCRF-CEM細胞)的鈣離子釋放的50%抑制，的抗體濃度(IC5tl)優(yōu)選為至少50nM、40nM、35nM或30nM(或任何30和50之間的整數(shù))、25nM、 20nM、15nM、10nM、7nM或5nM(或任何5和30之間的整數(shù))。例如，已經(jīng)顯示本發(fā)明C-9P21 抗體具有對CCRF-CEM細胞的29nM的IC5(I。已經(jīng)顯示9N10抗體具有對CCRF-CEM細胞的 3. 85nM 的 IC5tl。
在某些實施方案中，抗體可以阻斷或抑制CXCR4+細胞朝著CXCR4配體(如 SDF-1)的遷移或趨化作用(見實施例7)。遷移和趨化作用的抑制可用標(biāo)準方法例如使用transwell試驗來分析，。簡而言之,能夠趨化且表達CXCR4的細胞在一個腔室內(nèi)與抗體接觸，并且在另一個腔室內(nèi)，通過具有適宜孔徑的過濾膜，將CXCR4的配體例如SDF-1與第一腔室隔開。通過將抗體存在下的趨化作用與抗體缺乏下的趨化作用進行比較，確定抗體在細胞朝著配體遷移中(趨化作用)的作用。適宜的試驗在實施例7描述。取決于抗體的濃度，發(fā)現(xiàn)遷移的至少50%和高達100%抑制。
在本發(fā)明的某些實施方案中，能夠?qū)е麦w外CXCR4+細胞(例如CCRF-CEM細胞)的細胞遷移的50%抑制的抗體濃度(IC5tl)優(yōu)選為至少20 μ g/ml、15 μ g/ml (或15到20之間的任何整數(shù))、10 μ g/ml (或10和15之間的任何整數(shù))、5 μ g/ml (5和10之間的任何整數(shù))、 4 μ g/ml,3 μ g/ml,2 μ g/ml 或 I μ g/ml.。例如，本發(fā)明的 C-9P21 抗體顯示具有對 CCRF-CEM 細胞的2. 9 μ g/ml的IC5(I。在本發(fā)明某些實施方案中，抗體能夠在體外于Syg/mlUOyg/ ml、15 μ g/ml>20 μ g/ml、25 μ g/ml 或 30 μ g/ml (或 6 和 30 μ g/ml 之間的任何整數(shù))下實現(xiàn)100%抑制。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體(如C-9P21，C-1I24，D-1K21，B-1M22和9N10)能夠抑制 CXCR4與一個或多個其配體結(jié)合。優(yōu)選地，至少抑制與SDF-1的結(jié)合。更優(yōu)選地，抑制與 SDF-1和AMD-3100的結(jié)合。例如，抗體C_9P21、C_1I24、9N10和D-1K21已經(jīng)顯示能夠抑制 CXCR4與其配體(SDF-1)結(jié)合(實施例3)。抗體C-9P21、C-1I24和D-1K21也已經(jīng)顯示能夠抑制CXCR4與AMD-310結(jié)合(實施例3)?？紤]到它們對鈣通量的作用，可以認為B-1M22 也與用于結(jié)合到CXCR4上的配體競爭。
所謂“阻斷配體與CXCR結(jié)合”或“抑制配體與CXCR結(jié)合”是指配體與CXCR4的結(jié)合以可測量或明顯的方式降低，例如，比較抗體缺乏下的結(jié)合，在抗體存在下的結(jié)合降低至少 0%、20%、30%、或 40%，更優(yōu)選降低至少 45%、50% 55% 60% 65% 70%或 75%，甚至更優(yōu)選降低至少80 %。也考慮了配體與CXCR4的結(jié)合降低至少85 %、90 %或95 %的實施方案?；蛘?，當(dāng)配體首先與CXCR4接觸且隨后添加抗體時，配體能夠抑制抗體與CXCR4結(jié)合。
確定抗體是否能抑制配體與CXCR4結(jié)合的試驗是眾所周知的，且對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見。適宜的試驗在實施例3中描述。簡而言之，CXCR4+細胞用SDF-1 (或 AMD-3100,如果合適)或不用SDF-1 (或AMD-3100，如果合適)培育，然后添加抗體并且用標(biāo)記的抗人類抗體檢測所述抗體。對于具有抑制配體與CXCR4結(jié)合的能力的抗體，在 SDF-1 (或AMD-3100，如果合適)存在下預(yù)培育導(dǎo)致與CXCR4結(jié)合的抗體減少。特別地，抑制抗體與天然表達CXCR4的且與SDF-1或AMD-3100 —起預(yù)培育的Ramos細胞、Jurkat細胞或CCRF-CEM細胞的結(jié)合?；蛘?，同時將被測試抗體作為配體加入到細胞中，或可以首先添加抗體。
用于確定抗體是否能阻斷配體與CXCR4結(jié)合的替代試驗包括使用標(biāo)記配體，例如放射性標(biāo)記的配體。
盡管不是本發(fā)明抗體主要的作用機制，但本發(fā)明抗體優(yōu)選地具有誘導(dǎo)CXCR4+細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法在體外測定 ADCC。適宜的方法在實施例8中描述，在方法中，CXCR4+細胞，例如CCRF-CEM細胞，用熒光標(biāo)記進行標(biāo)記以評價在PBMC存在下的ADCC溶解?；蛘撸?，可以使用鉻-51釋放試驗。因此，本發(fā)明抗體可以例如在體外，例如，在人類PBMC存在時，導(dǎo)致CXCR4+細胞的至少10%、 15%、20%、22%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 98%致死。還包括可誘導(dǎo)100%或激活100%致死的抗體。例如，在一些實驗中，B-1M22抗體已經(jīng)顯示能誘導(dǎo) 100% (考慮到實驗誤差，或幾乎100%)的致死(見實施例8，其中在人PBMC和B-1M22抗體存在下，誘導(dǎo)CXCR4+細胞系CCRF-CEM的基本100%致死)。另外，在IgG水平下，抗體 C-9P21和C-1I24已經(jīng)顯示在人PBMC存在下導(dǎo)致CXCR4+細胞系CCRF-CEM的至少50%、 55%或60%致死，抗體D-1K21已顯示在人類PBMC存在下導(dǎo)致CXCR4+細胞系CCRF-CEM的 15%、20%或25%致死(見實施例8)。
盡管不是本發(fā)明抗體的主要作用機制，但ADCC有利于一些應(yīng)用，特別是一些治療性應(yīng)用。因此，在優(yōu)選的實施方案中，抗體可以在PBMC存在下誘導(dǎo)CXCR4+細胞的ADCCJt 選誘導(dǎo)CXCR4+腫瘤細胞。在其它實施方案中，抗體極少誘導(dǎo)ADCC或誘導(dǎo)不明顯的ADCC。
就完成這種ADCC水平所需的抗體濃度而言，本發(fā)明抗體還優(yōu)選顯示為適當(dāng)有效力的。另外，適宜的體外測試在實施例8中描述。
因此，用于體外CXCR4+細胞(例如，CCRF-CEM細胞)半數(shù)最大細胞溶解(EC5tl) 所需的抗體濃度優(yōu)選小于 2000ng/ml、1500ng/ml、1000ng/ml、700ng/ml、650ng/ml、620ng/ ml、600ng/ml、550ng/ml、500ng/ml、450ng/ml、400ng/ml、350ng/ml、300ng/ml、250ng/ml、 200ng/ml、150ng/ml、125ng/ml、100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、 45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、lOng/ml、9ng/ml、7ng/ ml、5ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 或 0. 25ng/ml。例如，在 IgG 水平下，本發(fā)明的 C-9P21 抗體已顯示對于CCRF-CEM細胞的1852ng/ml的EC5tl,并且本發(fā)明的Cl 124抗體已顯示對于 CCRF-CEM細胞的49. 2ng/ml的EC5(I。本發(fā)明抗體D-1K21已顯示具有79. 9ng/ml的EC5tl,并且本發(fā)明抗體B-1M22已顯示具有115. 7ng/ml的EC5(I。
在一些實施方案中，抗體可誘導(dǎo)CXCR4+細胞的補體依賴細胞毒性(CDC)，但在其它一些實施方案中，所述抗體不能誘導(dǎo)⑶C。例如，抗體B-1M22和C1I24，特別是C-1I24，已顯示出誘導(dǎo)CXCR4+細胞(例如在Ramos細胞中)的CDC的良好能力(見實施例9)。
⑶C的誘導(dǎo)可以用眾所周知的標(biāo)準方法測定，例如,通過熒光標(biāo)記來對CXCR4+細胞如Ramos細胞進行標(biāo)記以評價在人血清存在下的CDC溶解。適宜的試驗在實施例9中描述。
其它優(yōu)選的性質(zhì)包括在施用本發(fā)明抗體時體內(nèi)缺乏明顯的毒性以及體內(nèi)缺乏其它明顯的副作用。
優(yōu)選地，當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶φ账较啾容^時，在可測量或明顯的水平上且更優(yōu)選在統(tǒng)計顯著水平上觀察到本文所述能力。
一些抗體能夠被內(nèi)化入它們與之結(jié)合的細胞中。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，抗體能夠被內(nèi)化。因為連接至抗體的任何其它試劑與抗體分子被內(nèi)化，所以這種性質(zhì)特別有利于在免疫軛合物中使用。在其它實施方案中，未發(fā)現(xiàn)明顯的內(nèi)化。
技術(shù)人員將知道測定內(nèi)化的適宜方法，例如，在流式細胞儀或共聚焦顯微鏡上使用溫度差熒光標(biāo)記。適宜的測定的例子涉及到PH-敏感染料(如CypHer5E)標(biāo)記的二級抗體，該pH-敏感染料在堿性pH 值下為最小突光(在細胞外發(fā)現(xiàn))并在酸pH值下為最大突光(在細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn))。
術(shù)語“CXCR4的配體”包括CXCR4的天然配體，如SDF-1，該SDF-1可天然產(chǎn)生、重組表達或在實驗室中合成。該術(shù)語也包括CXCR4的非天然或者人工設(shè)計的配體，如可與CXCR4相結(jié)合的AMD-3100。
所謂"CXCR4+細胞"或"CXCR4表達細胞"意為在其表面上表達CXCR4、尤其為至少大體上呈其野生型構(gòu)象的細胞。CXCR4+細胞可能是天然CXCR4陽性的，或者它們可以是表達重組CXCR4的轉(zhuǎn)化體。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可以制作一系列的抗CXCR4抗體并用于各種實施方案，包括用于治療本文另外討論的任一病癥，特別是癌癥(包括轉(zhuǎn)移癌)，自身免疫病癥，炎癥病癥和感染(，尤其是病毒性感染例如HIV)。
除非在隨后特別說明了上限的情況下，否則在整個申請使用的術(shù)語“一個(a或 an)”用于表示"至少一個"，"至少第一個"，"一個或多個"，或“數(shù)個"提及的成分或步驟。因此，本文所用的"抗體"意味著"至少第一個抗體"?？尚械南拗坪蛥?shù)的組合，如任何單一藥劑的用量，將是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明了解的。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是包含本發(fā)明的至少一種抗CXCR4抗體、或其抗原結(jié)合片段的組合物。
包含編碼本文中定義的本發(fā)明的抗體或其部分或其片段的核苷酸序列的核酸分子、或與其大體同源的核酸分子形成于本發(fā)明的其它方面。優(yōu)選的核酸分子包含這樣的序列，其編碼在SEQ ID NO :35(其優(yōu)選由SEQ ID NO :34編碼)、SEQ NO ID :46(其優(yōu)選由SEQ ID N0:45 編碼))、SEQ ID NO :57 (其優(yōu)選由 SEQ ID N0:56 編碼)、SEQ ID NO :68(其優(yōu)選由SEQ ID N0:67編碼)或SEQ ID NO : 101 (其優(yōu)選由SEQ ID NO :100編碼)中列出的氨基酸序列。其它優(yōu)選的核酸分子包含編碼重鏈可變區(qū)(VH)的序列，所述重鏈可變區(qū)(VH)具有 SEQ ID NO :69、71、73或75的氨基酸序列(其優(yōu)選由SEQ ID NO :77、79、81或者83編碼)， 和/(或)包含編碼輕鏈可變區(qū)(VL)的序列，所述輕鏈可變區(qū)(VL)具 有SEQ ID NO :70、72、 74、76或103的氨基酸序列(其優(yōu)選由SEQ ID NO :78、80、82、84或者105編碼)。更優(yōu)選的是編碼以下組合的核酸SEQ ID NO :69和70 ;或SEQ ID NO 71和72 ;或SEQ ID NO 73 和74 ;或SEQ ID NO 75和76 ;或SEQ ID NO 69和103。還優(yōu)選的核酸分子包含以下組合 SEQ ID NO 77 和 78 ;或 SEQ ID NO 79 和 80 ;或 SEQ ID NO 81 和 82 ;或 SEQ ID NO 83 和 84 ;或 SEQ ID NO 77 和 105。
其它優(yōu)選的核酸分子包含編碼本發(fā)明抗體的IgG形式(例如實施例4中所述那些)、或鼠嵌合形式的序列。
如上文所述，本發(fā)明所涵蓋的其它核酸分子是編碼本發(fā)明的人抗體的部分或片段的那些，例如，編碼抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的那些(例如，編碼SEQ ID N0:69、71、73或75 的那些，例如分別為SEQ ID NO :77、79、81或83)或編碼抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)(例如，那些編碼 SEQ ID NO :70、72、74、76 或 103 的那些，例如分別為 SEQ ID NO :78、80、82、84 或 105)。 其它優(yōu)選的核酸分子為編碼本發(fā)明的抗體的重鏈的那些(例如，編碼SEQ ID NO :108,112, 116或120的那些，例如分別為SEQ ID NO :106、110、114或118)或編碼抗體的輕鏈的那些 (例如，編碼 SEQ ID NO :109、113、117、121 或 125 的那些，分別為 SEQ ID NO :107、111、115、 119 或 123)。
因此，本文定義的本發(fā)明的抗體的片段、或與其大體同源的序列、或者包含編碼此類片段的序列的核酸分子形成本發(fā)明的另一個方面。
有利地，當(dāng)呈IgG形式時，本發(fā)明的抗體有較高的CXCR4結(jié)合親和力，即其Kd為I X IO-8M或I X IO-9M或更少。重要的是，具有此類親和力的抗體處于已證明對治療有用的確定范疇內(nèi)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可與人CXCR4和猴CXCR4結(jié)合。例如，抗體 C-9P21、C1I24、D1K21、9N10和B-1 M 22都有具有此能力。物種之間、特別是人類和通常用作臨床前動物模型的物種之間的此類交叉反應(yīng)性可能是優(yōu)點，因為它允許從臨床前研究到臨床使用的更有效變換。例如，具有與所用的具體動物模型中存在的天然CXCR4交叉反應(yīng)的抗體意味著在此模型中的結(jié)果更能反映人類患者的情況，從而允許更加準確評估例如待投入劑量和識別任何潛在的相關(guān)或可疑的副作用的增加的可能性。如果抗體對猴和人 CXCR4具有類似的親和力則情況尤其如此。
例如，本發(fā)明抗體的結(jié)合人CXCR4和猴CXCR4的能力意味著該抗體可以在臨床前毒性研究中測試，以評估治療的不良副作用以及發(fā)現(xiàn)合適的耐受劑量。
此外，結(jié)合人CXCR4和小鼠CXCR4的能力意味著本發(fā)明的這種抗體在小鼠模型 (例如，使用免疫活性小鼠的小鼠同系基因模型)中的結(jié)果，有更大可能代表此抗體在人類受試者中的活性。其原因是可與人CXCR4結(jié)合但不與小鼠CXCR4結(jié)合的抗體將與由小鼠模型內(nèi)的人腫瘤細胞表達的CXCR4結(jié)合但不能與內(nèi)源性鼠CXCR4結(jié)合。這當(dāng)然不同于人類患者的狀況，在后者中可能存在腫瘤表達的CXCR4和內(nèi)源性CXCR4。
這種狀況的潛在缺點在于，與人CXCR4結(jié)合但不與小鼠CXCR4結(jié)合或以明顯更低親和力與小鼠CXCR4結(jié)合的抗體可能在免疫缺陷小鼠(例如裸小鼠或SCID小鼠)中的人腫瘤異種移植模型中表現(xiàn)良好，但這可能并未由其中存在更多CXCR4的人類系統(tǒng)O中的類似表現(xiàn)所反映。換句話說，在具有可與人CXCR4結(jié)合但不能與小鼠CXCR4結(jié)合的抗體的小鼠異種移植模型中觀察到的抗腫瘤效應(yīng)可能看上去比臨床實際情況好。相比之下，當(dāng)使用可以與人和小鼠CXCR4結(jié)合的抗體時，該抗體將與小鼠模型系統(tǒng)內(nèi)CXCR4的所有形式結(jié)合并且它可能要更能代表抗體被放置入人體的情況。如果抗體對小鼠和人CXCR4具有類似親和力則尤其如此。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體以類似親和力與人和猴CXCR4結(jié)合、或與人和小鼠CXCR4結(jié)合、或與人 和猴和小鼠CXCR4結(jié)合。
所謂"類似親和力"也意味著抗體對人CXCR4和對一個或多個其它所關(guān)注物種 (例如猴或小鼠)的結(jié)合親和力是相當(dāng)?shù)模绮町惒怀^20倍。更優(yōu)選地，結(jié)合親和力之間的差異小于15倍，更優(yōu)選的是小于10倍，更加優(yōu)選的是少于5、4、3或2倍。結(jié)合親和力的比較可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行。對于細胞表面配體例如CXCR4，流式細胞分析方法例如FACS提供一種便捷的比較方法，其中結(jié)合曲線和(例如)中位值可以在相同實驗中比較。實施例5描述一種適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> 然而，在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體可能不與猴CXCR4結(jié)合和/或它們可能不與小鼠CXCR4結(jié)合。
在以下根據(jù)本發(fā)明的組合物、免疫軛合物、藥物、組合、混合藥劑、試劑盒、第一和第二個醫(yī)療用途和所有方法的描述中，除非另有明確說明或從科學(xué)術(shù)語中明確表明，否則術(shù)語"抗體"和"單克隆抗體"或抗原結(jié)合區(qū)或其片段是指一系列的抗CXCR4抗體以及特異性 C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21 和 9N10 抗體。
如本文所用，術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"泛指任何組成人類抗原結(jié)合域的免疫結(jié)合試劑或分子，其包括多克隆和單克隆抗體。根據(jù)重鏈中的恒定域的類型，所有抗體被指定為五個主要類別之一 IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且本發(fā)明的抗體可能是這些類別中的任何一個。其中的幾個進一步分為亞類或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等等。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞單元結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。
一般來說，當(dāng)本發(fā)明使用整個抗體而不是抗原結(jié)合區(qū)域時，IgG和/或IgM是優(yōu)選地，因為它們是生理狀況中最常見的抗體并且因為它們最容易在實驗室設(shè)置中制備。特別優(yōu)選的是IgGl抗體。
哺乳動物抗體的"輕鏈"，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列和其可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)中的一些氨基酸，被指定為兩個完全不同類型之一 K (kappa)和λ (lambda)。本發(fā)明的抗體中對K或λ輕鏈恒定區(qū)的使用并無優(yōu)選。
如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，術(shù)語"抗體"包括的免疫結(jié)合試劑擴展到所有抗體和其抗原結(jié)合片段，包括整個抗體、二聚、三聚和多聚抗體；雙特異性抗體；嵌合抗體； 重組和工程抗體，和其片段。
術(shù)語"抗體"因此用于指任何具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體類分子，并且該術(shù)語包括組成抗原結(jié)合域的抗體片段，例如Fab’，F(xiàn)ab, F (ab ' )2,單域抗體(DAB), TandAbs 二聚體、Fv, scFv (單鏈 Fv), dsFv, ds-scFv, Fd,線性抗體,微型抗體(minibodies), 二價抗體 (diabodies)，雙特異性抗體片段，二抗體(bibody)，三抗體(tribody) (scFv-Fab融合， 分別為雙特異性或三特異性)；sc_ 二價抗體(sc-diabody) ； κ ( λ )抗體(kappa(Iamda) bodies) (scFv-CL融合)；雙特異性T細胞銜接器(Engager(BiTE)) (scFv串聯(lián)以吸引T細胞)；雙可變區(qū)(DVD)-1g(雙特異性格式)；小的免疫蛋白(SIP)(—類微型抗體)；SMIP(“小模塊化免疫藥物”scFV-Fc 二聚體；DART (雙鏈穩(wěn)定二價抗體"雙親和力再靶向")；包含一個或多個CDR的小抗體擬似物等等。
制備和使用各種基于抗體的構(gòu)造和碎片的技術(shù)在本領(lǐng)域中技術(shù)是眾所周知的 (見Kabat et al，1991，其特別以引用方式引入本文)。具體而言，二價抗體在EP404，097 和TO 93/11161中進一步描述，而線性抗體則在Zapata et al (1995)中進一步描述。
抗體可以使用常規(guī)技術(shù)片段化。例如，可以通過胃蛋白酶處理抗體生成F(ab' )2 片段。由此產(chǎn)生的F(ab' )2片段可以被處理來降低二硫鍵從而生產(chǎn)Fab'的碎片。木瓜蛋白酶消化可導(dǎo)致 fab 片段的形成。Fab, Fab'和 F (ab' )，scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, 二聚體，微型抗體，二價抗體，雙特異性抗體片段和其它片段也可以由重組技術(shù)合成或可以化學(xué)合成。生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)在該領(lǐng)域是被眾所周知和描述的。例如，Beckman et al. ,2006 ；Holliger&Hudson, 2005 ；Le Gall et al. ,2004；Reff&Heard, 2001 ；Reiter et al. , 1996 ；and Young et al. , 1995中的每一個都進一步描述并使有效抗體片段的生產(chǎn)成為可能。
抗體或抗體片段可以天然生成或可全部或部分合成生產(chǎn)。因此抗體可能來自任何適當(dāng)?shù)膩碓矗缰亟M來源，和/或在轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)，或在使用IgY技術(shù)的雞蛋中生產(chǎn)。因此，抗體分子可以在體外或體內(nèi)生產(chǎn)。
優(yōu)選地，抗體或抗體片段包括抗體輕鏈可變區(qū)(')(包括三個⑶R域)和一個抗體重鏈可變區(qū)(Vh)(包括三個⑶R域)。所述VL和VH —般形成抗原結(jié)合位點。
" Fv"片段是包含完整的抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。這個區(qū)域具有緊密非共價結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的二聚體。在這個構(gòu)象中每一個可變結(jié)構(gòu)域的三個高可變區(qū)(CDR)相互作用從而確立Vh-'二聚體表面的抗原結(jié)合位點。綜上所述，這六個高變區(qū)(CDR)賦予抗原與抗體結(jié)合的特異性。
然而,本領(lǐng)域清楚地記錄輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的三個⑶R和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的三個 CDR的存在不是抗原結(jié)合所必需的。因此，小于上述經(jīng)典抗體片段的結(jié)構(gòu)已知是有效的。
例如，胳馬它科抗體(Hamers-Castermanet al. , 1993 ；Arbabi Ghahroudi et al.， 1997)有廣泛的抗原結(jié)合能力但不結(jié)合輕鏈。此外，不含僅VH結(jié)構(gòu)域(Ward et al.，1989 ； Davies and Riechmann, 1995)或僅 VL 區(qū)(van den Beucken et al. , 2001)的單結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)果表明這些結(jié)構(gòu)域能以可接受的高親和力結(jié)合抗原。因此，三個CDR可以有效地結(jié)合抗原。
亦知，單個⑶R或兩個⑶R可以有效地結(jié)合抗原。第一個例子是，單個⑶R可以插入外源蛋白并賦予外源蛋白抗原結(jié)合能力，例如插入外源蛋白(如，GFP)的VH CDR3區(qū)，賦予外源蛋白抗原結(jié)合能力(Kiss et al. , 2006 ；Nicaise et al. , 2004)
進一步已知的，兩個⑶R可以有效地結(jié)合抗原，并且甚至賦予比父本抗體更優(yōu)越的性能。例如，(Qiu et al.，2007)已經(jīng)表明來自父本抗體(VH CDRl和VL CDR3區(qū))的兩個CDR保留父本分子的抗原識別屬性，但擁有穿透腫瘤的卓越能力。通過將這些CDR與適當(dāng)?shù)逆溄有蛄?例如，來自VH FR2)聯(lián)合以用類似天然父本抗體的方式來定向這些⑶R，這產(chǎn)生更好的抗原識別。因此，本領(lǐng)域已知的是有可能構(gòu)建這樣的抗原結(jié)合抗體擬似物，其包含兩個CDR結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選一個來自VH結(jié)構(gòu)域且一個來自VL結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選兩個CDR結(jié)構(gòu)域中的一個為⑶R3)，所述⑶R結(jié)構(gòu)域通過適合的框架區(qū)定向以保持父本抗體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)構(gòu)象。
因此，雖然本發(fā)明的優(yōu)選抗體可能包含六個⑶R區(qū)(三個來自輕鏈且三個來自重鏈)，但擁有少于六個CDR區(qū) 和少至一或兩個CDR區(qū)的抗體也被包括在本發(fā)明中。此外，還涵蓋具有僅來自重鏈或輕鏈的CDR的抗體。
結(jié)合到CXCR4的本發(fā)明優(yōu)選抗體包含至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含
(a)可變重(VH)⑶Rl，其具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列或與其大體同源的序列，
(b)VH CDR2，其具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列或與其大體同源的序列，和
(C)VH CDR3，其具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列或與其大體同源的序列；或
(d)可變重(VH)⑶Rl，其具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列或與其大體同源的序列，
(e)VH CDR2，其具有SEQ ID NO :8的氨基酸序列或與其大體同源的序列，和
(f)VH CDR3，其具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列或與其大體同源的序列；或
(g)可變重(VH) CDRl，其具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列或與其大體同源序列，
(h)VH⑶R2，其具有SEQ ID NO 14的氨基酸序列或與其大體同源的序列，和
(i)VH⑶R3，其具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列或與其大體同源的序列；或
(j)可變重(VH)⑶R1，其具有SEQ ID NO 19的氨基酸序列或與其大體同源的序列，
(k)VH⑶R2，其具有SEQ ID NO 20的氨基酸序列或與其大體同源的序列，和
(I)VH⑶R3，其具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列或與其大體同源的序列；或
用于與指定重鏈⑶R區(qū)聯(lián)合使用的優(yōu)選輕鏈⑶R區(qū)在本文中另外描述。然而，還涵蓋用于與指定重鏈CDR區(qū)聯(lián)合使用的包含三個CDR的其它輕鏈可變區(qū)?？梢耘c本發(fā)明的重鏈可變區(qū)組合使用并可以生成結(jié)合CXCR4的抗體的適合的輕鏈可變區(qū)可以容易地被所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員識別。
例如，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)可以與單個輕鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的所有組成成分組合并且所得抗體用于測試對CXCR4的結(jié)合?？梢灶A(yù)期的是本發(fā)明的重鏈可變區(qū)與不同輕鏈可變區(qū)的合理數(shù)量的此類組合將會保留結(jié)合CXCR4的能力。的確，抗體9N10擁有與 C-9P21相同的重鏈可變區(qū)但具有不同的輕鏈可變區(qū)。
類似的方法可以被用來識別替代性重鏈可變區(qū)，后者用于與本發(fā)明優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)的組合使用。
在某些實施方案中，抗體或抗體片段包括所有或部分重鏈恒定區(qū)，如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)或其部分。此外，抗體或抗體片段可以包含所有或部分κ輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)，或它們的部分。這些恒定區(qū)的全部或者部分可天然生成或為全部或部分合成的。這些恒定區(qū)的適合的序列是眾所周知的并且在該領(lǐng)域中記錄在案。當(dāng)輕鏈和重鏈恒定區(qū)的完整補體被包括在本發(fā)明的抗體中時，這種抗體在此通常被稱為"完整長度"抗體或"整個"抗體。
包含F(xiàn)e區(qū)域的抗體是某些用途、特別是體內(nèi)治療用途優(yōu)選的，其中Fe區(qū)域調(diào)節(jié)效應(yīng)子功能如ADCC。合適的Fe區(qū)為該領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知并因此可以進行選擇。
此處和氨基酸或者核酸序列聯(lián)合使用的術(shù)語"大體同源"包括相對氨基酸或者核酸序列具有至少70 %或75 %、優(yōu)選至少80 %、且甚至更優(yōu)選至少85 %、90 %、95 %、96 %、 97%、98%或99%的序列一致性。因此本發(fā)明的大體同源序列包括對本發(fā)明的序列的單 個或多個堿基或氨基酸變換(添加、替換、插入或刪除)。在氨基酸水平上，在構(gòu)成本發(fā)明的一個或多個框架區(qū)和/或一個或多個CDR中，優(yōu)選大體同源序列包含僅至多I個、2個、3個、 4個或5個、優(yōu)選至多I個、2個或3個、更優(yōu)選至多I個或2個變換的氨基酸。所述變換可以是保守或非保守的氨基酸。優(yōu)選地，所述變換是保守氨基酸的取代。
大體同源核酸序列還包括雜交到所公開的核酸序列(或其互補序列)的核苷酸序列，例如所述核苷酸序列在至少適度嚴格雜交條件下，雜交到編碼一個或多個本發(fā)明的輕鏈或者重鏈CDR的核酸序列，本發(fā)明的輕或者重鏈可變區(qū)，或者本發(fā)明的抗體(或雜交到其互補序列)。
術(shù)語"大體同源"還包括用大體相同的方式和本發(fā)明的蛋白或者核酸分子執(zhí)行大體相同的功能的本發(fā)明氨基酸和核酸序列的改型或化學(xué)等價物。例如，任何大體同源的抗體(或?qū)λM行編碼的大體同源核酸)應(yīng)當(dāng)保留如上文所述的結(jié)合CXCR4的能力。優(yōu)選的是，任何大體同源抗體應(yīng)當(dāng)保留一個或多個抗體的功能性能力，如本文另外所定義的。優(yōu)選地，任何大體同源的抗體應(yīng)保留特異性結(jié)合到該抗體所識別的CXCR4的相同抗原表位， 例如，如本文所述由本發(fā)明的CDR或者VH和VL識別的相同抗原表位。與同一個抗原表位/ 抗原的結(jié)合可以容易由眾所周知的且本領(lǐng)域所述的方法測試，例如，使用結(jié)合試驗，例如競爭試驗。其它功能特性的保留也可容易通過眾所周知且本該領(lǐng)域所述的方法測試。對本發(fā)明的抗體來說，特別優(yōu)選的是保留拮抗性和/或非誘導(dǎo)細胞凋亡性。
因此，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，結(jié)合試驗可以用于測試“大體同源”抗體是否擁有和本發(fā)明的抗體或者抗體片段相同的結(jié)合特異性，例如，結(jié)合測試如流式細胞計量術(shù)、 ELISA試驗或BIAcore試驗測驗可以容易用于確定這種"大體同源"的抗體是否可以結(jié)合到CXCR4。流式細胞計量術(shù)是用于分析與細胞表面受體如CXCR4的結(jié)合最簡便試驗。如上文所述，競爭結(jié)合試驗可以用于測試"大體同源"抗體是否保留特異性結(jié)合到由本發(fā)明的抗體所識別的相同CXCR4抗原表位的能力。上文所述的方法僅是合適競爭檢測試驗的一個例子。技術(shù)人員會熟知其它適當(dāng)?shù)姆椒ê推渥冃汀?br> 本發(fā)明的蛋白質(zhì)的大體同源序列包括(但不限于)保守氨基酸取代，或例如不影響抗體的VH域、VL域或CDR域的變換，例如包括使用不同的連接序列的scFv抗體或添加了標(biāo)記序列或其它組件但不影響抗原結(jié)合的抗體，將一種類型或格式的抗體分子或片段轉(zhuǎn)換為另一種類型或格式的抗體分子或片段(例如從Fab轉(zhuǎn)換成scFv，或反之)的變換，或從抗體分子到具體類別或亞類的抗體分子的轉(zhuǎn)換(例如，從抗體分子到IgG或其亞類如IgGl 或IgG3的轉(zhuǎn)換)。
如本文所用，"保守氨基酸取代"是將一個氨基酸殘基被替換為另一個具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在所屬領(lǐng)域中已有定義，包括堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天門冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、 β支化側(cè)鏈(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
同源性可由任何簡便方法進行評估。然而，為了確定序列之間的同源程度，進行多次序匹對比的計算機程序是有用的 ，例如Clustal ff(Thompson et al. , 1994)。如果需要， 則將Clustal W算法可與BLOSUM 62計分矩陣(Henikoff and Henikoff，1992)以及空位開放罰10分和空位延伸罰O.1分一起使用，從而在兩個序列中獲得最高位匹配，其中一個序列的至少50%的總長度被用于對比。其它可用于對比序列的方法是Needleman和Wunsch 方法(1970),經(jīng)Smith和Waterman (1981)修訂,從而在兩個序列直接獲得最高位匹配并且確定兩個序列之間相同的氨基酸的數(shù)目。計算兩個氨基酸序列之間的百分比一致性的其它方法在所屬領(lǐng)域內(nèi)被普遍承認并且包括(例如)被Carillo和Lipton(1988)描述的那些和在 Computational Molecular Biology, Lesk, e. d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing Informatics and Genomics Projects 中描述那些。
通常情況下，將采用計算機程序來用于這類計算。程序比較并對比序列，如 ALIGN (Myers and Miller, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, 1988 ；Pearson, 1990)和有間隙 BLAST (Altschul et al. , 1997), BLASTP，BLASTN，或 GCG (Devereux et al.，1984)對此用途也很有用。此外，歐洲生物信息學(xué)研究所的Deli服務(wù)器提供基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的對比(Holm, 1993 ；1995 ；1998)。
通過提供一個參考點，可以使用ALIGN程序以默認參數(shù)(例如可得自在互連網(wǎng) ± GENESTREAM 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，IGH, Montpellier, France)，測定具有 70%,75%,80%,85%, 90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性和一致性等的本發(fā)明序列。
所謂"至少適度嚴格雜交條件"是指促進溶液中兩個互補核酸分子之間的選擇性雜交的所選條件。雜交可能會發(fā)生于全部或部分的核酸序列分子。雜交部分通常至少為15(例如，20、25、30、40或50)個核苷酸長。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會認識到核酸雙連體或雜交體的穩(wěn)定性由Tm確定，后者在含鈉緩沖液中是有關(guān)鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(Tm = 81.5。。-16. 6 (LoglO [Na+]) +0. 41 (% (G+C) -600/1)，或類似的公式)。因此，決定雜交穩(wěn)定性的洗滌條件參數(shù)是鈉離子濃度和溫度。為了識別與已知的核酸分子類似但不完全相同的分子，1%的錯配可以被假設(shè)為導(dǎo)致Tm下降約1°C的跌幅。例如，如果發(fā)現(xiàn)核酸分子具有 > 95%的一致性，則最終洗滌溫度將下降約5°C?；谶@些考慮，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易選擇適當(dāng)?shù)碾s交技術(shù)條件。在優(yōu)選的實施方案中，選擇嚴格雜交條件。舉例來說， 下列條件可能被用來實現(xiàn)嚴格雜交基于上述公式，在Tm-5°C下以5x氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)/5xDenhardt’ s 溶液 /1. 0% SDS 雜交，然后在 60°C下洗滌 O. 2x SSC/0. 1% SDS。適度嚴格雜交條件包括在42°C下于3x SSC中的洗滌步驟。進一步舉例，"雜交"的序列是在非嚴格條件(例如在室溫下的6x SSC，50%甲酰胺)下結(jié)合(雜交)的序列，和在不嚴格的情況(例如2xSSC，室溫，更優(yōu)選是2x SSC, 42°C )或更嚴格的條件(如2XSSC，65°C ) (其中SSC = O. 15MNaCl，0. 015M檸檬酸鈉，pH 7. 2)下洗滌的序列?！?br> 然而，可以理解的，等效的嚴格條件可以通過使用替代性緩沖液、鹽和溫度實現(xiàn)。關(guān)于雜交條件額外指導(dǎo)意見可見于Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. ,1989,6. 3. 1-6. 3. 6 和 Sambrook et al. , Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3。
—般來說，優(yōu)選的是高度嚴格條件下雜交的序列，如若非因為密碼簡并，序列將在高度嚴格條件下雜交。
在其它優(yōu)選的實施方案中，提供與原始的抗CXCR4抗體相比具有增強或優(yōu)良的性質(zhì)的第二代抗體，如C-9P21，B-1M22, C-1I24，D-1K21或9N10。例如，第二代抗體可能有對 CXCR4的更強結(jié)合親和力，優(yōu)良交叉反應(yīng)性分布，誘使更低水平的CXCR4+細胞凋亡，優(yōu)良的對CXCR4+細胞(特別是腫瘤細胞)的靶向能力，例如，改善的抑制腫瘤細胞生長的能力，改善的拮抗能力，例如改善的阻止由于SDF-1結(jié)合到CXCR4引起的Ca通量，改善的對配體誘導(dǎo)的遷移的阻斷，或者改善的誘導(dǎo)ADCC或CDC的能力，或者改善的本文另外討論的病癥的治療。
識別有效第二代抗體的比較是容易進行和量化的，例如，使用一個或多個本文詳細描述或所屬領(lǐng)域描述的各種測試方法。本發(fā)明包括這樣的第二代抗體，其與本發(fā)明的抗-CXCR4抗體(如C-9P21，B-1M22，C-1I24，D-1K21抗體)比較，具有有增強的至少約2 倍、5倍、10倍、20倍、且優(yōu)選至少約50倍的生物學(xué)性質(zhì)或活性。特別優(yōu)選的第二代抗體包含與VL鏈(或替代性VL⑶R)組合的本發(fā)明抗體的VH鏈、或其VH⑶R。
本發(fā)明的抗體、結(jié)合蛋白和核酸分子一般是“分離的”或者“純化的”分子，只要它們不同于在人或動物體內(nèi)或源自人或動物體的組織樣品內(nèi)原位存在的任何此類成分。然而，這些序列與從人或動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的序列對應(yīng)或大體同源。因此，當(dāng)本文結(jié)合核酸分子或序列和蛋白或多肽(例如，抗體)使用時，術(shù)語“分離的”或“純化的”是指從天然環(huán)境中分離、純化、或大體不存在于其天然環(huán)境(例如，分離自或純化自人或動物體(如果它們確實天然產(chǎn)生))的分子，或者是指通過技術(shù)工藝生產(chǎn)的分子，即，包括重組子和合成生產(chǎn)的分子。
因此，當(dāng)與核酸分子聯(lián)合使用時，這些術(shù)語可能是指大體不含與其天然結(jié)合的材料如其它核酸/基因或多肽的核酸。此術(shù)語也可能指大體不含細胞材料或培養(yǎng)基(當(dāng)使用 DNA重組技術(shù)生產(chǎn)時)，或大體不含化學(xué)前體，或其它化學(xué)成分(當(dāng)化學(xué)合成時)的核酸。 分離或純化的核酸也可能大體不含由其衍生該核酸的天然位于該核酸側(cè)翼的序列(即，位于核酸5'和3'端的序列)，或者例如通過基因工程制使其位于該核酸的序列側(cè)翼的序列 (例如，無治療價值的標(biāo)記序列或者其它序列)。
由此，當(dāng)和蛋白或多肽分子例如輕鏈⑶Rl、2和3，重鏈⑶Rl、2和3，輕鏈可變區(qū)， 重鏈可變區(qū)，以及本發(fā)明的結(jié)合蛋白或抗體(包括全長抗體)聯(lián)合使用時，術(shù)語“分離的”或者“純化的”一般指一種蛋白，其大體不含來自其衍生來源的細胞物質(zhì)或其它蛋白。在某些實施方案，特別是在所述蛋白將施用至人或動物的情況下，這種分離或純化的蛋白大體不含培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn))，或者化學(xué)前體或其它化學(xué)成分(當(dāng)被化學(xué)合成)。這種分離或純化的蛋白也可能不含側(cè)翼序列，例如上文針對分離核酸分子描述那些。
如文本所用，術(shù)語“核酸序列”或者“核酸分子”指由天然形成的堿基、糖和糖間 (主鏈)鍵組成的核酸或者核苷酸單體的序列。此術(shù)語也包括含有非天然生成的單體的經(jīng)修飾或經(jīng)取代序列或其部分。本發(fā)明的核酸序列可能是脫氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列并且可以包括天然生成的堿基，所述堿基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該序列也可能含有修飾堿基。這些修飾堿基的例子包括氮雜和脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黃嘌呤和次黃嘌呤。該核酸分子可能是雙鏈或者單鏈。 該核酸分子可能是完全或者部分合成的或者重組的。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體，更優(yōu)選是完整的人抗體。在這方面，人抗體在人類治療使用中往往有至少三個潛在的優(yōu)勢。第一，人免疫系統(tǒng)不會將此抗體識別為外來物。第二，在人體循環(huán)中的半衰期將會類似于天然產(chǎn)生的人抗體，允許給于較小和較低頻率的劑量。第三，因為效應(yīng)子部分是人，所以在涉及殺死靶標(biāo)細胞的作用的實施方案中，它將更好地和人免疫系統(tǒng)的其它部分相互作用，例如通過補 體依賴細胞毒性(CDC) 或抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)來更高效地摧毀靶標(biāo)細胞。
然而，雖然一般認為人抗體顯示這些優(yōu)勢，但已知的是具有足夠親和力和適合的功能特性來使其成為成功的人類治療的候選者的人抗體的開發(fā)絕不簡單。因此所屬領(lǐng)域仍缺乏用于人類的安全和有效治療的抗-CXCR4，并且對此類藥劑的發(fā)展構(gòu)成挑戰(zhàn)。
如文本中與抗體分子和結(jié)合蛋白聯(lián)合所用，術(shù)語"人"首先指分離或衍生自人類所有組成成分或衍生自或?qū)?yīng)于在人或人類所有組成成分(如人類生殖或體細胞)中發(fā)現(xiàn)的序列的、具有可變區(qū)(例如VH、'、CDR或FR)和任選恒定抗體區(qū)的抗體和結(jié)合蛋白。本發(fā)明的C-9P21、B-1M22、C-1124、D-1K21和9N10抗體是這種人抗體分子的例子，其中所述可變區(qū)已從人類所有組成成分分離。
本發(fā)明的"人"抗體和結(jié)合蛋白的還包括不通過人序列(例如，通過隨機突變誘導(dǎo)的突變或體外定點突變，例如通過體外克隆或PCR誘導(dǎo)的突變)編碼的氨基酸殘基。這種突變的具體例子是這樣的突變，其涉及在抗體或結(jié)合蛋白的少量殘基中的保守取代或其它突變，例如，在抗體或結(jié)合蛋白的制作5個、4個、3個、2個或I個殘基中，優(yōu)選在構(gòu)成抗體或結(jié)合蛋白的一個或多個⑶R的至多5個、4個、3個、2個或I個殘基中。這種"人"抗體的某些例子包括已經(jīng)受標(biāo)準修飾技術(shù)以減少潛在免疫原性位點數(shù)量的抗體和可變區(qū)。
因此，本發(fā)明的"人"抗體包括衍生自并涉及在人類中發(fā)現(xiàn)的序列的序列，但它們可能不天然存在于人體內(nèi)的抗體胚系所有組成成分中。此外，本發(fā)明的人抗體和結(jié)合蛋白包括含有從人序列或與其大體同源的序列中識別的人共有序列的蛋白。
此外，本發(fā)明的人抗體和結(jié)合蛋白不限于本身在人抗體分子組合中發(fā)現(xiàn)的VH、\、 CDR或FR的組合。因此，本發(fā)明的人抗體和結(jié)合蛋白可以包括或?qū)?yīng)于不一定天然存在于人類中的這種區(qū)域的組合。
在優(yōu)選的實施方案中，人抗體將會是完整人抗體。如本文所用，"完整人"抗體是包含如上文定義的"人"可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDR而沒有實質(zhì)非人抗體序列或無任何非人抗體序列的抗體。例如，包含人類可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDR而"沒有實質(zhì)非人抗體序列" 的抗體是這樣的抗體、結(jié)構(gòu)域和/或⑶R，其中僅至多5個、4個、3個、2個或I個氨基酸是不由人抗體序列編碼的氨基酸。因此，"完整人"抗體而有別于"人源化"抗體，后者基于實質(zhì)非人類可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，例如小鼠可變區(qū)，其中某些氨基酸已經(jīng)被更改從而更好地與通常存在于人抗體中的氨基酸對應(yīng)。
本發(fā)明的"完整人"抗體可以是沒有有任何其它實質(zhì)性的抗體序列(例如單鏈抗體)的人類可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDR。或者，本發(fā)明的"完整人"抗體可能是與一個或多個人抗體恒定區(qū)整合或操作性連接的人類可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDR。某些優(yōu)選的完整人抗體是具有IgG恒定區(qū)的完整補體的IgG抗體。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的"人"抗體將是部分人嵌 合抗體。此處使用的" 部分人嵌合"抗體是包含操作性連接到、或接枝到非人物種(例如大鼠或小鼠)的恒定區(qū)的"人類"可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDR的抗體。此部分人嵌合抗體可以用于例如臨床前研究， 其中所述恒定區(qū)將優(yōu)選屬于用于臨床前測試的相同物種。這些部分人嵌合抗體也可用于例如體外診斷，其中非人物種的恒定區(qū)可提供抗體檢測的額外選擇。
如本文所用，術(shù)語"片斷"指具有生物相關(guān)性的片斷，例如，有利于抗原結(jié)合(例如，形成抗原結(jié)合位點的一部分)，和/或有利于抑制或減少CXCR4抗原功能的片斷。某些優(yōu)選的片段包含本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)(Vh結(jié)構(gòu)域)和/或輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域)。 其它優(yōu)選的片段包含本發(fā)明的抗體的一個或多個重鏈CDR (或本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域)，或本發(fā)明的抗體的一個或多個輕鏈CDR(或本發(fā)明的\結(jié)構(gòu)域)。某些優(yōu)選片段的長度至少為5 個氨基酸并包括至少一個⑶R區(qū)，優(yōu)選的是⑶R3區(qū)，更優(yōu)選的是重鏈⑶R3區(qū)。
在其中本發(fā)明的抗體包含任何已定義序列的片段(例如包含SEQ ID NO =35,46, 57，68或101的片斷)的實施方案中，例如，所述抗體是包含本發(fā)明的V1^P /或' 區(qū)的抗體，或是包含一個或多個本發(fā)明CDR的抗體或結(jié)合蛋白，然后這些區(qū)域/結(jié)構(gòu)域通常可以在抗體或結(jié)合蛋白內(nèi)被分隔以便每個區(qū)域/結(jié)構(gòu)域可以執(zhí)行其生物功能并且以便保留對抗原結(jié)合的有利性。因此，Vh和\結(jié)構(gòu)域優(yōu)選通過適合的骨架序列/鏈接序列分隔，并且CDR 優(yōu)選通過適合的框架區(qū)(例如在天然生成的抗體中發(fā)現(xiàn)的或有效工程抗體中發(fā)現(xiàn)那些)分隔。因此，本發(fā)明的Vh、'和各個CDR序列優(yōu)選被提供在或摻入適當(dāng)?shù)目蚣芑蚬羌芤詫崿F(xiàn)抗原結(jié)合。這種框架序列或區(qū)域可能對應(yīng)于天然產(chǎn)生的框架區(qū)(在適當(dāng)?shù)那闆r下為FR1、FR2、 FR3和FR4)以形成適當(dāng)?shù)墓羌?，或可能對?yīng)于共有的框架區(qū)域(例如通過比較各種天然產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)域來識別的)?；蛘?，可以使用非抗體骨架或框架，例如，T細胞受體框架。
可以被用作框架區(qū)的適當(dāng)序列是眾所周知且被所屬領(lǐng)域記載的，并且它們中的任何一個都可被使用。用于框架的優(yōu)選序列為構(gòu)成本發(fā)明的Vh和/或\結(jié)構(gòu)域的一個或多個(即一個、兩個、三個或四個)框架區(qū)，即，公開于表1、2、3、4或5中的一個或多個框架區(qū)，或與其大體同源的框架區(qū)，以及特別是那些允許維持抗原特異性的框架區(qū)，例如導(dǎo)致所述抗體大體相同或3D結(jié)構(gòu)相同的框架區(qū)。
在某些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的抗體中發(fā)現(xiàn)所有四個可變輕鏈(SEQ ID NO :30、31、32和33)和/或可變重鏈(SEQ ID NO :25、26、27和28)，在適當(dāng)?shù)那闆r下為SEQ ID N035的FR區(qū)(同時見表I)，或者與其大體同源的FR區(qū)。
在某些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的抗體中發(fā)現(xiàn)所有四個可變輕鏈(SEQ ID NO :41、42、43和44)和/或可變重鏈(SEQ ID NO :36、37、38和39)，在適當(dāng)?shù)那闆r下為SEQ ID N046的FR區(qū)(同時見表2)，或者與其大體同源的FR區(qū)。
在某些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的抗體中發(fā)現(xiàn)所有四個可變輕鏈(SEQ ID NO: 52、53、54和55)和/或可變重鏈(SEQ ID NO : 47、48、49和50)，在適當(dāng)?shù)那闆r下為SEQ ID NO 57的FR區(qū)(也示于表3)，或者與其大體同源的FR區(qū)。
在某些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的抗體中發(fā)現(xiàn)所有四個可變輕鏈(SEQ ID NO :63，64，65和66)和/或可變重鏈(SEQ ID NO :58，59，60和61)，在適當(dāng)?shù)那闆r為SEQ ID NO 68的FR區(qū)(同時見表4)，或者與其大體同源的FR區(qū)。
在某些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的抗體中發(fā)現(xiàn)所有四個可變輕鏈(SEQ ID NO :96，97，98和33)和/或可變重鏈(SEQ ID NO : 25、26、27和28)，在適當(dāng)?shù)那闆r下為SEQ ID NO :101的FR區(qū)(也示于表5)，或者與其大體同源的FR區(qū)。
此外，雖然本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括本發(fā)明的VH、Vl或者⑶R，應(yīng)當(dāng)注意本發(fā)明的抗體還包括和與其它不屬于本發(fā)明的VH、Vl或⑶R結(jié)合的一個或多個本發(fā)明的VH、Vl或⑶R， 前提是文中列出的本發(fā)明的抗體的CXCR4結(jié)合性質(zhì)或抗CXCR4性質(zhì)仍然存在。
如本文所用，術(shù)語"重鏈互補性決定區(qū)域"("重鏈⑶R")指在抗體分子的重鏈可變區(qū)(Vh區(qū))內(nèi)的具有超強可變性的區(qū)域。重鏈可變區(qū)有三個CDR，從氨基末端到碳基末端，被稱為重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3。重鏈可變區(qū)也具有四個框架區(qū)(從氨基末端到碳基末端，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4)。這些框架區(qū)分隔CDR。
如本文所用，術(shù)語"重鏈可變區(qū)"(Vh區(qū))指的抗體分子重鏈的可變區(qū)。
如本文所用，術(shù)語"輕鏈互補性決定區(qū)域"("輕鏈CDR")指在抗體分子的輕鏈可變區(qū)('區(qū))內(nèi)的具有超強可變性的區(qū)域。輕鏈可變區(qū)有三個CDR，從氨基末端到碳基末端，被稱為輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。輕鏈可變區(qū)也有四個結(jié)構(gòu)域(從氨基末端到碳基末端，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4)。這些框架區(qū)分隔CDR。
如本文所用，術(shù)語"輕鏈可變區(qū)"(八區(qū))指抗體分子輕鏈的可變區(qū)。
應(yīng)該注意，在必要時，本文遵循Kabat命名法來定義⑶R的位置(Kabat et all991，特別以引入方式并入本文)。
所屬領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員應(yīng)了解，可以通過任何眾所周知和所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知方法來制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)與多肽，如輕和重CDR，輕和重鏈可變區(qū)，抗體，抗體片段和免疫交聯(lián)劑，但優(yōu)選使用 重組方法來制備。
編碼本發(fā)明的抗體的輕或重鏈可變區(qū)的核酸片斷可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒?例如通過克隆或合成)來衍生或制備。例如，這種序列可以通過以下方式制備，克隆例如來自人類生殖系基因的適當(dāng)序列，然后通過使用眾所周知和所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知方法對生殖系基因序列進行必要修飾以以獲得本發(fā)明的序列。替代性和更高效方法將是合成適當(dāng)?shù)妮p或重鏈可變區(qū)序列作為重疊的引物，并且使用引物擴展以獲取完整序列。然后，此完整序列可以通過與包含適當(dāng)限制性位點的引物的PCR擴增以便進一步克隆和操縱，例如克隆入合適的表達載體中。每個可變區(qū)五到七個重疊引物一般是足夠的，從而這使得該技術(shù)非常有效和精確。
一旦獲得編碼本發(fā)明的抗體的輕或重鏈可變區(qū)的核酸片斷，則可以通過標(biāo)準DNA 重組技術(shù)進一步操作，例如將可變區(qū)片斷轉(zhuǎn)化成為擁有合適的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的全長抗體分子，或成為本文另外所述的抗體片段的特定格式，如Fab、scFv片段等。通常，或作為此進一步的操作程序的一部分，編碼本發(fā)明的抗體的核酸片斷一般被摻入合適的表達載體以促進本發(fā)明的抗體的生產(chǎn)。
只要該載體與所用宿主細胞相容，則可能的表達載體包括但不限于粘粒、質(zhì)粒、或經(jīng)修飾病毒(例如，復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。表達載體"適于轉(zhuǎn)變宿主細胞"，其意義是表達載體含有本發(fā)明的核酸分子和基于用于表達的宿主細胞選擇的調(diào)控序列，后者操作性聯(lián)接到該核酸分子。操作性聯(lián)接旨在以允許核酸表達的方式將核酸聯(lián)接到調(diào)控序列。
因此，本發(fā)明涵蓋一種重組表達載體，其含有本發(fā)明的核酸分子或其片段，和用于轉(zhuǎn)錄和翻譯由本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白所必需的調(diào)控序列。
適宜的調(diào)控序列可來源于不同來源，包括細菌，真菌，病毒，哺乳動物，或昆蟲基因 (例如，見Goeddel，1990所述的調(diào)控序列)。合適的調(diào)控序列的選擇取決于按下文所述選定的宿主細胞，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易完成。這種調(diào)控序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列，包括翻譯啟動信號。此外，根據(jù)所選定的宿 主細胞和所用的載體，其它序列，例如復(fù)制起點、額外的DNA限制性位點、增強子和賦予轉(zhuǎn)錄誘發(fā)能力的序列可以被摻入表達載體中。
本發(fā)明的重組表達載體還可能包含選擇性標(biāo)記基因，其促進對用本發(fā)明的重組分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞的選擇。選擇性標(biāo)記基因的例子是編碼例如以下蛋白的基因新霉素和潮霉素(提供對特定藥物的抗藥性))、β乳糖、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲熒光素酶、或免疫球蛋白或其部分(如免疫球蛋白(優(yōu)選IgG)的Fe部分)。選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄通過選擇性標(biāo)記蛋白(如β乳糖、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶或螢火蟲熒光素酶)的濃度變化來監(jiān)測。如果選擇性標(biāo)記基因編碼賦予抗生素抗性如新霉素抗性的蛋白，則轉(zhuǎn)化的細胞可以用G418來選擇。已整合選擇性標(biāo)記基因的細胞將存活下去，同時其它細胞死亡。這使得有可能目測和測定本發(fā)明的重組表達載體的表達并且特別是確定突變體對表達和表型的效果。應(yīng)了解，選擇性標(biāo)記可以從目的核酸中引入到單獨的載體上。
重組表達載體還可含有編碼融合部分的基因，該融合部分提供了重組蛋白的增強的表達，重組蛋白的增強的穩(wěn)定性；和通過作為親和純化的配體O幫助靶標(biāo)重組蛋白的純化(例如，可以提供使純化和識別成為可能的合適的“標(biāo)簽”，如His標(biāo)簽或者myc標(biāo)簽)。例如，可以在靶標(biāo)重組蛋白中加入蛋白水解裂解位點以允許在融合蛋白純化之后從融合部分中分離重組蛋白。典型的融合表達載體包括pGEX(Amrad公司(Corp.),墨爾本,澳大利亞)、 pMal (新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs),貝弗利(Beverly),MA)和pRIT5(法瑪斯亞(Pharmacia),皮斯卡塔韋(Piscataway) ,NJ),它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、 麥芽糖E結(jié)合蛋白、或蛋白A融合入重組蛋白中。
重組表達載體可以被引入到宿主細胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細胞。術(shù)語"用…轉(zhuǎn)化"，"用…轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"旨在包括通過本領(lǐng)域已知的許多可能技術(shù)之一將核酸(例如，載體)引入細胞。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的宿主細胞”也旨在包括能夠進行糖基化的細胞，其已用本發(fā)明的重組表達載體進行了轉(zhuǎn)化。原核細胞可以通過例如電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)化用核酸來轉(zhuǎn)化。例如，可以通過常規(guī)技術(shù)(如鈣磷或氯化鈣共沉淀、 EDEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔或顯微注射)將核酸引入到哺乳動物細胞中。 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染宿主細胞的適合方法可以從Sambrook et al. , 1989和其它實驗室教科書中找到。
適宜的宿主細胞包括各種真核生物宿主細胞和原核細胞。例如,本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。其它合適的宿主細胞可在Goeddel，1990中找到。此外，本發(fā)明的蛋白可以在原核細胞如大腸桿菌(Zhang et al. , 2004)中表達。
適于實施本發(fā)明的酵母和真菌宿主細胞包括但不限于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母屬(genera Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和曲霉的各個種。用于在酵母釀酒酵母中表達的載體的例子包括pYepSecl (Baldar1. et al. , 1987)、 pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982) >pJRY88 (Schultz et al. , 1987)和 pYES2(英杰公司 (Invitrogen Corporation),圣迭戈(San Diego),加利福尼亞(CA))。轉(zhuǎn)化酵母和真菌的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟識(見Hinnen et al. , 1978 ；Ito et al. , 1983,和Cullen et al. , 1987)。
適于實施本發(fā)明的哺乳動物細胞包括但不限于C0S(例如，ATCC No. CRL1650or 1651)、BHK(例如，ATCC No. CRL 6281)、CHO(ATCC No. CCL 61)、HeLa(例如，ATCC No. CCL 2)、293(ATCC No. 1573)、NS_1 細胞、NSO (ATCCCRL-11177)和 Per. C6 (庫塞爾(Crucell), 萊頓(Leiden),荷蘭(Netherlands))。用于在哺乳動物細胞內(nèi)直接表達的合適表達載體一般包括啟動子(例如，來 自病毒材料如多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猴病毒40)以及其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。哺乳動物表達載體的例子包括PCDM8 (Seed，B.，1987)和 pMT2PC(Kaufman et al. ,1987)。
考慮到本文提供的教示，也可容易地實現(xiàn)啟動子、終止子和引入適當(dāng)類型的表達載體進入植物、鳥類和昆蟲細胞的方法。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白可以由植物細胞表達(見Sinkar等，1987,其評價發(fā)根農(nóng)桿菌載體的使用；另見Zambryski等，1984, 其描述用于植物細胞表達載體的使用，所述載體包括但不限定于PAPS2022、PAPS2023和 PAPS2034)。
適合實施本發(fā)明的昆蟲細胞包括來自家蠶(Bombyx)、粉紋夜蛾(Trichoplusia) 或灰翅夜蛾物種的細胞和細胞系。在昆蟲細胞(SF 9細胞)中的表達蛋白的桿狀病毒載體包括 pAc 系列(Smith 等，1983)和 pVL 系列(Luckow and Summers 1989)。PCT/US/02442 描述了適合表達本發(fā)明的重組蛋白的昆蟲桿狀病毒細胞表達系統(tǒng)。
或者，本發(fā)明的蛋白也可能在非人類轉(zhuǎn)基因動物如大鼠、兔、羊、豬中表達(Hammer 等· 1985 ；Palmiter et al. 1983 ；Brinster et al. 1985 ;Palmiter和Brinster 1985,以及美國專利號碼No. 4，736，866)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過使用眾所周知的蛋白化學(xué)技術(shù)例如固相合成(Merrifield(1964) ；Frische et al. (1996))的化學(xué)合成或同質(zhì)溶液中的合成 (Houbenweyl, 1987))來制備。
包含軛合至其它分子(如蛋白質(zhì))的本發(fā)明抗體和蛋白的N端或C端融合蛋白可能通過重組技術(shù)融合來制備。所得融合蛋白含有融合到所選擇的蛋白或者標(biāo)記蛋白 (marker protein),或者如本文所述的標(biāo)簽蛋白(tag protein)的本發(fā)明的抗體或蛋白。 本發(fā)明的抗體和蛋白液可能通過已知技術(shù)軛合至其它蛋白。例如,可使用如WO 90/10457 所述異雙功能含硫接頭、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫-丙酸酯)或N-琥珀酰亞胺基-5硫代乙酸酯來連接蛋白?？捎糜谥苽淙诤系鞍谆蜍椇衔锏牡鞍椎睦影毎Y(jié)合蛋白，例如免疫球蛋白，激素，生長因子，凝集素，胰島素，低密度脂蛋白，胰高血糖素，腦內(nèi)啡，轉(zhuǎn)鐵蛋白，蛙皮素，脫唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，血凝素(HA)和截短 myc ο
不論制備第一抗-CXCR4抗體的核酸節(jié)段的方式，更加適合的抗體核酸節(jié)段可容易通過標(biāo)準的分子生物學(xué)技術(shù)來制備。為了確認任何變體、突變或第二代抗-CXCR4抗體核酸節(jié)段適用于本發(fā)明，將測試核酸節(jié)段以確認對應(yīng)本發(fā)明的抗-CXCR4抗體的表達。優(yōu)選地，還測試變體、突變或第二代核酸節(jié)段在標(biāo)準條件(優(yōu)選是標(biāo)準嚴格雜交條件)下的雜交。示例性的合適雜交條件包括在約50°C下在約7%十二烷基硫酸鈉(SDS)J^O. 5M NaPO4, 約ImM EDTA中雜交，并使用約1% SDS在約42°C下洗滌。
由于各種抗體可容易地制備，本發(fā)明的治療方法可以通過向動物或患者提供至少第一核酸節(jié)段或分子來執(zhí)行，所述第一核酸節(jié)段或分子在患者中表達生物有效量的本發(fā)明第一抗-CXCR4抗體。"表達抗-CXCR4抗體的核酸節(jié)段或分子"將一般呈至少表達構(gòu)造或載體形式，并且可能呈包含在病毒或重組宿主細胞內(nèi)的表達構(gòu)造或載體形式。本發(fā)明的優(yōu)選基因治療載體將一般是例如包含于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、巨細胞病毒(CMV)等等中的病毒載體。
另一方面提供了構(gòu)成一個或多個本發(fā)明的核酸節(jié)段或分子的表達構(gòu)造或者表達載體。優(yōu)選表達式構(gòu)造或載體是重組體。優(yōu)選地，所述構(gòu)造或載體進一步包含用于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白序列所必需的調(diào)控序列。
另一個方面提供了包括一個或者多個本發(fā)明的表達構(gòu)造或者表達載體的宿主細胞或病毒。還提供了包含一個或多個本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞或病毒。表達本發(fā)明的抗體的宿主細胞或病毒形成另一個方面。
本發(fā)明的另一個方面提供生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，其包含培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞的步驟。優(yōu)選方法包含以下步驟(i)在適合表達編碼的抗體或者蛋白的條件下，培養(yǎng)包含一個或多個的重組表達載體或一個或多個本發(fā)明的核酸序列的宿主細胞；和任選地(ii)從宿主細胞或從生長介質(zhì)/上清液中分離或獲取抗體或 蛋白。這種生產(chǎn)方法還可能包含以下步驟純化抗體或蛋白產(chǎn)品和/或?qū)⒖贵w或產(chǎn)品配制成包括至少一個額外成分(例如藥學(xué)上可接受的載運體或賦形劑)的組合物。
在實施方案中，當(dāng)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)由多于一個肽鏈(例如，某些片段如fab 片段)組成時，所有多肽優(yōu)選在相同或不同的表達載體的宿主細胞內(nèi)表達，從而完整的蛋白質(zhì)(例如，本發(fā)明的結(jié)合蛋白)可以在宿主細胞中裝配并從其中分離或純化。
本發(fā)明的抗體還可以用于產(chǎn)生其它與CXCR4結(jié)合的抗體。這類用途涉及例如在父本抗體的氨基酸序列中添加、刪除、取代或插入一或者多個氨基酸從而形成一個新的抗體， 其中所述父本抗體是本文另外定義的本發(fā)明的抗體中的一個；以及測試形成的新抗體以確認與CXCR4結(jié)合并具有一個或多個其它如本文所述優(yōu)選功能特性抗體。這種方法可以被用來形成多個新抗體，測試所述新抗體與CXCR4結(jié)合的能力和其它功能性質(zhì)。優(yōu)選地，所述添加、刪除、取代或插入一個或多個氨基酸發(fā)生于一個或者多個CDR結(jié)構(gòu)域中。
這種父本抗體的修改或突變可以使用眾所周知和所述領(lǐng)域有記錄的技術(shù)(例如通過進行隨機或定向誘變方法)以任何適當(dāng)?shù)姆绞絹韴?zhí)行。如果將使用定向誘變技術(shù)，則一種識別突變的合適殘基的策略利用結(jié)合蛋白抗原復(fù)合物(如，Ab-Ag復(fù)合物)的晶體結(jié)構(gòu)的分辨率來識別抗原結(jié)合所涉及的關(guān)鍵殘基(Davies和Cohen，1996)。隨后，所述殘基可以被突變從而強化相互作用?；蛘撸瑸榱硕ㄏ蛘T變可以僅靶向一個或多個氨基酸殘基，并評價對結(jié)合CXCR4的影響。
隨機突變可以任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M行，例如通過易錯PCR，鏈改組或增變株大腸桿菌菌株。
因此，一個或多個本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域可以和單個\結(jié)構(gòu)域或來自任何適當(dāng)來源的 '結(jié)構(gòu)域的所有組成成分組合，并且所得新抗體被測試以確定針對CXCR4的抗體特異性。這是優(yōu)選的。相反地，一個或多個本發(fā)明的'結(jié)構(gòu)域可以和單個Vh結(jié)構(gòu)域或來自任何適當(dāng)來源的Vh結(jié)構(gòu)域的所有組成成分組合，并且所得新抗體被測試以識別與CXCR4結(jié)合的抗體。
類似地，如果適當(dāng)，本發(fā)明的一個或多個、或優(yōu)選所有三個Vh結(jié)構(gòu)域和/或\結(jié)構(gòu)域的CDR可以被接枝入單個Vh結(jié)構(gòu)域和/或者\結(jié)構(gòu)域或Vh結(jié)構(gòu)域和/或者\結(jié)構(gòu)域的所有組成成分，并且所得新抗體被測試以識別與CXCR4結(jié)合的抗體。
⑶R、尤其是輕和/或重鏈的⑶R3的靶向突變已表明是增加抗體親和力的有效技術(shù)并且是優(yōu)選的。優(yōu)選地， 稱為"熱點"的特異性區(qū)域或CDR3的的3到4個氨基酸的嵌段被靶向用于突變。
"熱點"是發(fā)生體內(nèi)體細胞超強突變的序列(此處和下文，Neubergerand Milstein，1995)。熱點序列可以被定義為某些密碼子中的共有核苷酸序列。所述共有序列是四核苷酸(RGYW)，其中R可以為A或G，Y可以為C或T，并且W可以為A或T(Neuberger and Milstein，1995)。此外，相比由對應(yīng)于潛在熱點序列的TCN編碼的那些，由核苷酸AGY 編碼的絲氨酸殘基壓倒性地存在于可變結(jié)構(gòu)域的⑶R區(qū)中(Wagner et al. , 1995)。
因此，可以針對熱點序列和AGY密碼子的存在，掃描本發(fā)明的每個抗體的重和輕鏈CDR的核苷酸序列。輕和重鏈的CDR區(qū)的經(jīng)識別熱點隨后任選地通過國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(IMGT, http://imgt.cines.fr/textes/vquest/) (Davies et al. , 1990)與重和輕鏈的原始序列加以比較。與生殖種系相同的序列表明沒有發(fā)生體細胞突變；因此可以引入隨機突變，模仿發(fā)生在體內(nèi)的體細胞事件，或者，可在例如熱點和/或AGY密碼子出進行定向誘變。相反地,不同的序列表明已經(jīng)發(fā)生了一些體細胞突變。仍將確定體內(nèi)的體細胞突變是否是最佳的。
突變的優(yōu)選熱點是暴露的氨基酸的密碼，并且優(yōu)選的是編碼形成抗原結(jié)合位點的氨基酸。其它的優(yōu)選突變的熱點是編碼非保守氨基酸的那些。編碼CDR內(nèi)的嵌入或保守氨基酸的熱點優(yōu)選不要突變。這些殘基是通常是總體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，并且因為它們是嵌入的，所以不太可能與抗原互相反應(yīng)。
進行氨基酸和蛋白質(zhì)域的上述操縱的方法是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，所述操縱可以方便地通過核酸水平的遺傳工程進行，其中編碼適合的結(jié)合蛋白和其結(jié)構(gòu)域的核酸分子被修飾，使得所得的表達蛋白的氨基酸序列接著以適當(dāng)方式被修飾。
一個或多個抗體特異性結(jié)合CXCR4的能力的測試可以通過任何眾所周知的和所屬領(lǐng)域描述的適當(dāng)方法進行。CXCR4+細胞株可以從細胞培養(yǎng)物保藏中獲得，或者它們可能通過用允許表達重組CXCR4的構(gòu)造轉(zhuǎn)化CXCR4-陰性細胞來制備。這種細胞可容易用于測定結(jié)合，例如通過常規(guī)方法例如ELISA、BIACore、FACS等。
通過這些方法生產(chǎn)的新抗體優(yōu)選地具有改善的功能特性，如相對父本抗體的對 CXCR4的更高或者加強的親和力(或至少相當(dāng)?shù)挠H和力)，可以通過與本文另外描述的本發(fā)明的抗體相同的方式進行處理或使用(例如，用于治療，診斷，作為組合物的一部分等)?；蛘?，或另外，新抗體將會擁有一個或多個如同本文另外描述的其它改善的功能特性。
通過這些方法生產(chǎn)、獲取或可獲得的新抗體形成本發(fā)明的另一個方面。
這項發(fā)明進一步提供包含至少一個本發(fā)明的抗體或抗體片段(任選包括稀釋劑) 的組合物。這種組合物可能是藥學(xué)上可接受的組合物或在實驗室研究中使用的組合物。就藥學(xué)組合物而言，它們優(yōu)選被配制用于腸胃外、靜脈內(nèi)或甚至皮下給藥。
本發(fā)明提供本發(fā)明的人類抗體和抗體片段的許多方法和用途。除非特別指出，在所有方法中，術(shù)語“一個a"和an")用于指所例舉方法中的"至少一個"，"至少第一個"，"一個或多個"，“數(shù)個"步驟。這對治療方法中的給藥步驟尤其相關(guān)。因此， 本發(fā)明不僅可以采用不同的劑量，也可以使用不同次數(shù)的劑量，例如，注射中可以使用多達和包括多次注射。在抗CXCR4治療抗體的給藥之前或之后或在其期間，可以使用、施用組 合療法。
提供了本發(fā)明的抗體或免疫軛合物的各種有用的體外方法和用途，所述方法和用途具有重要生物學(xué)意義。首先提供的是結(jié)合CXCR4的方法和用途，其一般包含使包含 CXCR4的組合物與本發(fā)明的至少第一抗-CXCR4抗體或其抗原結(jié)合片段有效地接觸。本發(fā)明的抗體或其免疫軛合物由此可以在結(jié)合試驗中使用。適當(dāng)有用的結(jié)合試驗包括所屬領(lǐng)域中通常采用的那些，如在免疫印跡、蛋白印跡、RIAs, ELISAs、免疫組化、熒光活化的細胞分選 (FACS)、免疫沉淀、親和層析等等中采用那些。
提供了檢測CXCR4和方法和用途，其一般包含在有效允許CXCR4/抗體復(fù)合物形成并且檢測所形成的復(fù)合物的條件下，使疑似含有CXCR4的組合物與本發(fā)明的至少第一抗體或免疫軛合物或其抗原結(jié)合片段接觸。檢測方法和用途可與生物樣品(例如，在腫瘤診斷中)聯(lián)合使用，并且還提供了基于該檢測方法和用途的診斷試劑盒。此外有認為CXCR4 的檢測對一些病癥可以是預(yù)后性的，因此在相關(guān)的情況下，本文的對診斷的提及包括預(yù)后診斷。特別地，以指示CXCR4具有轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和存活、膠質(zhì)瘤和一些兒童癌癥的預(yù)后性價值。
本發(fā)明的抗體或結(jié)合蛋白可以用于體內(nèi)或體外檢測CXCR4，尤其是用于檢測 CXCR4+細胞。例如，因為CXCR4在某些腫瘤細胞上過表達，本發(fā)明的抗體或結(jié)合蛋白可用于體內(nèi)或體外檢測腫瘤細胞。此外,抗體定位CXCR4+細胞的能力意味著本發(fā)明的抗體可以靶向有CXCR4+細胞存在的身體部位，因此所述抗體可以作用于靶位。特別地，抗體定位 CXCR4+腫瘤細胞的能力意味著本發(fā)明的抗體可以靶向有CXCR4+腫瘤細胞存在的身體部位，因此所述抗體可以作用于靶位。
本發(fā)明的方法和用途特別用于動物和患者中，所述動物和患者具有與CXCR4表達或活性相關(guān)的或CXCR4在其中起到生物學(xué)作用的疾病或病狀,或有發(fā)展所述疾病或病狀的風(fēng)險。這種疾病或病狀包括由CXCR4陽性細胞、典型的是免疫調(diào)節(jié)CXCR4+T細胞介導(dǎo)的疾病，其在配體結(jié)合CXCR4時可能參與將導(dǎo)致或促成病癥或疾病的信號傳導(dǎo)通路)。它們還包括由表達CXCR4的細胞的異常增殖導(dǎo)致的疾病。這種異常增殖細胞可能天然為CXCR4+， 或者它們可能被突變/轉(zhuǎn)化而表達CXCR4。如上文所述，CXCR4的表達可能幫助癌癥細胞沿著SDF-1濃度梯度轉(zhuǎn)移。還包括特征為在本身就是CXCR4+的細胞上過表達CXCR4的疾病。 此外，HIV的CXCR4熱帶株利用CXCR4進入宿主細胞，因此阻斷該受體可限制這種疾病的擴散。
因此，提供一種治療由CXCR4介導(dǎo)和/或特征為CXCR4陽性細胞異常增殖和/或特征為在本身為CXCR4陽性的細胞上過表達CXCR4的疾病或病癥的方法。
從另一個角度看來，提供可受益于以下一個或多個的病狀治療
⑴對CXCR4與其配體的結(jié)合的抑制。
(ii)對針對CXCR4配體的CXCR4介導(dǎo)細胞應(yīng)答的抑制，特別是對例如與癌轉(zhuǎn)移/ 器官入侵或炎癥應(yīng)答、或增加的細胞內(nèi)鈣離子濃度(細胞活化)相結(jié)合的趨化或遷移的抑制。
(iii)選擇性消除CXCR4+細胞。
(iv)對CXCR4+造血干細胞的遷移的活化和誘導(dǎo)，因為這些細胞由其CXCR4與骨髓基質(zhì)中產(chǎn)生的SDF-1的相互作用而在骨髓內(nèi)保持非活性狀態(tài)。
(V)阻斷HIV的X 4株對CXCR4的感染，在感染期間將CXCR4用作共受體。
優(yōu)選地，CXCR4配體是SDF-1。
所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知因為CXCR4涉及廣泛的疾病和病癥，給定的抗CXCR4治療一旦顯示在任何可接受模型中有效，則可以用于治療與CXCR4表達有關(guān)的全部疾病和病癥。
在一個實施方案中，CXCR4介導(dǎo)的病況是癌癥，且特別是由CXCR4和它與它的配體相互作用來介導(dǎo)或支持的擴散、轉(zhuǎn)移形成、器官入侵和/或腫瘤生長。
CXCR4在各種腫瘤中表達，目前大量的文檔記錄了該表達在癌癥病理生理學(xué)特別是癌癥轉(zhuǎn)移中起決定性的作用。若干證據(jù)導(dǎo)致了目前廣為接受的理念，即CXCR4的表達使惡性細胞能夠利用用于轉(zhuǎn)移性遷移的SDF-1基梯度。CXCR4是迄今為止在癌癥細胞中最常表達的趨化因子受體。在幾乎所有的腫瘤研究中均發(fā)現(xiàn)表達。還有益的是SDF-1 (CXCL12) 在肝、肺、骨髓、淋巴結(jié)和大腦(以相對低的水平)，即，癌癥通常轉(zhuǎn)移到的或者血液系統(tǒng)腫瘤侵入的位置中，以特別高水平表達。大量證據(jù)表明阻斷SDF-1產(chǎn)生的CXCR4信號能夠在小鼠模型中減少或防止形成轉(zhuǎn)移。此信號抑制可以通過抗體(Muller et al,2001和其它)、 CXCR4 的 siRNA(Liang et al，2007)和肽(Kim et al，2008)實現(xiàn)。
阻斷CXCR4也被描述成對血管生成具有影響，例如抑制(抗血管生成作用)。因此， 在另一個實施方案中本發(fā)明的抗體可以用來影響血管生成(例如具有抗血管生成作用)。 在另一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗抗體可以與所屬領(lǐng)域中所述的任何抗血管生成藥劑一起使用。特別地，本發(fā)明的抗體可用于與阿瓦斯汀(Avastin)聯(lián)合使用來治療癌癥，或當(dāng)腫瘤獲得阿瓦斯汀抗性時作為患者的第二線治療方案。
Xu等，2009的研究顯示腫瘤細胞的CXCR4通過用阿瓦斯汀治療而被上行調(diào)節(jié)。這將使腫瘤細胞對用靶向CXCR4的抗體治療更加敏感。這對于對阿瓦斯汀治療已經(jīng)產(chǎn)生抗性的患者特別有益?；蛘?，可以一起給予所述兩種藥物。
此外，據(jù)稱具有抗轉(zhuǎn)移作用的阻斷CXCR4信號的許多化合物也已知抑制腫瘤生長。雖然通過阻斷CXCR4受體限制腫瘤生長的確切作用還未充分了解，越來越多的證據(jù)表明贅生性細胞與周圍基質(zhì)的相互作用是至關(guān)重要的。一項研究顯示，雖然用抗CXCR4的 siRNA轉(zhuǎn)染胰腺和結(jié)腸癌細胞在體外對細胞生長造成極小的影響，但源自這些細胞的腫瘤的體內(nèi)生長被明顯壓制(Guleng et al，2005)。此外，其表明癌相關(guān)的成纖維細胞與少量的肌纖維母細胞一起刺激混合的乳腺癌細胞的生長(明顯多于相同患者的正常的乳腺成纖維細胞)，并且通過聚集血管內(nèi)皮祖細胞促進血管的生成(Orimo et al，2005)。這些作用是通過腫瘤成纖維細胞/成纖維細胞分泌的SFD-1介導(dǎo)的?？筍DFD-1抗體或抗CXCR4的 siRNA抑制腫瘤生長。因此，這些研究一并顯示腫瘤微環(huán)境對于癌癥的行為的重要性，并且通過體內(nèi)靶向SDF-1/CXCR4相互作用獲得的顯著的腫瘤生長抑制。因此，本發(fā)明的抗體可以用于抑制CXCR4+細胞對腫瘤基質(zhì)的吸引，和/或抑制所述細胞的活化以創(chuàng)造有利于腫瘤的微環(huán)境。
在另一個實施方案中，治療的CXCR4介導(dǎo)病狀是表達CXCR4的轉(zhuǎn)化細胞的存在。如上文已述，CXCR4在許多腫瘤中大量表達。這可以用于通過誘導(dǎo)細胞凋亡、ADCC 或⑶C來殺死那些細胞。當(dāng)然，因為CXCR4也在各種健康細胞中表達，所以安全性方面和副作用是需要考慮的理由。對CXCR4的小分子拮抗劑的有限數(shù)量的可用I期研究顯示一些副作用，所述副作用大多是次要問題。然而，靶向CXCR4的藥物的長期使用方面沒有任何數(shù)據(jù)。此外，取決于所用藥物，可能存在一些變化；誘導(dǎo)細胞凋亡的抗體如MDX-1338)可能具有與不誘導(dǎo)細胞凋亡抗體非常不同的安全特性。此外，最近證明肽派生藥物CTCE 9908通過誘導(dǎo)多核生成、G2-M停滯和異常有絲分裂(有絲分裂障礙)造成卵巢癌細胞死亡(Kwong et al，2009)。可以推測，相比幾乎從不進行有絲分裂的完全分化CXCR4+神經(jīng)細胞，這種作用模式(例如有絲分裂障礙)在易于細胞分裂的CXCR4+腫瘤細胞中更有效。因此，在一些實施方案中，殺傷CXCR4+細胞是本發(fā)明的抗體另一個作用模式，但這種殺傷優(yōu)選是由除誘導(dǎo)細胞凋亡之外的機制誘導(dǎo)的。
在另一個的實施方案中，治療的CXCR4介導(dǎo)病狀是骨髓支持細胞到腫瘤位點的遷移。
開始在肝細胞癌中的II期臨床試驗，其研究CTCE_9908(阻斷CXCR4信號的二聚肽)和經(jīng)動脈化療栓塞術(shù)的聯(lián)合使用。假設(shè)CTCE 9908除了阻斷轉(zhuǎn)移過程，將在經(jīng)動脈化療栓塞術(shù)后阻斷腫瘤對骨髓來源的支持細胞的補充。
在另一個實施方案中，待治療的CXCR4介導(dǎo)的病狀是CXCR4+細胞到炎癥部位的遷移。
已知CXCR4在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。如同其它細胞因子，SFD-1通過將免疫系統(tǒng)的CXCR4+細胞吸引至炎癥部位來促成炎癥。阻斷該相互作用可能有益于各種炎癥和自身免疫性病癥，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。小分子藥物候選者AMD3465 (CXCR4拮抗劑)表現(xiàn)了在血吸蟲病抗原引起的肺肉芽腫形成模型中廢止Th2介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答(Hu et al.，2006)。
在另一個實施方案中，待治療的CXCR4介導(dǎo)的病狀是病毒性傳染病，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染如HIV感染，或任何其它病毒性感染，其中所述病毒使用CXCR4作為受體。
很大一部分HIV菌株在感染期間使用CXCR4作為復(fù)合受體(X 4HIV菌株)。阻斷 CXCR4受體已表明非常有效地阻斷感染。AMD3100已表明在人類臨床測試中能同時在體外和體內(nèi)高效地阻斷X 4 HIV菌株進入CXCR4株。這種化合物的具有加強的生物利用度的衍生物(AMD070)目前正處于針對HIV治療的II期臨床測試中。幾種CXCR4的其它拮抗劑處于用該目的的不同發(fā)展階段中。
在另一個實施方案中，待治療的CXCR4介導(dǎo)的病狀是需要動員保留在骨髓中的干細胞的病狀。這種干細胞動員可以通過阻斷CXCR4/SDF-1相互作用來實現(xiàn)，并且這允許例如免疫系統(tǒng)的恢復(fù)，例如全身輻射或骨髓移植或血癌如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’ s lymphoma)或多發(fā)性骨髓瘤之后所需的免疫系統(tǒng)恢復(fù)。這種方法可用于這些病狀和其它需要或可受益于造血干細胞移植的任何疾病。
2009年I月，健贊(Genzyme)公司收到美國食品藥品管理局的獲準以商品名 MozobiI 出售一種小分子CXCR4抑制劑普樂沙福(plerixafor (前AMD3100))，其為注射性藥物針對罹患非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤，需要造血干細胞移植的患者。此產(chǎn)品意在與G-CSF聯(lián)合使用來動員自體造血干細胞。阻斷CXCR4和SDF-1之間的相互作用已表明在外周血液中同時顯著增加白細胞計數(shù)和cd34+細胞數(shù)量，因為由骨髓基質(zhì)分泌的SDF-1在這種情況下有助于保持干細胞在骨髓中處于活化形式。幾種其它CXCR4拮抗劑處于針對此指示的研發(fā)中。
在另一個實施方案中，阻斷CXCR4受體介導(dǎo)信號使腫瘤細胞對其它化合物的治療如化療藥物敏化。因此，特別優(yōu)選的是與化療藥物一起的聯(lián)合療法。這種實施方案在血液癌癥治療中尤其有用。
在2009年12月，健贊公司宣布Ι/II期臨床試驗提供了早期臨床數(shù)據(jù)，其顯示與化療結(jié)合使用的Mozobil (普樂沙福注射劑)可對在骨髓中受到保護的白血病細胞提供治療性影響。在臨床試驗中，在針對復(fù)發(fā)或者難以治療的急性骨髓性白血病(AML)患者的化療(MEC方案米 托蒽醌、依托泊苷和阿糖胞苷)之前，將Mozobil作為預(yù)調(diào)理策略提供。 不少臨床試驗參與者在之前的治療后無應(yīng)答或者具有短期緩解。在可用于第一次后續(xù)評估的患者中，研究人員觀察到50%的患者完全緩解(CR或CRi)。已針對其它血液癌癥開始類似試驗。
上文所述的實施方案可以用于各種疾病的治療。
已顯示有增加的CXCR4表達的腫瘤類型的例子為乳腺癌，前列腺癌，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，惡性或轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤，頭部及頸部癌癥(包括但不限于口腔鱗狀細胞癌和鼻咽癌)，食管癌，腦腫瘤(包括但不限于膠質(zhì)瘤和腦膜瘤)，白血病，淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤，神經(jīng)母細胞瘤和其它兒童癌癥，腎癌，成血管細胞瘤，希林二氏病(von Hippel-Lindau disease)，肺腫瘤(SCLC和NSCLC)，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，乳頭狀甲狀腺癌和骨肉瘤。特別優(yōu)選的是對轉(zhuǎn)移性癌的治療或?qū)δ[瘤細胞侵入的抑制作用。
CXCR4介導(dǎo)的疾病或病癥也可能是疾病或與炎癥或自身免疫性疾病相關(guān)的病狀。 優(yōu)選的疾病或病癥包括
(I)過敏性疾病,如全身過敏反應(yīng)或超敏性反應(yīng),藥物過敏,過敏性支氣管肺曲霉病(ABPA)，昆蟲叮過敏和食物過敏，(2)炎癥性腸疾病，如克羅恩病(Crohn' s disease), 潰瘍性結(jié)腸炎，回腸炎和腸炎，⑶陰道炎，⑷牛皮癬和炎癥性皮膚病，如皮炎，濕疹，特應(yīng)性皮炎，過敏性接觸性皮，蕁麻疹和瘙癢，(5)血管炎，(6)脊柱關(guān)節(jié)病，(7)硬皮病，(8)哮喘和呼吸道過敏性疾病等，如過敏性哮喘，過敏性鼻炎，慢性阻塞性肺疾病，過敏癥肺疾病等，(9)自身免疫性疾病,如關(guān)節(jié)炎(包括風(fēng)濕性和牛皮癬性)，多發(fā)性硬化癥,系統(tǒng)性紅斑狼瘡，I型糖尿病，腎小球腎炎等等，(10)移植排斥反應(yīng)(包括同種異體移植排斥反應(yīng)和移植物宿主疾病)以及(11)其中將要抑制不希望的炎癥的其它疾病，如動脈粥樣硬化，肌炎， T細胞介導(dǎo)的神經(jīng)變性疾病，多發(fā)性硬化癥，腦炎，腦膜炎，肝炎，腎炎，膿毒癥，結(jié)節(jié)病、過敏性結(jié)膜炎，耳炎，卡斯?fàn)柭喜?Castleman' s disease),鼻竇炎,LPS誘發(fā)的內(nèi)毒素休克, 白塞氏綜合征(Behcet' s syndrome)和痛風(fēng)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和Th2介導(dǎo)的炎癥是特別優(yōu)選的用本發(fā)明的抗體治療的疾病。
如本文所用，術(shù)語"異常增殖"指偏離正常的、適當(dāng)?shù)幕蝾A(yù)期的過程的細胞增殖。 例如，異常細胞增殖可能包括其DNA或細胞成分已受損或有缺陷的細胞的不適當(dāng)增殖。
異常細胞增殖可能包括特征是與由不恰當(dāng)?shù)母咚郊毎至选⒉磺‘?dāng)?shù)牡退降募毎蛲龌蜻@兩者引起、調(diào)節(jié)或?qū)е滤霾磺‘?dāng)?shù)母咚郊毎至?、不恰?dāng)?shù)牡退降募毎蛲龌蜻@兩者的適應(yīng)癥相聯(lián)系的細胞增殖。此類適應(yīng)癥的特征可能為例如癌性或非癌性、良性或惡性的細胞、細胞群、或組織的單個或多個局部異常增殖，。
本文中任何對"腫瘤”的引用也指"癌癥"或"癌"。轉(zhuǎn)移性癌癥也可以被治療，如可以減少原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移。手術(shù)后患者體內(nèi)的所謂輕微后遺癥(MRD)可能通過抗 CXCR4抗體的免疫療法來控制。
因此，本發(fā)明進一步提供了治療如上所述的疾病的方法和用途，所述方法和用途包含對罹患這種疾病的動物或患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗CXCR4抗體、或抗CXCR4 抗體的抗原結(jié)合片段或免疫軛合物。
本發(fā)明的另一個方面提供了本發(fā)明抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或免疫軛合物在生產(chǎn)用于治療、造影或診斷的成分或藥劑中的用途。
本發(fā)明的另一個方面提供了用于治療、診斷或造影的本發(fā)明抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或免疫軛合物。
此外，本發(fā)明提供了組合物，其包含本發(fā)明抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段或免疫軛合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、稀釋劑、緩沖劑或穩(wěn)定劑。
如本文所述的體內(nèi)的方法一般在哺乳動物內(nèi)進行?？梢灾委熑魏尾溉閯游铮缛祟惡腿魏紊?、家養(yǎng)或?qū)嶒炇覄游铩＞唧w的例子包括小鼠，大鼠，豬，貓，狗，羊，兔，牛和猴。 但是，優(yōu)選該哺乳動物是人。
因此，如本文中所用，術(shù)語"患者"或"動物"包括任何哺乳動物，例如人類和任何禽畜，家養(yǎng)或?qū)嶒瀯游?。具體的例子包括小鼠，大鼠，豬，貓，狗，羊，兔，牛和猴。但是，優(yōu)選該動物或患者是人類受試者。
本發(fā)明聯(lián)合兩種方法，一種是使用未軛合的或裸的抗體和其片段治療上文所述病癥的方法，另一種是使用免疫軛合物(其中本發(fā)明的抗體或者其抗原結(jié)合片段操作性連接到治療性或診斷性藥劑上)的CXCR4+細胞(優(yōu)選是CXCR4+腫瘤細胞或免疫系統(tǒng)的CXCR4+ 細胞，如可以由HIV的CXCR4熱帶株感染的細胞)靶向方法。除非另有明確說明或用科學(xué)術(shù)語清楚表明，否則本文使用的術(shù)語"抗體和其片段"因此是指"未軛合的或裸的"抗體或片段，其連接至另一藥劑，尤其是治療性或診斷性藥劑。這些定義不排除對抗體的修改， 例如僅舉例而言，用于提高抗體、或具有其它效應(yīng)子與抗體組合的生物半衰期、親和力、活動性或其它屬性的修改。
本發(fā)明的治療方法和用途還包括未軛合的或裸的抗體及免疫軛合物的用途。在基于免疫軛合物的治療方法中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段優(yōu)選操作性連接到第二治療性藥劑上(第一治療性藥劑是抗-CXCR4抗體)。
合適的治療劑可以根據(jù)待治療疾病或病狀和/或治療作用的所需模式來選擇。
例如，當(dāng)作用的所需模式是拮抗性的，例如調(diào)節(jié)靶CXCR4+細胞的細胞信號，例如調(diào)節(jié)靶細胞內(nèi)的信號或調(diào)節(jié)靶細胞對其它細胞的信號，或下調(diào)或抑制CXCR4+細胞的功能 /信號，如腫瘤細胞或參與炎癥或自身免疫應(yīng)答的免疫系統(tǒng)的細胞或容易受到病毒如HIV 感染的細胞，則適當(dāng)?shù)乃巹┛赡苁敲庖哒{(diào)節(jié)治療藥劑例如抗炎藥，如皮質(zhì)類固醇(優(yōu)選糖皮質(zhì)激素)或非類固醇抗炎藥(NSAID)如C0X-2抑制劑、磺苯胺、力克飛龍(licofelone) 和Ω-3脂肪酸、類固醇拮抗劑、細胞因子或趨化因子拮抗劑、或細胞因子或趨化因子表達的抑制劑。替代性藥劑可以是血管生長抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)，內(nèi)皮他丁 (endostatin)，任何一種血管形成素(angiopoietins)，血管抑制素(vasculostatin)，血管生成抑制因子(canstatin)或抑癌基因(maspin)。替代性藥劑可以是額外的信號通路抑制劑，例如生長因子受體(例如，EGFR IGF受體如IGF-1受體(IGF-1R)、IGF-2R、IGF結(jié)合蛋白(IGFBP-3)和FGFR)的抑制劑。
當(dāng)抑制CXCR4+細胞的生長是所需的作用模式(如在癌癥治療中)時，則可以選擇具有生長抑制作用的合適藥劑，例如治療性的抑制細胞生長藥劑如類固醇受體(如雌激素受體)。
當(dāng)細胞殺傷是所需作用模式時，則可以選擇合適的細胞毒性藥劑例如放療藥劑或 ATP酶(ATPase)抑制劑。
對于癌癥治療，還可使用適當(dāng)?shù)目拱┧幬铩?
或者，在抗病毒的應(yīng)用中，例如HIV治療中，合適的抗病毒藥劑可被用作額外的治療手段。
重點要注意的是多種作用模式可能適合于某些疾病或疾病的階段，并且若如此， 則可以使用多種額外治療手段。同樣重點要注意的是許多藥劑具有多重效果或根據(jù)所處環(huán)境產(chǎn)生不同的效果。阻斷的信號通路可對腫瘤細胞的遷移以及腫瘤的生長產(chǎn)生作用。許多化療藥物也具有一個以上的功能。與抗炎應(yīng)用相比，趨化因子及其拮抗劑可在癌癥方面具有不同效果。然而，根據(jù)疾病、疾病的階段和所需的作用模式來選擇適當(dāng)?shù)念~外治療藥劑是在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
額外的治療劑可能以免疫軛合物形式提供，也可替代性地以組合療法提供，例如， 如果更合適的話，當(dāng)不同的藥劑被一起(例如作為混合物)、分別或隨后地施用時。
前述的多個治療方法和用途一般將涉及向動物或患者全身性地施用藥學(xué)有效組合物，如通過經(jīng)皮注射、肌內(nèi)注射、靜脈注射等。然而，可以接受允許治療藥劑定位腫瘤位點或者其它適合的位點(例如發(fā)炎或者病毒感染的位點)的任何施用途徑。因此，遞送的其它適合途徑包括口服遞送，鼻部遞送或呼吸遞送和局部遞送。
如本文所用，"施用"意義為以有效發(fā)揮療效(例如抗腫瘤、抗炎或抗病毒效果) 的一個或多個量和一段時間來提供或遞送抗CXCR4抗體治療劑。蛋白質(zhì)治療劑的被動施用一般來說是優(yōu)選的，部分是因為它的簡單性和可重復(fù)性。
然而，術(shù)語"施用"在本文用于指將本發(fā)明的抗CXCR4抗體遞送或提供到靶位的任何和所有方式。"施用"因此包括以有效導(dǎo)致遞送到靶位的方式來提供生產(chǎn)本發(fā)明的抗 CXCR4抗體的細胞。在這種實施方案中，可能需要配制或包裝這細胞在選擇性透膜、結(jié)構(gòu)或可植入器件(通?？梢砸瞥龔亩Ｖ怪委?內(nèi)。本發(fā)明的外源性抗CXCR4抗體一般仍將是優(yōu)選的，因為這代表著允許劑量被密切監(jiān)測和控制的非侵入性方法。
本發(fā)明的治療方法和用途還擴展至以有效導(dǎo)致它們表達在腫瘤附近或者它們定位愛在靶位的方式，提供編碼本發(fā)明的抗CXCR4抗體的核酸?？梢允褂萌魏位蛑委熂夹g(shù)， 如裸DNA遞送，重組基因和載體，基于細胞的遞送，包括患者細胞的體外操作等等。
本發(fā)明的抗-CXCR4抗體還可以用于向靶位遞送其它治療性的或診斷性的藥·劑。 在這種實施方案中，其它治療性的或診斷性的藥劑一般操作性附著至本發(fā)明的抗CXCR4抗體。
本發(fā)明中使用的"治療有效量"是本發(fā)明的CXCR4抗體或其免疫軛合物的量，該量可有效抑制CXCR4配體到CXCR4的結(jié)合；抑制對CXCR4配體的CXCR4-介導(dǎo)細胞應(yīng)答，優(yōu)選的是抑制在應(yīng)答于CXCR4配體的鈣離子釋放或抑制CXCR4+細胞遷移；減輕炎癥反應(yīng)；抑制轉(zhuǎn)移的形成；抑制腫瘤細胞侵入；抑制腫瘤生長；抑制腫瘤血管生成；在施用罹患CXCR4+ 腫瘤的動物或者患者藥物后誘導(dǎo)腫瘤退化或緩和；限制CXCR4HIV熱帶株的傳播和/或，當(dāng)作用機制涉及細胞殺傷時，特異性地殺死至少一部分靶標(biāo)CXCR4細胞。優(yōu)選地實現(xiàn)此類效果并同時表現(xiàn)對正常細胞、健康組織的極少結(jié)合或不結(jié)合，或極少殺死正常細胞、健康組織以及對動物或患者的正常、健康組織施加可忽視或可控制的不良副作用。
所謂"靶位"是指CXCR4+細胞的位置，其介導(dǎo)病癥或其以導(dǎo)致或加劇病癥的異常方式增殖。靶位可能因此，例如是腫瘤或CXCR4-介導(dǎo)的炎癥位點。"靶標(biāo)細胞"是介導(dǎo)病癥或其以導(dǎo)致或加劇病癥的的異常方式增殖的CXCR4+細胞。因此，靶標(biāo)細胞可以例如包括CXCR4+腫瘤細胞，免疫系統(tǒng)細胞如CXCR4+白細胞(用于抗炎/抗自身免疫的應(yīng)用)或被CXCR4HIV熱帶株靶向標(biāo)的CXCR4+免疫細胞。
如本文中在殺死CXCR4+細胞例如CXCR4+腫瘤細胞、CXCR4+白細胞(用于抗炎/抗自身免疫的應(yīng)用)或減少炎癥或誘導(dǎo)腫瘤退化或緩和的背景中所用，術(shù)語"優(yōu)先地"和" 特有地"因此意味著本發(fā)明的抗CXCR4抗體或其免疫軛合物作用為實現(xiàn)CXCR4+靶標(biāo)細胞破壞(腫瘤細胞破壞)的功能，例如腫瘤細胞的破壞，所述破壞大體局限于靶位并且大體不擴展以致造成動物或受試者的正常、健康的組織破壞。
本發(fā)明的抗CXCR4抗體或治療性軛合物優(yōu)選被聯(lián)接到一種或多種放射治療劑、化療藥劑、抗血管生成藥劑、凋亡誘導(dǎo)藥劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞或細胞毒性藥劑、細胞因子或趨化因子拮抗劑、細胞因子或趨化因子表達的抑制劑、ATP酶抑制劑、抗炎藥、其它抗體 (例如作為雙特異抗體)或凝血劑(凝血因子)或抗炎劑如皮質(zhì)類固醇，優(yōu)選的是糖皮質(zhì)素、或非類固醇抗炎藥(NSAID)。
本發(fā)明因此提供一系列的軛合抗體和其片段，其中抗CXCR4抗體操作性附著到至少一種其它治療性或診斷性藥劑。術(shù)語"免疫軛合物"寬泛地用來定義抗體與另一有效藥劑的操作性締合并且無意僅僅指任何類型的操作性締合，并且特別不限定于化學(xué)"軛合"。特別考慮了重組融合蛋白。只要遞送或靶向藥劑能夠結(jié)合到靶標(biāo)并且該治療性或診斷性藥劑在遞送時具有充分功能性，則附著的模式將是適合的。
藥劑通過抗體上的碳水化合物部分附著也在設(shè)想中。在O-聯(lián)和N-聯(lián)的糖基化都在抗體中自然發(fā)生。如果需要的話，重組抗體可以被修飾以重新創(chuàng)建或創(chuàng)建額外的糖基化位點，這簡單地通過在抗體的原始序列中工程設(shè)計合適的氨基酸序列(例如Asn-X-Ser， Asn-X-Thr, Ser或Thr,其中X是除Pro之外的任何氨基酸)來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的抗CXCR4抗體或治療性軛合物以及相關(guān)方法和用途中使用的目前優(yōu)選的藥劑是補充或強化抗體的效果的那些藥劑和/或針對具體病癥類型(腫瘤類型)或患者選擇的那些藥劑。
"補充或強化抗體效果的治療劑"包括放射治療藥劑，化療藥劑，抗血管生成藥劑，凋亡誘導(dǎo)藥劑，抗微管蛋白藥劑，抗細胞或細胞毒藥劑，凝血劑，細胞因子或趨化因子拮抗劑、細胞因子的或趨化因子的表達抑制劑，ATP酶抑制劑，抗炎藥如皮質(zhì)類固醇激素，優(yōu)選的是糖皮質(zhì)激素或非類固醇抗炎藥(NSAID)，其它抗體(例如作為雙特異抗體)，優(yōu)選在此處使用它們中的任何一個或多個。
目前優(yōu)選的抗癌、尤其是抗白血病藥劑包括蒽環(huán)類藥物，如柔紅霉素，阿霉素，阿糖胞苷，6-硫代鳥嘌呤,米托蒽醌、白消安(Myleran ),達沙替尼(Sprycel ),強的松、硫酸長春新堿(Oncovin )，苯丁酸氮芥，氟達拉濱，噴妥司汀和克拉屈濱。
目前優(yōu)選的抗血管生成藥劑包括血管他丁，內(nèi)皮他丁，任何一 種血管生成素，血管抑制素O，血管生成抑制因子O和乳腺絲抑蛋白。
如本文所用，"抗微管蛋白藥物”指任何藥劑、藥物、前體藥物或它們的組合，其優(yōu)選地通過直接或間接抑制細胞有絲分裂、優(yōu)選是微管蛋白聚合或解聚所必需的微管蛋白的活性來抑制細胞有絲分裂。目前優(yōu)選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙素，紫杉醇，長春花堿， 長春新堿、去乙酰長春酰胺和一種或多種考布他汀(combretastatin)。
目前優(yōu)選的NSAID包括C0X-2抑制劑，磺苯胺，力克飛龍和ω-3脂肪酸。
優(yōu)選藥劑與本發(fā)明的抗CXCR4抗體的附著或締合產(chǎn)生“免疫軛合物"，其中這種免疫軛合物往往具有強化的，甚至協(xié)調(diào)治療性質(zhì)，例如抗腫瘤或抗炎的性質(zhì)。
抗細胞和細胞毒劑的使用(當(dāng)合適時)導(dǎo)致本發(fā)明的抗CXCR4抗體"免疫毒素"，而凝血因子的使用導(dǎo)致本發(fā)明的抗CXCR4抗體"凝血配體(coaguligands)"。
也考慮了至少兩種治療劑的使用，例如一種或多種上述藥劑的組合。
在某些應(yīng)用中，本發(fā)明的抗CXCR4抗體治療劑將操作性附著到細胞毒性、細胞生長抑制性或其它抗細胞藥劑，其具有殺死或者抑制細胞生長或者細胞分裂的能力。適合的抗細胞藥劑包括化療藥物和細胞毒劑以及細胞生長抑制劑。細胞生長抑制劑一般是擾亂靶標(biāo)細胞的自然細胞周期以優(yōu)選使得細胞脫離細胞周期的那些。
示例性化療藥物包括激素，如類固醇；抗代謝產(chǎn)物(ant1-metabolites)，如阿糖胞苷，氟尿嘧啶，氨甲蝶呤或氨喋呤；蒽環(huán)類；絲裂霉素C ;長春花生物堿；抗生素；秋水仙胺(demecolcine);依托泊苷；光神霉素(mithramycin)和抗腫瘤燒化劑,如苯丁酸氮芥或馬法蘭。某些優(yōu)選的抗細胞藥劑是DNA合成抑制劑，如柔紅霉素，亞德里亞霉素/阿霉素 (doxorubicin/adriamycin)等等?？傮w而言,紫杉酹/紫杉醇，多西紫杉醇，順鉬，吉西他，考布他汀(combretastatin)和亞德里亞霉素/阿霉素是目前優(yōu)選的抗癌藥劑。
V-型ATP酶抑制劑也是目前優(yōu)選的，如salicylihalamide、刀球骯霉素 (concanamycin)或巴佛洛霉素(bafiIomycin),還優(yōu)選的是蛋白質(zhì)合成抑制齊Li，如 (psymberin)、青腰蟲素(pederin)、irciniastatin A.
在某些治療性應(yīng)用中，毒素部分將是優(yōu)選的，這是因為相比其它潛在藥劑，大多數(shù)毒素有更強的遞送細胞殺傷效果的能力。因此，本發(fā)明的抗CXCR4抗體構(gòu)造的某些優(yōu)選抗細胞藥劑是從植物源、真菌源或細菌源的毒素。示例性毒素包括表鬼白毒素 (epipodophylIotoxins);細菌性內(nèi)毒素或細菌性內(nèi)毒素的脂質(zhì)A部分；核糖體失活蛋白， 如皂素或白樹毒素；a_八疊球菌(a-sarcin);麥霉素；局限曲菌素；核糖核酸酶，如胎盤核糖核酸酶；白喉毒素和假單胞菌外毒素。目前優(yōu)選的例子是蓖麻毒素，白樹毒素，相思豆毒素，白喉，假單胞菌和百日咳毒素。
某些優(yōu)選的毒素是A鏈毒素，如蓖麻毒素A鏈。最優(yōu)選的毒素部分往往是經(jīng)過處理，修改或刪除碳水化合物基的蓖麻毒素A鏈，所以叫"去糖基化A鏈"(dgA)。去糖基化蓖麻毒素A鏈是優(yōu)選的，因為其極高的潛能、更長的半衰期，并且因為以臨床等級和規(guī)模生產(chǎn)它是經(jīng)濟可行的。也可以使用重組和/或截短的蓖麻毒素A鏈。
本發(fā)明的抗-CXCR4抗體治療劑可包含能夠促進凝血的成分(即，凝血劑)。在此， 靶向抗體可直接或間接地例如通過另一種抗體而聯(lián)接到直接或間接刺激凝血的因子。
針對此用途的優(yōu)選凝血因子是組織因子(TF)和TF衍生物，例如截短TF(tTF)、二聚、三聚、聚合/多聚TF和活化因子VII的能力缺陷的變種TF。其它合適的凝血因子包括維生素K依賴性凝血劑，例如因子ΙΙ/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa ;缺乏 Gla修飾的維生素K依賴性凝血因子；羅素(Russell' s)蝮蛇蛇毒因子X活化劑；小板活化化合物，如血栓素A2和血栓素A2合酶；和纖溶抑制劑，如α 2-抗血漿素?？傮w而言，截短的組織因子(tTF)是目前優(yōu)選的。
免疫軛合物和免疫毒素的制備一般在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知(參見例如美國專利號 4，340，535)。以下各專利進一步以引用方式并入本文，目的是在免疫毒素的生成、純化和使用方面更進一步補充本教示美國專利號6，004，554 ;5，855，866 ;5，965，132 ;5，776，427 ； 5，863，538 ;5，660，827 和 6，051，230。
各種各樣的化療劑和其它藥理劑也可以成功地與本發(fā)明的CXCR4抗體治療劑軛合。已與抗體軛合的示例性抗腫瘤藥劑包括阿霉素、柔紅霉素、氨甲蝶呤和長春花堿。此外，其它藥劑的附著，如新制癌菌素，大分子霉素，三亞胺醌(trenimon)和α -鵝膏菌素 (a -amanitin)已被描述(見美國專利號5，660，827 ;5，855，866 ;和5，965，132 ;全部并入本文)。
凝血配體的制備也可以容易地進行。一個或多個凝血因子與本發(fā)明抗CXCR4抗體的操作性締合可能是一種直接鏈接，例如上文針對免疫毒素所述那些?；蛘撸摬僮餍跃喓峡赡苁且环N間接附著，例如在抗體操作性附著到第二結(jié)合區(qū)(優(yōu)選是抗體或抗體的抗原結(jié)合區(qū))的情況下，所述結(jié)合區(qū)結(jié)合到凝血因子。特別在用共價鍵來接合分子的情況下，凝血因子應(yīng)該在不同于其功能性混凝位點處結(jié)合到本發(fā)明的抗CXCR4抗體上。
在本發(fā)明的方法中也可采用雙特異或三特異抗體。在這種抗體中，一個臂結(jié)合到 CXCR4并且是本發(fā)明的抗體。制備雙特異抗體的方法眾所周知并且在本領(lǐng)域中有所描述。
在免疫軛合物、免疫毒素和凝血配體的制備過程中，可以采用重組表達。編碼本發(fā)明的所選抗CXCR4抗體以及治療劑、毒素或凝血劑的核酸序列在框架內(nèi)附著至表達載體。 因此，重組表達導(dǎo)致核酸的翻譯從而生成所需的免疫軛合物?；瘜W(xué)交聯(lián)劑和抗生物素蛋白 生物素橋也可以將治療劑與本發(fā)明的抗CXCR4抗體結(jié)合。
本發(fā)明的組合物和方法可以用于其它治療劑和診斷劑的組合中。就生物藥劑、優(yōu)選診斷劑或治療劑來說，對于與根據(jù)本發(fā)明的抗CXCR4抗體“聯(lián)合”使用，簡潔地用術(shù)語" 聯(lián)合"來涵蓋實施方案的范圍。除非另有明確說明或用科學(xué)術(shù)語清楚表明，否則術(shù)語"聯(lián)合"適用于組合的組合物、藥品、混合藥劑、試劑盒、方法和第一和第二的醫(yī)療用途的各種形式。
本發(fā)明的"組合的”實施方案因此包括例如這樣的情況，本發(fā)明的抗CXCR4是裸抗體并且與未操作性結(jié)合至其的藥劑或治療劑聯(lián)合使用。在這種情況下，此藥劑或治療劑可以非靶向或靶向形式來使用。在“非靶向形式”中，藥劑、特別是治療劑一般將根據(jù)它們在本領(lǐng)域中的標(biāo)準用途使用。在"靶向形式"中，藥劑一般將操作性附著于不同抗體或靶向區(qū)， 所述祀向區(qū)將藥劑或者治療劑遞送到達祀標(biāo)疾病位點。生物藥劑(診斷劑和治療劑)的這種靶向形式的使用在本領(lǐng)域中也是相當(dāng)標(biāo)準的。
在本發(fā)明的其它“組合的”實施方案中，本發(fā)明的抗CXCR4抗體是一種免疫軛合物，其中抗本身與藥劑或者治療劑操作性締合或組合。操作性附著包括如本文所述和本領(lǐng)域內(nèi)已知的直接或間接的所有附著形式。
"組合的"使用，特別對于本發(fā)明的抗CXCR4抗體和治療劑的組合，還包括組合的組合物，藥品，混合藥劑，試劑盒，方法，和第一和第二醫(yī)療用途，其中治療劑以藥物前體的形式出現(xiàn)。在這種實施方案中，能夠?qū)⑺幬锴绑w轉(zhuǎn)化為藥物的功能性形式的活化成分可能再次與本發(fā)明的抗CXCR4抗體操作性締合。
在某些優(yōu)選的實施方案中，治療性的組合物，組合，藥物，混合藥劑，試劑盒，方法和第一和第二醫(yī)療用途將 會是"藥物前體組合"。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除非另有說明，否則術(shù)語"藥物前體組合"是指本發(fā)明的抗體操作性附著到能夠?qū)⑺幬锴绑w轉(zhuǎn)化為藥物的組合物，而不是抗體附著到藥物前體本身。然而，沒有要求本發(fā)明的藥物前體必需作為藥物前體組合來使用。因此，藥物前體可以按它們在本領(lǐng)域內(nèi)使用的任何方式來使用，包括 ADEPT和其它形式。
因此，當(dāng)描述組合的組合物、藥品、混合藥劑、試劑盒、方法和第一和第二醫(yī)療用途時，優(yōu)選對于診斷性的藥劑，并且更優(yōu)選治療劑，所述組合包括其為裸抗體和免疫軛合物的抗CXCR4抗體的組合，而且其中本發(fā)明的體內(nèi)實施方案的實踐涉及在先、同時或隨后施用裸抗體或免疫軛合物和生物藥劑、診斷劑或治療劑；只要以某種軛合或非軛合形式，實現(xiàn)某種形式的抗體和某種形式的生物藥劑、診斷劑或治療劑的全部提供。
本發(fā)明對腫瘤的效果的上述和其它解釋為了簡明解釋操作、附著藥劑等等的組合模式。此說明性方法不應(yīng)視為對本發(fā)明的抗-CXCR4抗體的有益性質(zhì)的保守描述或過分簡化。因此應(yīng)理解,這種抗體本身具有抗-CXCR4性質(zhì)并且這種抗體的免疫軛合物將保持這些性質(zhì)并將它們與所附著藥劑的性質(zhì)組合；此外，抗體和任何附著藥劑的組合效果通常將會被增強或/和放大。
本發(fā)明因此提供組合物、藥品組合物、治療性試劑盒和藥用混合藥劑，其任選在至少第一組合物或容器中包含生物有效量的本發(fā)明的至少第一抗-CXCR4抗體、或此抗-CXCR4抗體的抗原結(jié)合片段或免疫軛合物；以及生物有效量的至少第二生物藥劑、成分或系統(tǒng)。
"至少第二生物藥劑、成分或系統(tǒng)"將往往是治療性或診斷性的藥劑、成分或系統(tǒng)，但非必需如此。例如，至少第二生物藥劑、成分或系統(tǒng)可包含用于修飾抗體和/或用于將其它藥劑附著至抗體的成分。某些優(yōu)選的第二生物藥劑、成分或系統(tǒng)是用于制作和使用藥物前體的藥物前體和成分，(其包括用于制作藥物前體本身的成分和用于使本發(fā)明的抗體適于在此類藥物前體或ADEPT實施方案中發(fā)揮作用的成分)。
當(dāng)治療劑或診斷劑作為至少第二生物藥劑、成分或系統(tǒng)被包括時，這種治療劑或診斷劑將通常是與一個或多個上文定義的疾病的治療或診斷聯(lián)合使用的那些。
因此，在某些實施方案中"至少第二治療劑"將包括治療性的試劑盒或者混合藥劑。這個術(shù)語是根據(jù)本發(fā)明的抗CXCR4抗體為第一治療劑。與本發(fā)明相對應(yīng)的合適成為" 至少第二治療劑"的治療性地藥劑在上文與免疫軛合物聯(lián)系著被討論。
對于本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或藥物而言，治療劑的組合的有效數(shù)量可能被包含在單個容器或容納方式中，或被包含在不同的容器或容納方式內(nèi)?；旌纤巹┩ǔ１换旌显谝黄鹨员憬M合使用。配制用于靜脈注射施用的藥劑通常是優(yōu)選的。成像成分也可被包括在內(nèi)。該試劑盒還可包含對使用至少第一抗體和包括在內(nèi)的一個或多個其它生物藥劑的說明書。
總體而言，至少第二治療劑可與本發(fā)明的抗-CXCR4抗體大體同時地施用于動物或患者；例如從單一藥物組合物或從一起施用的兩種藥物組合物。
或者，至少第二治療劑可以在施用本發(fā)明的抗C X C R4抗體之后隨即地施用于動物或患者。如本文所用，“之后隨即地”指"錯開"，使得至少第二治療劑對動物或者患者的施用在時間上不同于本發(fā)明的抗C XCR 4抗體的施用。一般來說，這兩個藥劑以有效間隔的時 間施用，從而發(fā)揮兩個藥劑各自的治療效果，即，它們以"生物有效時間間隔"來施用。至少第二治療劑可以在生物有效時間上早于本發(fā)明的抗C XCR 4抗體、或在生物有效時間上順序于該治療劑來被施用于動物或患者。
因此，本發(fā)明提供治療罹患腫瘤的動物或患者的方法，所述方法包括
(a)使動物或患者經(jīng)受顯著降低腫瘤負荷的第一治療；和
(b)隨后施用本發(fā)明的至少第一抗-CXCR4抗體、或其抗原結(jié)合片段；任選地，其中抗體或片段與第二治療劑操作性締合。
優(yōu)選的第一治療包括手術(shù)切除和化療干預(yù)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供治療罹患CXCR4-介導(dǎo)病癥的動物或患者的方法， 所述方法包括
(a)使動物或患者經(jīng)受顯著降低CXCR4介導(dǎo)的負荷如炎癥的第一治療；和
(b)隨后施用本發(fā)明的至少第一抗-CXCR4抗體、或其抗原結(jié)合片段；任選地，其中抗體或片段與第二治療劑操作性締合。
在某些其它實施方案中，本發(fā)明的抗體和免疫軛合物可與一個或多個診斷劑(通常是用于與上文定義的病癥的診斷聯(lián)合使用的診斷劑)組合。因此一系列診斷性組合物、 試劑盒和方法被包括在本發(fā)明中。
其它方面是對受試者診斷或成像的方法，所述方法包含將適當(dāng)量的本文定義的本發(fā)明抗體或其它蛋白施用于受試者，和檢測受試者中本發(fā)明的抗體或其它蛋白的存在和/ 或量和/或位置。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供減輕動物體內(nèi)與CXCR4表達相關(guān)的免疫抑制的方法，所述方法包含以在所述動物體內(nèi)有效形成所述抗體和CXCR4的復(fù)合物的量向所述動物施用本發(fā)明的抗體、或其免疫軛合物，從而減輕動物體內(nèi)與CXCR4表達相關(guān)的免疫抑制。
將根據(jù)上述使用和方法來成像或診斷的合適的疾病包括如本文另外所述的與 CXCR4相關(guān)的任何疾病，并且優(yōu)選是如本文另外所述的任何癌癥。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供診斷動物中的疾病的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使取自所述動物的測試樣品與本發(fā)明的抗體或其免疫軛合物接觸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供診斷動物中的疾病的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使取自所述動物的測試樣品與本發(fā)明的抗體或其免疫軛合物接觸；
(b)測量或檢測在該測試樣品中抗體-抗原復(fù)合物的存在和/或量和/或位置； 任選地，
(c)與對照組比較抗體-抗原復(fù)合物的存在和/或量。
在上述方法中，所述接觸步驟是在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下進行。適當(dāng)?shù)臈l件可容易地由所述領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。
在以上方法中，可以使用任何適當(dāng)?shù)臏y試樣品，例如活檢細胞，疑似被疾病影響的組織或器官，或組織切片。
在某些上述方法中，測試樣品中任何量的抗體-抗原復(fù)合物的存在將指示疾病的存在。優(yōu)選地，對于待進行的積極診斷，測試樣品中抗體-抗原復(fù)合物的量多于、優(yōu)選顯著多于合適的對照樣品中的量。更優(yōu)選地，顯著更大水平是統(tǒng)計上顯著的，優(yōu)選的是概率值 < O. 05。確定統(tǒng)計顯著性的適當(dāng)方法眾所周知并在本領(lǐng)域中有所記錄，并且可以使用它們中的任何一種。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地選擇合適的對照樣品，例如，在診斷特定疾病的情況下，合適的對照樣品將是來自沒有罹患該疾病的受試者的樣品。例如，通過引用本領(lǐng)域中已知的正常受試者的范圍，合適的對照"數(shù)值"也可被容易地確定，而不需每個測試中都操作對照"樣品"，。
為了在診斷或成像應(yīng)用中使用，本發(fā)明的抗體可用可檢測標(biāo)記標(biāo)簽(，例如輻射不透過標(biāo)簽或放射性同位素，如3H，14C，32P，35S，123I，125I，131I ;放射性發(fā)射體(例如，a、β或Y 發(fā)射體)；熒光(熒光團)或化學(xué)發(fā)光(發(fā)色團)化合物，如異硫氰酸熒光素，羅丹明或熒光素；酶，如堿性磷酸酶，β半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；成像劑；或金屬離子；或化學(xué)部分，如生物素，其可以通過與特異性同源可檢測部分(例如被標(biāo)記的抗生物素蛋白/鏈霉親和素)結(jié)合而被檢測)進行標(biāo)簽。將標(biāo)簽附著于結(jié)合蛋白(例如，抗體或者抗體片段)的方法是本領(lǐng)域中已知的。這種可檢測的標(biāo)記允許檢測測試樣品中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的存在，數(shù)量或位置。
體內(nèi)使用的優(yōu)選可檢測標(biāo)記包括可X射線檢測的化合物，例如鉍(III)、金(III)、鑭(in)或鉛(II);放射性離子，例如銅67、鎵67、鎵68、銦m、銦113、碘123、碘125、碘131、汞197、 汞203、錸186、錸188、銣97、銣103、锝99或釔90 ;核磁自旋共振同位素，例如鈷(II)，銅(II)、鉻 (III)、鏑(III)、鉺(III)、釓(III)、欽(III)、鐵(II)、鐵(III)、鎂(II)、釹(III)、鎳(II)、 釤(III)、鋱(III)、釩(II)或鐿(III);或羅丹明或熒光素。
本發(fā)明還包括診斷劑或成像劑，其包含附著到標(biāo)簽從而直接或間接產(chǎn)生檢測信號的本發(fā)明的抗體。合適的標(biāo)簽本文另有描述。
本發(fā)明進一步包括試劑盒，其包含一種或多種本發(fā)明的抗體、免疫軛合物或組合物或編碼本發(fā)明的抗體的一種或多種核酸分子，或包含本發(fā)明的核酸序列的一種或多種重組表達載體，或包含重組表達載體或本發(fā)明的核酸序列的一種或多種宿主細胞或病毒。優(yōu)選的所述試劑盒是用于本文所述的方法和用途，如本文所述的治療、診斷性或成像的方法， 或用于本文所述體外試驗或方法。此類試劑盒中的抗體優(yōu)選是如本文另外所述的抗體軛合物，例如，可能軛合到可檢測性基團或可能是免疫軛合物。優(yōu)選地，所述試劑盒包含針對例如在診斷中使用試劑盒組件，的說明書。優(yōu)選地，所述試劑盒是用于診斷或治療本文另外所述的疾病，并且任選地包含針對使用試劑盒成分來診斷或治療這種疾病的說明書。
本文所定義的本發(fā)明的抗體還可能用作體外或體內(nèi)應(yīng)用和試驗的分子工具。由于抗體擁有抗原結(jié)合位點，這些抗體可以充當(dāng)特異性結(jié)合對的成員并且這些分子可以用于需要特定結(jié)合對成員的任何試驗中。
因此，本發(fā)明的其它方面提供包含本文所述的本發(fā)明抗體的試劑和這種抗體作為分子工具例如在體外或體內(nèi)試驗中的用途。
癌癥治療也可以通過以下進行
(a)通過以下方式形成腫瘤的圖像向罹患腫瘤的動物或患者施用診斷量的本發(fā)明至少一種可檢測-標(biāo)簽的抗-CXCR4抗體，包含操作性附著到本發(fā)明的抗-CXCR4抗體的診斷劑，從而形成可檢測的腫瘤圖像；和，
(b)隨后向同一動物或患者施用治療優(yōu)化量的本發(fā)明至少第一裸抗-CXCR4抗體或使用該抗體的治療劑-抗體構(gòu)造，從而導(dǎo)致抗腫瘤效果。
線。
線。
線。
劃線。現(xiàn)將結(jié)合各表和附圖在以下非限制性實例中更詳細描述本發(fā)明，其中表1列出本文公開的涉及抗體C-9P21的一些序列，表2列出本文公開的涉及抗體B-1 M 22的一些序列，表3列出本文公開的涉及抗體C-1I24的一些序列，表4列出本文公開的涉及抗體D-1K21的一些序列，表5列出本文公開的涉及抗體9N10的一 些序列，表6列出本文公開的涉及IgG形式的抗體C-9P21的一些序列?？勺儏^(qū)帶有下劃表7列出本文公開的涉及IgG形式的抗體B-1M22的一些序列?？勺儏^(qū)帶有下劃表8列出本文公開的涉及IgG形式的抗體C-1I24的一些序列。可變區(qū)帶有下劃表9列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體D-1K21的一些序列?？勺儏^(qū)帶有下
表10列出本文公開的涉及IgG形式的抗體9N10的一些序列。可變區(qū)帶有下劃線。
表11列出了本文公開的涉及其它本發(fā)明的的抗體的一些序列。


圖1顯示無性系C-9P21的尤其重和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通過 Ncol/Notl位點克隆到pH0G21。用于初始克隆的限制性位點(Nco1、HindII1、MluI和NotI) 是斜體并帶有下劃線。VH和VL之間的鏈接序列是斜體。c-myc抗原表位和6_His分別帶有下劃線和雙下劃線。
圖2顯示無性系B-1M22的尤其重和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通過 Ncol/Notl位點克隆到pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點(NcoI, HindIII, MluI和 NotI)是斜體并帶有下劃線。VH和VL之間的鏈接序列是斜體。c-myc抗原表位和6-His分別帶有下劃線和雙下劃線。
圖3顯示無性系C-1I24的尤其重和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通過 Ncol/Notl位點克隆到pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點(NcoI, HindIII, MluI和 NotI)是斜體并帶有下劃線。VH和VL之間的鏈接序列是斜體。c-myc抗原表位和6-His分別帶有下劃線和雙下劃線。
圖4顯示無性系D-1K21的尤其重和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通過 Ncol/Notl位點克隆到pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點(NcoI, HindIII, MluI和 NotI)是斜體并帶有下劃線。VH和VL之間的鏈接序列是斜體。c-myc抗原表位和6-His分別帶有下劃線和雙下劃線。圖5顯示無性系9N10的尤其重和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。ScFV是通過NcoI/ NotI位點克隆到pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點(NcoI, HindIII, MluI和NotI) 是斜體并帶有下劃線。VH和VL之間的鏈接序列是斜體。c-myc抗原表位和6_His分別帶有下劃線和雙下劃線。
圖6A 顯示 EasyCyte 染色，其證明 B-1M22、C-9P21、C-1I24 和 D_lK21scFv 無性系與CXCR4轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染的HEK293細胞系的結(jié)合。圖6B顯示EasyCyte染色，其證明B-1M22、 C-9P2UC-1I24和D_lK21scFv無性系與CXCR4轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染的DT40細胞系的結(jié)合。圖6C 顯示EasyCyte染色，其證明C_9P21、9N10和F7IgG無性系與Ramos和CCRF-CEM細胞系的彡口口
圖7A顯示在有和沒有配體和AMD-3100競爭的情況下分別使用O. 5μ gB_lM22、 C-9P21、C-1I24 和 D_lK21scFv 無性系的 IO5Jurkat 細胞的 EasyCyte 染色。圖 7B 顯示在有和沒有配體和AMD-3100競爭的情況下分別使用O. 5μ g B-1M22、C-9P21、C-1I24和 D-1K2IscFv無性系的IO5Ramos細胞的EasyCyte染色。圖7C顯示在有和沒有競爭的情況下分別使用O.1 μ g C-9P2U9N10和F7IgG無性系的IO5CCRF-CEm細胞的EasyCyte染色。
圖8A顯示使用0.5yg C1I24(虛線)、B_1M22(深色實線)和F7(淺色實線)對比 PBS (深色陰影)的IO5CCRF-CEm細胞的EasyCyte染色。圖8B顯示使用O. 5 μ gD_lK21 (虛線)、C-9P21 (深色實線)和F7 (淺色實線)對比PBS (深色陰影)的IO5CCRF-CEm細胞的 EasyCyte染色。所有的抗體為IgGl格式并且通過山羊抗人IgGrPE 二級抗體檢測結(jié)合。
圖 9 顯示 B-1M22、C-9P21、C-1I24 和 D-1K21 與瞬時表達小鼠 CXCR4 的 HEK293T/17細胞的結(jié)合。標(biāo)記為“福吉因(Fugene) ”的各列為用不含DNA的轉(zhuǎn)染試劑處理的細胞。該列用作陰性對照物。
圖10 顯示 EasyCyte 實驗，其中 B-1M22、C-9P21、C_1I24 和 D-1K21 的 scFv 無性系被滴定于CCRF-CEM細胞上以確定用于Ca++通量試驗的最佳濃度。
圖11A、圖11B、圖1lC和圖1lD和圖1lE顯示CCER-CEM細胞上(標(biāo)記為Fluo-4) Ca++通量試驗的結(jié)果?？贵wB-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21在scFv水平(圖11A)和 IgG水平(圖11B，圖1lC和圖11D)上測試，無性系9N10在IgG水平上測試(圖11E)。在添加 CXCR4 特異性配體 SDF-1 α 之前，用 4 μ g/ml scFvs (圖 11A)或 10 μ g/ml 和 100 μ g/ ml IgGs (圖 11B，圖1lC 和圖 11D)，或者 I μ g/ml 和 10 μ g/mlIgGs ( 11Ε)將細胞預(yù)培育 15分鐘。信號記錄開始于添加配體約10秒之后。曲線下的面積(AUC)被積分并繪制為針對僅SDF-1 α的最大刺激的AUC百分比。
圖12Α和圖12Β顯示CCER-CEM細胞中(標(biāo)記為Fluo_4) Ca++通量試驗的結(jié)果?？贵wC-9P21和9N10在IgG水平上測試。在添加CXCR4特異性配體SDF-1 α之前，用不同濃度的抗體將細胞預(yù)培育15分鐘。信號記錄開始于在添加配體約10秒之后。圖12Α顯示一系列濃度下的信號衰減。圖12Β顯示原始數(shù)據(jù)。
圖13顯示抗_CXCR4scFv C-9P21對配體(SDF-1 α )誘導(dǎo)的細胞遷移的抑制。用 BATDA標(biāo)記的人類T細胞白血病CCRF-CEM細胞在博伊登(Boyden)室內(nèi)被誘導(dǎo)而遷移，其中 SDF-1配體置于下室并且細胞與僅作為對照物的抗體或培養(yǎng)基在上室中共培育。在Triton X-100誘導(dǎo)的細胞溶解之后，通過熒光強度來檢測遷移到下室的細胞。繪制三次重復(fù)試驗的平均值和SD值。
圖14A、圖 14B 和圖 14C 顯示通過抗-CXCR4 抗體 B-1M22、C-9P21、C_1I24 和 D-1K21 的 ADCC 誘導(dǎo)。針對 C-9P21 和 D-lK21(a)的 scFv，和 C-9P21 和 D-1K21 (b)的 IgG，和 B-1M22 和C-1I24的IgG示出CCRF-CEM細胞的劑量響應(yīng)殺傷。
圖15A和圖15B顯示測試抗體B-1M22、C-9P21、C_1I24和D-1K21誘導(dǎo)CDC的能力的試驗結(jié)果。針對B-1M22和C-1I24的IgG示出了在人血清存在下Ramos細胞的劑量響應(yīng)殺傷(圖15A)。C-9P21和D-1K21不誘導(dǎo)CDC(圖15B)。作為對照，使用IgG形式的抗體 F7。
圖16A顯示用膜聯(lián)蛋白V進行的抗-CXCR4抗體B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21 的凋亡活性分析。作為對照，使用抗體F7和星形孢菌素(Staurosporin) (S ;25nM)。沒有抗體和星形孢菌素加入的陰性對照(背景水平)顯示于列O中。淺灰色陰影死亡細胞總量，對膜聯(lián)蛋白V和PI均為陽性，深灰色陰影定義為對膜聯(lián)蛋白V陽性但對PI陰性的凋亡細胞。圖16B顯示用膜聯(lián)蛋白V進行的抗-CXCR4抗體C-9P21和9N10的凋亡活性分析。 作為對照，使用抗體F7。輕淺灰色陰影死亡細胞總量，對膜聯(lián)蛋白V和PI均為陽性，深灰色陰影定義為對膜聯(lián)蛋白V陽性但對PI陰性的凋亡細胞。
具體實施方式
實施例1:新型抗體
五個可以特異性地結(jié)合到CXCR4的人抗體被確定。所述抗體的單鏈形式被克隆進入其中含有c-myc和6xHis標(biāo)記抗原表位的pH0G21質(zhì)粒(Kipriyanov et al. , 1997)。TGl細菌被轉(zhuǎn)化，并在IPTG誘導(dǎo)后表達單鏈抗體。純化抗體的結(jié)合通過EasyCyte確認。
產(chǎn)生無性系的抗體的重和輕鏈的核苷酸序列被測序?？贵w被指定為C-9P21、 B-1M22、C-1I24、D-1K21和9N10。C-9P21的核苷酸序列和輕，重鏈的氨基酸序列示于圖1。 C-9P21的輕、重鏈的⑶R區(qū)域示于表I。B-1M22的核苷酸序列和輕、重鏈的氨基酸序列示于圖2。B-1M22的輕、重鏈的⑶R區(qū)域示于表2。C-1124的核苷酸序列和輕，重鏈的氨基酸序列示于圖3。C-1I24的輕、重鏈的⑶R區(qū)域示于表3。D-1K21的核苷酸序列和輕，重鏈的氨基酸序列示于圖4。D-1K21的輕、重鏈的⑶R區(qū)域示于表4。9N10的核苷酸序列和輕，重鏈的氨基酸序列示于圖5。9N10的輕、重鏈的⑶R區(qū)域示于表5。
還制備了抗體 C-9P21、B-1M22、C-1I24、D-1K21 和 9N10 的 IgG 格式。IgG 形式是IgGl同種型，并且它包含兩個重鏈和兩個輕鏈。各重鏈包含VH域SEQ ID NO :69(對應(yīng) C-9P21)，SEQ ID NO 71 (對應(yīng) B-1M22)，SEQ ID NO 73 (對應(yīng) C-1I24)，SEQ ID NO 75 (對應(yīng)D-1K21)或SEQ ID NO :69 (對應(yīng)9N10)和人IgGl恒定區(qū)。各輕鏈包含'域SEQ ID NO :70(對應(yīng) C-9P21)，SEQ ID NO :72 (對應(yīng) B-1M22)，SEQ ID NO :74 (對應(yīng) C-1I24)，SEQ ID NO :76(對應(yīng)D-1K21)或SEQ ID NO : 103 (對應(yīng)9N10)和人λ輕鏈恒定區(qū)(對應(yīng)Β-1Μ22和 C1I24)或人類 K 輕鏈恒定區(qū)(對應(yīng) C-9P21，D-1K21 和 9Ν10)。C-9P21、Β-1Μ22、C-1I24、 D-1K21的9Ν10的全長IgG序列的分別示于表6、7、8、9和10。
細胞和細胞培養(yǎng)
CCRF-CEM(急性淋巴細胞白血病，ATCC 號碼 CCL 119)、ΗΕΚ293Τ/17 (人腎，ATCC 號碼 CRL 11268、Ramos (伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’ s leukemia)，ATCC 號碼 CRL-1596)、 Jurkat 6E-1 (人體T細胞白血病，ATCC ECACC)和DT40 (雞淋巴瘤，ATCC號碼CRL-2111)細胞系得自美國典型組織培養(yǎng)庫(American Type Culture Collection) (ATCC,羅克維爾市， 馬里蘭州(Rockville，MD))。CCRF-CEM、Ramos、Jurkat 和 DT40 細胞被維持于 RPM1-1640 培養(yǎng)基中，并且HEK293T細胞被維持于達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM))培養(yǎng)基中。所有細胞均用胎牛血清維持，對DT40和HEK293T細胞，濃度為10%，并且對CCRF-CEM細胞、Jurkat和Ramos細胞，濃度為20%。所有培養(yǎng)基都用青霉素和鏈霉素補充。
Ramos和Jurkat細胞每周分裂三次,經(jīng)48小時生長達到3xl05細胞/毫升并且在周末達到2xl05細胞/毫升。
CCRF-CEM細胞每周分裂三次，經(jīng)48小時生長達到3xl05細胞/毫升并在周末達到 2xl05細胞/毫升。
HEK293Y/17細胞每周分裂二至三次，經(jīng)48小時生長達到3. 2xl05細胞/毫升并在周末達到2. 7xl05細胞/毫升。
為瞬時轉(zhuǎn)染，HEK293T/17細胞以每個T75燒瓶中2xl06細胞接種。接種48小時后，所述細胞用Fugene(羅氏(Roche))轉(zhuǎn)染。每個T75使用40 μ I Fugene和16 μ gDNA。 轉(zhuǎn)染48小時后使用細胞進行分析。
實施例2 :抗體無件系與CXCR4表汰細胞結(jié)合的特異件
四個抗體B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21，在scFv水平上通過它們結(jié)合CXCR4 表達細胞的能力來測試它們的CXCR4特異性。轉(zhuǎn)化的細胞與它們未轉(zhuǎn)化的同類僅僅區(qū)別在 CXCR4的表達。
材料和方法
DT40和HEK293T/17細胞如上文所述那樣維持。
從培養(yǎng)瓶中收集DT40+CXCR4、HEK293T/17+CXCR4、DT40 和 HEK293T/17 細胞，用 PBS 洗滌2遍(400xg，5min，4°C )并且再懸浮于含O. 2% BSA和O. 09% NaN3的PBS中。IxlO5細胞/孔被等分裝入V-型96孔板(葛來娜第一生化(Greiner Bio-One), Frikenhausen,德國)。細胞經(jīng)離心(400x g, 5min, 4°C )并且再懸浮于50 μ I ScFvs (10 μ g/ml)的PBS (含 O. 2% BSA 和 O. 09% NaN3)。培育 I 小時(4。。)后，所述細胞用 100 μ IPBS (含 O. 2% BSA 和 O. 09% NaN3)洗滌3遍并且用自制哺乳動物抗c_Myc抗體(2. 5 μ g/ml)來染色。培育I小時(4°C)后，細胞用100 μ I PBS (含O. 2% BSA和O. 09% NaN3)洗滌3遍并且在4°C下用在 PBS (含O. 2% BSA和O. 09% NaN3)中稀釋至5 μ g/ml的RPE軛合山羊抗小鼠IgG (F0479, Dako，丹麥)培育30分鐘。細胞被洗滌，再懸浮于200 μ I PBS (含O. 2 % BSA和O. 09 % NaN3),并且轉(zhuǎn)移至一個 U-型 96 孔板(Costar,康寧(Corning), Schiphol-Ri jik,荷蘭)以便使用Easy Cyte裝置(Guava科技,海沃德(Hayward),加利福尼亞(CA),美國)進行流式細胞計量。
益果
除轉(zhuǎn)化的HEK細胞上的B-1M22外，所有四個無性系顯示對轉(zhuǎn)染細胞系的特異性結(jié)合(見圖6A和6B)，(但B-1M22抗體顯示對DT40轉(zhuǎn)染細胞的特異性結(jié)合)。應(yīng)當(dāng)注意指出的是已知CXCR4根據(jù)表達它的細胞系而具有發(fā)展稍有不同的構(gòu)象的趨勢(Baribaud等， 2001)。這一事實很可能在不同的細胞系中造成不同的結(jié)果。在這些實驗中，無性系C-9P21一般是最佳結(jié)合者。
此外，如下文所述，無性系9N10、C-9P21和F7在LgG水平上測試它們結(jié)合天然表達 CXCR4 的細胞(Ramos，C CRF-CEM)的能力。
材料和方法
Ramos和CCRF-CEM細胞在上文所述條件下培養(yǎng)。
從培養(yǎng)瓶中收獲細胞，用PBS洗滌2遍(350xg，5min，4°C )并且再懸浮于含0. 2% BSA和0. 09% NaN3的PBS中。IxlO5細胞/孔被等分裝入V-型96孔板(葛來娜第一生化 (Greiner Bio-One), Frikenhausen,德國)。細胞經(jīng)離心(350x g, 5min, 4°C )并且再懸浮于 50 μ I LgG (50 μ g/ml)的 PBS (含 0. 2% BSA 和 0. 09% NaN3)。以 12 個點和 3 倍稀釋液進行滴定。培育I小時(4°C)后，細胞用PBS(含0.2% BSA和0.09% NaN3)洗滌3遍并且在4°C下用在PBS(含0.2% BSA和0.09% NaN3)中稀釋至2. 5 μ g/ml的RPE軛合山羊抗小鼠IgG(F0479, Dako，丹麥)培育30分鐘。細胞被洗滌，再懸浮于200 μ I PBS(含O. 2% BSA 和 0. 09% NaN3)，并且轉(zhuǎn)移至 U-型 96 孔板(Costar,康寧(Coming)，Schiphol-Rijik, 荷蘭)以便Easy Cyte儀器(Guava科技,海沃德(Hayward),加利福尼亞(CA),美國)進行流式細胞計量。
在這個實驗中，所有3個無性系以劑量依賴方式識別所述細胞系(見圖6C)。當(dāng)與 9N10和C-9P21相比時，F(xiàn)7表現(xiàn)略微更佳地結(jié)合兩個細胞系。
實施例3 :抗CXCR4抗體干擾配體結(jié)合
四個抗體B-1M22、C-9P21、C-1I24和D-1K21在scFv水平上在存在和缺乏特異性結(jié)合到CXCR4的兩種分子的情況下，通過它們結(jié)合到CXCR4轉(zhuǎn)染細胞和組成型表達CXCR4 的類淋巴母細胞的能力來測試它們的CXCR4特異性。一種分子是SDF-1，CXCR4的天然配體，另一種是AMD3100，對SDF-1 α與CXCR4結(jié)合的高度特異性競爭性抑制劑。
材料和方法:
Jurkat和Ramos細胞如上文所述那樣維持。
scFv無性系大規(guī)模表達并通過SEC分餾純化為單體部分。從培養(yǎng)瓶中收獲天然 CXCR4+表示細胞系Jurkat和Ramos，用PBS (用O. 2 % BSA和O. 09 % NaN3緩沖液補充)洗滌 2遍并且以IxlO5細胞/孔被等分裝入V-型96孔板(葛來娜第一生化(Greiner Bio-One), Frikenhausen,德國)。細胞通過離心(400x g,5min)沉淀然后在4°C下在PBS (用O. 2% BSA 和O. 09% NaN3緩沖液補充)中用稀釋至10 μ g/ml的I μ gSDF-1 a (PeproTech EC,倫敦， 英國)和50 μ I scFv培養(yǎng)60分鐘，SDF-1 α和scFv兩者被同時加入細胞。沒有配體的樣品或157 μ gAMD3100作為CXCR4特異性的對照，因為AMD3100僅結(jié)合到這種受體。AMD3100 和scFv同時被加入細胞。在400g離心步驟5分鐘之后吸走上清液，并且細胞用100 μ I PBS (用O. 2 % BSA和O. 09 % NaN3補充)再洗滌兩遍并進行離心步驟(400g，5分鐘)，然后在 4°C下用在PBS (含用O. 2% BSA和O. 09% NaN3補充)中稀釋至2.5yg/ml的50 μ I自制抗 c-Myc培育I小時。在用PBS (用O. 2% BSA和O. 09% NaN3補充)洗滌3遍之后，細胞用在 PBS (含O. 2% BSA和O. 09%NaN3)中稀釋至5 μ g/ml的rPE軛合山羊抗小鼠IgG (BD生物科學(xué)(Biosciences))染色并且在4°C下培育30分鐘。細胞被再次洗滌并且用200 μ IPBS(含 O. 2% BSA和O. 09% NaN3)再懸浮，并且被轉(zhuǎn)移至U-型96孔板(Costar,康寧(Corning)， Schiphol-Rijik,荷蘭)以便使用Easy Cyte儀器(Guava科技,海沃德(Hayward),加利福尼亞(CA)，美國)進行流式細胞計量。
結(jié)果:
四個無性系中的三個(除B-1M22外)顯示與兩個細胞系的特異性結(jié)合。所有三個結(jié)合克隆還同時被SDF-1和AMD3100抑制，但競爭程度不同(見圖7A(Jurkat細胞)和圖7B(Ramos細胞))。這表明所述無性系結(jié)合到作為天然配體的大致相同結(jié)合位點，并且可能具有生物效應(yīng)。對于B-1M22，結(jié)合水平太低以致不需對結(jié)合或競爭進行說明。然而，如以下的實例所示，B-1M22是本文所述的在CCRF-CEM細胞上結(jié)合CXCR4方面最佳的結(jié)合者之一(見實施例4和圖8A)。此外，認為CXCR4根據(jù)表達它的細胞系有發(fā)展稍微不同的構(gòu)象的趨勢是對由B-1M22所得數(shù)據(jù)的解釋?？梢宰⒁獾紺-9P21和C-1I24很好地結(jié)合到所有被測試的細胞種類，表明它們具有結(jié)合到多種構(gòu)象的CXCR4的能力，這可能是非常有利的。
在另一個的實驗中，如下文所述，三種抗體9N10、C_9P21和F7在IgG水平上，在存在和缺乏SDF-1 (特異性結(jié)合到CXCR4的分子)的情況下，通過它們結(jié)合天然表達CXCR4的 CCRF-CEM細胞的能力來測試它們的CXCR4特異性。
材料和方法:
CCRF-CEM細胞如上文所述那樣維持。
從培養(yǎng)瓶中收獲天然表達CXCR4+的CCRF-CEM細胞系，用PBS(由0.2% BSA和 0. 09% NaN3緩沖液補充)洗滌2遍并且以IxlO5細胞/孔被等分裝入V-型96孔板(葛來娜第一生化(Greiner Bio-One), Frikenhausen,德國)。細胞通過離心(350g,5min)沉淀然后在4°C下用在PBS(由0.2% BSA和0.09% NaN3緩沖液補充)中稀釋至2 μ g/ml的4yg、I μ g、0. 5μ g SDF-1 a (PeproTech EC，倫敦，英國)和 50 μ I IgG 培育 60 分鐘，SDF-1 α 和 IgG兩者被同時加入細胞。無配體樣品作為對照。在350g離心步驟5分鐘之后吸走上清液，并且細胞用150 μ I PBS (含O. 2% BSA和O. 09% NaN3)再洗滌兩遍，離心步驟(400g，5 分鐘)，然后在4°C下用在PBS (由O. 2% BSA和O. 09% NaN3補充)中稀釋至2. 5 μ g/ml的 RPE軛合山羊抗人IgG(AbD seroTec#204009)染色，并培育30分鐘。細胞被再次洗滌并且再懸浮于200 μ I PBS (含O. 2 % BSA和O. 09 % NaN3)，并且被轉(zhuǎn)移至U-型96孔板(Costar, 康寧(Corning), Schiphol-Ri jik,荷蘭)以便使用Easy Cyte儀器(Guava科技,海沃德 (Hayward),加利福尼亞(CA),美國)進行流式細胞計量。
結(jié)果:
兩種無性系C-9P21和9N10顯示與CCRF-CEM細胞系的特異性結(jié)合。這兩種無性系也被SDF-1抑制(見圖7C)。應(yīng)當(dāng)注意的是在這個實驗中，通過最高的絕對信號判斷，F(xiàn)7 顯示與細胞的最佳結(jié)合。
實施例4 :將抗體候選者轉(zhuǎn)化為IgG格式
為了比較已識別抗CXCR4抗體的生物活性，B-1M22、C-1I24、C-9P21和D-1K21和 9N10被轉(zhuǎn)化成全長IgGl抗體格式。作為對照，產(chǎn)生抗體F7。F7抗體被描述為與CXCR4結(jié)合(見W02008/060367，Medarex)。F7抗體的VH和VL鏈的序列被提供在W02008/060367的 SEQ ID N0:25和SEQ ID NO :29中。為了產(chǎn)生IgGl格式的這種抗體，從F7抗體的氨基酸序列反推出優(yōu)化的核苷酸序列，如專利W02008/060367所述(VH :SEQ ID N0:25和VL:SEQ ID NO :29)。然后合成此序列，克隆成人IgGl/K格式,如Norderhaug et al所述(JIM 204 27-87，1997年)，在HEK293細胞中表達并且隨后通過蛋白A來純化。為了確認IgG保留其與CXCR4陽性細胞結(jié)合的能力，都在天然表達CXCR4的CCRF-CEM細胞上評估所有IgG。
材料和方法:
編碼對應(yīng)的可變結(jié)構(gòu)域的基因被克隆進入哺乳動物表達載體pLNO，所述pLNO包含用于人恒定結(jié)構(gòu)域的基因(Norderhaug等,上文)。
抗體在細胞工廠中表達，并且第一收獲物在蛋白A柱上純化并且通過體積排阻色譜分級為單體。
從培養(yǎng)瓶中收獲天然CXCR4+表達細胞系CCRF-CEM，用PBS (由0. 2 % BSA和0. 09 % NaN3緩沖液補充)洗滌2遍并且以IxlO5細胞/孔被等分裝入V-型96孔板(葛來娜第一生化(Greiner Bio-One),Frikenhausen,德國)。細胞通過離心(400g,5min)沉淀，然后在 4°C下用在PBS (由0.2% BSA和0.09% NaN3緩沖液補充)中稀釋至10 μ g/ml的50 μ I IgG 培育60分鐘。在400g離心5分鐘之后吸走上清液，并且細胞用150 μ IPBS(用0. 2% BSA 和0. 09% NaN3補充)再洗滌2遍，每次洗滌后都進行離心步驟(400g，5分鐘)。然后在4°C 下用在PBS (由0.2% BSA和0.09% NaN3補充)中稀釋至2. 5 μ g/ml的RPE軛合山羊抗人 IgG (AbD seroTec)染色，并在4°C下培育30分鐘。細胞被再次洗滌并且再懸浮于200 μ I PBS (含 0. 2% BSA 和 0. 09% NaN3)，并且被轉(zhuǎn)移至 U-型 96 孔板(Costar，康寧(Coming)， Schiphol-Rijik,荷蘭)以便使用Easy Cyte儀器(Guava科技,海沃德(Hayward),加利福尼亞(CA)，美國)進行流式細胞計量。
結(jié)果:
所有被測試的克隆都保留它們與CXCR4陽性細胞結(jié)合的能力 (C-1124和B-1M22見圖8A ；C-1124和B-1M22見圖8B，D-1K21和C-9P21 ；9N10的數(shù)據(jù)沒有顯示)。從圖 8的EasyCyte曲線中應(yīng)當(dāng)注意的是在這些實驗中，相比F7抗體，本文所述的無性系顯示與CXCR4表達CCRF-CEM細胞顯著更佳結(jié)合(中間值48. 11 (F7)，179. 03 (D-1K21)， 626. 43(C-9P21) ,910. 58(C_1I24)和 1077. 33(B_1H22)對比 3. 11 (PBS 陰性對照)。
實施例5 :物種交叉反應(yīng)性
抗體候選者在scFv水平上測試它們與來自猴和小鼠的CXCR4交叉反應(yīng)的能力。
材料和方法:
HEK293T/17細胞在上文所述條件下培育。
使用經(jīng)編碼小鼠(基因庫(Gene bank)收錄號BC031665)或者猴(獼猴)(NCBI 收錄號NP_001036110)CXCE4的染質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的HEK-293細胞來進行FACS-結(jié)合分析 (EasyCyte)。進行兩個實驗,一個使用a-cMyc和PE-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體,第二個使用用于檢測的直接軛合的RPE-c-Myc抗體。此外，分析IgG水平上的交叉反應(yīng)性。在后一種情況下，用PE-軛合山羊抗人IgG抗體來檢測抗體結(jié)合。
結(jié)果
D-1K21顯示與小鼠和猴CXCR4的良好交叉反應(yīng)性。scFv變種B-1M22、C-9P21和 C-1I24也顯示與猴抗原的良好交叉反應(yīng)性，但與小鼠CXCR4的反應(yīng)性為低(B-1M22)到中等 (C-1I24，C-9P21)。(見圖9)。還測試9N10，并且顯示具有與C-9P21相同的交叉反應(yīng)性模式，和略微高的結(jié)合的絕對值。
實施例6 :通討CXCR4對配體-誘導(dǎo)信號的抑制
抗CXCR4 抗體 B-1M22、C-1I24、C-9P21 和 D-1K21 均在 scFv 和 LgG 水平上測試它們影響SDF-1 α配體誘導(dǎo)Ca++通量的能力。9Ν10僅在IgG水平上測試。該實驗使用天然 CXCR4+陽性CCRF-CEM細胞系來進行。
在第一個步驟中，最佳抗體濃度通過在CCRF-CEM細胞上滴定抗體來確定。
材料和方法:
CCRF-CEM細胞如上文所述那樣維持。
從培育瓶中收獲天然CXCR4+表達CCRF-CEM細胞系，用PBS (由O. 2 % BSA和O. 09 % NaN3緩沖液補充)洗滌2遍并且以IxlO5細胞/孔被等分裝入V-型96孔板(葛來娜第一生化(Greiner Bio-One), Frikenhausen,德國)。細胞通過離心(400g,5min)沉淀然后在 PBS緩沖液(由O. 2% BSA和O. 09% NaN3緩沖液補充)中用稀釋至10 μ g/ml起始濃度并進一步用2倍稀釋液滴定11遍的50 μ I IgG在4°C下培育60分鐘。在400g離心步驟5分鐘之后，吸走上清液，并且細胞用100 μ I PBS (由O. 2% BSA和O. 09 ^NaN3補充)再洗滌 2遍，每次洗滌后進行離心步驟(400g，5分鐘)。然后細胞在PBS (由O. 2% BSA和O. 09% NaN3補充)中用稀釋至5 μ g/ml的rPE軛合山羊抗人IgG (AbD seroTec)染色,并在4°C下培育30分鐘。細胞被再次洗滌并再懸浮于200 μ I PBS (含O. 2% BSA和O. 09% NaN3)中， 并且被轉(zhuǎn)移至一個U-型96孔板(Costar,康寧)以便使用Easy Cyte儀器(Guava科技,海沃德(Hayward),加利福尼亞,美國)進行流式細胞計量。
結(jié)果:
因此，確認用于競爭實驗的抗體濃度是10 μ g/ml或100 μ g/ml的IgG(9N10除外， 這種情況下濃度是I μ g/ml或10 μ g/ml)(數(shù)據(jù)未顯示)和4 μ g/ml的scFv(見圖10)。
在識別正確濃度后，進行實際競爭試驗。
材料和方法:
CCRF-CEM靶標(biāo)細胞通過離心收獲，并且用RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌2遍。將Iml 2. 5X IO6個或細胞(對應(yīng)IgG) IOml 2. 5X IO7細胞(對應(yīng)scFv)與Fluo-4_AM(醋酸基甲基酯；英杰公司(Invitrogen))、普郎尼克(Pluronic)F-127 (英杰公司)和丙磺舒 (Probenecid)分別混合為最終濃度I μ M，O. 02%和ImM。細胞在垂直轉(zhuǎn)輪(7轉(zhuǎn)/分鐘)上于 37°C下培育60分鐘。所有隨后步驟在ImM二丙苯磺胺的存在下進行。細胞在含10%胎牛血清(FCS)的 RPM1-1640 中洗滌 2 遍，一次在分析緩沖液(145mM NaCl, 4mM KCl, ImM Na·H2PO4, O. 8mM MgCl2, 25mM Hepes, 22mM, 22mM葡萄糖)中，并且隨后再懸浮至最終濃度(4xl06細胞 /毫升)?；旌舷嗤w積的細胞、有和沒有抗體和配體(SDF-1a)的分析緩沖液。前兩個成分(細胞和抗體)預(yù)-培育15分鐘，然后添加配體SDF-1 α (最終濃度50ng/ml)。抗體的最終濃度是10 μ g/ml或100 μ g/ml的IgG以及4 μ g/ml的scFv。立即使用FACSCantII (BD 生物科學(xué))的515-545nm帶通濾波器進行分析樣品。曲線下面積(AUC)使用Prism軟件 (GraphPad)來積分和并且繪制為針對僅SDF-1 α的最大刺激的AUC百分比。
結(jié)果:
在scFv水平上，變體C-9P21和D-1K21表現(xiàn)強烈拮抗活性。C-1I24也顯示一些拮抗作用。B-1M22沒有表現(xiàn)活性(圖11A)。
在IgG水平上，五個被測試抗體中的四個(B-1M22，C-1I24，C-9P21和9N10)表現(xiàn)出對SDF-1-誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)的抑制(圖11B、C、D和E)。由于未知原因，變體D-1K21在IgG 格式中似乎僅在高濃度下有輕微抑制。
此外，沒有一個抗體可以自身誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)，即抗體沒有顯示拮抗活性(數(shù)據(jù)未顯示)O
總的來說，表明所有抗體顯示對SDFl α結(jié)合到CXCR4所誘導(dǎo)的Ca++信號傳導(dǎo)的拮抗作用。C-9P21和9Ν10具有最突出的效果。
在另一個實驗中，與C-9P21相比，在IgG水平上測定9Ν10減少配體誘導(dǎo)的鈣通量的能力。
材料和方法:
實驗如上文所述那樣進行，但是以濃度為100、20、4、0· 8、0· 16、0. 032、0. 064和 O. 00128 μ g/ml滴定系列使用所述抗體。
:
結(jié)果表明，相比于C-9P21的29的IC5tl (nM)，9N10在鈣通量抑制上的效率為約8倍， IC50(nM)為 3.85(見圖 12A 和圖 12B)。
實施例7 :對配體誘導(dǎo)細胞遷移的抑制
scFv C-9P21降低配體誘導(dǎo)的細胞遷移的能力在CXCR4+的CCRF-CEM細胞系中評估?？?GFP scFv片段用作陰性對照并且抗-cMyc抗體被用來交聯(lián)兩種scFv以模仿IgG 格式抗體的效果。
材料和方法
CCRF-CEM細胞如上文所述那樣維持。
CCRF-CEM靶標(biāo)細胞通過離心沉淀，并且用不含F(xiàn)CS的RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌2遍。細胞密度隨后被調(diào)整至IxlO6細胞/毫升并且將60ml的懸浮液與38 μ I的BATDA [雙(醋酸基甲基)2，2’ 6’，2”-三聯(lián)吡啶-6，6”-二羧酸酯)](Perkin Elmer, Ealtham, MA)混合。細胞在BATDA中于37°C被培育20分鐘，并且通過每10分鐘溫和地倒置容器來混合。 細胞含20% FCS的RPM1-1640中洗滌3遍。并且隨后再懸浮于RPM1-1640/20% FCS達到 2X107細胞/毫升的最終濃度。將標(biāo)記的細胞與同樣體積的含10% FCS培養(yǎng)基、抗c-Myc抗體(克隆9E10)和scFv C-9P21的系列1/2稀釋液混合，從而導(dǎo)致分別為濃度20 μ g/ml和 32 μ g/ml 到 16ng/ml 的抗-cMyc LgG 和 scFv C-9P21。32 μ g/ml 的抗-GFP scFv 作為陰性對照與20 μ g/ml的抗-cMyc抗體組合使用。同時，將含O. 15nM SDF-1 α配體的30 μ IRPMI 加入 ChemoTX 96 孔博伊登(Boyden)腔板(Neuro Probe,蓋色斯堡(Gaithersburg),馬里蘭(MD))的下隔間。50 μ I抗體-包裹的BATDA-標(biāo)記的細胞隨后加入ChemoTX 96孔博伊登腔板的上隔間并且在這個狀態(tài)下于37°C培育2. 5個小時。濾紙上的細胞隨后被移除并且濾紙用PBS洗滌，接著所述板以收集下室的所有細胞，然后移除所述濾紙。該板隨后倒置于V-形板的頂部，然后離心。V-形板中的細胞用100 μ I PBS洗滌，通過離心沉淀并且再懸浮于含1. 3% Triton X-100的35 μ I PBS中。所述樣品轉(zhuǎn)移至黑色96孔微量滴定板， 與 200 μ I 銪溶液(Europium Solution) (Perkin Elmer)混合，并且使用 TECAN M200 讀板器分析突光(在340nm處激發(fā),在613nm處放射,滯后時間0. 4ms并且積分時間0. 4ms)。對各抗體濃度，計算在存在/缺乏scFv的條件下的信號與遷移抑制作用的百分比的比率。數(shù)據(jù)通過使用Prism軟件(GraphPad) “l(fā)og( 抑制劑)對比響應(yīng)”模式的非線性回歸曲線擬合進行制圖和分析。
結(jié)果:
數(shù)據(jù)證明在抗CXCR4scFv C-9P21存在下對CCRF-CEM細胞的SDF-1誘導(dǎo)趨化作用的抑制(見圖13)。在這些條件下，IC50值(導(dǎo)致50%細胞遷移抑制的抗體濃度)被計算為2. 9 μ g/ml，并且在scFv濃度20 μ g/ml下達到100%抑制?？?GFP scFv片段(陰性對照)顯示無細胞遷移抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。
因此，scFv格式的C-9P21抗體抑制CXCR4+CCRF-CEM細胞的配體誘導(dǎo)遷移(IC5tl 值為 2. 9 μ g/ml (約 IOOnM))，并且當(dāng) 20 μ g/ml (O. 7 μ Μ)時表現(xiàn) 100%抑制。
實施例8 :抗體依賴件細胞毒件(ADCC)的誘導(dǎo)
如果殺死靶標(biāo)細胞是優(yōu)選的作用模式，則抗體可以治療性使用的潛在機制是介導(dǎo) CXCR4表達靶標(biāo)細胞的ADCC的能力。這通過使用源自T細胞淋巴瘤并且具有CXCR4的組成型表達的CCRF-CEM細胞進行測試。將所選抗體作為與抗-cMyc抗體交聯(lián)的scFv片斷和作為全人IgGl抗體進行測試。
材料和方法:
CCRF-CEM細胞如上文所述那樣維持。
CCRF-CEM靶標(biāo)細胞通過離心沉淀，并且用RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌2遍。將2. 5 X IO6 細胞/毫升與鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)(英杰公司)混合至最終濃度10 μ M并且在37°C 下培育30分鐘。細胞在由10% FCS補充的RPM1-1640中洗滌3遍并且細胞密度被調(diào)整至 3X105細胞/毫升。從新鮮捐獻者血液通過人淋巴細胞分離液(Axis-Shield，利物浦，英國)密度梯度離心制備人PBMC，在RPM1-1640/10% FCS中洗滌并且在RPMI (含10% FCS和 10% DMS0)中以3X107的密度于液氮中冷凍保存。效應(yīng)細胞在實驗當(dāng)天解凍，在含10%FCS的RPM1-1640中洗漆，并且以6X IO6細胞/毫升的密度再懸浮。50 μ I的各靶標(biāo)和效應(yīng)細胞在96孔微量滴定板的同一個孔中混合，從而提供20 I的效應(yīng)物-對-靶標(biāo)(Ε Τ) 細胞比率。將體積為100 μ I的IgGl各種的抗體加入同一個孔中，導(dǎo)致O. 8至1000ng/ml 的濃度范圍。相應(yīng)地，在之前和過量的(20 μ g/ml)抗-cMyc嵌合(小鼠可變/人恒定) IgGl抗體(衍生自雜種瘤9E10)預(yù)先混合之后，加入體積為20 μ I的scFv片斷達到2. 5至 5 X104ng/ml的最終濃度。微量滴定板于37°C下培育4小時。3小時45分鐘的培育之后，將 20 μ I O. 9% Triton-XlOO加入對照孔以實現(xiàn)靶標(biāo)細胞的完全裂解(最大裂解)。100 μ I各樣品上清液隨后轉(zhuǎn)移入黑色微量滴定板中，并且使用TECAN Μ200讀板器進行記錄熒光(在 488nm處激發(fā)，在518nm處發(fā)射)。每個實驗重復(fù)4遍。無抗體的樣品的熒光強度被作為背景除去，并且計算帶有抗體的樣品的特異性裂解的百分數(shù)。劑量響應(yīng)曲線通過非線性回歸分析和使用Prism軟件(GraphPad)的三參數(shù)擬合模型進行運算。
結(jié)果:
圖14中所示結(jié)果證明所有測試抗CXCR4抗體都能在人PBMC存在下并且作為scFv 和全長IgGl誘導(dǎo)ADCC并且最大殺傷率接近100 %。被測試scFv和IgG可以根據(jù)它們的最大殺傷率排名如下C-9P21 > D-1K21 (scFv);和 B-1M22 > C-1I24 C-9P21 > D-1K21 (IgG) (又見表A)。
表A :被測試抗CXCR4抗體的比較性ADCC活性
權(quán)利要求
1.一種分離抗體，其結(jié)合到CXC趨化因子受體4 (CXCR4)并且不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的顯著細胞凋亡。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中如果使用小于或等于O.4 μ g/ml的濃度的所述抗體，則所述抗體不導(dǎo)致CXCR4表達細胞的顯著細胞凋亡。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中所述抗體能抑制配體與CXCR4的結(jié)合，或能抑制CXCR4表達細胞的配體誘導(dǎo)遷移，或能抑制CXCR4表達細胞中的配體誘導(dǎo)的鈣通量。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包含(i)可變重(VH)CDRl，其具有 S/G Y X3 M/1 H/S (SEQ ID N0:126)、或 X1 Y X3 MH (SEQID NO :127)或 S Y X3 M H (SEQ ID NO :128)的氨基酸序列； 其中X1可以是S或G，優(yōu)選的是S ; X3可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是G或W或Y或A，更優(yōu)選的是W ； (ii)具有X1I X3 X4 D G S X8 X9 X10 Y A D S V K G(SEQ ID NO :129)的氨基酸序列的 VH CDR2 ； 其中X1可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是V或R，更優(yōu)選的是R ； X3可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是S或N，更優(yōu)選的是N ； X4可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是Y或S，更優(yōu)選的是S ； X8可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是N或S，更優(yōu)選的是S ； X9可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是K或T，更優(yōu)選的是T ;和 X1?？梢允侨魏伟被幔瑑?yōu)選的是Y或S，更優(yōu)選的是S ； 或具有 X1 I X3 P X5 X6 G X8 X9 N Y A Q K F Q G(SEQ ID NO :131)的氨基酸序列的VH CDR2 ； 其中X1，可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是R或G，更優(yōu)選的是R ； X3可以是任何氨基酸、優(yōu)選的是N或I，更優(yōu)選的是N; X5可以是任何氨基酸、優(yōu)選的是N或I，更優(yōu)選的是N; X6可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是S或F，更優(yōu)選的是S ； X8可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是G或T，更優(yōu)選的是G ;和 X9可以是任何氨基酸，優(yōu)選的是T或A，更優(yōu)選的是T ;和 (iii)VHCDR3，其具有SEQ ID NO s 3，9，15或21的氨基酸序列或其大體同源的序列， 其中所述大體同源的序列是與給定的CDR序列相比含I個、2個、或3個氨基酸取代的序列，或其中所述大體同源的序列是含有給定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體，其中所述抗體 (a)包含至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包括 ⑴可變重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列或其大體同源的序列； (ii)VH⑶R2，其具有SEQID NO 2的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (iii)VHCDR3，其具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列或其大體同源的序列；和/或其中所述輕鏈可變區(qū)包含(iv)可變輕(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其大體同源的序列； (V)VL⑶R2，其具有SEQ ID NO : 5的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (vi)VL⑶R3，其具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列或其大體同源的序列； 其中所述大體同源的序列是與給定的CDR序列相比含I個、2個、或3個氨基酸取代的序列，或其中所述大體同源的序列是含有給定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或(b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
6.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體，其中所述抗體 (a)包含至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包含 ⑴可變重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列或其大體同源的序列； (ii)VH⑶R2，其具有SEQID NO 8的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (iii)VHCDR3，其具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列或其大體同源的序列；和/或其中所述輕鏈可變區(qū)包含 (iv)可變輕(VL)CDRl，其具有SEQID NO 10的氨基酸序列或其大體同源的序列； (V)VL⑶R2，其具有SEQ ID NO=Il的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (vi)VL⑶R3，其具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列或其大體同源的序列； 其中所述大體同源的序列是與給定的CDR序列相比含I個、2個、或3個氨基酸取代的序列，或其中所述大體同源的序列是含有給定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
7.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體，其中所述抗體 (a)包含至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包含 ⑴可變重(VH)⑶R1，其具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列或其大體同源的序列； (ii)VH⑶R2，其具有SEQID NO 14的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (iii)VH⑶R3，其具有SEQID NO 15的氨基酸序列或其大體同源的序列；和/或 其中所述輕鏈可變區(qū)包含 (iv)可變輕(VL)CDRl，其具有SEQID NO 16的氨基酸序列或其大體同源的序列； (V)VL⑶R2，其具有SEQ ID NO 17的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (vi)VL⑶R3，其具有SEQ ID NO 18的氨基酸序列或其大體同源的序列； 其中所述大體同源的序列是與給定的CDR序列相比含有I個、2個、或3個氨基酸取代的序列，或其中所述大體同源的序列是含有給定CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
8.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體，其中所述抗體 (a)包括至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包含 ⑴可變重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO 19的氨基酸序列或其大體同源的序列； (ii)VH⑶R2，其具有SEQID NO 20的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (iii)VHCDR3，其具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列或其大體同源的序列；和/或 其中所述輕鏈可變區(qū)包含(iv)可變輕(VL)CDR1，其具有SEQ ID NO :22的氨基酸序列或其大體同源的序列； (V)VL⑶R2，其具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (vi)VL⑶R3，其具有SEQ ID NO 24的所述氨基酸序列或其大體同源的序列； 其中所述大體同源的序列是與給定的CDR序列相比含I個、2個、或3個氨基酸取代的序列，或其中所述大體同源的序列是含有給定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或(b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
9.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗體，其中所述抗體 (a)包含至少一個含有三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個含有三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包含 ⑴可變重(VH)CDR1，其具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列或其大體同源的序列； (ii)VH⑶R2，其具有SEQID NO 2的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (iii)VH⑶R3，其具有SEQID NO 3的氨基酸序列或其大體同源的序列；和/或 其中所述輕鏈可變區(qū)包含 (iv)可變輕(VL)CDR1，其具有SEQID NO 88的氨基酸序列或其大體同源的序列； (V)VL⑶R2，其具有SEQ ID NO 89的氨基酸序列或其大體同源的序列；和 (vi)VL⑶R3，其具有SEQ ID NO 90的氨基酸序列或其大體同源的序列； 其中所述大體同源的序列是與給定的CDR序列相比含I個、2個、或3個氨基酸取代的的序列，或其中所述大體同源的序列是含有給定的CDR序列的保守氨基酸取代的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
10.如權(quán)利要求5至9中任一項所述的抗體，其包含所述VH⑶R結(jié)構(gòu)域(i)、(ii)和(iii)中的一個，和所述VL CDR結(jié)構(gòu)域(iv)、(v)和(vi)中的一個。
11.如權(quán)利要求1或5所述的抗體，其中所述抗體(a)具有SEQID NO 69的VH結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO 70的VL結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
12.如權(quán)利要求1或6所述的抗體，其中所述抗體 (a)具有SEQID NO 71的VH結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO 72的VL結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
13.如權(quán)利要求1或7所述的抗體，其中所述抗體 (a)具有SEQID NO 73的VH結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO 74的VL結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
14.如權(quán)利要求1或8所述的抗體，其中所述抗體 (a)具有SEQID NO 75的VH結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO 76的VL結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
15.如權(quán)利要求1或9所述的抗體，其中所述抗體 (a)具有SEQ ID NO 69的VH結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列，和/或SEQ ID NO 103的VL結(jié)構(gòu)域或具有與其至少80%序列一致性的序列；或 (b)是可以與抗體(a)競爭結(jié)合CXCR4的抗體。
16.如權(quán)利要求5至15中任一項所述的抗體，其中所述抗體(b)可以結(jié)合到與所述抗體(a)大體相同的表位。
17.如權(quán)利要求1至16中任一項所述的抗體，其中所述抗體是人抗體，優(yōu)選是全人抗體。
18.如權(quán)利要求1至17中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含抗體重鏈恒定區(qū)和/或抗體輕鏈恒定區(qū)的全部或者部分。
19.如權(quán)利要求18所述的抗體，其中所述抗體是IgG抗體，優(yōu)選是IgGl抗體。
20.如權(quán)利要求18或19所述的抗體，其中所述抗體包含含有SEQID NO :108的氨基酸序列或具有與其至少80%序列一致性的序列的重鏈，和/或含有SEQ ID NO :109的氨基酸序列或具有與其至少80 %序列一致性的序列的輕鏈。
21.如權(quán)利要求18或19所述的抗體，其中所述抗體包含含有SEQID NO :112的氨基酸序列或具有與其至少80%序列一致性的序列的重鏈，和/或含有SEQ ID NO :113的氨基酸序列或具有與其至少80 %序列一致性的序列的輕鏈。
22.如權(quán)利要求18或19所述的抗體，其中所述抗體包含含有SEQID NO :116的氨基酸序列或具有與其至少80%序列一致性的序列的重鏈，和/或含有SEQ ID NO :117的氨基酸序列或具有與其至少80 %序列一致性的序列的輕鏈。
23.如權(quán)利要求18或19所述的抗體，其中所述抗體包含含有SEQID NO :120的氨基酸序列或具有與其至少80%序列一致性的序列的重鏈，和/或含有SEQ ID NO :121的氨基酸序列或具有與其至少80 %序列一致性的序列的輕鏈。
24.如權(quán)利要求18或19所述的抗體，其中所述抗體包含含有SEQID NO :124的氨基酸序列或具有與其至少80%序列一致性的序列的重鏈，和/或含有SEQ ID NO :125的氨基酸序列或具有與其至少80 %序列一致性的序列的輕鏈。
25.如權(quán)利要求1至24中任一項所述的抗體，其中所述抗體是抗體的抗原結(jié)合片斷。
26.如權(quán)利要求25所述的抗體，其中所述抗體的所述抗原結(jié)合片斷是Fab’、Fab、F(ab，)2、單域抗體、TandAbs雙聚體、Fv、scFv、dsFv、ds_scFv、Fd、線型抗體、微型抗體、二價抗體、雙特異抗體片斷、二抗體、三抗體、sc-二價抗體、K (λ)抗體、BiTE、DVD-1g、SIP、SMIP、DART或包含一個或多個⑶R的小抗體擬似物。
27.如權(quán)利要求1-26中任一項所述的抗體，其中所述抗體被附著到至少第二診斷劑或治療劑。
28.如權(quán)利要求27所述的抗體，其中所述抗體被附著到至少放療藥劑、化療藥劑、抗-血管生成藥劑、細胞凋亡-誘導(dǎo)藥劑、抗-微管蛋白藥劑、抗-細胞或者細胞毒性藥劑、類固醇、細胞因子拮抗劑、細胞因子表達抑制劑、趨化因子拮抗劑、趨化因子表達抑制劑、三磷酸腺苷酶抑制劑、抗炎藥劑、信號傳導(dǎo)途徑抑制劑、抗-癌癥藥劑、其它抗體、凝血劑或抗病毒劑，其中所述抗-病毒劑優(yōu)選地選自由核苷、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑組成的組。
29.一種免疫軛合物，其包含如權(quán)利要求1-28中任一項所述的抗體，所述免疫軛合物附著到至少第二治療劑或診斷劑。
30.一種組合物，包含如權(quán)利要求1-28中任一項所述的至少第一抗體或其免疫軛合物，其中所述組合物優(yōu)選是藥學(xué)上可接受的組合物。
31.如權(quán)利要求30的所述的組合物，其中所述組合物進一步包括至少第二治療劑。
32.一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1-28中任一項所述的抗體的核苷酸序列區(qū)。
33.如權(quán)利要求32所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列區(qū)具有SEQID NO :34、SEQID NO :45、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO 67 或 SEQ ID NO :100 的核苷酸序列，或具有與其至少80%序列一致性的序列。
34.—種表達載體,其包含權(quán)利要求32或33的所述核酸分子。
35.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求32或33的所述核酸分子或權(quán)利要求34的所述表達載體。
36.一種病毒，其包含權(quán)利要求32或33的所述核酸分子或權(quán)利要求34的所述表達載體。
37.一種試劑盒，在至少第一容器中，包含 (a)權(quán)利要求1至28中任一項的所述抗體； (b)權(quán)利要求29的所述免疫軛合物； (c)權(quán)利要求30-31中任一項的所述組合物； (d)權(quán)利要求32或33的所述核酸分子； (e)權(quán)利要求34的所述表達載體； (f)權(quán)利要求35的所述宿主細胞；或 (g)權(quán)利要求36的所述病毒。
38.一種生產(chǎn)抗體的方法,其包含 (a)在有效表達編碼抗體的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求34的所述表達載體的宿主細胞；和 (b)從所述宿主細胞獲得表達的抗體。
39.一種結(jié)合CXCR4的方法，其包含使含有CXCR4的組合物與權(quán)利要求1_28中任一項的所述抗體、或其免疫軛合物接觸。
40.一種檢測CXCR4的方法，其包含在有效的允許形成所述CXCR4和所述抗體之間的復(fù)合物并檢測由此形成的所述復(fù)合物的條件下，使疑似含有CXCR4的組合物與權(quán)利要求1-28中任一項的所述抗體、或其免疫軛合物接觸。
41.一種診斷與在動物體內(nèi)CXCR4表達有關(guān)的疾病的方法，其包含以下步驟 (a)使取自所述動物的測試樣品與權(quán)利要求1-28中任一項的所述抗體或其免疫軛合物接觸；任選地， (b)測量或檢測所示測試樣品中抗體-抗原復(fù)合體的存在和/或數(shù)量和/或位置；和，任選地， (c)將所述測試樣品中抗體-抗原復(fù)合體的存在和/或數(shù)量與對照物進行比較。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中將所述測試樣品從所述動物中分離并且在體外與所述抗體或免疫軛合物接觸。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中將所述抗體或免疫軛合物施用給所述動物，從而在體內(nèi)接觸所述測試樣品。
44.如權(quán)利要求41-43中任一項所述的方法，其中與CXCR4表達相關(guān)的所述疾病是通過CXCR4介導(dǎo)的疾病，或特征為CXCR4+細胞異常增殖的疾病，或特征為CXCR4過量表達的疾病。
45.如權(quán)利要求41-43中任一項所述的方法，其中所述疾病是癌癥，轉(zhuǎn)移性癌癥，癌癥細胞對器官的入侵，血管生成相關(guān)的疾病，炎性或免疫性疾病，自身免疫性病癥如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，病毒感染如HIV感染，或需要從骨髓動員干細胞以恢復(fù)免疫系統(tǒng)的病狀。
46.如權(quán)利要求41-45中任一項所述的方法，其中在所述測試樣品中的CXCR4增加量對所述疾病是診斷性的。
47.一種用于治療與動物體內(nèi)CXCR4表達或活性相關(guān)的疾病的方法，其包含向罹患所述疾病的動物施用治療有效量的權(quán)利要求1-28中任一項的所述抗體、或其免疫軛合物。
48.如權(quán)利要求47所示的方法，其中與CXCR4表達或活性相關(guān)的所述疾病是由CXCR4介導(dǎo)的疾病，或特征為CXCR4+細胞異常增殖的疾病，或特征為CXCR4過量表達的疾病。
49.如權(quán)利要求47至48中任一項所述的方法，其中所述疾病是癌癥，轉(zhuǎn)移性癌癥，癌癥細胞對器官的入侵，血管生成相關(guān)的疾病，炎性或免疫性疾病，自身免疫性病癥如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，病毒感染如HIV感染，或需要從骨髓動員干細胞以恢復(fù)免疫系統(tǒng)的病狀。
50.如權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述抗體或其免疫軛合物造成以下一項或多項 (a)抑制CXCR4對至少SDF-1結(jié)合； (b)抑制CXCR4-介導(dǎo)細胞對CXCR4配體的應(yīng)答，優(yōu)選抑制響應(yīng)于CXCR4配體的鈣離子釋放，或抑制CXCR4表達細胞的配體誘導(dǎo)的遷移； (c)誘導(dǎo)CXCR4+細胞的ADCC； (d)誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)； (e)誘導(dǎo)CXCR4+細胞的⑶C； (f)抑制現(xiàn)存癌癥引起的轉(zhuǎn)移形成； (g)抑制癌癥細胞入侵新器官； (h)抑制腫瘤基質(zhì)對CXCR4+細胞的吸引，和/或有利于腫瘤微環(huán)境的細胞的活化； (i)敏感化腫瘤細胞以便用其它治療有效的化合物來治療。
51.如權(quán)利要求47-50中任一項所述的方法，進一步包含對所述動物施用第二治療劑。
52.如權(quán)利要求41-51中任一項所述的方法，其中所述抗體是二價或多價的抗體，其包含所述抗體的至少兩個抗原結(jié)合片斷。
53.如權(quán)利要求41-52中任一項所述的方法，其中所述動物是人受試者。
54.如權(quán)利要求1-28中任一項所述的抗體、或其免疫軛合物，用于治療、成像和診斷。
55.如權(quán)利要求54所述的抗體或免疫軛合物，用于治療、成像或診斷與CXCR4表達或活性相關(guān)的病狀。
56.如權(quán)利要求55所述的抗體或免疫軛合物，其中所述疾病如權(quán)利要求48或49中定義。
全文摘要
本發(fā)明提供抗體，所述抗體與CXC趨化因子受體4(CXCR4)結(jié)合，并且不誘導(dǎo)CXCR4表達細胞的顯著細胞凋亡。還提供的尤其是免疫軛合物和包含這種抗體的組合物，以及特別在醫(yī)療和診斷領(lǐng)域中涉及這種抗體的方法和用途。
文檔編號A61K39/395GK103003306SQ201180019263
公開日2013年3月27日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者阿妮塔·卡夫利, 謝爾蓋·米哈伊洛維奇·庫普里亞諾夫 申請人:艾菲泰克研究公司