專利名稱：血管生成的調(diào)節(jié)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了治療可以通過提供血管生成改善的病理狀態(tài)的方法。本發(fā)明總體上涉及通過給予表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞來提供血管生成。本發(fā)明還涉及藥物發(fā)現(xiàn)方法來篩選可調(diào)節(jié)所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力的試劑。本發(fā)明還涉及可以用來提供給予受試者的細胞的細胞庫，所述細胞庫包括具有所需的ー種或多種促血管生成因子的表達和/或分泌水平的細胞。本發(fā)明還涉及包括具有所需的ー種或多種促血管生成因子特定表達和/或分泌水平的細胞的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明還涉及在將所述細胞給予要治療的受試者之前實施的診斷方法，包括用于評估待給予的細胞所需效能的測定。本發(fā)明進一步涉及治療后診斷測定以評估所述細胞對被治療的受試者的效果。所述細胞是非胚胎干細胞、非生殖細胞，具有以下ー個或多個特征在培養(yǎng)物中長期復制，明確的長期復制的標志物，例如端粒酶、多能性標志物 ，和廣泛的分化潛能，無需轉(zhuǎn)化(transformed)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明廣義上涉及提供血管生成的方法。本發(fā)明還涉及提供ー種或多種促血管生成因子來提供血管生成的方法。促血管生成因子包括但不限于FGF、VEGF, VEGFR、NRP-1、Angl、Ang2、PDGF (BB-同源ニ聚體)、PDGFR、TGF-P、內(nèi)皮糖蛋白、TGF-P受體、MCP-1、整聯(lián)蛋白aj3、av^3>a J p VE-鈣粘蛋白、CD31、肝配蛋白、纖溶酶原激活物、纖溶酶原激活物抑制因子-1、eNOS、COX-2、AC133、Id2/Id3、血管生成素、HGF、Vegf、Il-I a , 11-8、11-6, Cxcl5、Fgf a、Fgf^、Tgf a、Tgf@、MMP (包括mmp9)、纖溶酶原激活物抑制因子-1、血小板反應素、血管生成素I、血管生成素2、雙調(diào)蛋白、瘦蛋白、內(nèi)皮素-1、AAMP、AGGF1、AM0T、ANGLPTL3、ANGPTL4、BTGl、IL-I 運、N0S3、TNFSF12 和 VASH2。根據(jù)本發(fā)明，提供血管生成可以通過給予天然(即非重組地)表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞或所述細胞的條件培養(yǎng)基來實現(xiàn)。細胞包括但不限于非胚胎干細胞且非生殖細胞的細胞，其具有某些胚胎干細胞的特征，但來源于非胚胎組織，并表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子。所述細胞可以天然表達/分泌ー種或多種促血管生成因子(即未經(jīng)遺傳或藥物修飾以激活表達和/或分泌)。但是，天然表達子可以經(jīng)遺傳或藥物修飾以增強效能。所述細胞可以表達多能性標志物，例如oct4。它們還可以表達與長期復制能力相關的標志物，例如端粒酶。其他的多能性特征可以包括分化為多于一種胚層，例如外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的兩種或三種的胚胎胚層，的細胞類型的能力。在培養(yǎng)物中這種細胞可以是或可以不是永生化的或轉(zhuǎn)化的。所述細胞可以高度擴增而不轉(zhuǎn)化并維持正常的核型。例如，在一個實施方案中，所述非胚胎干細胞、非生殖細胞可以在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍増，例如50次、60次或更多，其中所述細胞沒有轉(zhuǎn)化并具有正常核型。所述細胞可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系兩種中每ー種的至少ー種細胞類型，并可以包括分化為所有的三種譜系。進ー步地，所述細胞可以是不致瘤的，例如不會產(chǎn)生畸胎瘤。如果細胞是轉(zhuǎn)化的或致瘤的，并且需要使用它們來侵入，通過阻止細胞増殖形成腫瘤的處理，這種細胞可以是缺陷的，它們不會在體內(nèi)形成腫瘤。這種處理在本領域內(nèi)是眾所周知的。細胞包括但不限于以下編號的實施方案I.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍増，其中所述細胞表達oct4，沒有轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。2.如以上I所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其進ー步表達端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的ー種或多種。
3.如以上I所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個譜系中的至少ー種細胞類型。4.如以上3所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其進ー步表達端粒酶、rex-l、rox-1或sox-2中的ー種或多種。5.如以上3所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。6.如以上5所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其進ー步表達端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的ー種或多種。7.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，是通過培養(yǎng)非胚胎、非生殖組織獲得的，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少40次細胞倍増，其中所述細胞沒有轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。8.如以上7所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。9.如以上7所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個中的至少ー種細胞類型。10.如以上9所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。11.如以上9所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。12.如以上11所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。13.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍増，其中所述細胞表達端粒酶，沒有轉(zhuǎn)化，并具有正常的核型。14.如以上13所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其進一步表達oct4、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。15.如以上13所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個中的至少ー種細胞類型。16.如以上15所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其進一步表達oct4、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。17.如以上15所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。18.如以上17所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其進一步表達oct4、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。19.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個中的至少ー種細胞類型，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍増。20.如以上19所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。21.如以上19所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。22.如以上21所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、 rox-1、或sox-2中的ー種或多種。在一個實施方案中，所述受試者是人。所述的表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞可以用于藥物發(fā)現(xiàn)方法，來篩選可調(diào)節(jié)所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子以便能提供血管生成的能力的試劑。所述試劑包括但不限于有機小分子、反義核酸、siRNA、DNA適體、肽類、抗體、非抗體蛋白、細胞因子、趨化因子和化學引誘物。在ー個具體例證的實施方案中，通過將細胞暴露于TNF-a、IL-I ^、和IFN-Y的結合物而增強了效能。在其他實施方案中，這些組分中的任一種都可以單獨使用。在進ー步的實施方案中，可以使用其他促炎癥分子，包括但不限于其他的白細胞介素或干擾素，例如 111-a、IL-6、TGF-b、GM-CSF、ILlU IL12、IL17、IL18、IL8、toll 樣受體配體包括 LPS、Poly(IiC)、CPGN-0DN和酵母聚糖。在另ー個具體例證的實施方案中，通過將所述細胞暴露于拉坦前列腺素(ー種前列腺素F的類似物)而增強了效能。在另ー個實施方案中，所述細胞可以暴露于前列腺素F、任意其他的前列腺素F2 a受體類似物、E型前列腺素或類似物。由于本申請中描述的血管生成效果可以由分泌的因子引起，所以不只所述細胞，產(chǎn)自培養(yǎng)所述細胞的條件培養(yǎng)基(或其提取物)也可以用于實現(xiàn)所述的效果。所述培養(yǎng)基會含有分泌的因子，因此可以用于代替所述細胞或加入到所述細胞中。因此，在所述細胞有用時，應該認為條件培養(yǎng)基(或其提取物)也是有效的并可以被替代或加入。鑒于所述細胞可以實現(xiàn)血管生成效果的性質(zhì)，可以建立細胞庫，其包括選擇的具有表達和分泌ー種或多種促血管生成因子以便提供血管生成的所需效能的細胞。因此，本發(fā)明包括測定細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力以及將具有所需效能的細胞加入細胞庫。細胞庫可提供制備給予受試者的藥物組合物的來源?？梢詮膸熘兄苯邮褂眉毎蛟谑褂们皵U增細胞。特別是在所述細胞被進ー步擴增的情況下，在擴增后需要驗證細胞仍然具有所需的效能。細胞庫允許對受試者來說是同種異體的細胞的“現(xiàn)成”使用。因此，本發(fā)明還涉及在將所述細胞給予受試者之前實施的診斷方法。所述方法包括評估所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子以便能夠提供血管生成的效能。所述細胞可以取自細胞庫并直接使用或在給予前擴增。在兩種情況下，均可以就所需效能評估所述細胞。特別是在所述細胞被進ー步擴增的情況下，在擴增后需要驗證細胞仍然具有所需的效能?；蛘?，所述細胞可以來源于受試者并在給予前擴増。在這種情況下，可以在給予回受試者(自體的)之前就所需效能評估所述細胞。雖然選擇用來表達ー種或多種促血管生成因子的細胞在選擇程序中需要進行測定，但是在給予受試者以治療之前再次測定細胞以確認細胞仍然能夠表達所需水平的因子是優(yōu)選的和謹慎的。這在所述表達者細胞已被擴增或儲存一段時間如儲存在細胞庫中的情況下是特別優(yōu)選的，在細胞庫中細胞在儲存期間很可能被冷凍。
關于用表達/分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞進行治療的方法，在所述細胞的最初分離和給予受試者之間，可以多次(即相繼)進行因子表達的測定。這是為確保所述細胞在這段時間范圍內(nèi)發(fā)生的操作后仍然表達/分泌所述的ー種或多種促血管生成因子。例如，可在所述細胞的毎次擴增之后進行測定。如果細胞儲存于細胞庫中，它們可在被從存儲中取出后進行測定。如果它們被冷凍，則可在解凍后對它們進行測定。如果來自細胞庫的細胞被擴增，可在擴增之后對它們進行測定。優(yōu)選地，可對最終細胞制品(即實際給予所述受試者的細胞制品)的一部分進行測定。本發(fā)明進一歩包括在給予所述細胞之后的治療后診斷測定，以評估功效。該診斷測定包括但不限于依據(jù)臨床癥狀、形態(tài)學(例如血管的存在情況)或依據(jù)ー種或多種血管生成生物標志物的血管生成分析。本發(fā)明還涉及通過評估所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子以便提供血管生成的效能來確定所述細胞用量的方法。在這種情況下，應測定所述效能并相應地調(diào)整所述用量。效能可以通過測量所述細胞因子本身的量來評估。其還可以通過測定因子提供的效果，例如體內(nèi)或體外血管生成，來評估。本發(fā)明還涉及包括具有所需效能，特別是表達和/或分泌所需數(shù)量的ー種或多種促血管生成因子，的細胞群體的組合物。這些細胞群體可以作為適合給予受試者的藥物組合物和/或在細胞庫中，在細胞庫中細胞可以用于直接給予受試者或在給予前擴增。在一個實施方案中，所述細胞相比之前的(親代的)細胞群體具有增強的(増加的)效能。親代細胞如本文所定義。可以通過選擇天然表達者或通過作用于所述細胞的外部因子來實現(xiàn)增強。本發(fā)明所述的方法和組合物可以用于治療血管生成對其有益的任何疾病。這包括但不限于任何的缺血病癥,例如急性心肌梗塞、慢性心カ衰竭、外周血管疾病、中風、慢性完全閉塞、腎臟缺血和急性腎損傷。對于這些治療，可以給予表達所述ー種或多種促血管生成因子的細胞。所述細胞已經(jīng)就其表達和/或分泌的因子的量進行了評估，并且就所述因子的所需表達和/或分泌量進行了選擇。應理解，對任意上述疾病的治療，使用所述細胞是方便的；也就是說，所述細胞已經(jīng)就因子表達和/或分泌進行了評估并在給予以治療病癥前就所需水平的表達和/或分泌進行了選擇。


圖I-MultiStem在體外誘導血管生成并分泌多種促血管生成因子(A)。由培養(yǎng)HUVEC的MultiStem條件培養(yǎng)基(CM)誘導的體外血管生成的照片。(B)在每種條件下每個視野形成的管的平均數(shù)。(C)以MultiStem第4天條件培養(yǎng)基孵育的血管生成抗體陣列。VEGF, IL-8和CXCL5是由MultiStem分泌的。在來自4個獨立培養(yǎng)的3天耗盡培養(yǎng)基中CXCL5 (D)、VEGF(E)和IL_8(F)的蛋白濃度顯示MultiStem在標準培養(yǎng)條件下連續(xù)地表達這些蛋白。圖2-VEGF對于MultiStem誘導血管生成是必需的。從條件培養(yǎng)基移除VEGF可阻止血管生成(A)完全VEGF免疫耗竭和抗體特異性，而IL-8 (B)和CXCL5 (C)水平不受影響。(D、E)VEGF的免疫耗竭可降低了由MultiStem條件培養(yǎng)基誘導的血管生成。需要加入至少250pg/ml的VEGF165或50pg/ml的VEGF121以恢復某些水平的血管生成，但二者均未完全恢復活性。圖3-IL-8對于MultiStem誘導血管生成是必需的。條件培養(yǎng)基中IL-8的免疫耗竭降低了血管生成，但是在基礎培養(yǎng)基中加入IL-8不足以誘導血管生成。(A)將HUVEC細胞與(a)內(nèi)皮生長因子培養(yǎng)基(EGM)、(b)無血清基礎MultiStem培養(yǎng)基、(c) 4天的無血清 MultiStemCM, (d)兔IgG同種型對照和(e) 4天的IL-8免疫耗竭的無血清MultiStem CM孵育18小時。(B) IL-8通過免疫耗竭降低(C、D) VEGF，CXCL5水平?jīng)]有改變。圖4-CXCL5對于MultiStem誘導的血管生成是必需的。但是，IL-8和CXCL5不足以引發(fā)血管生成。(A)將HUVEC細胞與(a)內(nèi)皮生長因子培養(yǎng)基(EGM)、(b)EGM+IgG同種型對照、(c)EGM+10ug/mlCXCL5中和抗體、(d)無血清基礎MultiStem培養(yǎng)基、(e)僅4天的無血清MultiStem條件培養(yǎng)基(CM)、(f)CM+IgG同種型對照、(g) CM+CXCL5中和抗體(IOug/ml)孵育 18 小時。將(B、C)IL-8(4000pg/ml)或 CXCL5 (150pg/ml)単獨或與 MultiStem 基礎培養(yǎng)基一起加入不足以誘導血管生成。圖5-不像MultiStem，MSC不會在體外誘導血管生成。(A)體外血管生成測定顯示了 MSC和MultiStem條件培養(yǎng)基(CM)對內(nèi)皮細胞管形成的效果上的不同。(B)來自體外血管生成測定的照片顯示了 MSC和MultiStem CM在6小時和24小時后對內(nèi)皮細胞管形成的效果。(C-E)由MSC和MultiStem分泌的CXCL5、VEGF和IL-8的濃度。圖6-MultiStem和MSC具有不同的分泌譜。在血管生成特異性抗體陣列上對從相同供體(分析了 3個供體樣本組)獲得的MSC和MultiStem的條件培養(yǎng)基進行分析。(A)顯影的膜的照片顯示了 MultiStem的分泌譜與來自其他供體的MultiStem相似,但與MSC,甚至來自相同供體的MSC，相比有顯著不同。(B)對所述陣列的半定量分析顯示了 MSC與MultiStem相比不同的分泌譜，包括僅MultiStem表達的IL-8。數(shù)據(jù)表示為平均點強度，為陽性對照的百分數(shù)，歸ー化回總蛋白含量。圖7-在體外用Cytomix處理MultiStem增加了促血管生成分子的表達。將MultiStem 培養(yǎng) 3 天，然后用 CytomixC 10ng/mL TNF-a，IL-I ^ 和 IFNy )處理 24、48、72 小吋。隨后收集細胞，用于RT-PCR分析促血管生成基因的表達。在用Cytomix處理后CXCL5、FGF2和HGF基因表達都增加超過了基準線。另外，在這些條件下IL-8也增加。圖8-微陣列分析也顯示用Cytomix處理(48小時)的MultiStem中血管生成基因表達上調(diào)。該圖顯示了血管生成因子被調(diào)節(jié)的樣品。微陣列分析顯示了用Cytomix處理6或48小時的MultiStem中促血管生成因子的增加。在Illumina微陣列芯片(HumanHT_12_V4)上分析了來自用Cytomix處理的MultiStem (姆時間點n=6)或未處理的MultiStem (姆時間點n=6)的RNA。檢測了兩個MultiStem細胞庫。該圖給出了促血管生成基因上調(diào)的樣品的倍數(shù)増加的例子。需要通過qPCR作進ー步確認，該工作正在進行。圖9-在HUVEC細胞管形成測定中，Cytomix處理增強了 MultiStem的血管生成效能。該圖顯示了血管生成評分。在HUVEC細胞管形成測定中，用Cytomix處理MultiStem增加了血管生成。三天后從細胞收集的無血清條件培養(yǎng)基顯示，盡管來自未處理的MultiStem的條件培養(yǎng)基給出強的HUVEC管形成，用Cytomix處理細胞導致了血管生成效能的增強。來自Lonza MSC的無血清條件培養(yǎng)基沒有誘導顯著的HUVEC管形成。對MSC的處理只輕微增加了血管生成效能。EGM =內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(陽性對照)。EBM=無血清基礎內(nèi)皮培養(yǎng)基(陰性對照)。圖IOA-C-用前列腺素F或拉坦前列素(前列腺素F類似物)預處理MultiStem在體外增加了 MultiStem的血管生成因子表達。用前列腺素F類似物拉坦前列素處理Multi Stem也増加了所述促血管生成因子的表達。將MultiStem用ー個劑量范圍的拉坦前列素處理24、48或72小吋。然后，用RT-PCR分析促血管生成因子的基因表達。KITLG(A)、HGF和VEGF⑶以及I1-8(C)的基因表達都增加。生物的前列腺素F也増加了 VEGF A水平(B)。圖Il-HUVEC管形成測定用來檢驗拉坦前列腺素(IuM)處理的MultiStem的血管生成能力。與使用來自未處理細胞的條件培養(yǎng)基相比，使用來自拉坦前列腺素處理細胞的條件培養(yǎng)基的HUVEC管形成適度地增加。在第三天從單獨培養(yǎng)的MultiStem或存在拉坦前列腺素(IuM)下培養(yǎng)的MultiStem收集無血清培養(yǎng)基?；A培養(yǎng)基或加入拉坦前列腺素的基礎培養(yǎng)基不會誘導顯著的管形成。相比之下，來自未處理細胞的條件培養(yǎng)基單獨或在收集后在培養(yǎng)基加入拉坦前列腺素(luM)，誘導了相等水平的血管生成。該體外測定中測量顯示，收集自用拉坦前列腺素處理三天的細胞的無血清條件培養(yǎng)基適度地増加了血管生成能力。EGM和含血清MultiStem培養(yǎng)基作為陽性對照。EBM和基礎無血清培養(yǎng)基為陰性對照。圖12-體外血管生成分析可以用來檢驗不同細胞批和處理方法的效能。使用HUVEC管形成測定對血管生成能力進行測量可以用來評估來自不同細胞批(解凍a-f )或不同處理條件(解凍ゴ相對對24小時A-F)的細胞的功能效能。
具體實施例方式應該理解，本發(fā)明不受本文所述的具體操作、方法和試劑等限制，這些可以變化。本文使用的術語只為描述具體的實施方案，不是意欲限制所公開的的發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權利要求書限定。本文使用的段落標題僅僅作為組織目的，而不應被解釋為任何形式的對所述主題的限制。除非另外指明，本申請中的方法和技術通常按本領域公知的常規(guī)方法和本申請中引用和論述的多種綜合及專業(yè)參考文獻執(zhí)行。參見，例如，Sambrook et al. , Molecularしloning:A Laboratory Manual，3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, N. Y. (2001)and Ausubel et al. , Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates(1992)，and Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. (1990).
"一"或"ー個"在本文中是指ー個或多于一個；至少ー個。當本文中使用復數(shù)形式時，通常包括単數(shù)形式?！凹毎麕臁笔菫閷硎褂枚囵B(yǎng)和儲存的細胞的エ業(yè)術語。細胞可以儲存為小份。它們可以直接從儲存中取用或可以在儲存后擴増。這很方便以至有可用的“現(xiàn)成的”細胞用來給予。細胞可以是已儲存在藥用賦形劑中，因此可以直接給予或者在細胞從儲存中釋放時可以和適當?shù)馁x形劑混合。細胞可以是冷凍的或儲存為保留活力的形式。在本發(fā)明的一個實施方案中，建立了細胞庫，其中的細胞已就ー種或多種促血管生成因子增強表達進行了選擇。在從儲存釋放后，給予所述受試者之前，優(yōu)選再次測定細胞的效能，即ー種或多種促血管生成因子的表達水平。這可以使用本申請描述的或本領域已知的任何直接的或間接的測定來完成。然后，具有需要的效能的細胞可以給予所述受試者用于治療?？梢允褂脕碓从谝委煹膫€體的細胞(來自他們出生前組織例如胎盤、臍帶血或臍帶基質(zhì)或在出生后任何時間從所述個體擴增的)來建立細胞庫。或者細胞庫可以含有用于同種異體用途的細胞。
“共給予”是指彼此結合、一起、配合地給予，包括同時或依次給予兩種或多種試齊U。在沒有其他限制的情況下，“包含”是指必須包括所指事物，但不對其他可包括的事物進行限制或排除。例如，“包含X和y的組合物”包括含有X和y的任何組合物，而不管所述組合物中是否存在其他組分。同樣，“包含步驟X的方法”包括其中進行X (不管X是所述方法中的唯一步驟還是只是步驟之一)的任何方法，不管可能存在多少其他步驟，也不管X與這些步驟相比多么簡單或復雜。“包括”和使用詞根“含”的類似短語在本文中用作“包含”的同意詞并具有相同的含義?！鞍ā笔恰鞍钡耐x詞(見上)?！皸l件細胞培養(yǎng)基”是本領域公知的術語，指細胞已在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基。在本文中，這是指將所述細胞培養(yǎng)足夠的時間以分泌能夠有效達到本申請描述的任何效果的因子，所述效果包括提供血管生成或提供ー種或多種促血管生成因子。條件細胞培養(yǎng)基是指細胞已在其中培養(yǎng)從而將因子分泌到所述培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基。出于本發(fā)明的目的，可培養(yǎng)細胞歷經(jīng)足夠數(shù)量的細胞分裂以產(chǎn)生有效量的所述因子，使得所述培養(yǎng)基具有所述效果，其包括提供血管生成或提供一種多種促血管生成因子?？赏ㄟ^本領域任何已知的方法將細胞從所述培養(yǎng)基中除去，所述方法包括但不限于離心、過濾、免疫耗竭(例如通過連接標志物的抗體和磁性柱)和FACS分選?！癊C細胞”是從被稱為畸胎瘤的癌癥類型的分析中發(fā)現(xiàn)的。1964年，研究人員注意到畸胎瘤中的單個細胞可被分離并在培養(yǎng)物中保持不分化。這種類型的干細胞被稱為胚胎癌細胞(EC 細胞，embryonic carcinoma cell)?！坝行Я俊蓖ǔＶ赣商峁┭苌僧a(chǎn)生的提供需要的局部或全身效果的量。例如，有效量是足以實現(xiàn)有益或需要的臨床效果的量。所述有效量可以單次給藥的形式一次全部提供或以多次給藥提供所述有效量的形式分份提供。對什么量會被認為是有效量的準確確定可基于每個受試者的個人因素，包括他們的身高體重、年齡、損傷和/或待治療的疾病或損傷以及距損傷發(fā)生或疾病開始的時間。本領域技術人員能夠基于這些本領域中慣常的考慮確定給予受試者的有效量。當用于本文時，涉及治療的“有效劑量”與“有效量”意義相同?！坝行緩健蓖ǔＪ侵柑峁┯糜趯ⅸ`種試劑送遞至所需腔室、系統(tǒng)或位置的途徑。例如，有效途徑是給予試劑以在所需的作用位點提供量足以實現(xiàn)有益或所需的臨床效果的所述試劑的途徑?！芭咛ジ杉毎?ESC)”為本領域所熟知并已從多種不同哺乳動物種中制得。胚胎干細胞是源自被稱為胚泡的早期胚胎的內(nèi)細胞團的干細胞。它們能夠分化為三種原胚層夕卜胚層、內(nèi)胚層和中胚層的所有衍生物。這些包括成體內(nèi)超過220種細胞類型的每ー種。ES細胞可成為體內(nèi)除胎盤外的任何組織。只有桑椹胚細胞是全能性的，能夠成為所有組織和胎盤。某些類似于ESC的細胞可以通過將體細胞核轉(zhuǎn)移到去細胞核的受精卵來產(chǎn)生。使用術語“包括”并非意圖進行限制。“增加”意指完全地誘導ー個生物學事件或增加所述事件的程度。 “誘導的多能干細胞(IPSC或IPS細胞)”是被再編程的體細胞，例如通過引入賦予所述體細胞分化程度較低的表型的外源基因產(chǎn)生的體細胞。然后，這些細胞可被誘導分化為分化程度較低的后代。使用首先在2006年公開的方法的改進方法可獲得 IPS 細胞(Yamanaka, S. et al.，Cell Stem Cell，1:39-49 (2007))。例如，在ー個實例中，為形成IPS細胞，科學家以皮膚細胞開始，隨后通過用反轉(zhuǎn)錄病毒將基因插入到細胞DNA中的標準實驗室技術對所述皮膚細胞進行了改良。在一個實例中，所插入的基因為0ct4、Sox2、Lif4和c-myc，這些基因已知作為天然調(diào)控因子一起作用以使細胞保持在與胚胎干細胞相似的狀態(tài)。文獻已對這些細胞進行了描述。參見,例如，Werniget al.，PNAS, 105:5856-5861 (2008) ；Jaenisch et al.，CelI，132:567-582 (2008);Hanna et al. , Cel1,133: 250-264 (2008)；以及 Brambrink et al. , Cell StemCell, 2:151-159 (2008)。這些參考文獻以引用的方式納入以教導IPSC和制備它們的方法。也可通過特定培養(yǎng)條件(暴露于特定試劑)獲得這些細胞。術語“分離的”指不與ー種或多種細胞結合或者不與在體內(nèi)與所述ー種細胞或多種細胞結合的一種或多種細胞組分結合的ー個或多個細胞。“富集群”指需要的細胞相對于體內(nèi)或原代培養(yǎng)物中一種或多種其他細胞類型的數(shù)量上相對增加。然而，本文所用的術語“分離的”不表示僅胚胎干細胞的存在情況。而是，術語“分離的”表示細胞從其天然組織環(huán)境中取出并以相對所述正常組織環(huán)境更高的濃度存在。因此，“分離的”細胞群可進ー步包括干細胞以外的細胞類型并可包括其他組織組分。這還可用例如細胞的倍增來表示。細胞可在體外或離體進行10、20、30、40次或更多次的倍增，從而相對其在體內(nèi)或在原始組織環(huán)境(例如骨髄、外周血、胎盤、臍帶、臍帶血、脂肪組織等)中的原始數(shù)量被富集。“MAPC”是“多能成體祖細胞”的首字母縮略詞。它是指非胚胎干細胞或非生殖細胞但具有這兩種細胞的某些特征的細胞。MAPC可以以許多其他描述來表征，每ー個描述在被發(fā)現(xiàn)時均賦予所述細胞以新特征。因此，它們可以用這些描述中的ー個或多個來表征。第一，它們無需轉(zhuǎn)化(發(fā)生腫瘤)而具有在培養(yǎng)物中長期復制的能力并具有正常核型。第二，它們在分化時可以生成多于ー個胚層，例如兩個或全部三個胚層(即，內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)，的細胞后代。第三，雖然它們不是胚胎干細胞或生殖細胞，但它們可以表達這些原始細胞類型的標志物，因此MAPC可以表達Oct 3/4 (即Oct 3A)、rex-1和rox-1中的一種或多種。它們還可以表達sox-2和SSEA-4中的ー種或多種。第四，像干細胞一祥，它們可以自我更新，也就是無需轉(zhuǎn)化而具有長期復制能力。這意味著這些細胞可表達端粒酶(即具有端粒酶活性)。因此，以“MAPC”命名的細胞類型可以由通過若干新性質(zhì)描述該細胞的替代的基本特征來表征。MAPC中的術語“成體”是非限制性的。它是指非胚胎體細胞。MAPC核型正常并且在體內(nèi)不形成畸胎瘤。該首字母縮略詞在美國專利No . 7，015，037中首次用于描述從骨髓分離的多能細胞。但是，隨后發(fā)現(xiàn)了具有多能性標志物和/或分化潛能的細胞，對于本發(fā)明的目的，這些細胞可以等價于這些首次被命名為“ MAPC”的細胞。MAPC類型細胞的基本描述在上文本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容中提供。MAPC 代表比 MSC 更原始的祖細胞群(Verfai I lie, CM.，Trends Cell Biol12:502-8(2002), Jahagirdar, B. N. , et al. , Exp HematoI, 29:543-56(2001);Reyes, M. andCM. Verfaillie, Ann N Y Acad Sci, 938:231-233(2001);Jiang, Y. et al. , Exp HematoI, 30896-904 (2002) ; and (Jiang, Y. et al. , Nature, 418:41-9. (2002))。術語“MultiStem⑧”是基于美國專利No. 7，015，037的MAPC的細胞制品的商品名稱，即如上所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞。MultiStem 可按照本專利申請中公開的細胞培養(yǎng)方法制備，特別是低氧和聞血清?！翱伤幱幂d體”是用于本發(fā)明中所用細胞的任何可藥用介質(zhì)。所述介質(zhì)可保持等滲性、細胞代謝、PH等。所述介質(zhì)與對受試者的體內(nèi)給藥相客，因此可用于細胞遞送和治療。術語“效能”是指細胞(或者來自所述細胞的條件培養(yǎng)基)實現(xiàn)本申請描述的各種效果的有效性的程度。因此，效能是指各種水平的效果，包括但不限于(I)提供血管生成；
(2)表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子；或者(3)治療與血管生成不足相關的臨床癥狀以減少(包括預防)所述癥狀。可培養(yǎng)并刺激“原始胚胎生殖細胞”(PG或EG細胞)以產(chǎn)生很多分化程度較低的細胞類型?！白婕毎笔窃诟杉毎只^程中產(chǎn)生的細胞，其具有它們的最終分化子代的特性的一些但非全部。確定的祖細胞例如“心臟祖細胞”可形成細胞譜系，而不形成具體的或終末分化的細胞類型。首字母縮略詞“MAPC”中使用的術語“祖”并不將這些細胞限制于具體的細胞譜系。祖細胞可以形成比所述祖細胞分化程度更高的子代細胞。本文使用的術語“減少”是指阻止以及下降。在上下文所述的治療中，“減少”是阻止或改善一種或多種臨床癥狀。臨床癥狀是如果不予處理將對受試者的生活質(zhì)量(健康)產(chǎn)生或?qū)a(chǎn)生消極影響的ー種(或多種)癥狀。這還適用于潛在的生物學效應，其最終結果是改善血管生成不足的有害效應?！斑x擇”具有所需水平的效能(例如，表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子)的細胞可以指鑒別(如通過測定)、分離和擴增細胞。這能夠產(chǎn)生具有比所述細胞分離自的親代細胞群更高效能的細胞群?！坝H代”細胞群是指選擇的細胞從其分裂的親代細胞?！坝H代”是指實際的Pl — Fl關系(S卩，子代細胞)。因此，如果細胞X是從細胞X和Y的混合群落(其中X是表達子而Y不是)中分離的，則人們不會把純的X分離物分類為具有增強的表達。但是，如果X的子代細胞是更高表達子，則人們可把所述子代細胞歸類為具有增強的表達。為選擇表達所述ー種或多種促血管生成因子的細胞，將會包括測定是否表達/分泌所述ー種或多種促血管生成因子的測定，還包括獲得所述表達子細胞。所述表達子細胞可以天然地表達ー種或多種促血管生成因子，因為所述細胞不表達通過重組方式的所述因子。但是，表達子可以通過與増加因子表達的試劑孵育或暴露于該試劑而改迸。在進行所述測定前，可以不知道從中選擇所述表達子細胞的細胞群是否表達所述的一種或多種促血管生成因子。選擇可以來自組織中的細胞。例如，在這種情況下，細胞將從所需的組織中分離、在培養(yǎng)基中擴增、選擇用于表達/分泌ー種或多種促血管生成因子，并對選擇的細胞進ー步擴増。
選擇還可以來自離體的細胞，例如培養(yǎng)物中的細胞。在這種情況下，對培養(yǎng)物中的所述ー個或多個細胞測定ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌，并且獲得的表達/分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞可以被進一歩擴增。還可以就ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌增強選擇細胞。在這種情況下，從中獲得表達增強的細胞群可以已經(jīng)表達/分泌所述ー種或多種促血管生成因子。表達/分泌增強是指比親代表達子細胞群更高量的每個細胞的ー種或多種促血管生成因子(表達和/或分泌)。從中選擇更高表達子的親代細胞群可以是大體上同種的(相同細胞類型)。從這種細胞群獲得高表達子的ー種方式是形成單個的細胞或細胞池并測定這些細胞或細胞池的ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌來獲得天然表達/分泌更高水平的ー種或多種促血管生成因子(相對于用ー種或多種促血管生成因子的誘導物處理細胞)的克隆，然后擴增為天然更高的表達子的細胞。但是，細胞可以用ー種或多種可以增強所述因子的內(nèi)源細胞基因的因子表達的試劑處理。因此，可以處理大體上同種的細胞群來增強表達。如果所述細胞群不是大體上同種的，那么優(yōu)選在要處理的親代細胞群中含有至少100個在其中尋求表達增強的表達子細胞類型，更優(yōu)選為至少1，000個細胞，還更優(yōu)選為10，000個細胞。處理之后，這個亞群可以通過公知的細胞選擇技術從異種細胞群中回收，如果需要的話可進一歩地擴增。因此，因子表達的所需水平可以是高于給定在前的細胞群的水平。例如，被放入來自組織的原代培養(yǎng)物并通過不是特別設計用來促進因子表達的培養(yǎng)條件擴增和分離的細胞，可以提供親代細胞群。這樣的親代細胞群可以經(jīng)過處理來增強每個細胞的平均因子表達或篩選出細胞群內(nèi)沒有故意處理就有高表達水平的細胞。然后，可以擴增這些細胞來提供較高(所需)表達的細胞群?！白晕腋隆笔侵府a(chǎn)生復制子代干細胞的能力，所述子代干細胞具有與其來自的親代細胞相同的分化潛能。本文中使用的類似術語是“増殖”?！案杉毎笔侵缚梢赃M行自我更新(S卩，子代具有相同的分化潛能)并且也可以產(chǎn)生分化潛能更受限的子代細胞的細胞。在本發(fā)明的上下文中，干細胞還可以涵蓋分化程度更高的細胞，其已經(jīng)通過例如以下方式去分化通過核轉(zhuǎn)移、通過與更原始的干細胞融合、通過導入特定的轉(zhuǎn)錄因子或者通過在特定條件下培養(yǎng)。參見，例如，Wilmut et al.,Nature, 385:810-813(1997);Ying et al. , Nature, 416:545-548(2002);Guan et al.,Nature, 440:1199-1203(2006);Takahashi et al.，Cell, 126:663-676(2006);Okita etal. , Nature, 448:313-317(2007);和 Takahashi et al.，Cell，131:86ト872(2007)。去分化還可以通過給予ー些化合物或在體內(nèi)或體外暴露于可以引起去分化的物理環(huán)境而引起。干細胞還可以來自異常組織，例如畸胎癌和一些其他來源，例如胚狀體(盡管這些可被認為是胚胎干細胞，因為它們來自胚胎組織，盡管不是直接來自于內(nèi)細胞團)。干細胞還可以通過將與干細胞功能相關的基因?qū)敕歉杉毎缯T導的多能干細胞中而產(chǎn)生?！笆茉囌摺笔侵讣棺祫游?，例如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限于人、狗、貓、馬、牛和豬。術語“治療有效量”是指被確定可在哺乳動物中產(chǎn)生任何治療反應的試劑量。例如，有效的治療試劑可以延長患者的存活力，和/或抑制明顯的臨床癥狀。在本文使用的術語的含義范圍內(nèi)，治療有效的治療包括改善患者的生活質(zhì)量的治療，即使它們沒有改善疾 病結果本身。這樣的治療有效量很容易地由本領域普通技術人員確定。因此，“治療”是指送遞這樣的量。因此，治療可以防止或改善血管生成不足的病理癥狀。本發(fā)明中廣泛使用術語“治療(“Treat”、“treating”或“treatment，，)”，其中包括防止、改善、抑制或者治愈缺陷、機能障礙、疾病或其他有害的過程，包括干擾治療的和/或由治療導致的那些?！膀炞C”是指確認。在本發(fā)明的上下文中，確認ー個細胞是具有所需效能的表達子。然后，這使得可以使用具有合理的期望效能的細胞(用于治療、入細胞庫、藥物篩選等)。因此，進行驗證是指確認原先被發(fā)現(xiàn)具有/確立具有有促血管生成活性的細胞實際上保持所述活性。因此，驗證是涉及原先確定和后續(xù)確定的兩事件過程的確認事件。此處第二個事件是指“驗證”。干細胞本發(fā)明可以優(yōu)選地使用脊椎動物物種的干細胞進行，所述脊椎動物物種例如人、非人靈長類、馴養(yǎng)動物、家畜和其他非人哺乳動物。這些包括但不限于下文描述的那些細胞。胚胎干細胞研究最透徹的干細胞是胚胎干細胞(ESC)，因為它具有無限的自我更新和多能分化潛能。這些細胞可以源自胚泡的內(nèi)細胞團，或者可以源自植入后胚胎的原始生殖細胞(胚胎生殖細胞或EG細胞)。ES和EG細胞最初是從小鼠中得到，之后從很多不同的動物中得到，最近還從非人靈長類和人中得到。當ESC被導入小鼠胚泡或者其他動物的胚泡中吋，ESC可以成為所述動物的所有組織。ES和EG細胞可通過用抗SSEAl (小鼠)和SSEA4 (人)的抗體陽性染色來鑒別。參見，例如，美國專利 No. 5，453，357,5, 656，479,5, 670，372,5, 843，780、5，874，301、5，914，268、6，110，739、6，190，910、6，200，806、6，432，711,6, 436，701、6，500，668,6, 703，279,6, 875，607,7, 029，913,7, 112，437,7, 145，057,7, 153，684 和7，294，508，其各自以引用的方式納入本文，用于闡述胚胎干細胞以及制備和擴增所述胚胎干細胞的方法。因此，ESC及其分離和制備方法是本領域中公知的。已經(jīng)鑒定了許多影響胚胎干細胞在體內(nèi)的效能狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子和外源性細胞因子。被描述涉及干細胞多能性的首個轉(zhuǎn)錄因子是0ct4。0ct4屬于POU(Pit-Oct-Unc)轉(zhuǎn)錄因子家族，是能夠活化基因轉(zhuǎn)錄的DNA結合蛋白，在啟動子或增強子區(qū)域內(nèi)包含被稱為“八聚體基序”的八聚序列。0ct4在受精卵的分裂期時表達，直到卵圓柱形成。0ct3/4的功能是抑制分化誘導基因(即，F(xiàn)oxaD3、hCG)、活化促進多能性的基因(FGF4、Utfl、Rexl)。Sox2——高遷移率族(high mobility group,HMG)框轉(zhuǎn)錄因子(box transcription factor)的一個成員——與0ct4協(xié)作活化內(nèi)細胞團中表達的基因的轉(zhuǎn)錄。0ct3/4在胚胎干細胞中的表達維持在某些水平之間是必要的。0ct4表達水平>50%的過表達或者下調(diào)將改變胚胎干細胞命運，分別為形成原始內(nèi)胚層/中胚層或滋養(yǎng)外胚層。在體內(nèi)，0ct4缺陷的胚胎可發(fā)育至胚泡期，但是內(nèi)細胞團細胞不是多能的。相反，它們沿著胚胎外滋養(yǎng)層譜系分化。Sall4——ー種哺乳動物Spalt轉(zhuǎn)錄因子——是0ct4的上調(diào)調(diào)節(jié)子，因此對于在胚胎早期維持合適的0ct4水平是重要的。當Sall4水平下降至低于某ー閾值時，滋養(yǎng)外胚層細胞將異位擴增至內(nèi)細胞團中。多能性所需要的另ー個轉(zhuǎn)錄因子是Nanog,是以Celtic部族“Tir Nan 0g” 永遠年輕的土地，命名的。在體內(nèi)，Nanog從致密桑葚胚期表達，之后被限制在內(nèi)細胞團中，并且在植入期下調(diào)。Nanog的下調(diào)對于在原腸胚形成過程中避免多能細胞的不受控擴增和允許多向分化可能是重要的。第5. 5天分離的Nanog無效胚胎由無序胚泡構成，主要包含胚胎外內(nèi)胚層和無法辨認的上胚層。 非胚胎干細胞已在大部分組織中鑒別到干細胞?？赡茏钋宄碚鞯氖窃煅杉毎?HSC)。HSC是來自中胚層的細胞，其可以使用細胞表面標志物和功能特性來純化。它們已經(jīng)被從骨髄、外周血、臍帶血、胎肝和卵黃囊中分離到。它們起始造血作用并且產(chǎn)生多種造血譜系。當它們被移植進入致死量放射線照射的動物中吋，它們能夠再造紅系嗜中性粒細胞-巨噬細胞(erythroid neutrophi 1-macrophage)>巨核細胞和淋巴造血細胞庫。它們還能被誘導進行ー些自我更新的細胞分裂。參見，例如，美國專利No. 5，635，387,5, 460，964,5, 677，136、5，750，397,5, 681，599和5，716，827。美國專利No. 5，192，553報道了用于分離人新生兒或胎兒造血細胞或祖細胞的方法。美國專利No. 5，716，827報道了作為Thy-I+祖細胞的人造血細胞，以及在體外再生它們的合適生長培養(yǎng)基。美國專利No. 5，635，387報道了用于培養(yǎng)人造血細胞和它們的前體的方法和裝置。美國專利No. 6，015，554描述了重建人淋巴和樹突細胞的方法。因此，HSC及其分離和擴增方法是本領域中公知的。本領域中公知的另ー種干細胞是神經(jīng)干細胞(NSC)。這些細胞可在體內(nèi)增殖并且連續(xù)地再生至少ー些神經(jīng)細胞。當離體培養(yǎng)時，神經(jīng)干細胞可被誘導增殖以及分化為不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。當神經(jīng)干細胞被移植至腦中時，其能夠植入并且產(chǎn)生神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。參見，例如Gage F.H.，Science, 287:1433-1438(2000),Svendsen S. N. et al, Brain Pathology, 9:499-513 (1999)和 Okabe S. et al. , MechDevelopment, 59:89-102(1996)。美國專利No. 5，851，832報道了從腦組織中得到的多能神經(jīng)干細胞。美國專利No. 5，766，948報道了由新生兒大腦半球產(chǎn)生神經(jīng)母細胞。美國專利No. 5，564，183和5，849，553報道了哺乳動物神經(jīng)嵴干細胞的用途。美國專利No. 6，040, 180報道了在體外由哺乳動物多能CNS干細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生分化的神經(jīng)元。WO 98/50526和WO 99/01159報道了神經(jīng)上皮干細胞、少突星型膠質(zhì)細胞前體和譜系受限的神經(jīng)元前體的產(chǎn)生和分離。美國專利No. 5，968，829報道了從胚胎前腦得到的神經(jīng)干細胞。因此，神經(jīng)干細胞以及制備和擴增它們的方法是本領域中公知的。本領域中已經(jīng)大量研究的另ー種干細胞是間充質(zhì)干細胞(MSC)。MSC來自于胚胎中胚層，可從多種來源分離到，主要包括成體骨髄、外周血、脂肪、胎盤和臍帶血。MSC能夠分化成為很多中胚層組織，包括肌肉、骨、軟骨、脂肪和腱。關于這些細胞有大量的文獻。參見，例如，美國專利 No. 5，486，389,5, 827，735,5, 811，094,5, 736，396,5, 837，539,5, 837，670和 5，827，740。還可見于 PUtenger，M. et al, Science, 284:143-147 (1999)。成體干細胞的另ー個實例是脂肪來源的成體干細胞(ADSC)，其通常已被通過以下方式從脂肪分離吸脂術，之后使用膠原酶釋放ADSC。ADSC在很多方面類似于源自骨髓的MSC，不同的是能夠從脂肪中分離更多細胞。已經(jīng)報道這 些細胞可以分化成為骨、脂肪、肌肉、軟骨和神經(jīng)元。U. S. 2005/0153442描述了ー種分離方法。本領域中已知的其他干細胞包括胃腸干細胞、表皮干細胞和肝臟干細胞，其也被稱作“卵形細胞”(Potten, C.，et al. , Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998)
,Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997);Alison et al., Hepatology, 29:678-683(1998))。據(jù)報道能夠分化成為超過ー種胚胎胚層的細胞類型的其他非胚胎細胞包括但不限于來自臍帶血的細胞(參見美國公布文本No. 2002/0164794)、來自胎盤的細胞(參見美國公布文本No. 2003/0181269)、來自臍帶基質(zhì)的細胞(Mitchell, K. E. et al. , StemCells, 21:50-60(2003))、來自小胚胎樣干細胞的細胞(Kucia，M.et al. , J PhysiolPharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006))、來自羊水干細胞的細胞(Atala, A.，J TissueRegen Med，1:83-96 (2007))、來自皮膚來源的前體的細胞(Toma et al. , Nat CellBiol, 3:778-784 (2001))和來自骨髓的細胞(參見美國公布文本No. 2003/0059414和2006/0147246)，其各自以引用的方式納入本文用于教導這些細胞。重編稈體細胞的方法已經(jīng)使用了ー些不同的方法(例如核移植、細胞融合和培養(yǎng)誘導的重編程)來誘導分化的細胞轉(zhuǎn)化為胚胎狀態(tài)。核轉(zhuǎn)移包括將體細胞核注射進入去核卵母細胞，當所述卵母細胞被轉(zhuǎn)移進入代理母親中時，可以形成克隆(“生殖性克隆”)，或者當所述卵母細胞在培養(yǎng)物中外植時，可以形成遺傳匹配的胚胎干(ES)細胞(“體細胞核轉(zhuǎn)移”，SCNT)。體細胞與ES細胞的細胞融合致使產(chǎn)生顯示多能ES細胞的全部特性的雜合體。培養(yǎng)物中的體細胞的外植可選擇用于可以是多能(pluripotent or multipotent)的無限增埴細胞系。目前,精原干細胞是來源自出生后動物的多能細胞的唯一來源。用規(guī)定的因子轉(zhuǎn)導體細胞可以啟動重編程至多能狀態(tài)。對這些試驗方法有大量綜述(Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441:1061-1067(2006)和 Yamanaka, S.，Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007))。核轉(zhuǎn)移核移植(NT)，也被稱作體細胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)，是指將來自供體體細胞的核導入去核卵母細胞以產(chǎn)生克隆動物，例如多莉羊(ffilmut et al.，Nature, 385:810-813 (1997))。通過NT產(chǎn)生活動物證明了體細胞的表觀遺傳狀態(tài)(epigenetic state)(包括終末分化的細胞的表觀遺傳狀態(tài))盡管穩(wěn)定，但也不是不可逆地固定的，而是可以重編程至胚胎狀態(tài)，其能夠指導新生物體的發(fā)育。除了為闡釋胚胎發(fā)育和疾病中涉及的基本表觀遺傳機制提供令人興奮的實驗方法外，核克隆技術具有用于患者特異性移植醫(yī)學的潛在益處。
體細胞和胚胎干細胞的融合將體細胞核表觀遺傳重編程至未分化狀態(tài)，已經(jīng)在通過胚胎細胞和體細胞融合產(chǎn)生的鼠雜合體中被證明。多種體細胞與胚胎癌細胞(Solter，D.，Nat RevGenet, 7:319-327(2006))、胚胎生殖細胞(EG)或 ES 細胞(Zwaka and Thomson, Development, 132:227-233 (2005))之間的雜合體有很多與親本胚胎細胞相同的特性，表明多能表型在這樣的融合產(chǎn)物中是主要的。對于小鼠(Tada et al.，Curr Biol,11:1553-1558 (2001))，人ES細胞具有在融合之后重編程體細胞核的潛能(Cowan et al.，Science, 309:1369-1373 (2005) ; Yu et al.，Science, 318:1917-1920 (2006))。沉默多能性標志物例如0ct4的活化,或者失活體細胞X染色體的再活化為所述雜合細胞中體細胞基因組的重編程提供了分子證據(jù)。已經(jīng)提出，DNA復制對于在融合2天后首次觀察到的多能性標志物的活化是必要的(Do and Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)),以及當與神經(jīng)干細胞融合時，Nanog在ES細胞中的強制過表達可促進多能性(Silva etal.，Nature, 441:997-1001(2006))。培養(yǎng)物誘導的重編程 已經(jīng)從胚胎源得到了多能細胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的內(nèi)細胞團(ICM) (ES細胞)、上胚層(EpiSC細胞)、原始生殖細胞(EG細胞)和出生后精原干細胞(“maGSCsm”，“ES-樣”細胞)。以下的多能細胞，與它們的供體細胞/組織一起，描述如下單性生埴ES細胞(parthogenetic ES cell)來自鼠卵母細胞(Narasimha et al. , Curr Biol, 7:881-884 (1997));胚胎干細胞來自卵裂球(Wakayamaet al.，Stem Cells, 25:986-993 (2OO7));內(nèi)細胞團細胞(來源不適用)(Eggan etal. ,Nature, 428:44-49 (2004));胚胎生殖細胞和胚胎癌細胞來自原始生殖細胞(Matsuiet al.，Cell, 70:841-847(1992)) ;GMCS、maSSC 和 MASC 來自精原干細胞(Guan et al. , Nature,440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara et al.，Cell, 119:1001-1012(2004);和 Seandel et al. , Nature, 449:346-350 (2007)) ;EpiSC 細胞來自上胚層(Brons etal.，Nature, 448:19ト 195 (2007) ; Tesar et al.，Nature, 448:196-199 (2007));單性生殖 ES 細胞來自人卵母細胞(Cibelli et al. , Science, 295L819 (2002) ; Revazova etal. , Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007));人 ES 細胞來自人胚泡(Thomson et al. , Science, 282:1145-1147(1998)) ;MAPC 來自骨髓(Jiang et al. , Nature, 418:41-49 (2002);Phinney and Prockop, Stem Cells, 25:2896-2902 (2007));胳帶血細胞(來自胳帶血)(van de Ven et al. , Exp Hematol, 35:1753-1765 (2007));神經(jīng)球(neurosphere)衍生的細胞來自神經(jīng)細胞(Clarke et al.，Science, 288:1660-1663 (2000))。來自生殖細胞譜系的供體細胞(例如PGC或精原細胞干細胞)已知在體外是單能性的，但是已證明多能ES 樣細胞(Kanatsu-Shinohara et al.，Cell, 119:1001-1012 (2004))或 maGSC (Guan etal. , Nature, 440:1199-1203 (2006))在體外長時間培養(yǎng)后可被分離。盡管大部分這些多能細胞類型能夠在體外分化和形成畸胎瘤，但依據(jù)更嚴格的標準，僅ES、EG、EC和精原干細胞衍生的maGCS或ES樣細胞是多能的，因為它們能夠形成出生后嵌合體并且成為生殖種系。最近，多能成體精原干細胞(MASC)從成體小鼠的睪丸精原干細胞中得到，并且這些細胞具有與 ES 細胞不同(Seandel et al.，Nature, 449:346-350 (2007))但是與 EpiSC 細胞類似的表達譜，所述EpiSC細胞來自植入后小鼠胚胎的上胚層(Brons et al. , Nature, 448:191-195 (2007);Tesar et al.，Nature，448:196-199(2007))。通過規(guī)定的轉(zhuǎn)錄因子進行重編程Takahashi和Yamanaka已經(jīng)報道了將體細胞重編程回ES樣狀態(tài)(Takahashi andYamanaka, Cell, 126:663-676 (2006))。在將 4 種轉(zhuǎn)錄因子 0ct4、Sox2、c-myc 和 Klf4 進行病毒介導的轉(zhuǎn)導，之后針對0ct4靶基因Fbxl5的活化進行選擇之后，他們成功地將小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和成體成纖維細胞重編程為多能ES樣細胞(圖2A)。具有活化的Fbxl5的細胞是制造的iPS (誘導的多能干)細胞并且通過它們形成畸胎瘤的能力證明了它們是多能的，但是它們不能產(chǎn)生活的嵌合體。這種多能狀態(tài)依賴于轉(zhuǎn)導的0ct4和Sox2基因的連續(xù)病毒表達，而內(nèi)源0ct4和Nanog基因或者不表達，或者以比ES細胞中低的水平表達，并且發(fā)現(xiàn)它們各自的啟動子大量甲基化。這與以下結論一致，即雖然Fbxl5-iPS細胞與ES細胞并不一樣，但是可能代表了重編程的不完全狀態(tài)。盡管遺傳實驗已經(jīng)確定了 0ct4和Sox2對于多能性是必需的(Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004) ; Ivanona etal. , Nature, 442:5330538 (2006) ;Masui et al.，Nat Cell Biol, 9:625-635 (2007))，但是兩種癌基因c-myc和Klf4在重編程中的作用仍較不清晰。這些癌基因中的ー些實際上對 于重編程來說可能不是必要的，因為已經(jīng)在不存在c-myc轉(zhuǎn)導的情況下得到了小鼠和人的iPS 細胞，盡管效率較低(Nakagawa et al. , Nat Biotechnol, 26:191-106 (2008) ;fferninget al. , Nature, 448:318-324(2008);Yu et al.，Science, 318:1917-1920 (2007))。MAPC人MAPC記載于美國專利7，015, 037。已經(jīng)在其他哺乳動物中鑒定了 MAPC。例如，鼠MAPC也記載于美國專利7，015，037。大鼠MAPC還描述于美國專利No. 7，838，289。這些參考文獻因記載了由Catherine Verfaillie首次分離的MAPC而以引用的方式納入本文。MAPC的分離和培養(yǎng)MAPC分離方法是本領域中已知的。參見，例如，美國專利7，015，037，這些方法連同MAPC的表征(表型)以引用的方式納入本文。MAPC可從多個源分離，所述源包括但不限于骨髓、胎盤、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝臟、脊髄、血液或皮膚。因此，可能獲得骨髓抽吸物、腦或肝臟活檢樣品和其他器官，并且使用本領域技術人員知曉的陽性或陰性選擇技木，其依賴于這些細胞表達(或者不表達)的基因(例如，通過功能性或形態(tài)學測定例如上文引用的申請中公開的那些，所述申請以引用的方式納入本文)分離所述細胞。MAPC 還可以 通過在 Breyer et al. , ExperimentalHematology, 34:1596-1601 (200b；和 Subramanian et al.，Cellular Programmingand Reprogramming:Methods and Protocols;S. Ding(ea ノ，Methods in MolecularBiology, 636:55-78(2010)中描述的改進方法來獲得，這些方法以引用的方式納入本文。美國專利7.015. 037中描沭的來自人骨髓的MAPCMAPC不表達共有的白細胞抗原⑶45或成紅細胞特異的血型糖蛋白-A (Gly-A)0將細胞的混合群進行Ficoll Hypaque分離。然后，以使用抗⑶45的抗體和抗Gly-A的抗體的陰性選擇對細胞進行處理，耗盡CD45+和Gly-A+細胞群，然后回收剩余的約0. 1%的骨髓單核細胞。還可將細胞鋪板于纖連蛋白包被的孔中，并且如下文所述培養(yǎng)2-4周以耗盡⑶45+和Gly-A+細胞。在貼壁骨髓細胞(adherent bone marrow cell)的培養(yǎng)物中，很多貼壁基質(zhì)細胞在細胞倍增約30次時發(fā)生復制性衰老，更同質(zhì)的細胞群繼續(xù)擴增并且保持長的端粒?；蛘撸梢酝ㄟ^細胞特異性標志物的組合使用陽性選擇來分離細胞。陽性和陰性選擇技術都是本領域技術人員可以得到的，并且本領域中可得到很多適于陰性選擇目的的單克隆和多克隆抗體(參見，例如，Leukocyte Typing V, Schlossman, et al. , Eds. (1995)Oxford University Press),其可從許多來源市購得到。從細胞群混合物中分離哺乳細胞的技術也已經(jīng)由Schwartz et al.在美國專利5, 759, 793 中(磁性分離)，Basch et al. , 1983 (免疫親和層析)和 Wysocki and Sato etal.，1978 (熒光激活細胞分選)記載。細胞可在低血清或無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)物MAPC的無血 清培養(yǎng)基記載于美國專利7，015，037中。通常使用的生長因子包括但不限于血小板衍生的生長因子和表皮生長因子。參見，例如，美國專利 No. 7, 169,610,7, 109,032,7,037, 721,6,617, 161、6，617，159,6, 372，210,6, 224，860,6, 037，174,5, 908，782,5, 766，951,5, 397，706 和4，657，866 ;全部以引用的方式納入本文用于教導在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。另外的培養(yǎng)方法在另外的實驗中，培養(yǎng)MAPC的密度可以是從約100個細胞/cm2或約150個細胞/cm2至約10，000個細胞/cm2變化，包括約200個細胞/cm2至約1500個細胞/cm2至約2000個細胞/cm2。所述密度可隨種類的不同而變化。此外，最佳密度可依賴于培養(yǎng)條件和細胞來源而變化。本領域技術人員能夠確定對于給定培養(yǎng)條件和細胞組的最佳密度。同樣，在培養(yǎng)物中，在MAPC的分離、生長和分化期間的任何時間都可以使用低于約10%，包括約1-5%，尤其是3-5%的有效大氣氧濃度?？稍诙喾N血清濃度下(例如約2-20%)培養(yǎng)細胞?？梢允褂锰ヅＱ?。更高的血清濃度可以與更低的氧張カ結合使用，例如約15-20%。不必在貼壁至培養(yǎng)皿之前選擇細胞。例如，在Ficoll梯度離心之后，將細胞以例如250，000-500，000/cm2直接鋪板。可以挑出貼壁集落，可以合并并且擴増。在一個實施方案中，在實施例的實驗方法中使用的高血清(約15-20%)和低氧(約3-5%)條件被用于細胞培養(yǎng)物。具體地，將來自集落的貼壁細胞以約1700-2300個細胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下(具有TOGF和EGF)中鋪板并傳代。在特異針對MAPC的實施方案中，補充物是允許MAPC保持分化為多于ー個胚胎譜系例如所有三個譜系的細胞類型的能力的細胞因子或組分。這可以通過未分化狀態(tài)的特定標志物例如Oct 3/4 (Oct 3A)和/或高擴增能力標志物例如端粒酶的表達來指示。細胞培養(yǎng)物對于下文列出的全部組分，參見U. S. 7，015，037，其以引用的方式納入本文用于教
導這些組分。一般來說，可以在本領域中公知并且可以得到的培養(yǎng)基中維持并且擴增可用于本發(fā)明的細胞。還考慮到了給細胞培養(yǎng)基補充哺乳動物血清。還可以有利地使用其他補充物來為所述細胞提供必需微量元素以實現(xiàn)最佳生長和擴増。還可以有利地將激素用于細胞培養(yǎng)物。還可以根據(jù)細胞類型和分化細胞的命運來使用脂質(zhì)和脂質(zhì)載體以補充細胞培養(yǎng)基。還考慮到了使用飼養(yǎng)細胞層。
培養(yǎng)物中的細胞可維持在懸浮液中或貼壁于固體支持物，例如胞外基質(zhì)成分。干細胞經(jīng)常需要促進其附著于固體支持物的另外的因子，例如I型和II型膠原、硫酸軟骨素、纖連蛋白、“超纖連蛋白(superfibronectin) ”和纖連蛋白樣聚合物、明膠、聚-D-和聚-L-賴氨酸、血小板反應蛋白和玻璃粘連蛋白。本發(fā)明的一個實施方案利用了纖連蛋白。參見，例如Ohashi et al. , Nature Medicine, 13:880-885 (2007);Matsumoto et al. , J Bioscience and Bioengineering, 105:350-354(2008);Kirouac et al. , Cell Stem Cell,3:369-381(2008);Chua et al., Biomaterials, 26:2537-2547(2005);Drobinskaya et al. , Stem Cells, 26:2245-2256(2008);Dvir-Ginzberg etal.,FASEB J, 22:1440-1449 (2008);Turner et al. , J Biomed Mater Res Part B:AppIBiomater, 82B:156-168(2007);和 Miyazawa et al. , Journal of Gastroenterology andHepatology, 22:1959-1964(2007)。還可在“3D”(聚集的)培養(yǎng)物中培養(yǎng)細胞。ー個實例是2009年I月21日提交的PCT/US2009/31528。一旦在培養(yǎng)物中被建立，細胞可被新鮮使用，或者使用例如含40%FCS和10%DMS0 的DMEM冷凍并以冷凍儲液形式儲存。對于用于制備所培養(yǎng)的細胞的冷凍儲液的其他方法也是本領域技術人員可獲得的。藥物制劑U. S. 7，015，037以引用的方式納入本文用于教導藥物制劑。在一些實施方案中，所述細胞群體存在于組合物中，所述組合物被改造為適于遞送，也就是生理學相容的。在一些實施方案中，用于給予受試者的細胞(或條件培養(yǎng)基)的純度是約100% (基本同質(zhì))。在其他實施方案中，純度是95%至100%。在一些實施方案中，純度是85%至95%。具體地，對于與其他細胞的混合物的情況，所述百分比可以是約10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%_40%、40%_45%、45%_50%、60%_70%、70%_80%、80%_90% 或 90%_95%。或者，分離/純度可以細胞倍増的方式表達，其中所述細胞已經(jīng)經(jīng)歷了例如10-20、20-30、30-40,40-50或更多次的細胞倍増。對于給定應用，用于給予所述細胞的制劑的選擇將依賴于多種因素。其中主要的因素是受試者的種類；待治療的病癥的性質(zhì)，它的狀態(tài)和在所述受試者中的分布；所給予的其他療法和試劑的性質(zhì)；給藥的最佳途徑；經(jīng)所述途徑的存活力；給藥方案和對于本領域技術人員來說明顯的其他因素。例如，合適載體和其他添加劑的選擇會依賴于給藥的確切路徑和具體劑型的性質(zhì)。細胞/培養(yǎng)基的水性懸液的最終制劑一般包括將所述懸液的離子強度調(diào)節(jié)至等滲(即，約0. I至0.2)并且調(diào)節(jié)至生理pH (8卩，約？冊.8至7.5)。最終制劑一般還會包含流體潤滑剤。在一些實施方案中，細胞/培養(yǎng)基被配制為單位劑量的可注射形式的制劑，所述的可注射形式例如溶液劑、懸液劑或乳剤。適于注射細胞/培養(yǎng)基的藥物制劑一般是無菌的水性溶液和分散液。用于可注射制劑的載體可以是包含例如以下物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì)水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙ニ醇、液態(tài)聚こニ醇等)及其合適的混合物。本領域技術人員可以容易地確定本發(fā)明方法中給予的組合物中的細胞和任選的添加剤、賦形物和/或載體的量。一般地，任意添加劑(除所述細胞之外)的存在量為在溶液中(例如在磷酸鹽緩沖鹽水中)0. 001至50wt%?；钚猿煞忠晕⒖酥梁量说牧考壌嬖?，例如為約0. 0001至約5wt%，優(yōu)選約0. 0001至約lwt%，最優(yōu)選為約0. 0001至約0. 05wt%或者約0. 001至約20wt%，優(yōu)選約0. 01至約10wt%，最優(yōu)選為約0. 05至5wt%。在某些實施方案中，將細胞封裝(膠囊化)給藥，特別是當膠囊化可提高治療效カ時或者提供操作和/或貯藏壽命上的優(yōu)點吋。細胞可在植入前通過膠囊以及膜進行封裝?？梢灶A料的是，可使用可用于細胞膠囊化的多種方法中的任意ー種。在微囊化細胞的多個實施方案中可使用多種材料。這些材料包括例如聚合物膠囊，藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽微膠囊、聚-L-賴氨酸藻酸鋇膠囊、藻酸鋇膠囊、聚丙烯腈/聚氯こ烯(PAN/PVC)中空纖維以及聚醚砜(PES)中空纖維?？捎糜诮o藥細胞的細胞微囊化技術為本領域技術人員已知，并且在例如Chang, P. , et al. , 1999 ; Matthew, H. ff. , et al. , 1991; Yanagi, K. , et al. , 1989 ; CaiZ. H. , et al. , 1988; Chang, T. M.，1992 以及美國專利 No. 5，639，275 (其描述了例如用于長 期維持穩(wěn)定表達生物活性分子的細胞的生物相容膠囊)中有描述。膠囊化的其他方法見歐洲專利公開 No. 301，777 和美國專利 No. 4，353，888 ;4，744，933 ;4，749，620 ;4，814，274 ；5，084，350 ;5，089，272 ;5，578，442 ;5，639，275 和 5，676，943。所有上述文獻都以引用的方式納入本文中與細胞膠囊化有關內(nèi)容。某些實施方案將細胞整合至聚合物中，例如生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的實例包括但不限于纖連蛋白、纖維蛋白(fibin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、凝血酶、膠原和蛋白聚糖。其他因子例如上面討論的細胞因子也可被整合至所述聚合物中。在本發(fā)明的其他實施方案中，細胞可被整合至三維凝膠的間隙中。大的聚合物或凝膠通常通過手術植入。可配制成足夠小的顆?；蚶w維的聚合物或凝膠可通過其他常規(guī)的、更方便的、非手術的途徑給予。所述細胞的劑量可在很大范圍內(nèi)變化，并且在每種具體情況下均會適合個體需求。一般地，在腸胃外給藥的情況下，常規(guī)地給予約I萬個至約2千萬個細胞/kg受體體重。細胞的數(shù)量將根據(jù)以下因素變化受體的體重和病癥、給藥的次數(shù)或頻率以及本領域技術人員已知的其他可變因素?？赏ㄟ^適于所述組織或器官的途徑給予所述細胞。例如，它們可被全身給予，即經(jīng)腸胃外給予、通過靜脈給予，或者可以被靶向具體的組織或器官；它們可被通過皮下給藥或通過向具體的所需組織中的給藥而被給予。所述細胞可以約0.01 X IO6個至約5 X IO6個細胞/ml的濃度懸浮于合適的賦形劑中。對于注射溶液適合的賦形劑是與細胞和受體在生物學和生理學上相容的那些賦形劑，例如緩沖的鹽水溶液或其他合適的賦形劑。用于給藥的所述組合物可根據(jù)符合適當?shù)臒o菌性和穩(wěn)定性的標準方法而配制、產(chǎn)生和存儲。對淋巴造血組織給藥用于向這些組織中給藥的技術是本領域中已知的。例如，骨髄內(nèi)注射可以包括將細胞直接注射進入骨髄腔中，其通常為髂后嵴的骨髄腔但是還可以包括髂嵴、股骨、脛骨、肱骨或尺骨中的其他位點；脾臟注射可以包括在射線拍照指導下注射進入脾臟，或者通過腹腔鏡或剖腹術手術暴露脾臟；派伊爾氏淋巴集結(peyer' s patch)、GALT或BALT注射可以要求剖腹術或腹腔鏡注射過程。
確定劑暈用于人或其他哺乳動物的劑量可無需過度實驗即由本領域技術人員根據(jù)本公開內(nèi)容、本文引用的文獻和本領域中的知識確定。適合用于本發(fā)明的各個實施方案的細胞/培養(yǎng)基的劑量會依賴于許多因素。確定主要和輔助療法所給予的最佳劑量的參數(shù)一般會包括以下中的ー些或全部待治療的疾病及其階段；受試者的種類、其健康情況、性別、年齡、體重和代謝速率；受試者的免疫活性；給予的其他治療法；和根據(jù)所述受試者的病史或基因型預測的可能并發(fā)癥。所述參數(shù)還包括所述細胞是否是同源的、自體同源的、同種異體的或者異種的；它們的效能(具體活性);所述細胞/培養(yǎng)基若要有效則必須靶向的位點和/或分布；以及所述位點的特性例如細胞/培養(yǎng)基的可及性(accessibility)和/或細胞的植入。其他參數(shù)包括與其他因子(例如生長因子和細胞因子)的共給予。給定情況的最佳劑量還將考慮制備所述細胞/培養(yǎng)基的方式，給予所述細胞/培養(yǎng)基的方式，以及所述細胞/培養(yǎng)基在給藥之后在所述祀位點處集中(localize)的程度。細胞的最佳劑量可以在用于自體同源單核骨髄移植的劑量范圍內(nèi)。對于完全純的細胞制品，多個實施方案中的最佳劑量的范圍是毎次給藥IO4至IO8個細胞/kg受體體重。 在一些實施方案中，每次給藥的最佳劑量為IO5至IO7個細胞/kg。在很多實施方案中，每次給藥的最佳劑量為5X IO5至5X IO6個細胞/kg。作為參考，前述的較高劑量類似于自體同源單核細胞骨髄移植中使用的有核細胞的劑量。一些較低的劑量類似于自體同源單核骨髓移植中使用的CD34+細胞數(shù)目/kg。在多個實施方案中，可以以初始劑量給予細胞/培養(yǎng)基，之后通過進ー步給藥來維持。初始可用ー種方法給予細胞/培養(yǎng)基，之后通過相同的方法或者ー種或多種不同的方法給予?？赏ㄟ^所述細胞/培養(yǎng)基的持續(xù)給藥來維持所述水平。多個實施方案通過靜脈注射來初始給予所述細胞/培養(yǎng)基和/或在所述受試者中維持其水平。在多個實施方案中，根據(jù)患者的病癥和其他因素(在本文他處描述)可使用其他形式的給藥。細胞/培養(yǎng)基可以多種頻率在很寬時間范圍內(nèi)給予。一般地，治療的長度會與所述疾病過程的長度、實行的治療的效カ以及接受治療的受試者的病癥和反應成比例。MS給予所述細胞可用于在任意數(shù)目病理狀況中提供血管生成，包括但不限于任意的缺血癥狀例如急性心肌梗塞、慢性心カ衰竭、外周血管疾病、中風、慢性完全閉塞、腎臟缺血和急性腎損傷。ー種或多種促血管生成因子的誘導物可以在給藥前和所述細胞混合來給予或者和所述細胞共給予(同時或依次地)。此外，由本申請描述的生物學機制知識提供了其他用途。這些用途中的ー種包括藥物發(fā)現(xiàn)。該方面包括就調(diào)節(jié)表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力和/或所述細胞分泌的ー種或多種促血管生成因子的血管生成效果篩選ー種或多種化合物。這涉及測定所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力和/或所述ー種或多種促血管生成因子的血管生成效果。因此，該測定可以設計為在體內(nèi)或在體外進行。細胞(或培養(yǎng)基)可以通過直接測定因子蛋白或RNA進行選擇。這可以通過任意本領域可得到的已知技術來完成，例如通過FACS和其他基于抗體的檢測方法以及PCR和其他基于雜交的檢測方法。間接測定也可以用于因子表達，例如結合到任意已知的受體。間接效應還包括測定由因子結合到其任意受體而觸發(fā)的任意的具體生物學信號傳遞步驟/事件。因此，還可以使用基于細胞的測定。下游目標也可以用來測定所述ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌。檢測可以是直接的例如通過RNA或蛋白測定或者間接的例如這些因子的ー種或多種生物學效應的生物學測定。因此，可以使用替代的標志物，只要其可以作為細胞表達/分泌一種或多種促血管生成因子的指示劑。用于表達/分泌的測定包括但不限于對組織樣本或細胞的ELISA、Luminex、qRT-PCR、因子抗體蛋白質(zhì)印跡(anti-factor western blot)和因子免疫組織化學。對細胞和條件培養(yǎng)基中的因子的定量確定可以使用市售測定試劑盒(例如，依賴兩步驟消減的基于抗體的測定(two-step subtractive antibody-based assay)的R&D系統(tǒng))來進行。體外血管生成測定還可以用于評價所述因子的表達/分泌。這種體外血管生成測 定在本領域是公知的。參見，例如本申請描述的HUVEC管形成測定、內(nèi)皮細胞増殖或遷移測定、主動脈環(huán)測定和雞胚尿囊膜測定(CAM)。體內(nèi)血管生成的測定還可以使用任意已知的體內(nèi)測定血管生成的測定來實現(xiàn)，例如matrigel plug測定、雞主動脈弓測定和基質(zhì)膠海綿測定。本發(fā)明的進ー步用途是建立可提供用于臨床給藥的細胞的細胞庫。通常，這ー過程的基本部分是在多種治療性臨床環(huán)境中提供用于給藥的具有所需效能的細胞。任何用于藥物發(fā)現(xiàn)的同樣的測定也可應用于為所述細胞庫選擇細胞以及從細胞庫選擇用于給藥的細胞。因此，在建立細胞庫過程中，將就所述細胞(或培養(yǎng)基)實現(xiàn)任意上述效果的能力進行測定。然后，會選擇具有用于任意上述效果的所需效能的細胞，這些細胞將形成建立細胞庫的基礎。還考慮到了通過用外源化合物處理來增加效能，所述化合物例如通過用大的組合文庫篩選細胞而發(fā)現(xiàn)的化合物。這些化合物文庫可以是試劑文庫，所述試劑包括但不限于小的有機分子、反義核酸、siRNA DNA適體、肽、抗體、非抗體蛋白質(zhì)、細胞因子、趨化因子和趨化物。例如，細胞可在培養(yǎng)和制備過程中的任意時間暴露于這類試劑。唯一的要求是有足夠數(shù)目使得所需測定得以進行以評估所述試劑是否增加效能。在上文描述的一般藥物發(fā)現(xiàn)方法中發(fā)現(xiàn)，在入庫前的最后傳代過程中，可以更有利地應用這類試劑。已經(jīng)成功應用于MultiStem的一個實施方案如下所述。從合格的骨髓供體中分離細胞，所述合格的骨髄供體已經(jīng)接受了特定的測試要求以確定從該供體得到的細胞產(chǎn)物可安全地在臨床情況下使用。使用手工或自動化方法分離所述單核細胞。將這些單核細胞置于培養(yǎng)中，使得這些細胞貼壁至經(jīng)處理的細胞培養(yǎng)容器表面?？墒筂APC細胞在經(jīng)處理的表面擴增，在第2天和第4天更換培養(yǎng)基。在第6天，通過機械方法或酶學方法將細胞從所述經(jīng)處理的基質(zhì)中移走，并且重置于另ー個經(jīng)處理的細胞培養(yǎng)容器的表面。在第8天和第10天，如前所述將所述細胞從所述經(jīng)處理的表面移走并且進行重放置。在第13天，將所述細胞從所述經(jīng)處理的表面移走，洗滌并且與冷凍保護材料結合，并且最后在液氮中冷凍。在所述細胞已經(jīng)冷凍至少I周之后，取出細胞的等分試樣并用于效能、同一性、無菌性測試以及其他測試以確定所述細胞庫的可用性。然后，可通過解凍該庫中的這些細胞，將它們置于培養(yǎng)中來使用這些細胞，或者在解凍之后使用它們來治療可能的適應癥。另ー個用途是對給予所述細胞之后的效能和有益的臨床效果進行診斷測定。根據(jù)所述適應癥，可以有可用于評估的生物標志物。細胞的劑量可在治療期間根據(jù)所述效果進行調(diào)整。另ー個用途是評估所述細胞達到上述任意結果的功效，所述評估作為將所述細胞給予受試者之前的治療前診斷。另外，劑量可以依賴正在給予的細胞的效能而定。因此，針對效能的治療前診斷測定可用于確定初始給予所述患者的細胞劑量，并可能用于在治療期間基于臨床效果的實時評估來確定進一步給予的細胞劑量。還應該理解的是，本發(fā)明所述的細胞不僅可以為治療目的提供血管生成，也可以為研究目的在體內(nèi)和體外提供血管生成以便理解正常和疾病模型中血管生成涉及的機制。在一個實施方案中，體內(nèi)或體外的血管生成測定可以在已知的參與血管生成的試劑存在的情況下進行。然后可以評估這些試劑的效果。這些類型的測定還可以用于篩選對血管生成有效應的試劑，所述的血管生成可被本發(fā)明所述的細胞促迸。因此，在一個實施方案中，可以在疾病模型中篩選逆轉(zhuǎn)消極效果和/或促進積極效果的試劑。相反地，可以在正常血管 生成的模型中篩選具有消極效果的試劑。鉬合物本發(fā)明還涉及細胞群，其具有實現(xiàn)本文描述的任意效果的具體效能。如上所述，這些群是通過選擇具有所需效能的細胞建立的。這些群被用于制備其他組合物，例如包含具有具體所需效能的群的細胞庫和包含具有具體所需效能的細胞群的藥物組合物。在一個實施方案中，TNF-a、IL-I^和IFN-Y的結合物可以增強所述細胞的血管生成效能。將所述細胞暴露于這種因子結合物可増加促血管生成基因表達，例如CXCL5、FGF2和HGF。在這些條件下IL-8也可能増加。促血管生成分子的分泌還可以通過將細胞用前列腺素F類似物拉坦前列腺素處理而增加。通過RT-PCR分析的促血管生成因子的基因表達顯示了 HGF、VEGF、KITLG和IL-8的增加。生物前列腺素F還增加了 VEGF A水平。實施例實施例IMM已經(jīng)顯示在缺血損傷后遞送外源干細胞可以通過給予損傷組織營養(yǎng)支持來提供治療性益處，其中的營養(yǎng)支持是通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥細胞、限制細胞凋亡、刺激新血管生成以及招募宿主組織用于修復。之前的結果表明，MultiStem對缺血損傷有益的機制可能部分地是MultiStem通過促進血管生成誘導新血管形成的能力的結果。因此，本研究g在檢驗MultiStem是否能誘導血管生成并鑒定負責該活性的因子以及比較MultiStem和MSC的血管生成活性。方法和結果使用已得到確認的體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)血管生成測定，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)4天后從MultiStem收集的條件培養(yǎng)基在體外誘導了血管生成。發(fā)明人鑒定了由MultiStem分泌的多種促血管生成因子，包括VEGF、CXCL5和IL-8，并且發(fā)現(xiàn)這全部三種因子對于MultiStem誘導血管生成都是必需的。有趣的是，沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的骨髓衍生的間充質(zhì)干細胞(MSC)表達CXCL5和IL-8。與MultiStem不同，在這個體外系統(tǒng)中僅來自MSC的條件培養(yǎng)基不能誘導血管生成。益論MultiStem可以誘導血管生成，部分地通過IL-8、VEGF和CXCL5的表達。這種分泌譜與MSC不同并且這些不同反映在它們的功能性活性上。精簡摘要使用已得到確認的血管生成測定，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從MultiStem收集的條件培養(yǎng)基在體外誘導了血管生成。發(fā)明人鑒定了由MultiStem分泌的多種促血管生成因子，包括VEGF、CXCL5和IL-8，并且發(fā)現(xiàn)這全部三種因子對于MultiStem誘導血管生成都是必需的。有趣的是，沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的骨髓衍生的間充質(zhì)干細胞(MSC)表達CXCL5和IL-8。與MultiStem不同，在這個體外系統(tǒng)中來自MSC的條件培養(yǎng)基不能誘導血管生成。 缺血損傷，以流到組織或器官的血液減少為特征，由于到達缺血區(qū)域的營養(yǎng)和氧減少導致的組織損傷和細胞死亡，可以具有毀滅性的后果\急性心肌梗塞(AMI)、外周血管疾病(PVD)和中風是由分別流向心臟、四肢和腦的血液減少引起的缺血損傷的三個常見例子。這些病癥可以導致嚴重的長期器官損害、四肢截肢甚至由于氧和營養(yǎng)喪失的死亡。這些病癥的治療常常集中于快速恢復到達損傷區(qū)域的血流以阻止進ー步的組織損害、細胞死亡并減少炎癥2。MultiStem⑧，從骨髓衍生的大規(guī)模擴增的貼壁多能祖細胞群，在動物模型中當被遞送至下述的缺血損傷例如AMI和PVD時已經(jīng)被證實是有益的3_6。例如，與賦形劑對照相比，在由直接左前降支動脈結扎誘發(fā)的心肌梗死后，將MultiStem遞送至梗死周圍位點導致了左心室收縮性能改善、創(chuàng)傷區(qū)域減少、血管密度増加和心肌能量特征改善7。在嚴重下肢缺血模型中，小鼠和人MultiStem也已被證實可改善肢體活動、増加血流量和毛細血管密度并減少壞死5。由于MultiStem植入的低水平和MultiStem到心肌或內(nèi)皮細胞的極小量分化，MultiStem對于AMI和PVD的益處被認為來源于旁分泌效應。與賦形劑治療的對照相比，在MultiStem治療的AMI和PVD動物中觀察到的血管密度増加表明，MultiStem可能能夠通過促進血管生成而誘導新血管形成。這種活性可能是對AMI和PVD的治療有益的重要機制。血管密度増加最終導致了血流量増加，因此到損傷位點的氧和營養(yǎng)遞送増加8_9。大量研究已證實，干細胞可以通過分泌促血管生成因子(例如VEGF)促進或增強血管生成和新血管形成1(l_n?；谶@些研究，發(fā)明人假定，MultiStem也具有誘導血管生成的能力。因此，MultiStem被檢查來確定它是否分泌可促進血管生成的因子。使用血管生成因子免疫印跡陣列，檢測了來自從常見供體建立的MultiStem和MSC培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，證明了兩種培養(yǎng)物環(huán)境中具有一致的血管生成因子表達模式。收集自MultiStem的無血清條件培養(yǎng)基在體外誘導了血管生成。鑒定了由MultiStem分泌的多種促血管生成因子，包括VEGF、CXCL5和IL-8 ;免疫耗竭研究證明全部三種因子對于MultiStem誘導的血管生成都是必需的。但是，這些因子単獨均不足以誘導血管生成。培養(yǎng)的骨髓衍生的間充質(zhì)干細胞(MSC)沒有表達CXCL5和IL-8。與MultiStem不同，在這個體外系統(tǒng)中來自MSC的條件培養(yǎng)基不能誘導血管生成。以前的研究已經(jīng)證明，在缺血動物模型中MSC可以在體外穩(wěn)定血管形成并增加血管密度，然而最近的研究已經(jīng)表明在某些條件下MSC阻止血管生成并導致內(nèi)皮細胞死亡1卜13。這些結果表明，在沒有與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的情況下MSC不會分泌足夠的可溶因子來維持血管生成。綜上所述，這些結果表明在多種條件和環(huán)境下MultiStem和MSC具有不同的分泌譜，這些不同反映在它們的旁分泌活動中。材料和方法細朐培養(yǎng)物將人MultiStem維持在如前所述的培養(yǎng)物中7。MSC是從Lonza(Walkersville, MD)購買并按供應商說明書在培養(yǎng)物中擴大培養(yǎng)。對于同一供體MultiStem和MSC的制備，對每個細胞系使用前述的條件從新鮮骨髓分離貼壁細胞并培養(yǎng)14。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC，Lonza)按照制造商說明書以2500個細胞/cm2的濃度在培養(yǎng)中擴大培養(yǎng)。HUVEC在第3次和第5次傳代之間使用，在用于血管生成測定之前，以3000個細胞/cm2濃度鋪板并維持三天，此時匯合度約為70-80%。 無血■清條件培養(yǎng)基(CM)的制備MultiStem鋪于含有MultiStem培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。24小時后，移走含血清的培養(yǎng)基，用I XPBS洗滌細胞并加入含有生長因子但不含血清的人MultiStem培養(yǎng)基。不改變培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞4天，在第4天，收集無血清的條件培養(yǎng)基,在4°C以1900rpm離心(spundown) 5min,分為小份并儲存在_80°C。Panomics 陣列Panomics (Fremont, CA)人血管生成抗體陣列是根據(jù)制造商的說明書使用2ml的2倍稀釋的第4天無血清MultiStem條件培養(yǎng)基樣品來進行的。血管牛成陣列血管生成抗體陣列(R&D systems, Minneapolis, MN)是根據(jù)制造商的說明書使用2ml的2倍稀釋的來自衍生自同一供體的MultiStem和MSC的第3天條件培養(yǎng)基樣品來進行的。ELISAIL_8、VEGF和CXCL5的蛋白水平是通過ELISA (R&D Systems)測定的。對VEGF的所有亞型都進行了檢測。誤差線表示+/-標準差。VEGF 和 CXCL8/IL-8 免疫耗竭蛋白A-瓊脂糖珠(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)以 75L 的 50%勻衆(zhòng)姆 Iml CM 的濃度使用。小鼠抗人VEGF的單克隆抗體(Santa Cruz)以4ug/ml CM的濃度使用，兔抗人IL_8的多克隆抗體(Millipore, Billerica, MA)以2ug/ml CM的濃度使用。正常小鼠IgG(SantaCruz)和色譜純(ChromPure)兔 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)作為同種型對照使用。蛋白A-瓊脂糖珠與抗VEGF的抗體、抗IL-8的抗體或同種型對照在4°C下?lián)u晃預孵育過夜，然后用冰冷的I XPBS洗滌4次，在4°C下以2500rpm離心2分鐘。CM在6ml小份中在4°C下?lián)u晃2小時進行免疫耗竭，然后通過0. 45M濾器過濾以去掉任何殘留的珠子。用小鼠IgG-AC處理的CM作為同種型對照。重組人VEGF121 (eBioscience, San Diego, CA)和/或VEGF165 (R&D Systems)亞型以50_1000pg/ml的濃度范圍加回到免疫耗竭的CM中。
CXCL5/ENA-78 中和使用人CXCL5/ENA-78 抗體(R&D Systems)以 10 ii g/ml CM 的濃度在 4 °C下將CXCL5搖晃中和2小吋。使用濃度為10 ii g/ml CM的正?？偵窖騃gG (JacksonImmunoResearch)作為同種型對照。另外使用的對照是內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EGM, Lonza),其中摻入濃度為IOii g/ml的人ENA-78中和抗體或正?？偵窖騃gG。血管牛成測定生長因子減少的基質(zhì)膠(BD Bioscience, San Jose, CA)在冰上在4°C下解凍過夜，以6. 0-6. 5mg/ml的濃度使用，在冰上使用冰冷的I XPBS稀釋。將400微升基質(zhì)膠分布在24孔組織培養(yǎng)板的內(nèi)部孔中，并在37°C下固化I小吋?；|(zhì)膠的加入在冰上進行并且板的外部孔用Iml的I X PBS填充。HUVEC按如下方法收獲將細胞用IXPBS洗滌然后用0. 25X胰蛋白酶-EDTA作短暫的沖洗，然后用I XPBS (有殘留血清)洗滌以淬滅。將細胞重懸在內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)基 (EBM)中并計數(shù)。將HUVEC加入到CM，其他實驗條件和対照的濃度為55，000個細胞/ml/孔。每個樣品和對照作三次重復測定。將板在5%C02和37°C孵育6小時或18小時以容許管形成。對每個孔分析4個視野，總共12個視野。使用IOX物鏡拍攝照片。通過計數(shù)細胞間形成的管的數(shù)量對血管生成評分。結果表示為每個視野形成的管平均數(shù)+/-SEM。結果可以在體外促講血管牛成的MultiStem分泌因子以前的研究顯示，與用賦形劑治療的對照相比，用MultiStem治療缺血損傷導致了在接近損傷區(qū)域的血管密度増加，表明MultiStem可誘導新的血管形成和血管生成。為檢驗MultiStem是否分泌促進血管生成的因子,利用了ー種使用來自MultiStem的條件培養(yǎng)基的體外血管生成測定。MultiStem在正常條件下鋪板24小吋。然后，所述細胞被轉(zhuǎn)移到無血清條件4天來產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。然后，在體外管形成測定中檢驗該培養(yǎng)基的血管生成活性。HUVEC鋪板在減少生長因子的基質(zhì)膠上，該基質(zhì)膠被進一步稀釋到ー個濃度，在該濃度下基質(zhì)膠和無血清基礎MultiStem培養(yǎng)基或無血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基一起都不會產(chǎn)生任何自發(fā)的血管生成。將HUVEC鋪板在條件培養(yǎng)基、基礎培養(yǎng)基或內(nèi)皮生長培養(yǎng)基中18個小吋。每個條件下血管生成的測量表示為每個視野內(nèi)形成的管的平均數(shù)。在沒有任何額外因子時，基礎培養(yǎng)基中単獨存在血清可以誘導血管生成。因此，所有實驗都使用了無血清培養(yǎng)基。在含血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中觀察到了強的、復雜的管形成，而無血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基或無血清基礎MultiStem培養(yǎng)基顯示幾乎沒有管形成的誘導。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與基礎培養(yǎng)基相比,來自4天MultiStem培養(yǎng)物的無血清條件培養(yǎng)基誘導了血管生成(圖1A，B)。為鑒定由MultiStem分泌的可以促進血管生成和新血管形成的因子，在血管生成抗體陣列上分析了 MultiStem無血清條件培養(yǎng)基(圖1C)。許多促血管生成因子以及ー些抑制血管生成因子由MultiStem分泌到培養(yǎng)基中。最顯著地是，VEGF和白細胞介素8 (IL-8)是由MultiStem分泌的，兩者都是有效的血管生成分子15_'CXCL5，另ー種有效的血管生成細胞因子，也是由MultiStem分泌的(圖ID) 18。VEGF、CXCL5和IL-8在4天的MultiStem條件培養(yǎng)基中是以生理有效水平表達的(圖D-F)。VEGF在血管生成誘導中作為關鍵因子參與的作用促使我們檢查VEGF對于MultiStem的促血管生成活性是否是必需的使用VEGF抗體，將VEGF從MultiStem條件培養(yǎng)基中免疫耗竭。為確保將VEGF從培養(yǎng)基中真正地免疫耗竭，使用VEGF ELISA測定了免疫耗竭的培養(yǎng)基中的VEGF水平。與所述條件培養(yǎng)基和単獨清除IgG的培養(yǎng)基相比，免疫耗竭的培養(yǎng)基中VEGF水平減少了超過95%(圖2A)。CXCL5水平和IL-8水平?jīng)]有受VEGF免疫耗竭影響(圖2B、C)。在沒有VEGF吋，由MultiStem條件培養(yǎng)基誘導的血管生成減少了(圖2，補充圖I)。這些結果證明VEGF在MultiStem條件培養(yǎng)基中對于誘導血管生成是必需的。為確立在MultiStem條件培養(yǎng)基中維持血管生成活性需要的VEGF的最低水平，逐漸增量的VEGF被加回到免疫耗竭的培養(yǎng)基中。VEGF-A，研究最多的VEGF形式，通常稱為VEGF，其有多種亞型包括VEGF 121和VEGF 165。當這兩種亞型被分別加回到免疫耗竭的MultiStem條件培養(yǎng)基中以測定誘導血管生成需要的VEGF的最小量時(圖2A、C)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雖然兩種亞型單獨地都不足以完全恢復之前用MultiStem條件培養(yǎng)基觀察到的血管生成水平，但是250pg/ml的VEGF 121足夠恢復ー些血管生成(圖2C)。50pg/ml的VEGF165足以恢復一定水平的血管生成，并且加入更多VEGF 165不會明顯看出增加血管生成水平(圖2D)。 CXCL5和IL-8對于MultiStem誘導血管牛成的if常水平都是必需的，伯不足以誘導血管生成雖然VEGF是血管生成需要的，但是VEGF単獨地以在所述條件培養(yǎng)基中的濃度是不足以誘導強壯的血管生成的22_24。對由MultiStem分泌的額外的血管生成因子的鑒定促使我們檢查CXCL5和IL-8對于MultiStem的血管生成活性是否是必需的。為檢驗這個假設，IL-8被從MultiStem條件培養(yǎng)基中免疫耗竭，并且被發(fā)現(xiàn)減少達95% (圖3)。通過ELISA測量的VEGF和CXCL5水平在IL-8免疫耗竭的培養(yǎng)基中保持不受影響。在沒有IL-8時，使用MultiStem條件培養(yǎng)基的HUVEC體外管形成減少了約60% (圖3，補充圖II)。這些結果表明，IL-8對于MultiStem條件培養(yǎng)基誘導血管生成是必需的，雖然即使在沒有IL-8時MultiStem條件培養(yǎng)基仍然保持一定水平的血管生成活性。類似地，通過在所述培養(yǎng)基中加入CXCL5阻斷抗體而阻斷CXCL5活性導致了 HUVEC血管生成測定中管形成的顯著下降(圖4A)。所述培養(yǎng)基中CXCL5水平由于阻斷抗體而減少，但是VEGF和IL-8水平保持不變(補充圖III)。有趣的是，在基礎培養(yǎng)基中僅加入CXCL5、僅加入IL-8或加入其兩者都不足以誘導血管生成，表明這些因子對于MultiStem誘導的血管生成是必需的，但不足以誘導血管生成(圖4B、C)。在體外測定中MSC表汰VEGF伯.不能引起HUVEC的血管牛成為評估MultiStem誘導的血管生成水平是否同其他干細胞系誘導的血管生成水平相類似，收集來自MSC的無血清條件培養(yǎng)基并檢驗其在培養(yǎng)基中誘導血管生成的能力，與MultiStem進行比較。在這個測定中MSC條件培養(yǎng)基沒有誘導血管生成，即使重復了來自多個供體的MSC時也是如此(圖6A，補充圖III)。雖然其他報告顯示在體外HUVEC測定中MSC可以誘導血管生成，但是這些測定是在鋪板后4-6小時分析的，其顯示了不完全的血管生成或使用了不同的條件25が。當在6小時檢查血管生成管形成吋，MSC和MultiStem條件培養(yǎng)基都誘導了ー些管形成。但是，到24小時，使用MSC條件培養(yǎng)基的血管生成瓦解了，而使用MultiStem條件培養(yǎng)基的血管生成卻繼續(xù)保持(圖5)。檢查了 MSC條件培養(yǎng)基中VEGF、CXCL5和IL-8的表達，發(fā)現(xiàn)VEGF以比在MultiStem條件培養(yǎng)基中更高的水平表達，而MSC條件培養(yǎng)基中的CXCL5和IL-8沒有以可探測到的水平表達。為確認這些結果是MSC分泌譜的指示而不是由無血清培養(yǎng)物引起的假象，由MSC表達的VEGF、IL-8和CXCL5的水平在它們正常培養(yǎng)條件下被檢測并與在MultiStem培養(yǎng)條件下MultiStem條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的這些因子的蛋白水平相比較。對于這些細胞系，發(fā)明人從同一供體獲得MSC和MultiStem以排除兩種細胞系之間任何的遺傳差異。即使這些細胞類型是從同一供體獲得的，CXCL5和IL-8水平在MSC條件培養(yǎng)基中是不能檢測到的，但是在MultiStem培養(yǎng)基中以生理有效的水平表達(圖5B)。為進ー步檢測這些細胞系的分泌譜，發(fā)明人在血管生成抗體陣列上(圖6A)對從同一供體獲得的細胞的MultiStem條件培養(yǎng)基的分泌譜和MSC條件培養(yǎng)基的分泌譜進行了比較(圖6，補充數(shù)據(jù)I )。數(shù)據(jù)顯示，有多種由MultiStem分泌但MSC不分泌的血管生成因子和抑制血管生成因子，包括血管生成素、HGF、IL-8、瘦蛋白、TMP-4 和 IGFBP-1。相比之下，HMP-I (25 倍)和 IGFBP-2 (16 倍)在 MSC 中都以比MultiStem更高的水平表達。VEGF和IGFBP-3在MSC中也一致地以比MultiStem更高的水平表達，雖然只是3-4倍。綜上所述，這些結果表明，即使來自同一供體的MultiStem和MSC也有不同的分泌譜并且這些不同反映在細胞系之間功能的不同上。討論 從多種組織(包括骨髄、臍帶血和脂肪組織)分離的成體干細胞正在被開發(fā)以治療缺血損傷例如急性心肌梗塞、中風和外周血管疾病28_3°。這些損傷引起細胞和組織損害，這種損害來自受影響組織初期的氧氣和營養(yǎng)喪失，也來自所述區(qū)域隨后的炎癥。快速而持續(xù)的血流恢復可以減少缺血區(qū)域的損害和炎癥?；诩毎闹委煹脑灸康氖窃趽p傷后通過外源干細胞的遞送和隨后的分化使損失和損害的組織再生和修復。但是，后續(xù)的檢查干細胞治療益處的機制的研究顯示，很多干細胞主要通過旁分泌效應起作用而不是通過再生，因為很多細胞類型在遞送幾天后不再能檢測到31-33。治療假設是，這些細胞群可以通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥細胞、限制細胞凋亡、刺激新血管生成以及招募宿主組織用于修復來為損傷組織提供營養(yǎng)支持。益處可能來源于這些途徑的動態(tài)級聯(lián)，并且不同的細胞群可能在某些途徑上更強烈地施加影響。用于治療的最適當?shù)馁N壁干細胞群的選擇可以反映給定的細胞群對于關鍵途徑的效能，以及為有效介導所述應答的遞送時間。因此，對這些途徑建立標準化的測定以提供比較數(shù)據(jù)然后把這些有活性的體外替代品同損傷和恢復聯(lián)系起來是重要的。多能成體祖細胞是從骨髓培養(yǎng)物中獲得的貼壁成體干細胞群。以前的體內(nèi)研究顯示了，在缺血損傷后用MultiStem治療的動物中血管密度的增加4’7。在本研究中，我們已經(jīng)顯示，MultiStem可分泌可以在體外管形成測定中誘導血管生成的因子。進ー步分析顯示，MultiStem可分泌多種促血管生成因子，包括VEGF、IL-8和CXCL5。這些因子中的兩種，CXCL5和IL-8，經(jīng)由MultiStem的分泌與經(jīng)由MSC的分泌有很大差別，MSC分泌的CXCL5和IL-8即使有，也很少。VEGF、CXCL5和IL-8對于MultiStem誘導血管生成都是必需的。除去或抑制這些因子中任ー個均會大大地降低MultiStem條件培養(yǎng)基促進血管生成的能力。VEGF 165是涉及血管生成的主要亞型。但是，多種VEGF亞型可能對MultiStem誘導血管生成起作用，因為在VEGF免疫耗竭的MultiStem條件培養(yǎng)基中獨立地使用VEGF 121或VEGF165都不能100%地恢復管形成。雖然其他小組已經(jīng)遞送了単一促血管生成因子(例如VEGF)到動物缺血損傷模型中以提供ー些有益效果，但是結果對于臨床適應癥例如AMI和PVD來說是混亂的34’35。在大鼠AMI模型中，不受控制的血管生成因子表達可以導致嚴重的副作用例如血管瘤形成、關節(jié)炎和視網(wǎng)膜病，以及嚴重的胸腔積液和心包積液34’36’37。對于PVD，通過基因或蛋白遞送単一血管生成因子的臨床試驗結果是令人失望的，這很可能是由于多種因素，其包括目前檢測的長期益處需要的因子不穩(wěn)定、遞送并發(fā)癥、缺血組織的低的攝取和應答以及為實現(xiàn)功能性血管形成需要幾種共同作用因子。相反，用干細胞對缺血損傷進行治療可以提供對単一蛋白或基因治療的有吸引力的替代方案。干細胞治療缺血損傷的使用可以通過應答并定位到低氧和炎癥微環(huán)境的細胞導致多種血管生成因子直接遞送到損傷位點，實現(xiàn)刺激適當?shù)难苌蓱鸬膭討B(tài)平衡。此外，干細胞例如MultiStem還可以通過免疫調(diào)節(jié)和抗細胞凋亡機制同時阻止組織損害。在本研究中，發(fā)明人證明了 MultiStem通過至少三種促血管生成因子的表達確實能夠直接誘導血管生成。雖然MSC表達并分泌高水平的VEGF，但是在該體外測定系統(tǒng)中來自MSC的條件培養(yǎng)基不足以誘導血管生成。以前的研究已經(jīng)顯示MSC可以在體外穩(wěn)定血管形成。但是，這些研究中的很多檢查血管形成是在較早的時間點，例如在4-6小時或在不同的條件下25_27，38。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在這些較早的時間點，在陰性對照中有高水平的血管生成本底，這種血管生成 本底在24小時時是不穩(wěn)定的。類似地，我們發(fā)現(xiàn)在6小時時，MSC可以誘導某些水平的血管生成，隨后其在24小時時間點消失。相反，MultiStem誘導了在24小時保持穩(wěn)定的管形成。這些結果表明，雖然MSC在短期內(nèi)支持血管生成，但沒有其他因子時這種血管形成是不穩(wěn)定的。這些結果反映了較早研究的數(shù)據(jù)，其中顯示單獨的VEGF以這些細胞表達的水平不足以引發(fā)穩(wěn)定的血管形成24。在以前用MSC治療缺血損傷顯示出血管密度増加的體內(nèi)實驗上下文中，MSC可以通過誘導內(nèi)源性炎癥細胞或組織祖細胞以促進血管生成來増加血管密度。參考文獻I. 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權利要求
1.一種在受試者中提供血管生成的方法，所述方法包括選擇具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞；測定所述細胞中所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能；并將所述的具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞以治療有效量給予所述受試者并持續(xù)足以實現(xiàn)治療效果的時間，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-ι或rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞。
2.一種在受試者中提供血管生成的方法，所述方法包括將具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞以治療有效量給予所述受試者并持續(xù)足以實現(xiàn)治療效果的時間，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其中在給藥前已經(jīng)驗證所述細胞具有這種效能。
3.權利要求I或2的方法，其中所述的細胞是同種異體的。
4.權利要求I或2的方法，其中所述的受試者具有選自急性心肌梗塞、慢性心力衰竭、外周血管疾病、中風、慢性完全閉塞、腎臟缺血和急性腎損傷的病癥。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述受試者為人。
6.—種構建細胞庫的方法,所述方法包括選擇具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞；并且擴增和儲存所述的細胞以便將來給予受試者，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或ι·0Χ_1中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、夕卜胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞。
7.—種構建細胞庫的方法，所述方法包括擴增并儲存用于將來給予受試者的具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或ι·0Χ-1中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其中在入庫前已經(jīng)驗證所述細胞具有這種效能。
8.—種藥物發(fā)現(xiàn)方法，所述方法包括選擇具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞；并將所述細胞暴露于試劑以評估所述試劑對所述細胞表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的能力的效應，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox-Ι中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞。
9.一種藥物發(fā)現(xiàn)方法，所述方法包括將具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞暴露于試劑以評估所述試劑對所述細胞表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的能力的效應，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞，所述細胞已經(jīng)就具有所需效能經(jīng)過選擇并且已經(jīng)經(jīng)過驗證具有這種效倉泛。
10.一種包含表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞的組合物，所述細胞以比親代細胞群更高的水平分泌一種或多種促血管生成因子。
11.一種增強細胞中一種或多種促血管生成因子表達的方法，所述方法包括將所述細胞暴露于TNF-α、IL-I β、和IFN-Y的結合物，其中所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-1或ι·0Χ-1中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞。
12.—種增強細胞中一種或多種促血管生成因子表達的方法，所述方法包括將所述細胞暴露于前列腺素F類似物的結合物,其中所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎干細胞、非生殖細胞。
13.權利要求12的方法，其中所述前列腺素F類似物是拉坦前列腺素。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療可以通過血管生成改善的病理狀態(tài)的方法。本發(fā)明總體上涉及通過給予表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的細胞來提供血管生成。本發(fā)明還涉及藥物發(fā)現(xiàn)方法來篩選可調(diào)節(jié)細胞表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的能力的試劑。本發(fā)明還涉及可以用來提供給予受試者的細胞的細胞庫，所述細胞庫包括具有所需的一種或多種促血管生成因子的表達和/或分泌水平的細胞。
文檔編號A61P9/00GK102858956SQ201180020289
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權日2010年2月25日
發(fā)明者J·M·沃達, A·E·廷, N·A·雷曼 申請人:Abt控股公司