專利名稱：包含至少一種疏水性治療活性物質(zhì)和選自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水溶性藥物組合物，其包含至少一種治療活性物質(zhì)，以及選自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混和物的至少一種化合物。在此組合物中，至少一種治療活性物質(zhì)為疏水性藥物。特別地，本發(fā)明涉及由經(jīng)修飾的鞘糖脂或鞘糖脂的納米膠束組成的可注射無(wú)菌組合物，其可以被白蛋白非共價(jià)包被，且允許高疏水性分子的受控釋放。
背景技術(shù)：
主要由于缺乏到達(dá)正確位點(diǎn)以發(fā)揮治療作用的能力，許多藥物特別是那些疏水性藥物的療效受到了限制。在很多情況下，甚至當(dāng)藥物為水溶性時(shí)，只有小部分的給藥劑量到·達(dá)其治療位點(diǎn)，而大部分藥物則分散于全身。由此，這種在健康器官及組織中的分散常常限制了藥物的劑量。因此，理想的具有高疏水性主要活性成分的藥物制劑應(yīng)該使藥物在水介質(zhì)中具有高溶解度，并能以復(fù)合物的形式穩(wěn)定存在而不會(huì)分解，與此同時(shí)還能夠聚集于特異的作用位點(diǎn)。具有高疏水性和極低或有限水溶性的活性成分的實(shí)例包括用于腫瘤治療的(例如紫杉醇、多烯紫杉醇和阿霉素)、抗真菌病(例如兩性霉素B)、用作激素(黃體酮)和麻醉劑(例如異丙酚)的那些。此外還包括前列腺素、二硝酸異山梨酯、睪酮、硝酸甘油、雌二醇、維生素E、可的松、地塞米松及其酯和戊酸倍他米松。特別地，紫杉醇(paclitaxel, Ptx)是從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹(shù)中分離出來(lái)的具有抗癌特性的二萜類化合物。大約30年前，由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所進(jìn)行的臨床前研究中證實(shí)了上述樹(shù)木的粗提取物具有抗腫瘤活性，此后，人們提出將紫杉醇用于癌癥治療。Ptx是一種與微管蛋白結(jié)合并促使其聚合以形成高穩(wěn)定性微管的分子。這種微管的穩(wěn)定性導(dǎo)致了微管網(wǎng)重組的正常動(dòng)態(tài)受到抑制。這與例如秋水仙堿、長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春堿之類的引起微管解體的其它抗微管藥物作用相反(諸如秋水仙堿、長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春堿之類的其它抗微管藥物顯示了相反的作用它們導(dǎo)致了微管的解體)。在開(kāi)發(fā)包含PTX的藥物過(guò)程中遇到的最主要困難之一在于其極不溶于水的特性。傳統(tǒng)上，將低水溶性藥物制劑加工為乳劑，或?qū)⑺幬锱c諸如膠束的溶解藥物的膠體結(jié)合，從而增加其在水介質(zhì)中的濃度。具體來(lái)說(shuō)，PTX的水溶性很低(低于10yg/ml);因此，研究了用于靜脈輸注的不同載體。實(shí)際上某些有機(jī)溶劑可以部分溶解PTX ;然而，在將混溶溶劑用于水稀釋于含水介質(zhì)中，并且其中的PTX接近其飽和點(diǎn)時(shí)，此藥物就會(huì)開(kāi)始沉淀。由于這個(gè)原因，在不同臨床實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)人的給藥，將50%CremoforEL/50%無(wú)水乙醇稀釋于生理溶液中或5%的葡萄糖水溶液中以使Cremofor EL和無(wú)水乙醇的終濃度為5%或更低，從而配制了的不同PTX組合物。
如今,Bristol-MyersSquibb Co.(紐約，N. Y.)將 30mg(5ml)劑量的 PTX 針劑行銷世界各地。每毫升所述制劑包含大約6mg Ptx、527mg Cremofor EL、和 49. 7%(vol/vol)的無(wú)水酒精。給藥時(shí)，可將該濃縮制劑稀釋于生理溶液、5%葡萄糖水溶液、包含5%葡萄糖的生理溶液、或者包含5%葡萄糖水溶液的林格氏液中(Goldspiel，1994，"PharmaceuticalIssues!Preparation, Administration, Stability, and Compatibility with OtherMedications^Ann. Pharmacotherapy, vol. 28, pp. S23-26. Harvey Whitney BooksCompany)。然而,應(yīng)該注意的是在Cremophore/乙醇中的PTX制劑稀釋于水介質(zhì)后會(huì)變得不穩(wěn)定，并出現(xiàn)纖維狀沉淀。在美國(guó)專利US 5，504, 102中可以查閱到Cremophore中的PTX制劑。像大多數(shù)化療藥物一樣，最大耐受劑量受到其毒性的限制。在人體中，PTX的大部分毒性作用可見(jiàn)于約100至約250mg/m2的濃度范圍。例如，在毒副作用中，文獻(xiàn)提到了粒細(xì)胞減少癥(Holmes F. A. et al·, “Phase II trial of taxol, an active drug in the treatment of metastatic breast cancer，，，J Natl Cancer Inst. 1991, 83:1797-1805),和系統(tǒng)性周圍神經(jīng)病變，后者為主要的非血液性毒性作用(Rowinsky E. K. etal. , 1995, Review Article. Drug Therapy-Pacl i tax el (Taxol) N. Engl. J. Med. Vol332:1004-1014 N. 15)。最近，PTX已被制備成用于胃腸外灌注的液態(tài)及固體狀態(tài)。美國(guó)專利US6，743，826描述了通過(guò)與人白蛋白或重組人白蛋白的相互作用而獲取可溶性Ptx的方法。另一方面，美國(guó)專利US 2005282734A1中描述了包含與人白蛋白結(jié)合的Ptx或多烯紫杉醇的凍干制劑或水溶性組合物，其中Ptx的濃度高于500 μ g/ml。然而，所述申請(qǐng)沒(méi)有清楚地顯示Ptx在所述制劑中的溶解度。白蛋白分子在諸如Ptx的疏水分子的傳遞中起到了關(guān)鍵作用，其在不同組織中的累積與白蛋白和細(xì)胞受體間相互作用的能力有關(guān)(Gradishar ff. J.，2006，“Albumin-boundpaclitaxel:A next-generation taxane, . Expert Opin Pharmacother;7:1041 - 1053)。通過(guò)與受體結(jié)合，白蛋白啟動(dòng)了所謂的白蛋白-Ptx復(fù)合物轉(zhuǎn)胞吞作用，使白蛋白-Ptx復(fù)合物(稱為ABI-007)穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜到達(dá)間質(zhì)復(fù)合體，從而直接暴露于腫瘤表面(Ibrahim N. K. et al.，2002，“Phase I and pharmacokinetic study of ABI-007, aCremophor-free, protein-stabilized, nanoparticle formulation of paclitaxel，，，ClinCancer Res-;8:1038 - 1044 ；Gradishar ff. J. , 2006, “Albumin-bound paclitaxel:Anext-generation taxane，，，Expert Opin Pharmacother, 7:1041 - 1053 ；Drummond D. C. etal.，1999，“Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solidtumors，，· Pharmacol Rev. ; 51:691-743)。白蛋白在腫瘤中蓄積，這至少部分是由于所謂的白蛋白結(jié)合蛋白(SPARC，分泌蛋白，酸性而富含半胱氨酸，也稱為BM-40)的分泌，這可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合于白蛋白的PTX在腫瘤內(nèi)蓄積(Fukunaga-Kalabis M. and Herlyn Μ. , 2007, “Unraveling mysteries of themultifunctional protein SPARC，，，J Invest Dermatol; 127:2497 - 2498)。另一方面，近年來(lái)在專業(yè)文獻(xiàn)中也發(fā)表了其他獲取水溶性PTX的方法，比如將其與聚谷氨酸聚合物結(jié)合(US 專利 No. 7，384，977)。
另外，多烯抗生素兩性霉素B (AmB)也是高疏水性分子。這種分子主要通過(guò)與甾醇類(比如存在于真菌細(xì)胞膜中的麥角留醇)相互作用而發(fā)揮效力，從而增加其滲透性。然而，用兩性霉素B治療全身性真菌感染與廣泛的腎損傷密切相關(guān)(BennetJ.E.,1996 “Antimicrobial agents” · In:Hardman JG, Limbird LE，Molinoff PB，RuddonRW,Goodman Gilman A, editors. Goodman and Gilman’ s The Pharmacological Basis ofTherapeutics. 9th ed. New York:McGraw Hill, : 1175-90)。所觀察到的兩性霉素 B 在人體內(nèi)的毒性很可能和其與所有哺乳類細(xì)胞中膽固醇的相互作用有關(guān)。為了解決這些問(wèn)題，AmB起初被制備成膠束制劑，通過(guò)了 FDA認(rèn)證，并以Anfostat為名稱進(jìn)行銷售。爾后，人們開(kāi)發(fā)出兩性霉素B的脂質(zhì)體制劑，并以Ambisome為名稱進(jìn)行銷售(Boswell G. W. et al.，1998，“AmBisome(Liposomal amphotericin B):A comparativereview”，J Clin Pharmacol vol. 38:583-92) 0該產(chǎn)品是最早獲批應(yīng)用于臨床治療全身真菌感染的脂質(zhì)體制劑(Gray A. and Morgan J. (1991) Liposomes in hematology. BloodRev;258-271)。
在正常劑量下，脂質(zhì)體兩性霉素B的特征在于優(yōu)先傳遞到肝臟和脾臟，從而減輕了兩性霉素 B 的腎臟毒性特征(Boswell G. W. et al.，1998，“AmBisome (Liposomalamphotericin B) :A comparative review”，J Clin Pharmacol vol. 38:583-92;AhmadI.et al.， 1991，“Tissue distribution and antileishmanial activity of liposomisedamphotericin-B in BALB/c mice”. J Biosci. voll6:217_21)。然而，當(dāng)高劑量使用時(shí)，腎臟毒性再次出現(xiàn)(Longuet P. et al.，1991，“Limited protection by small unilamellarliposomes against the renal tubular toxicity induced by repeated amphotericinB infusion in rats” . Antimicrob Agent Chemother; vol. 35:1303-1308) 0 顯然，該毒性是由于肝臟和脾臟巨噬細(xì)胞吸收機(jī)制的飽和而造成的。Ambisome也可以用于治療網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的耐藥性寄生感染(Davidson R. N. etal.，1991，“Liposomal amphotericin B in drug-resistant leishmaniasis，，;Lancetvol. 337:1061-1062) 0實(shí)際上，脂質(zhì)體可被巨噬細(xì)胞俘獲及其聚集于肝臟和脾臟的能力使其成為了治療諸如利什曼病的肝臟和腎臟疾病的理想選擇。此外，有趣的是注意到當(dāng)被O-硬脂酰支鏈淀粉和聚氧乙烯(polioxiethylene)或單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂包被后，脂質(zhì)體還可以被定向傳遞到肺部(Deol P，KhullerGK. (1997) “Lung specific stealth liposomes!stability, biodistribution and toxicity of liposomal anti tubercular drugs，，· Biochim Biophys Actavol. 1334:161-72)o將諸如利福平或異煙肼之類的抗結(jié)核藥物包封于脂質(zhì)體中可以調(diào)節(jié)或調(diào)控它們的毒性(Deol P. andKhuller G. K. , 1997, iiLung specific stealth liposomes: stability,biodistribution and toxicity of liposomal antitubercular drugs，，，Biochim BiophysActa vol. 1334:161-72)并且改善這些藥物的療效(Deol P. et al.，1997，“Therapeuticefficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specificstealthliposomes against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice”.Antimicrob Agent Chemother vol. 41:1211-4)。常規(guī)的脂質(zhì)體制劑經(jīng)配制使藥物或其他活性成分置于其核心的水相(親水性藥物)或者分配于脂雙分子層(非親水性藥物)中。經(jīng)證實(shí)，將各種抗腫瘤或抗霉菌藥物包封于常規(guī)脂質(zhì)體中減少了藥物引起的細(xì)胞毒副作用，從而保持或在某些情況下增強(qiáng)了其抗腫瘤或治療效果。毒性的降低是由于脂質(zhì)體能夠減少藥物與非目標(biāo)組織的接觸及隨之而來(lái)的不必要損傷。包封的抗癌或抗真菌藥物的作用機(jī)理還不清楚；這可能是由于脂質(zhì)體能夠向血液循環(huán)中緩慢釋放所包裹的藥物，或脂質(zhì)體與腫瘤表面的相互作用使藥物得以緩慢釋放到目標(biāo)腫瘤中。然而，脂質(zhì)體包封藥物面臨一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題包封后藥物會(huì)從脂質(zhì)體中快速釋放出來(lái)。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，那些分配于脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層中的高度親脂性(非水溶性)藥物在某些情況下似乎會(huì)改變膜的物理性質(zhì)，以至于膜本身變得不穩(wěn)定而不能再保有藥物，從而將其釋放到介質(zhì)中?；谶@些所觀察到的現(xiàn)象，在藥物包封系統(tǒng)中，應(yīng)力圖穩(wěn)定脂質(zhì)體使其得到保護(hù)，從而避免藥物和脂質(zhì)體相互之間的不利作用。另一方面，由于被主要位于肝臟和脾臟中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞快速清除，脂質(zhì)體通過(guò)血流進(jìn)行特異性給藥的應(yīng)用受到了嚴(yán)重影響。事實(shí)上，人們熟知較小的脂質(zhì)體其血液循環(huán)壽命會(huì)增加(美國(guó)專利No. 5，225，212)?？墒?，較小脂質(zhì)體的血管內(nèi)體積 也較小，使其治療價(jià)值甚微。為解決這個(gè)問(wèn)題的另外一種嘗試是使用結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體和納米球的 Ptx 微膠囊(Bartoni D. and Boitard R. , 1990, “In vitro and in vivo anti tumoractivity of free and encapsulated taxol, J. Microencapsulation, vol. 7:191-197)。尤其是脂質(zhì)體制劑被證實(shí)至少與單獨(dú)的Ptx同樣有效。然而只有那些Ptx含量低于2% 的制劑具有物理穩(wěn)定性(Sharma A. et al. , 1995, “Antitumor efficacy of taxaneliposomes on a human ovarian tumor xenograft in nude athymic mice”. J. Pharm. Sci·vol. 84:1400-4 ；Sharma U. S. et al. 1995“Pharmaceutical and physical properties ofpaclitaxel (taxol) complexes with cyclodextrins，，· J. Pharm. Sci. vol. 84:1223-30)。另一方面，納米球制劑被證實(shí)具有毒性。這些制劑所要實(shí)現(xiàn)的重要特性是增加血漿循環(huán)時(shí)間。針對(duì)特別選定的器官或組織進(jìn)行了生物分布研究；分析了組織勻漿樣品中脂質(zhì)體的脂質(zhì)含量或所研究藥物的含量。將含糖的脂分子，或如GMl神經(jīng)節(jié)苷脂的含氨基酸基團(tuán)的脂分子聚集到脂質(zhì)體中顯著降低了脂質(zhì)體中的脂質(zhì)在肝臟和脾臟中的蓄積。例如長(zhǎng)春新堿，其制劑綜合了 PH 2的脂質(zhì)體內(nèi)部PH與存在于脂質(zhì)體雙分子層中的GMl。將包含2、3或4mg/kg藥物的該制劑通過(guò)靜脈注射對(duì)接種P388腫瘤細(xì)胞的小鼠進(jìn)行給藥，與對(duì)照組相比，這種給藥極大地增加了這些小鼠的壽命。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室還研究了通過(guò)模擬紅血球表面以延長(zhǎng)脂質(zhì)體平均循環(huán)時(shí)間的可能性。表面碳水化合物在細(xì)胞識(shí)別中的作用已被廣泛研究(Ashwe 11 G. and More 11A.G. , 1974, “The role of surface carbohydrates in the hepatic recognition andtransport of circulating glyco-proteins”，Adv Enzymol 41:99-128;HakormoriS.,1981, “Glycosphingolipids in cellular interaction,differentiation,andoncogenesis” · Annu Rev Biochem. vol. 50:733 - 764) 神經(jīng)節(jié)苷脂和唾液酸的化學(xué)性質(zhì)，代謝及生物功能也已被深入考慮(Schauer, R. , 1982, “Chemistry, metabolism, andbiological functions of sialic acids，，，Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 40, 131 -23;Ledeen R. ff. et al.,1998, “Sphinglolipids as signaling modulators in thenervous system”, Annals of the New Cork Academy of Science, Vol 845)。已有石開(kāi)究表明在由磷脂酰膽堿(PC)和膽固醇組成的脂質(zhì)體摻入GMl神經(jīng)節(jié)苷脂可以顯著地延長(zhǎng)它們的平均血液循環(huán)時(shí)間(Bedu-Addo F. K. andL. Huang, 1996,^Effect of matrix lipid chainlength on liposomes containing cholesterol and GMlganglioside:Implicationsin drug delivery，，，Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 85,Issue 7,Pages714 - 719)。上述結(jié)果和闡述清楚地表明了目前需要開(kāi)發(fā)包含水溶性疏水物質(zhì)的制劑，其在包含有效劑量的比如紫杉醇、多烯紫杉醇和兩性霉素B的活性藥物的同時(shí)不會(huì)出現(xiàn)由上述藥物的不溶性所帶來(lái)的缺點(diǎn)。極低水溶性藥物制劑傳統(tǒng)上一直使用乳劑和其他膠體締合物，例如膠束，來(lái)制備；這種結(jié)構(gòu)可溶解藥物，并且還可以增加它們?cè)谒橘|(zhì)中的濃度(美國(guó)專利No. 6，296，870)。然而，這些乳劑，特別是膠束懸浮液不一定穩(wěn)定，而且不一定能到達(dá)特異靶位點(diǎn)。已知載有活性藥物的乳劑和膠束比脂質(zhì)體更加不穩(wěn)定。一般認(rèn)為，只有當(dāng)膠束與組成膠束的表面活性單體處于平衡狀態(tài)時(shí)，膠束才是穩(wěn)定的。因此，在缺乏單體的情況下，膠束會(huì)解體成為水溶性單體，并最終完全稀釋。同理，在缺乏單體時(shí)，微乳劑的液滴合并成大滴，并最終消逝。
因此，當(dāng)膠束制劑由于比如靜脈給藥之類的原因而稀釋時(shí)，膠束會(huì)溶解并分散于介質(zhì)中，其內(nèi)容物會(huì)在幾秒鐘內(nèi)泄漏到血流中。與之相似的是，乳劑制品表現(xiàn)了同樣的不穩(wěn)定特性。其他快速清除膠束包裹藥物的機(jī)理是通過(guò)與脂蛋白之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。


圖I :將包含IOOmg單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GMl (—*^)、GM2 ("■-)和GM3 (~^)的樣品稀釋于Iml的蒸餾水(pH 5)中或者Iml 20mM醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中，輕輕攪拌，直到全部溶解。將溶液于4或8° C放置至少24小時(shí)。然后將清夜于50，000Xg離心15分鐘，并將上清夜通過(guò)0. 22微米孔過(guò)濾。從每個(gè)100mg/ml的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂溶液中取0. 5ml試樣，并將其與50微升Ptx含量遞增的DMSO混合，以達(dá)到如下的Ptx-神經(jīng)節(jié)苷脂關(guān)系:1/25、1/20、1/15和1/10。將溶液置于4° C溫育I小時(shí)，而后在15，000 X g離心15分鐘以清除沒(méi)有被膠束包封的不溶性Ptx。最后，樣品置于蒸餾水或者20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中透析24小時(shí)以徹底清除DMS0。通過(guò)HPLC進(jìn)行Ptx定量。圖2 :將包含IOOmg GMl單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的樣品稀釋于Iml的蒸餾水(pH 5)或者Iml 20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中，輕輕攪拌，直到全部溶解。將溶液于4或
8。C靜置至少24小時(shí)。然后將清夜于50，OOOXg離心15分鐘，并將上清夜通過(guò)0.22微米孔過(guò)濾。從100mg/ml的溶液中取0. 5ml試樣，并將其與50微升Ptx含量遞增的DMSO混合，以達(dá)到如下的Ptx-GMl關(guān)系1/100、1/50、1/25和1/11。將溶液置于4° C溫育I小時(shí)后在15，OOOXg離心15分鐘以清除沒(méi)有被GMl膠束包封的不溶性Ptx物質(zhì)。最后，樣品置于蒸餾水或者20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中透析24小時(shí)以徹底清除DMS0。從每個(gè)樣品中取400ul試樣,注射到AKTA Explorer分子過(guò)濾系統(tǒng)中，該系統(tǒng)采用Superdex G200層析柱及包含50mM NaCl的流動(dòng)相磷酸緩沖液(pH 7)。分子量確定如下GMl (+) 365KDa (膠束)和 I. 6KDa (單體)PTX/GM1 1/100 (+)— 350KDaPTX/GM1 :1/50 (+)— 315KDa
PTX/GM1 :1/25 (+)— 280KDaPTX/GM1 :1/11 (各)—255KDa圖3 :將包含IOOmg GMl和LIGA的樣品稀釋于Iml的蒸餾水(pH 5)或者Iml 20mM pH為5的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中，輕輕攪拌，直到全部溶解。將溶液放置于4或8° C至少24小時(shí)。然后將清夜于50，000 Xg離心15分鐘，并將上清夜通過(guò)O. 22微米孔過(guò)濾。從每個(gè)100mg/ml的溶液中取O. 5ml試樣，并將其與50微升Ptx含量遞增的DMSO混合，以得到如下的Ptx-GMl或Ptx-LIGA關(guān)系:1/25、1/20、1/15和1/10。將溶液置于4° C溫育I小時(shí)后在15，000 Xg離心15分鐘以清除沒(méi)有被GMl膠束包封的不溶性Ptx物質(zhì)。最后將樣品置于蒸餾水或者20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中透析24小時(shí)以徹底清除DMSO。通過(guò)HPLC測(cè)定與膠束結(jié)合的PTX。圖4 JfGMl溶液與濃度遞增的Ptx混合，以得到如下Ptx摩爾關(guān)系1/100、1/50、1/25、1/20、1/15、1/10和1/5。通過(guò)HPLC測(cè)定摻入GMl膠束的Ptx的量?！D5 :將Ptx按照如下比例載入到神經(jīng)節(jié)苷脂膠束中1/10、1/15、1/20和1/25。載入過(guò)程用時(shí)30分鐘，其中A-(S)載入溫度為O。C ；B-(Q) GMl經(jīng)過(guò)55。C預(yù)熱，Ptx載入溫度為O。C ;C-(S)GM1經(jīng)過(guò)55。C預(yù)熱，Ptx載入溫度為25。C ;D-(H)中GMl的預(yù)熱和載入都在55° C進(jìn)行。通過(guò)HPLC測(cè)定以可溶形式摻入GMl膠束中的Ptx的量。圖6 :將非腫瘤來(lái)源的VERO和MA細(xì)胞與濃度遞增的如下物質(zhì)混合a)_(^*~)Ptx的 DMSO 溶液、b)_ (一)Ptx-GMl 比例為 1/25 的膠束、c) -GMl 膠束以及 d) - (+)白蛋白-Ptx-GMl復(fù)合物的膠束?；旌蠝赜?4小時(shí)后，用MTT化驗(yàn)標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞活性。圖7 :將腫瘤來(lái)源的HEP-2和HELA細(xì)胞與濃度遞增的如下物質(zhì)混合a)_
Ptx 的 DMSO溶液、b)-(^^)Ptx-GMl 比例為 1/25 的膠束、c) -GMl 膠束和 d) -GMl-Ptx-白蛋白復(fù)合物的膠束?；旌蠝赜?4小時(shí)后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。圖8 :將GMl 和比例為1/25的Ptx-GMl復(fù)合物樣品與濃度遞增的Dox混合，以得到摩爾關(guān)系為1/10、1/5、1/2. 5和1/1的Dox-GMl復(fù)合物。通過(guò)分光光度法在492nm測(cè)定摻入膠束中的Dox的量。圖9 :將包含5mg/ml GMl的GMl膠束與數(shù)量遞增的純化人血清白蛋白混合，以達(dá)到如下濃度0· 83、I. 67、5、15和30mg/ml (終濃度)；它們代表的GMl-Alb關(guān)系(w/w)分別為6/1 (- ~)、3/1 (~*~)、1/1 (~ ~)、1/3 (^1^)和 1/6 (~>*···)。于 37。C 溫育 3 小時(shí)。圖 A 對(duì)應(yīng)完整的色譜運(yùn)行過(guò)程，而圖B代表了 A中所標(biāo)出的插入框，并對(duì)應(yīng)于分子量較高的色譜峰。圖10 :將包含5mg/ml GMl且Ptx-GMl摩爾關(guān)系為1/25的Ptx-GMl膠束與數(shù)量遞增的純化人血清白蛋白混合，以達(dá)到如下濃度0. 83,1. 67、5、15和30mg/ml (終濃度);它們所代表的 GMl-Alb 關(guān)系(w/w)分別為 6/1 (~*~)、3/1 ( )、1/1 (■▼■)、1/3 (~*^)和 1/6 (-*-)°于37° C溫育3小時(shí)。圖A對(duì)應(yīng)于整個(gè)色譜運(yùn)行過(guò)程，而圖B代表了圖A中所標(biāo)出的插入框，并且對(duì)應(yīng)于分子量較高的色譜峰。圖11 :將Ptx-GMl摩爾關(guān)系為1/25的Ptx-GMl膠束與數(shù)量固定的純化人血清白蛋白混合，以達(dá)到1/1的GMl-Alb比例(w/w)。于4° C溫育I小時(shí)(■—)、4小時(shí)(+)和24小時(shí)(+)四A對(duì)應(yīng)了整個(gè)色譜運(yùn)行過(guò)程，而圖B代表了圖A中所標(biāo)出的插入框，并且對(duì)應(yīng)于分子量較高的色譜峰。圖12 :將Ptx-GMl摩爾關(guān)系為1/25的Ptx-GMl膠束與數(shù)量固定的純化人血清白蛋白混合，以達(dá)到1/1的GMl-Alb比例(w/w)。于37° C溫育I小時(shí)(+)、4小時(shí)(+)和24小時(shí)(+)。圖A對(duì)應(yīng)了整個(gè)色譜運(yùn)行過(guò)程，而圖B代表了圖A中標(biāo)出的插入框，并且對(duì)應(yīng)于分子量較高的色譜峰。圖13 :將Ptx-GMl摩爾關(guān)系為1/25的Ptx-GMl膠束與數(shù)量固定的純化人血清白蛋白混合，以達(dá)到1/1的GMl-Alb比例(w/w)。于55。C溫育I小時(shí)(+)和4小時(shí)(+)四中還包括了在55° C(+)溫育4小時(shí)的白蛋白樣品，作為在該溫度下蛋白穩(wěn)定性的對(duì)照。圖14 :將 GMl 溶液與 AmB 混合以得到 GMl/AmB 為 1/5 (+)、1/1 (+)、5/1 (+)和25/1 (I)的最終摩爾關(guān)系。繪制每個(gè)樣品從300至500nm的吸光光譜。圖中附有溶于乙醇的AmB樣品(.)，做為AmB單體狀態(tài)的對(duì)照。比例為1/5和1/1的樣品以聚集物形式存在，其最大吸光波長(zhǎng)為345nm ;而比例為5/1和25/1的樣品則以單體形式存在，其最大吸光波長(zhǎng)為 365,385 和 410nm。 圖15 :用濃度固定為16 μ g/ml的AmB制備摩爾關(guān)系為5/1 (+)、2. 5/1 (一)、1/1 (-+-)和1/2. 5 (+)的AmB-GMl膠束。制備GMl (+)對(duì)照膠束和AmB (+)對(duì)照膠束，以便研究它們單獨(dú)存在時(shí)各自的效果；并且制備一個(gè)正對(duì)照(+)和一個(gè)負(fù)對(duì)照(+)，以觀察微生物生長(zhǎng)情況。將不同的GMl-AmB制品和它們各自的對(duì)照與濃度為IxlO5細(xì)胞/ml的白色念珠菌(Candida albicans)溶液于96孔板中混合，并在37° C溫育24小時(shí)。對(duì)板中的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，直至AmB最終濃度達(dá)到O. 0625 μ g/ml0溫育后，用分光光度法在波長(zhǎng)610nm測(cè)量溶液的渾濁度，渾濁度表明了微生物的生長(zhǎng)狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及水溶性藥物組合物，其包含至少一種治療活性物質(zhì)和選自唾液酸鞘糖月旨、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一種化合物，并且其中至少一種治療活性成分為疏水性藥物。優(yōu)選地，所述疏水性藥物選自抗腫瘤藥物和抗真菌藥物。特別地，本發(fā)明的組合物應(yīng)該適合用于病人靜脈注射給藥。更具體地，本發(fā)明的組合物為無(wú)菌半透明的注射劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物包括至少一種鞘糖脂，其優(yōu)選選自神經(jīng)節(jié)苷脂。在具體實(shí)施方式
中，所述神經(jīng)節(jié)苷脂選自單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂或它們的混合物。更具體地，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂選自GMl、GM2或其混合物，二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂選自⑶la、⑶Ib或其混合物，而三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂則為GT1。本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂混合物，或二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂混合物，或者單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物。
具體實(shí)施例方式為了充分利用膠束結(jié)構(gòu)作為負(fù)載和傳遞系統(tǒng)，將藥物釋放到血流中，有必要根據(jù)以下幾個(gè)關(guān)鍵方面改善“背景技術(shù)”中所提到的膠束的表現(xiàn)I.避免由稀釋現(xiàn)象而引起的膠束解體相關(guān)問(wèn)題，2.獲得其表面，或物理化學(xué)和/或電學(xué)性質(zhì)模擬紅血球的結(jié)構(gòu)，以避免它們之間的相互作用，和3.使膠束被多聚物或蛋白包被，所述多聚物或蛋白可以i)穩(wěn)定膠束-藥物復(fù)合物和/或ii)充當(dāng)將膠束傳遞到祀位點(diǎn)的試劑，4.為了避免RES造成的藥物快速釋放到血流中而獲得盡量小的結(jié)構(gòu)，
5.另一方面，其分子量應(yīng)大于40kDa，以避免被腎系統(tǒng)迅速清除。本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種新型技術(shù)，極大地改善了以上“背景技術(shù)”中所提到的問(wèn)題，特別地，本發(fā)明人研發(fā)了基于穩(wěn)定納米膠束的新型制劑，其可載入高濃度疏水藥物。由此，本發(fā)明在利用諸如神經(jīng)節(jié)苷脂之類的兩性分子的基礎(chǔ)上，提出了新型膠束的用途。與其他所有聚合物膠束相反，這些分子的特征在于其顯示了極低的臨界膠束濃度(cmc)。神經(jīng)節(jié)苷脂尤其是GMl和GM2單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的cmc為約10_8M，這極大地增強(qiáng)了膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。特別地，提出了在高于cmc的濃度下使用神經(jīng)節(jié)苷脂。這樣可以獲得高唾液酸含量的結(jié)構(gòu)，從而獲得與紅血細(xì)胞相似的電負(fù)性。前面已經(jīng)提到過(guò)在神經(jīng)節(jié)苷脂分子中和在諸如血型糖蛋白的糖蛋白中存在唾液酸對(duì)于細(xì)胞膜表面特性的重要性。此外，唾液酸還對(duì)GR的壽命以及循環(huán)中的血小板和淋巴細(xì)胞起到作用。酶解清除唾液酸會(huì)暴露半乳糖末端，導(dǎo)致循環(huán)中的GR被迅速清除并被肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer cell)俘獲。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明人闡述了帶有紫杉醇的神經(jīng)節(jié)苷脂膠束的分子量(MW)在150至350kDa的范圍。本發(fā)明人已闡明神經(jīng)節(jié)苷脂膠束具有高度穩(wěn)定型，特別是那些通過(guò)透析法由GMl形成的膠束。結(jié)果顯示總膠束中大約有25%在透析72小時(shí)后消失,這些結(jié)果與Formi sano等發(fā)表的結(jié)果(“Critical micelle concentrations of gangliosides，，； 1979，Biochemistry18:1119-1124)相符合。然而，當(dāng)膠束中載入了例如Ptx或Dtx的疏水性藥物而形成GMl-Ptx或GMl-Dtx復(fù)合物的時(shí)候，通過(guò)透析損失的GMl和藥物量則分別低于5%和10% ;這說(shuō)明疏水分子自身可以調(diào)節(jié)膠束解體機(jī)制，從而有利于膠束形式的穩(wěn)定。同理，神經(jīng)節(jié)苷脂膠束，特別是GMl組成的膠束可以載入其他腫瘤藥物，比如Doxo,從而形成GMl-Doxo復(fù)合物。在具體實(shí)施方式
中，由神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是GMl神經(jīng)節(jié)苷脂組成的膠束系統(tǒng)可以在同一膠束表面同時(shí)摻入兩種腫瘤藥物最疏水的藥物比如Ptx或Dtx進(jìn)入膠束核心，而最親水的藥物比如Doxo進(jìn)入另一膠束區(qū)域；這樣即可獲得穩(wěn)定的水溶性GMl-Ptx-Doxo三元復(fù)合物。在本發(fā)明提出的條件下，GMl納米膠束以及GMl-Ptx或GMl-Ptx-Doxo膠束可以自發(fā)地通過(guò)疏水樣相互作用以非共價(jià)方式與白蛋白分子相互作用，從而組成新型的高度穩(wěn)定的復(fù)合物或結(jié)構(gòu)。通過(guò)白蛋白與受體(SPARK)的結(jié)合，所述復(fù)合物可以引發(fā)穿越內(nèi)皮細(xì)胞而向間質(zhì)性介質(zhì)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)；如白蛋白-Ptx復(fù)合物(稱為ABI007)所顯示的，這里即為腫瘤組織所在區(qū)域。另一方面，在具體實(shí)施方式
中，可以預(yù)先將GMl-Ptx復(fù)合物注射到裝有人白蛋白，人全血清或人全血漿的輸液袋中，從而將其遞送到人體中；在此，GMl-Ptx復(fù)合物與白蛋白特異結(jié)合，使GMl-Ptx-Alb或GMl-Ptx-Doxo-Alb的三元或四元復(fù)合物具有生物活性。本發(fā)明中組合物的優(yōu)點(diǎn)之一在于由于其cmc低(約10_8M)，這些神經(jīng)節(jié)苷脂膠束的高穩(wěn)定性提高了疏水生物活性物質(zhì)在水介質(zhì)中保持可溶性的能力；因此，提高了在此結(jié)構(gòu)中的生物活性物質(zhì)循環(huán)時(shí)間。另一方面，由于該組合物極大減少了不良副作用，從而使其治療活性得到顯著改善。因此，本發(fā)明的目的之一是介紹一種包含由唾液酸鞘糖脂-膠束構(gòu)成的載體的制齊U，即經(jīng)過(guò)調(diào)整高于其cmc的唾液酸鞘糖脂或鞘糖脂的混合物，尤其是神經(jīng)節(jié)苷脂膠束，更具體地，是單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，優(yōu)選GM1、GM2膠束或它們的混合物，其允許非共價(jià)地?fù)饺胧杷幬?。特別地，本發(fā)明包括以神經(jīng)節(jié)苷脂-納米膠束作為載體的制劑，其中所述神經(jīng)節(jié)苷脂為GMl，其允許以非共價(jià)方式摻入疏水藥物，例如Ptx、Dtx或兩性霉素B，從而產(chǎn)生高度水溶性的復(fù)合物，該復(fù)合物可以通過(guò)與諸如白蛋白之類的血漿蛋白之間的疏水相互作用而被其以非共價(jià)的方式選擇性地包被。 因此，本發(fā)明的目的之一是產(chǎn)生水溶性藥物組合物，其包含至少一種治療活性物質(zhì)和選自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一種或多種化合物，并且其中至少一種治療活性物質(zhì)為疏水性藥物。在具體實(shí)施方式
中，所述治療活性物質(zhì)選自抗腫瘤藥物和抗真菌藥物；在其他實(shí)施方式中，則選自抗生素和類固醇激素。在本發(fā)明中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療活性物質(zhì)”、“藥物”、“主要活性成分”、“活性藥物”和“生物活性物質(zhì)”應(yīng)該理解為等同含義。依照優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的藥物組合物可適用于靜脈注射給藥。更優(yōu)選地，所述藥物組合物為穩(wěn)定而半透明的靜脈注射用組合物。特別地，本發(fā)明的水溶性藥物組合物可以被凍干，或者以凍干的形式存在。在這種情況下，可以用諸如蒸餾水，鹽溶液(NaClO. 9%)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，5%的葡萄糖蒸餾水溶液和5%的葡萄糖鹽溶液的溶劑將所述組合物重溶。本發(fā)明的又一具體目的在于生產(chǎn)水溶性無(wú)菌凍干藥物組合物，所述組合物可以重懸，從而使抗腫瘤藥物，比如Dtx或Ptx的最終濃度達(dá)到O. I至10mg/ml的范圍,優(yōu)選O. I至6mg/ml,更優(yōu)選I至6mg/ml。優(yōu)選地，本發(fā)明中的水溶性藥物組合物應(yīng)包含至少一種治療活性物質(zhì)和一種或多種鞘糖脂；后者優(yōu)選選自神經(jīng)節(jié)苷脂。更優(yōu)選地，在神經(jīng)節(jié)苷脂中，優(yōu)選單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷月旨、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂或它們的混合物。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂選自GM1、GM2或它們的混合物；所述二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂選自⑶la、⑶Ib或它們的混合物，而所述三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂則為GTl。同理，優(yōu)選的神經(jīng)節(jié)苷脂混合物選自于單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物，二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物以及單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物。優(yōu)選在本發(fā)明的水溶性藥物組合物中，疏水性藥物以非共價(jià)方式與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，且神經(jīng)節(jié)苷脂形成納米膠束。更優(yōu)選地，納米膠束的pH在pH 3至pH 7的范圍。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，納米膠束的pH在pH 4至pH 6的范圍。特別地，本發(fā)明的水溶性藥物組合物，其納米膠束平均小于200nm，更具體地，小于IOOnm,優(yōu)選介于IOnm和80nm之間，更優(yōu)選介于IOnm和50nm之間。
神經(jīng)節(jié)苷脂為兩性分子，具有由鞘氨醇和脂肪酸(比如硬脂酸)組成的親脂部分，和由碳水化合物組成的親水部分，其至少包括I到4個(gè)單糖和I到3個(gè)唾液酸分子，從而產(chǎn)生已知的各種神經(jīng)節(jié)苷脂。已知這些復(fù)雜的糖脂為水溶性酸并且透析性能極差。由于神經(jīng)節(jié)苷脂主要與神經(jīng)組織膜相關(guān)聯(lián)，所以人們提出其可在跨膜信息傳輸中起至丨J 作用(Ledeen R. ff. y col.,1998, “Sphinglolipids as signaling modulators inthe nervous system” · Annals of the New Cork Academy of Science Vol 845)。特別是GMl單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂與鼠小腦中的神經(jīng)元分化過(guò)程相關(guān)(Willinger M. andSchachner Μ. , 1980, “GM1 ganglioside as a marker for neuronal differentiationin mouse cerebellum”，Dev Biol. 74(1) :101 - 117)并且與霍亂毒素受:體相關(guān)(Wu, G.and Leeden, 1988, “The ganglioside-GMl is the specific receptor for the choleratoxin” , Anal R. . Biochem. , vol. 173, p. 368-375)。本發(fā)明所使用的神經(jīng)節(jié)苷脂可從包含這些脂質(zhì)的動(dòng)物中獲得。具體地，可以獲取自動(dòng)物的神經(jīng)組織，例如選自哺乳和非哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，例如貓、牛、豬、馬和魚。
本發(fā)明中的神經(jīng)節(jié)苷脂膠束具有多方面用途，不僅可以溶解并結(jié)合高水溶性分子或大分子，還可以溶解并結(jié)合不溶性分子。膠束為膠質(zhì)的結(jié)合體，其包含強(qiáng)各向異性的區(qū)域和由外到內(nèi)遞減的水溶性梯度。這是使得膠束可以廣泛地溶解其他溶質(zhì)的性質(zhì)之一。膠束可以溶解不可溶的有機(jī)物質(zhì)，這是由于其可將所述物質(zhì)摻入到它的高疏水區(qū)域。位于烴鏈最外端部分的3或4個(gè)碳原子均為反式，因此該部分的流動(dòng)性較差。因此，此區(qū)域的疏水性弱，而由此可以部分水合。這樣就在純疏水區(qū)和純親水區(qū)之間呈現(xiàn)了一個(gè)過(guò)渡區(qū)域。進(jìn)入該區(qū)域的分子必定與脂鏈的疏水部分和極性頭的溶劑化區(qū)域都稍稍相容，因此必然表現(xiàn)為兩性分子。當(dāng)主要活性成分具有疏水性時(shí)，它們傾向于通過(guò)和脂肪酸的疏水鏈相互作用而直接定位于膠束深部。至于膠束極性頭部，其組成成分范圍廣泛；這意味著每種膠束可能具有一系列不同的表面性質(zhì)，這可以用來(lái)結(jié)合一系列活性物質(zhì)。在這種離子膠束中，極性頭部可以結(jié)合大量的反離子；而由此與電解質(zhì)濃縮液相似。此外，見(jiàn)于經(jīng)載入膠束中的彌散性離子雙層還延伸到所謂的腹層(stern layer)。膠束可以溶解活性物質(zhì)并且構(gòu)成了俘獲和摻入不溶或部分不溶分子的優(yōu)良系統(tǒng)。人們提出這種分子分配可能限于相對(duì)較小的分子，小分子可以適應(yīng)脂肪酸鏈的高度各向異性結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)樗鼈冋紦?jù)了中間區(qū)域或是它們可被容納在脂肪酸鏈中。由此膠束可以充當(dāng)用于將完全或部分不溶于水的藥物直接運(yùn)輸進(jìn)入硬脂酸烴鏈的活性物質(zhì)。本發(fā)明闡述了包含生物活性藥物的脂質(zhì)膠束的多種組合物及其獲得方法和用途。本發(fā)明一方面闡述了一系列的膠束制劑，其可摻入生物活性藥物，還可摻入PH介于3和7之間的緩沖溶液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述水溶性藥物組合物包含5份和15份單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，配以I份二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(En una realizacion particular, lacomposicion farmaceutica soluble en agua de la invencion comprende alrededorde I parte de disialogangliosidos por cada alrededor de entre 5y 15 partesde monosialogangliosidos)。在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含5份和15份單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，配以I份三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(En otra, comprende alrededor deIparte de trisialogangliosidos por cada alrededor de entre 5y 15 partes demonosialogangliosidos)。在另外的實(shí)施方式中，所述組合物包含I份三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和10份二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的水溶性藥物組合物包含一種或多種鞘糖脂，其選自包含糖苷域共價(jià)偶聯(lián)葉酸的神經(jīng)節(jié)苷脂，或包含唾液酸共價(jià)偶聯(lián)葉酸的神經(jīng)節(jié)苷脂。具體地，包含共價(jià)偶聯(lián)葉酸的神經(jīng)節(jié)苷脂占組合物中總神經(jīng)節(jié)苷脂的O. 5%和15%。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，水溶性藥物組合物包含Ptx或多烯紫杉醇(Dtx)。優(yōu)選其中的Ptx或Dtx藥物與神經(jīng)節(jié)苷脂之間的摩爾比例介于1:10和1:100之間。更優(yōu)選，Ptx或Dtx介于0. lmg/ml到6mg/ml之間，而神經(jīng)節(jié)苷脂介于4mg/ml至300mg/ml之間。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的水溶性藥物組合物包含Doxo，且Doxo與神經(jīng)節(jié)苷脂之間的摩爾比例為1:1和1:50。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的水溶性藥物組合物包含Doxo及選自Ptx和Dtx的至少一種藥物，每種藥物與神經(jīng)節(jié)苷脂之間的摩爾比例為1:10 和 1:100。·
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述水溶性藥物組合物包含兩性霉素B，優(yōu)選兩性霉素B與神經(jīng)節(jié)苷脂之間的摩爾比例介于2:1至1:5之間，更優(yōu)選兩性霉素B與神經(jīng)節(jié)苷脂之間的摩爾比例為01: I。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物包括的兩性霉素B介于O. lmg/ml至10mg/ml之間而神經(jīng)節(jié)苷脂則介于O. 18mg/ml至10mg/ml之間。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述水溶性藥物組合物包含神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束，其以非共價(jià)方式由人血清白蛋白、重組人血清白蛋白或牛白蛋白包被，更優(yōu)選，由包含脂肪酸的人血清白蛋白包被。更具體地，由含或不含脂肪酸的人血清白蛋白進(jìn)行包被，其中GMl-白蛋白比例為2:l(ff/ff)0在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明包括水溶性藥物組合物，其中神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束由包含共價(jià)偶聯(lián)葉酸的白蛋白包被，更具體地，與葉酸共價(jià)偶聯(lián)的白蛋白的量占總白蛋白的I到20%之間。例如，當(dāng)向患者給藥時(shí)，可將本發(fā)明的水溶性藥物組合物注射到包含人白蛋白的塑膠袋中(類似輸液用塑膠袋)，以容許GMl-Ptx、GMl-Dtx、GMl-Ptx-Doxo、GMl-AmB納米膠束與白蛋白結(jié)合。值得注意的是，相對(duì)于根據(jù)例如美國(guó)專利No. 5，171，578和No. 5，077, 056中所描述的利用脂質(zhì)體脂雙層間的跨膜電位向脂質(zhì)體載入生物活性劑的一般方法，本發(fā)明中所描述的膠束載入過(guò)程顯示了重要的差別。本發(fā)明的制劑可以通過(guò)被動(dòng)載入的方法制備。例如，可以使用例如在低溫或高溫下溫育，以在此期間自發(fā)進(jìn)行摻入的簡(jiǎn)單方法，將濃度的生物活性藥物包封到神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束中。另一方面，人血清白蛋白自發(fā)地以疏水樣相互作用的方式非共價(jià)地包被GMl膠束表面；這種包被最終產(chǎn)生由GMl-藥物-白蛋白構(gòu)成的三元復(fù)合物，或者當(dāng)白蛋白包含共價(jià)方式摻入的葉酸時(shí)，產(chǎn)生四元復(fù)合物GM1-藥物-白蛋白-葉酸。所述過(guò)程可概述如下通過(guò)緩慢振蕩，使GMl單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂稀釋于蒸餾水中，隨后，于4和8° C靜置至少24小時(shí)。此溫育時(shí)間允許神經(jīng)節(jié)苷脂膠束形成尺寸小于200nm的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。然后，將神經(jīng)節(jié)苷脂膠束與包含完全可溶的疏水性腫瘤藥物的溶劑(如乙醇或二甲基亞砜)混合，其中所述神經(jīng)節(jié)苷脂膠束與所述溶劑的體積比為l/10(vol/vol)。將樣品于4和8° C溫育至少4小時(shí)。然后，通過(guò)透析將有機(jī)溶劑從神經(jīng)節(jié)苷脂膠束中除去。使用在PH合適的靜脈注射用藥物級(jí)溶液進(jìn)行所述透析。將摻入藥物、基本不含有機(jī)溶劑且pH值適宜的膠體制劑在15，000和30，OOOXg離心15分鐘以清除沒(méi)有摻入膠體的不溶性的不良疏水化合物。隨后，將包含捕獲或包封的抗腫瘤藥物或抗真菌藥物的納米膠束透明含水制劑與純化人白蛋白，包含共價(jià)偶聯(lián)葉酸的純化人白蛋白，人全血漿或人全血清溫育，以便確保白蛋白/GMl膠束的相互作用。此溫育在37° C進(jìn)行8小時(shí)，或于55° C進(jìn)行30分鐘。最后將由GMl和Ptx或GMl-Ptx-白蛋白復(fù)合物組成的制劑凍干。因此，本發(fā)明還涉及用于獲得膠束的方法，所述膠束包含至少一種疏水性生物活性藥物的膠束的程序，所述方法包括如下步驟(a)將神經(jīng)節(jié)苷脂溶解于蒸餾水或pH介于3與7之間的鹽溶液中，保持其濃度一 直高于cmc，并將溶液于4° C靜置至少24小時(shí)；(b)向按前一步驟所得到的神經(jīng)節(jié)苷脂膠束溶液中加入大約10%的包含所選生物活性藥物的二甲基亞砜或乙醇溶液；(C)將所述混合物在介于4和8° C之間的低溫或45和60° C之間的高溫下溫育足夠的時(shí)間，優(yōu)選I到4小時(shí)，以保證生物活性藥物正確摻入到膠束中；隨后，(d)在介于4和8° C之間的溫度下，將包含生物活性成分的膠束溶液在蒸餾水溶液或PH介于3與7之間的藥學(xué)可接受的溶液中透析24小時(shí)，以徹底清除有機(jī)溶劑；(e)將GMl-藥物組成的膠束與人血清白蛋白混合，在介于45和60° C之間的溫度下溫育I小時(shí)，或在37° C溫育8小時(shí)，以便形成GMl-藥物-白蛋白三元復(fù)合物；(f)將前一步驟中所得的摻入疏水性生物活性藥物的GMl膠束透明含水溶液通過(guò)
O.I或O. 2微米的過(guò)濾消毒；(g)將無(wú)菌膠束凍干；和(h)最后，將凍干的膠束重懸于藥學(xué)可接受的溶液中，用于治療疾病的靜脈注射給藥?？梢杂霉庾V技術(shù)或適當(dāng)?shù)纳V技術(shù)，如高壓液相色譜(HPLC)，測(cè)定摻入到神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束中的不同生物活性藥物(Ptx、Dtx、Doxo、AmB等)的量?？梢杂煤线m的溶劑進(jìn)行神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束的載入。特別地，可以使用預(yù)先溶解于諸如乙醇或二甲基亞砜之類的有機(jī)溶劑中的抗腫瘤藥物，如Dtx或Ptx來(lái)進(jìn)行膠束的載入。在具體實(shí)施方式
中，用于將多烯紫杉醇和紫杉醇摻入到神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束中的乙醇或二甲基亞砜的量占總體積的I到15%。同理，也可在4到6° C之間的溫度進(jìn)行載入?？赏ㄟ^(guò)適用于此目的的方法清除用于納米膠束載入的溶劑和/或游離的治療活性物質(zhì)。例如，可以通過(guò)透析或用Sephadex G25分子過(guò)濾法清除。如前所述，可使用上述被動(dòng)摻入法將一種或多種藥物載入到這些穩(wěn)定的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束中。概括來(lái)說(shuō)，利用本發(fā)明的納米膠束組合物可以獲得大多數(shù)疏水性藥物的透明含水溶液，這些藥物傾向于分配于并穩(wěn)定存在于神經(jīng)節(jié)苷脂膠束中由神經(jīng)酰胺組成的疏水部分。類似于Ptx、Dtx、Dox、AmB和黃體酮的且可以摻入到本發(fā)明的組合物中的其他藥物則由油/水分配系數(shù)定義，作為標(biāo)準(zhǔn)油/水混合物(如辛醇/水)中的量度，所述油/水分配系數(shù)應(yīng)大于1，優(yōu)選大于5。此類中的代表藥物包括前列腺素，二硝酸異山梨酯，睪酮，硝化甘油，雌二醇，維生素E，可的松，地塞米松及其酯，和戊酸倍他米松。依其結(jié)構(gòu)與形式的不同，神經(jīng)節(jié)苷脂膠束在摻入藥物時(shí)顯示了不同的性能。從這個(gè)意義上來(lái)講，本發(fā)明人所得到的結(jié)果清楚地表明了當(dāng)寡糖親水鏈的長(zhǎng)度由GMl降低到GM2并進(jìn)一步降到GM3時(shí)，這些脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。這意味著GMl和GM2保持了膠束結(jié)構(gòu)，而GM3不再具有膠束結(jié)構(gòu)，而是具有囊泡結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致藥物摻入減少；其中GMl摻入能力最強(qiáng)，GM2較低，而GM3則大大降低，這要?dú)w咎 于它所形成的結(jié)構(gòu)效力最低(參見(jiàn)圖I)。電子顯微鏡研究表明本發(fā)明中的GMl膠束不是球形而是橢圓體。此結(jié)果揭示疏水藥物/膠束混合物使膠束尺寸發(fā)生了改變。與預(yù)期相反，這種改變說(shuō)明在GMl膠束中摻入紫杉醇形成GMl-Ptx復(fù)合物會(huì)使其分子量減小(參看圖2)。不參考任何特定的解釋，該結(jié)果至少可用兩種假設(shè)解釋藥物致使膠束中的GMl單體數(shù)量減少，或者藥物致使膠束形式改變，使其由橢圓體變成球狀從而形成較小的流體力學(xué)半徑，最后產(chǎn)生較低的分子量。另一方面，眾所周知，聚集數(shù)(aggregation number)是影響膠束幾何結(jié)構(gòu)的因素，而聚集數(shù)則由單體結(jié)構(gòu)而定。特別是在本研究中，當(dāng)形成GMl膠束的GMl單體中硬脂酸被氟乙?；〈鷷r(shí)，產(chǎn)生了命名為L(zhǎng)IGA的新型化合物。這種新型GMl膠束的聚集數(shù)由300變到100-120個(gè)GMl單位(LIGA)。這使得膠束尺寸減小，并顯著降低了藥物摻入(參看圖3)。實(shí)施例實(shí)施例I在GMl神經(jīng)節(jié)苷脂中載入紫杉醇將包含30、100、300和600mg GMl神經(jīng)節(jié)苷脂的樣品溶解于2ml蒸餾水(pH 5)中或溶解于2ml 20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中，振蕩以使其完全溶解。將溶液于4或8° C靜置至少24小時(shí)。然后將透明溶液于50，OOOXg離心15分鐘，上清液通過(guò)O. 22微米孔過(guò)濾。從每一濃度的溶液(分別為15mg/ml、50mg/ml、150mg/ml 和 300mg/ml)中取 O. 5ml試樣，并將其與50 μ I紫杉醇(Ptx)含量遞增的DMSO混合，以達(dá)到以下的PtX-GMl摩爾比例1/100、1/50、1/25、1/20、1/15、1/10和1/5。將溶液置于4° C溫育I小時(shí)，然后于15，OOOXg離心15分鐘以清除沒(méi)有包封于GMl膠束內(nèi)的不溶性紫杉醇物質(zhì)。最后，為了除去所有DMS0，將樣品置于蒸餾水或20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中透析24小時(shí)。用HPLC測(cè)定摻入GMl膠束的Ptx的量。圖4顯示，當(dāng)所述比例為1/100至1/25時(shí)，與GMl結(jié)合并保持可溶的Ptx所占的百分比幾乎是恒定的；在上述比例范圍，摻入的Ptx量占添加到介質(zhì)中Ptx總量的95%。當(dāng)所述比例由1/25增高到1/5時(shí)，觀察到與GMl結(jié)合的可溶性Ptx的量分別下降到90%、60%、30%，以至10%。實(shí)施例2溫度對(duì)在GMl膠束中載入Ptx的影響如實(shí)施例I中所示，將Ptx按照1/10、1/15、1/20、1/25的摩爾關(guān)系載入到神經(jīng)節(jié)苷脂膠束中，但每個(gè)載入過(guò)程分別在如下溫度下進(jìn)行30分鐘DA-O0 C (對(duì)照)；
2) B-GMl 預(yù)熱至 55° C 并于 0° C 載入 Ptx ;3) C-GMl 預(yù)熱至 55° C 并于 25° C 載入 Ptx ;4)D-GMl預(yù)熱與載入都在55° C進(jìn)行。溫育過(guò)后，將樣品于15，000 Xg離心15分鐘，并使用蒸餾水在4° C透析24小時(shí)。最后，用HPLC測(cè)量摻入GMl膠束的可溶形式Ptx的量。圖5顯示，當(dāng)所述比例為1/25時(shí)，Ptx載入時(shí)的溫度變化沒(méi)有明顯提高摻入率；在所有條件下，載入率均超過(guò)90%。然而，在更高的比例下，觀察到與0° C相比，在55° C進(jìn)行載入的Ptx載入率分別增加了 20%、50%和80%。實(shí)施例3Ptx-GMl與Ptx對(duì)腫瘤和非腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)影響的體外對(duì)比研究
將不同類型的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞(如HEP-2和Hela細(xì)胞)以及非腫瘤細(xì)胞(如VERO和MA細(xì)胞)，置于包含2%牛胎血清的MEM培養(yǎng)基(Natocor-Villa CarlosPaz-Cordoba-Argentina)中，于含5%C02的CO2培養(yǎng)箱中培育至匯合。在細(xì)胞培養(yǎng)中加入不同濃度的下述組合物a)-溶于DMSO的Ptx，作為正對(duì)照；b)-摩爾比例為1/25的Ptx-GMl膠束；c)-與b)中同樣濃度的GMl膠束，作為GMl自身作用的對(duì)照；和d)-白蛋白-Ptx-GMl復(fù)合物的膠束。培養(yǎng)24小時(shí)后，由MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。圖6和7表明單獨(dú)的GMl并不能對(duì)任何類型的細(xì)胞構(gòu)成影響，而溶于DMSO的Ptx和Ptx-GMl制劑則在濃度達(dá)到10ng/ml使腫瘤細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)全部死亡，在達(dá)到IOOng/ml時(shí)非腫瘤細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)全部死亡。當(dāng)制劑包含白蛋白-Ptx-GMl三元復(fù)合物時(shí)，需要在腫瘤細(xì)胞中達(dá)到20ng/ml的濃度，在非腫瘤細(xì)胞中達(dá)到200ng/ml的濃度才能得到同樣效
果O實(shí)施例4在GMl或Ptx-GMl膠束中摻入阿霉素通過(guò)攪拌，將10、30、150、300和600mg純化的GMl單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂溶解于2ml蒸餾水(pH 5)或20mM的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5)中，直至其完全溶解。將溶液在介于4和8° C之間的溫度下靜置至少24小時(shí)。將溶液于50，OOOXg離心15分鐘，上清液通過(guò)
O.22 μ m微孔過(guò)濾。使用該制劑進(jìn)行兩份阿霉素載入試驗(yàn)(a)阿霉素與 GMlJP(b)阿霉素與Ptx-GMl的復(fù)合物。對(duì)于a)從包含 15mg/ml, 75mg/ml, 150mg/ml 和 300mg/ml 的每種制劑中取 O. 5ml試樣，將其與50 μ I阿霉素溶液混合以使Dox-GMl復(fù)合物的摩爾比例達(dá)到1/15、1/10、1/5、1/2. 5和1/1。將溶液再次于4° C放置I小時(shí)后，在15，OOOXg離心15分鐘，以除去可能存在的不溶性聚集物。最后，將樣品于4° C透析24小時(shí)以除去可能存在的游離阿霉素。對(duì)于b)預(yù)先將Ptx載入到GMl膠束中使Ptx-GMl的摩爾比例為1/25，然后按a)中所描述的進(jìn)行試驗(yàn)。用分光光度法在490nm測(cè)定摻入到GMl膠束中的阿霉素的量。
圖8顯示，當(dāng)摩爾比例從1/15到1/10時(shí)，結(jié)合于GMl和Ptx-GMl的Doxo百分比幾乎保持恒定。當(dāng)所述比例從1/5升高到1/1時(shí)，觀察到GMl膠束的Doxo量分別減少了 5%、8%至55%，而Ptx-GMl膠束的Doxo量則減少了 15%、20%和62%。實(shí)施例5在GMl和Ptx-GMl膠束中摻入白蛋白制備如上述實(shí)施例中所描述的GMl和Ptx-GMl膠束，其包含5mg/ml GMl并且Ptx-GMl的摩爾關(guān)系為1/25。將這些膠束與增量的純化人血清白蛋白(Laboratorio deHemoderivados dependiente de la Universidad Nacional de Cordoba)混合以達(dá)到如下終濃度0.83、1.67、5、15和30mg/ml。將樣品置于37° C溫育3小時(shí)。如圖9和圖10所示，當(dāng)把GMl和Ptx-GMl膠束與白蛋白一起在37° C溫育時(shí)，觀察到由于結(jié)合作用而出現(xiàn)了由GM1、Alb和Ptx組成的分子量不同的三類群體。其中之 一的分子量約為600-700kDa，并且分子量隨白蛋白濃度而逐漸升高，另一類群的分子量為500-550kDa,而最后一個(gè)類群的分子量為180_190kDa。另一方面，Ptx-GMl摩爾關(guān)系為1/25且包含5mg/ml GMl的Ptx-GMl膠束與5mg/ml白蛋白同樣于4、37和55° C這三個(gè)溫度下溫育I至24小時(shí)。圖11、12和13分別對(duì)應(yīng)了與白蛋白在4、37和55° C下的溫育，如圖所示，在所檢測(cè)的三個(gè)溫度下，Ptx-GMl復(fù)合物與介質(zhì)中所添加的白蛋白相互作用。這種相互作用在較高溫度下更快地達(dá)到最大峰值。實(shí)施例6在GMl @父束中慘入兩性霉素B (AmB)復(fù)合物形成的光譜分析將O. 9ml包含不同濃度GMl的H2O與O. Iml AmB的DMSO溶液(40mg/ml)混合以使得GMl/AmB的最終摩爾比例為1/5、1/1、5/1和25/1。所述樣品于室溫下溫育10分鐘后，在4° C透析24小時(shí)。最后，將所得溶液在15，OOOXg離心15分鐘以清除可能存在的不溶性聚集物。為了確定摻入GMl膠束中的AmB量，從溶液取樣并稀釋于200倍乙醇中，測(cè)量在410nm下的吸光度并與經(jīng)同樣條件處理的AmB對(duì)照曲線進(jìn)行對(duì)比。此外，用300到500nm的光譜分析評(píng)估所存在的單體狀態(tài)或AmB聚集狀態(tài)。為此，在水中進(jìn)行稀釋，以便不改變聚集狀態(tài)(參看圖14)。在每個(gè)所測(cè)比例下，當(dāng)AmB濃度增加時(shí)，峰強(qiáng)度即發(fā)生變化。這可以解釋為AmB存在兩個(gè)主要光譜狀態(tài)單體形式在365、385和41Onm吸光度最大,而AmB聚集形式在345nm吸光度最大。實(shí)施例7載入兩件霉素B的膠束對(duì)白色念珠菌的牛長(zhǎng)抑制活件用濃度固定為16 μ g/ml的AmB制備摩爾比例為1:5、1:2. 5、I: I和2. 5:1的GMl-AmB膠束。另外制備GMl膠束和AmB對(duì)照。將體積100 μ I的不同GMl-AmB制劑及其各自的對(duì)照與900 μ I濃度為IxlO5細(xì)胞/ml的白色念珠菌溶液在96孔板中混合，并在37° C溫育24小時(shí)。在板內(nèi)進(jìn)行連續(xù)稀釋使AmB的終濃度達(dá)到O. 0625 μ g/ml。溫育后，用分光光度法在610nm檢測(cè)溶液的渾濁度，所述渾濁度代表了微生物的生長(zhǎng)。圖15表明比例為1:5的GMl-AmB復(fù)合物與AmB對(duì)照產(chǎn)生了同等水平的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。另一方面，在1:2. 5和I: I的比例所產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制僅略低于對(duì)照組。比例為2. 5/1的GMl-AmB復(fù)合物則對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生了極低的抑制 。
權(quán)利要求
1.水溶性藥物組合物，其特征在于，包含至少一種治療活性物質(zhì)和選自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一種物質(zhì)，其中所述治療活性物質(zhì)中的至少一種為疏水性藥物。
2.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述疏水性藥物選自抗腫瘤藥物和抗真菌藥物。
3.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其可通過(guò)注射給藥。
4.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其為可注射的無(wú)菌半透明物質(zhì)。
5.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述鞘糖脂選自神經(jīng)節(jié)苷脂。
6.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂選自單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂或它們的混合物。
7.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂選自GM1、GM2或它們的混合物。
8.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂選自⑶la、⑶Ib或它們的混合物。
9.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂為GTl。
10.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物。
11.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物。
12.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物。
13.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷月旨、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的混合物。
14.如權(quán)利要求10所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含I份二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和O. I至10份的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。
15.如權(quán)利要求11所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含I份三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和O. I至10份的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。
16.如權(quán)利要求12所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含I份三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和O. I至10份的二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。
17.如權(quán)利要求4所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含一種或多種鞘糖脂，所述鞘糖脂選自包含糖苷域共價(jià)偶聯(lián)葉酸的鞘糖脂，或包含唾液酸共價(jià)偶聯(lián)葉酸的鞘糖脂。
18.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述包含共價(jià)偶聯(lián)葉酸的神經(jīng)節(jié)苷脂占所述組合物中總神經(jīng)節(jié)苷脂的O. 5%到15%。
19.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂組合物包含1%到25%的與聚乙二醇共價(jià)偶聯(lián)的磷脂酰乙醇胺。
20.如權(quán)利要求5所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，一種或多種所述疏水性藥物非共價(jià)地與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，且所述神經(jīng)節(jié)苷脂以膠束形式存在。
21.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含紫杉醇，且紫杉醇/神經(jīng)節(jié)苷脂摩爾比例介于1:10和1:100之間。
22.如權(quán)利要求20所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含多烯紫杉醇，且多烯紫杉醇神經(jīng)節(jié)苷脂的摩爾關(guān)系介于1:10和1:100之間。
23.如權(quán)利要求21或22所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含O.lmg/ml至約6mg/ml的紫杉醇或多烯紫杉醇，以及4mg/ml至300mg/ml的神經(jīng)節(jié)苷脂。
24.如權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束的pH介于3和7之間。
25.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束的pH介于4和6之間。
26.如權(quán)利要求20-25中任一項(xiàng)所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束平均小于IOOnm。
27.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束平均介于IOnm和60nm之間。
28.如權(quán)利要求20所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含阿霉素，且阿霉素/神經(jīng)節(jié)苷脂的摩爾比例介于1:1和1:50之間。
29.如權(quán)利要求20所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含阿霉素和至少一種選自紫杉醇和多烯紫杉醇的藥物，且每種藥物神經(jīng)節(jié)苷脂的摩爾關(guān)系介于1:10和1:100之間。
30.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束的pH介于3和7之間。
31.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束的pH介于4和6之間。
32.如權(quán)利要求20所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含兩性霉素B，且兩性霉素B/神經(jīng)節(jié)苷脂的摩爾比例介于2:1和1:5之間。
33.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其包含兩性霉素B，且兩性霉素B/神經(jīng)節(jié)苷脂的摩爾比例為1:1。
34.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物,其特征在于,其包含O.lmg/ml至IOmg/ml的兩性霉素B和O. 18mg/ml至10mg/ml的神經(jīng)節(jié)苷脂。
35.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束平均小于200nmo
36.如權(quán)利要求32-35中任一項(xiàng)所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束平均介于IOnm和80nm之間。
37.如權(quán)利要求32-36中任一項(xiàng)所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束的pH介于3和7之間。
38.如權(quán)利要求32-37中任一項(xiàng)所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述納米膠束的pH介于4和5之間。
39.如權(quán)利要求20-38中任一項(xiàng)所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束由人血清白蛋白、重組人血清白蛋白或牛白蛋白非共價(jià)包被。
40.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束由人血清白蛋白非共價(jià)包被。
41.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束由含脂肪酸的人血清白蛋白非共價(jià)包被。
42.如權(quán)利要求40或41所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束由含或不含脂肪酸的人血清白蛋白包被，其比例為GM12:1W/W。
43.如權(quán)利要求39所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述神經(jīng)節(jié)苷脂納米膠束由包含共價(jià)偶聯(lián)葉酸的白蛋白包被。
44.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述共價(jià)偶聯(lián)葉酸的白蛋白占總白蛋白的I至20%。
45.如權(quán)利要求6所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其為凍干組合物。
46.如前述權(quán)利要求所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，其由選自蒸餾水、鹽溶液(NaCl O. 9%)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、5%的葡萄糖蒸餾水溶液和5%的葡萄糖鹽溶液中的溶劑重溶。
47.如權(quán)利要求7，21，22，29或32所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，在給藥前將其注射到裝有人白蛋白和適當(dāng)溶劑的塑膠袋中以使GMl-紫杉醇納米膠束、GMl-多烯紫杉醇、GMl-紫杉醇-阿霉素、GMl-兩性霉素B與白蛋白結(jié)合。
48.如權(quán)利要求I中所述的水溶性藥物組合物，其特征在于，所述疏水性藥物選自前列腺素，二硝酸異山梨酯，睪酮，硝酸甘油，雌二醇，維生素E，可的松，地塞米松及其酯，以及戊酸倍他米松。
49.用于獲得包含至少一種納米包封的治療活性物質(zhì)的膠束的方法，其特征在于包括 (a)在蒸餾水中或pH為3到7的鹽溶液中溶解神經(jīng)節(jié)苷脂，使其濃度一直保持在cmc之上，并使溶液靜置24小時(shí)， (b)在前一步驟中所得的神經(jīng)節(jié)苷脂膠束溶液中加入約10%的包含所選治療活性物質(zhì)的二甲亞砜或乙醇溶液， (c)將所述混合物溫育以確保所述治療活性物質(zhì)摻入所述膠束， (d)將包含所述治療活性物質(zhì)的膠束溶液在蒸餾水溶液或pH介于3與7之間的藥學(xué)可接受溶液中透析，以便徹底清除所述有機(jī)溶劑， (e)將由GMl-治療活性物質(zhì)復(fù)合物組成的膠束與人血清白蛋白一起溫育以使GMl-治療活性物質(zhì)-白蛋白三元復(fù)合物形成； (f)將前一步驟中所得的包含摻入GMl膠束的所述治療活性物質(zhì)的透明含水溶液通過(guò)O. 22微米孔，以進(jìn)行滅菌； (g)將所述無(wú)菌膠束凍干，和 (h)最后將所述凍干膠束重懸于藥學(xué)可接受的溶液中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了水溶性藥物組合物，其包含至少一種治療活性物質(zhì)和選自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一種化合物，其中至少一種治療活性物質(zhì)為疏水性藥物。特別地，本發(fā)明涉及由鞘糖脂或經(jīng)修飾的鞘糖脂的納米膠束組成的可注射無(wú)菌組合物，其可以被白蛋白非共價(jià)包被，且允許高疏水性分子的運(yùn)輸和受控釋放。
文檔編號(hào)A61P31/10GK102905693SQ201180024806
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者但丁·貝爾特拉姆, 維多利亞·雷奧哈德, 維拉利亞·阿拉西諾, 伊斯梅爾·比安科 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)和技術(shù)研究委員會(huì)(Conicet), 卓越產(chǎn)品工藝科爾多瓦中心(Ceprocor)