專利名稱：用于癌癥治療的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，特別是涉及癌癥治療的生物醫(yī)學領域，通過揭示出用于抗癌藥物開發(fā)的新的治療靶。所述藥物由于其更大的選擇性和效力而有助于改進癌癥患者的目前治療。描述了用于通過COMMDl蛋白的核表達和積累來治療癌癥的方法。在肽HARIKPTFRRLKffKYKGKFff的一級結構中所引入的化學修飾增加了 COMMDl的核定位并提高了該肽的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。
現(xiàn)有技術盡管在癌癥治療方面有著巨大的進展，但是由于腫瘤細胞形成對于目前的抗癌藥物的抗性，因而在開發(fā)具有新的作用方式的新的抗腫瘤試劑方面存在有大利益。由于其作為重要生物學功能的介體的作用以及其獨特的固有特性(這使它們成為特別有吸引力的治療試劑)，因而肽作為新的治療藥物仍然具有大利益。肽顯示出高的生物學活性，伴有低的毒性和高的特異性。由于這些特征而造成的益處包括增高的對于所希望的靶標的結合特異性，使藥物-藥物相互作用最小化，和表現(xiàn)出更小的在組織中的積累，從而降低了由于中間代謝物而引起的并發(fā)癥的風險(Vlieghe等人，2010，Drug Discovery Today, 15:40-56)。目前，存在有這樣的抗癌治療，其使用具有對于特定靶蛋白的結合選擇性的肽和/或小分子，所述靶蛋白在癌癥發(fā)展中具有重要的生物學功能。在第一種情形下，可以將這些治療導向抑制蛋白質的特定功能，并且作為主要事件而引起癌細胞凋亡，例如熱休克蛋白(HSP)的抑制劑(Subbarao 等人，2004，Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257);酪氨酸激酶的抑制劑(Garrido等人，2007，Rev Med Chil，10:1327-1332)。在大多數(shù)情況下，這些蛋白質在惡性過程中是異常的，如果與正常組織相比較。在第二種情形下，藥物與靶蛋白相結合，所述靶蛋白在惡性過程中可以是或不是異常的(與正常組織相比較)；在這種情況下，在惡性過程中被激活的信號傳導途徑受到影響，例如脫氧核糖核酸(DNA)復制的抑制劑、微管裝配的抑制劑和轉錄因子NFkB的抑制劑。盡管第一種情形在特定的造血系統(tǒng)惡性腫瘤中是高度有效的，但是它們中的大多數(shù)在實體腫瘤的復雜性下具有有限的有效性。相反地，第二種情形包括一些在腫瘤學藥典中最有效和甚至最具有毒性的藥物。為此原因，需要在 尋找新藥物方面有所前進，所述新藥物越來越是選擇性的和有效的，從而使其毒性最小化。在這個意義上，鑒定新的治療靶和了解其在癌癥發(fā)展中的作用有助于鑒定出新的藥物抗性機制，并促進設計出保留更大的活性并可以與現(xiàn)有的藥物相組合的新藥物，從而降低這些藥物的毒性并提聞癌癥患者的生活質量。COMMDl 蛋白，以前稱為 MURRl (van de Sluis 等人，2002，Human MolecularGenetic, 11:165-173)，屬于一個新的蛋白質家族，其首字母縮寫為COMMD (銅代謝基因MURRl結構域，縮寫為C0MMD)。該家族的十個蛋白質成員在多細胞生物中是高度保守的并且遍在地表達，然而其大多數(shù)成員的生物學功能尚不知曉。該家族的主要特征是存在有保守且獨特的COMM結構域(銅代謝Murrl結構域)，其包含在C-末端的氨基酸殘基 110-190 之間(Burstein 等人,2005, The Journal of BiologicalChemistry, 280:22222-22232)。COMMDl牽涉各種不同的生物學過程，例如銅代謝的控制(Tao 等人，2003，Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596);鈉的細胞內(nèi)運輸?shù)恼{(diào)節(jié)(Biasio 等人，2004，Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434);轉錄因子 NFkB 的抑制(Maine 等人，2007，The EMBO Journal, 26:436-447);由低氧誘導因子HIF-I α 所調(diào)控的基因的表達的抑制(van de Sluis 等人，2007，Molecular and CellularBiology, 27:4142-4156)。COMMDl顯現(xiàn)出與 轉錄因子NFkB的RelA(p65)亞基、與因子HIF-1 α的催化性亞基-α和與上皮鈉通道中的Delta ENaC的物理相互作用。在所有情況下，該相互作用導致這些“客戶”蛋白質的降解，其通過涉及遍在蛋白化和經(jīng)由蛋白酶體的降解的機制。已證明，COMM結構域參與蛋白質-蛋白質相互作用，不僅對于C0MMD1的“客戶”蛋白質，而且還對于該家族的成員之間的相互作用。存在有關于C0MMD1的N-末端區(qū)域的三維結構的提議，但還不存在關于COMM結構域的三級結構(Sommerhalter等人，2007, Journal of MolecularBiology, 365:715-721)。借助于遍在蛋白化和蛋白酶體降解(通過位于COMM結構域中的一系列亮氨酸殘基)的過程，在細胞中C0MMD1的基礎表達受到控制(Maine等人，2009，BiochemicalJournal, 417:601-609)。最近，描述了 C0MMD1具有這樣的機制，該機制構成通過也位于其COMM結構域中的核輸出信號(NES)的細胞質-細胞核轉運。已報道，亮氨酸序列的破化和/或抑制蛋白酶體降解的試劑造成在細胞中C0MMD1的表達的增加。此外，C0MMD1中的NES序列的破壞增強因子NFkB和HIF-I α的轉錄活性的抑制(MulIer等人，2009，Traffic, 10:514-527)。異常的贅生性細胞過表達不同的抗凋亡蛋白質，例如抑制凋亡的蛋白XIAP和簇集蛋白(CLU)，其加速非雄激素依賴型前列腺癌的進展。這兩種蛋白質都有利于C0MMD1的遍在蛋白化和蛋白酶體降解，從而促進NFkB的激活和腫瘤細胞的存活。據(jù)報道，蛋白酶體的抑制劑，例如 MG132 (Shirley 等人，2005，Neoplasia, 7:1104-1111 ；Zhou 等人，2009, Cancer Research, 21:333-339)，具有通過抑制遍在蛋白化和蛋白酶體降解的機制的抗腫瘤效應。與XIAP結合的化合物通過阻斷該蛋白質對于胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9激活的抑制效應來誘導凋亡(Vogler等人，Cancer Research, 2009, 69:2425-2434)。已提出，被設計用于抑制CLU的功能的干擾核糖核酸(iRNA)具有抗腫瘤效應，通過使因子NFkB的細胞質抑制劑(稱為I-kB)穩(wěn)定化(Zoubeidi等人，2010，Molecular CancerResearch, 8:19-30)。在國際專利申請WO 07/095867中，發(fā)明的實質涉及源自LALF (鱟抗脂多糖因子)蛋白的32-51區(qū)域的肽，其中進行了確保瓦解與細菌脂多糖(LPS)結合的能力的氨基酸置換，并且其具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)效應。這些肽之一為稱為肽L2的肽。此外，在另一個發(fā)明(國際申請PCT/⑶2008/000006)中，揭示了上面所提及的肽穿透入細胞中的能力。然而，在所述發(fā)明中，既沒有公開也沒有暗示這些肽的作用機制。目前,存在有眾多旨在治療癌癥的療法(化學療法、放射療法、免疫療法等),它們中的許多還處于臨床試驗階段中。但是，仍然有著與這些療法相關的缺點，例如低選擇性、毒性和形成藥物抗性。在該領域中要考慮的另一個重要方面是選擇可用作藥物效力的診斷物和/或預測物的生物標志物。因此，仍存在有研究和發(fā)現(xiàn)新分子的需要，所述新分子在癌癥的治療和/或診斷中，以及在具有更低毒性的、越來越選擇性和有效的藥物的設計中是有用的。發(fā)明描述本發(fā)明通過描述用于通過增加COMMDl蛋白的核定位來治療癌癥的方法而解決了上面提及的問題。所述增加引起癌細胞的增殖的降低或阻斷。在本發(fā)明中，首次揭示了，在癌細胞中肽L2 (其序列為HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW，SEQ ID No. I)與COMMDl相互作用，并且COMMDl的核定位與癌細胞的的死亡相關。由此，本發(fā)明提供了 COMMDl蛋白在鑒定具有抗腫瘤活性的化合物中的用途，所述化合物促進COMMDl的核積累和定位。在本發(fā)明中所提供的數(shù)據(jù)證明，抗腫瘤肽L2與COMMDl相互作用，特別是在包含于COMMDl的氨基酸110-190之間的區(qū)域中。此外，肽L2引起COMMDl的核積累。此外，在本發(fā) 明中首次報道了，攜帶核定位序列(NLS)的COMMDl蛋白的表達足以誘導癌細胞的死亡。因此，本發(fā)明首次證明了 COMMDl在癌癥的治療中作為治療靶的用途。此外，從肽L2的序列(SEQ ID No. I)開始，優(yōu)化了肽L552 (SEQ ID No. 3)，以引起COMMDl在核中的積累并提高所述肽的體外和體內(nèi)抗腫瘤效應。經(jīng)優(yōu)化以促進COMMDl的核定位的在本發(fā)明中所描述的肽L552 (SEQ ID No. 3)具有下述序列Ac-HARIKpTFRRIKffKYKGKFff SEQ ID No. 3。所述優(yōu)化基于進行化學修飾，通過在特定位置(其在上面所包括的序列中以小寫和粗體來表示)處用非天然氨基酸(D-氨基酸)置換天然氨基酸和借助于乙酰化(在上面所包括的序列中標明為Ac-)的對于N-末端的保護。這些對于肽L2的序列(SEQ ID No. I)所進行的并且導致產(chǎn)生肽L552 (SEQ ID No. 3)的修飾，確保了 COMMDl在核中的更大的積累以及肽L552相對于原始肽L2而言的抗腫瘤活性的提高。因此，肽L552是新的一個類別的分子，其與COMMDl相互作用，從而促進COMMDl的核定位并引起癌細胞增殖的抑制。增加COMMDl蛋白的核定位的試劑在制備用于癌癥治療的藥物中的用途也是本發(fā)明的目標。在促進COMMDl的核積累的試劑或化合物之中，可以包括例如蛋白質(包括抗體)、突變蛋白、肽、多核苷酸、適體、核酸和有機小分子。這些化合物可以從天然來源分離，以合成或重組方式進行制備，或者它們的任何組合。在一個特別的實施方案中，增加COMMDl蛋白的核定位的試劑為肽L552(SEQ ID No. 3)。在本發(fā)明的背景下，提高或增加COMMDl的核定位與使COMMDl蛋白在細胞核中積累具有相同的含義。在另一個特別的實施方案中，增加COMMDl蛋白的核定位的試劑可以是核酸類型的，例如哺乳動物細胞表達載體，其包含編碼含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列。該類型的載體可以用作基因療法。此外，用于治療癌癥的藥物組合物也是本發(fā)明的一部分，所述藥物組合物包含增加COMMDl蛋白的核定位的試劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物包含有效量的增加COMMDl蛋白的核定位的試劑(通過其半數(shù)抑制濃度(IC5tl)而測定的)以及藥學上可接受的賦形劑或載體。該組合物可以通過腸胃外途徑或通過局部途徑進行施用。包含增加COMMDl蛋白的核定位的試劑的藥物組合物的施用構成了用于治療或預防受試者中的實體腫瘤的方法，其中該方法包括以有效量施用促進COMMDl的核定位的試齊U，以降低或阻斷腫瘤細胞的生長。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以向白血病(特別是髓細胞白血病)患者施用增加COMMDl蛋白的核定位的試劑，從而阻斷癌細胞的增殖，甚至在炎癥刺激存在下。在本發(fā)明中證明，可以將肽L552與標準化學療法相聯(lián)合地進行使用，以產(chǎn)生協(xié)同效應和減少細胞抑制劑(例如，順鉬和5-氟尿嘧啶(5-FU))的劑量。因此，用于治療癌癥的藥物組合也是本發(fā)明的目標，所述藥物組合包含一種或多種增加COMMDl蛋白的核定位的試劑，以及一種或多種對于癌癥的標準化學療法特異的藥物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述試劑為肽L552，并且所述對于標準化學療法特異的藥物選自順鉬和5-FU。在所述藥物組合中，構成所述藥物組合的一部分的所述試劑和所述藥物可以在同一治療過程中同時地、分開地或順次地進行施用。另一方面，炎癥與癌癥之間的關系是現(xiàn)今已接受的事實。目前，炎癥微環(huán)境被列為腫瘤的特點，其歸類在由Hanahan和Weinbergs (Perwez等人,2007, Int JCancer, 121:2373-2380)所描述的癌癥的六個最重要的特征之中。本發(fā)明中所提供的數(shù)據(jù)表明，在炎癥刺激存在下，肽L552在阻斷癌細胞生長方面 是有效的。同樣地，攜帶NLS的GFP-NC0MMD1蛋白的表達在癌細胞中促進相同的效應。更特別地，結果顯示，肽L552在炎癥刺激例如LPS和腫瘤壞死因子(TNF-α )存在下促進癌細胞的死亡。同樣地，體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)證明了該肽在結腸腫瘤的鼠類模型中的有效性，其中用通過注射LPS而造成的炎癥刺激來攻擊小鼠。為此，本發(fā)明還提供了用于抑制與炎癥相關的腫瘤的發(fā)展以及其轉移的方法，其包括向有此需要的受試者施用肽L552。在與炎癥相關的腫瘤以及其轉移中存在有例如下述類型的癌癥結腸直腸癌、食道癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌。此外，還可以以預防的方式進行肽L552的施用，以預防與慢性炎癥(例如，克羅恩病、潰瘍性結腸炎、胰腺炎、肝硬化等)相關的癌癥的發(fā)展。因此，用于預防與慢性炎癥相關的癌癥的方法也是本發(fā)明的目標，所述方法的特征在于，向有此需要的個體施用肽L552或包含所述肽的組合物。關于用包含肽L552 (作為增加COMMDl的核定位的試劑)的組合物要遵從的治療劑量和方案，技術人員可以容易地確定(預防性或治療性)治療的劑量和方案。有效量可以依據(jù)各個組合物的相對功效而變化，并且可以基于該肽的分子量和在體外或在動物研究中的IC5tl來進行計算。例如，在知曉所述化合物(化學結構)的分子量和有效實驗劑量(IC5tl)的情況下，可以常規(guī)地計算出以mg/Kg體重表示的劑量。通常,所述劑量為O. 2-4mg/Kg體重。該肽或包含其的組合物可以每周地或甚至每幾個月地施用一次或多次。本發(fā)明還涉及COMMDl作為新的用于癌癥患者的預后標記物的用途，通過測定在樣品中COMMDl的核定位的存在或不存在。同樣地，肽L552提供了用于治療疾病的活性試劑，在所述疾病中COMMD蛋白起作用或者牽涉該疾病的進展。這是可能的，例如在那些這樣的疾病中，在所述疾病中COMMD家族的一些成員的量增加或減少和/或其活性提高或降低，并且這造成該疾病。肽L552與包含在COMMD蛋白的C-末端的氨基酸殘基110-190之間的COMM結構域相結合的能力支持了該肽的治療活性。附圖
簡述圖I.圖解說明了肽L2與COMMDl蛋白之間的物理相互作用，其中使用酵母雙雜交技術。作為陰性對照，采用用空載體PGBKT7轉化的酵母菌株AH109與轉化到菌株Y187中的COMMDl片段的每種構建物的交配。為了鑒定相互作用，進行用攜帶L2序列的載體轉化的菌株AH109與轉化到菌株Y187中的COMMDl片段的每種構建物的交配。作為陽性對照，采用攜帶轉錄因子GAL4的pCLl的交配。如所觀察到的，用攜帶COMMDl基因的完整序列的質粒和包含COMMDl蛋白的氨基酸110-190的構建物，出現(xiàn)相互作用。圖2. (A)圖解說明了肽L2與COMMDl的相互作用的驗證，通過在SW948細胞中的免疫沉淀技術(pulldown)。在該實驗中，添加100 μ g的總蛋白質(TP)和在大腸桿菌(Escherichia coli)中獲得的重組COMMDl蛋白(C0MMDlr)，MW (分子量標準)。(B)圖解說明了在用肽L2處理的SW948細胞中COMMDl的亞細胞定位。在核中COMMDl的表達(N)，在細胞質中COMMDI的表達(C)，未處理的細胞(NT )。β -肌動蛋白為細胞質級分的對照，hnRNP為核級分的對照。圖3. (A)圖解說明了通過經(jīng)優(yōu)化的肽L552而引起的更大的COMMDl的核積累。(B)顯示了在免疫沉淀(pulldown)實驗中，在不同的腫瘤細胞系中L552與COMMDl蛋白之 間的相互作用。用滯蛋白7 (CUL7)未檢測到相互作用。在所述不同的細胞系中，顯示了在總蛋白質提取物中β_肌動蛋白的存在。圖4.在不同組織學來源的腫瘤細胞中所述肽的抗增殖效應，L0(從外周血分離的人淋巴細胞)。圖5.在TC-I腫瘤模型中肽L552的抗腫瘤效應。(A)顯示了腫瘤塊的生長抑制曲線。(B)顯示了不同實驗組的累積存活百分比。圖6.圖解說明了含有核定位序列的COMMDl蛋白的表達足以誘導細胞死亡。顯示了在72小時時用溴化乙錠染色的非活細胞的百分比，作為用攜帶作為陰性對照的綠色熒光蛋白(GFP)的構建物、構建物GFP-C0MMD1和核定位構建物GFP-N-C0MMD1進行的轉染的結果。圖7. (A)顯示了在用構建物GFP-NC0MMD1轉染的結腸癌細胞HT-29中對于5-FU的化學敏感性。指明了 IC5tl值。(B)圖解說明了通過添加LPS和TNF-α而引起的炎癥環(huán)境對于IC5tl的影響。圖8.圖解說明了在不同的炎癥刺激存在下，肽L552對于癌細胞增殖的效應。在用LPS和TNF-α處理的人髓細胞白血病細胞(THP-1) (A)和鼠類結腸癌細胞(CT-26) (B)中測定ic5(l。圖9.在經(jīng)歷了通過注射LPS而引起的炎癥刺激的BALB/c小鼠中，在結腸癌模型中肽L552的抗腫瘤效應。(A)顯示了不同實驗組的累積存活百分比。(B)顯示了關于每個實驗組的腫瘤塊的體積的平均值。
實施例實施例I.肽L2與COMMDl之間的物理相互作用。為了鑒定抗腫瘤肽L2-蛋白質相互作用，使用酵母雙雜交系統(tǒng)。為了克隆相應于該肽的序列，設計了下列寡核苷酸L2F CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGGGTAAGTTCTGGTAA
L2R GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTTGATTCTAGCGTG其相應于肽序列L2 :HARIKPTFRRLKWKYKGKFW。為了將這些序列克隆在載體pGBKT7 NcoI-BamHI中，在這些寡核苷酸的末端添加與這些位點互補的序列。通過限制酶切分析和測序來驗證攜帶肽序列L2的重組質粒PGBKL2-1。通過乙酸鋰方法來將該質粒轉化到酵母菌株AH109中，并接種在SD-Trp培養(yǎng)基中。驗證了，當接種在SD-Trp-His平板中時，不能自我激活。為了篩選相互作用，使用轉化到菌株Y187中的源自人肝臟cDNA的文庫。為了形成二倍體和選擇相互作用，使5X IO8個包含質粒PGBKL2-1的AH109細胞與5 X IO8個包含人肝臟DNA文庫的Y187細胞一起在30°C 下在YPDA固體培養(yǎng)基中生長4小時。在YPDA培養(yǎng)基平板上，在其表面上添加IOml無菌水，并且用刮刀小心地使細胞重懸浮，并轉移至15個SD-Trp-Leu-His-Ade基本培養(yǎng)基平板，并在30°C下生長7天。將所得的74個菌落轉移到在96-深孔平板中的SD-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中。在觀察到在液體培養(yǎng)基中的生長后，進行酵母DNA的純化。將每一個這些DNA獨個地轉化到大腸桿菌菌株DHlOB中，純化其DNA并保存于_20°C。將這些獨個克隆中的每一個轉化到酵母菌株Y187中，并通過與用質粒PGBKT7和pGBKL2_l轉化的菌株AH109進行交配來驗證相互作用。對陽性克隆的DNA進行測序。通過BLAST程序(Altschul等人，1990. JMol Biol, 215:403-410)的序列分析揭示出，這些克隆之一(L2-21)相應于編碼COMMDl蛋白的氨基酸6-190的基因的序列，并且該克隆能夠與包含肽序列L-2的質粒相互作用。為了明確地鑒定出負責所述相互作用的COMMDl蛋白的區(qū)域，對于質粒PGBKL2-1構建物進行缺失，從而產(chǎn)生克隆 pGBKL2 (6-110)、pGBKL2 (6-70)、pGBKL2 (71-190)、pGBKL2 (110-190)。如在圖I中所看到的，僅在質粒PGBKL2 (110-190)中保留了相互作用，該質粒包含負責對于COMMD家族的蛋白質所描述的相互作用的COMM結構域。該結果說明，肽L2與包含在氨基酸110-190之間的區(qū)域特異性地結合。實施例2.使用肽L2的免疫沉淀以及COMMDl的核積累的實驗。所述實驗分為兩塊(A)使通過使用固相方法合成的合成肽L2(SEQ ID No. I)生物素化，并用作結合至鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖樹脂的“誘餌”。作為“捕獲物”，使用腫瘤細胞系SW948(人結腸癌)的蛋白質提取物。這些實驗被稱為“pulldown”。使用提取緩沖液(Triton X-1000. 5%;25mMHEPES, pH 7. 5; IOOmM NaCl; ImM EDTA;10% 甘油;ImM 二硫蘇糖醇(DTT)，和蛋白酶抑制劑)，從2X IO7個細胞獲得蛋白質提取物。將所述生物素化的肽(300 μ g)與50 μ L鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖樹脂(GE Healthcare) —起溫育一小時，并用磷酸緩沖鹽水(IX PBS)+ImMDTT進行洗滌。然后，將500 μ g總蛋白質與50 μ L含有所述生物素化的肽的樹脂一起在環(huán)境溫度下溫育5小時。然后，用IX PBS和ImM DTT充分地洗滌所述樹脂。保持與樹脂相結合的蛋白質是與所述肽相互作用的那些，并且將其懸浮在25 μ L電泳緩沖液(62. 5mM TrisHCl; pH 6. 9; O. IM DTT, 20%十二烷基硫酸鈉(SDS)，10%甘油和O. 01%溴酚藍)中。為了檢測目的蛋白質，進行在聚丙烯酰胺凝膠(7. 5%)中的電泳，隨后通過“Western印跡”進行免疫檢測。為了檢測COMMDl蛋白，使用抗-COMMDl單克隆抗體(Sigma，cion 2A12)。使用總蛋白質提取物(100μ g)和在大腸桿菌中獲得的重組蛋白C0MMD1。在圖2A中呈現(xiàn)的結果顯示，當與總蛋白質提取物進行比較時，在該“pulldown”實驗中肽L2濃縮了 COMMDl蛋白。這是L2與COMMDl之間的相互作用的指示。(B)將 SW948 細胞(3 X IO6 個細胞)與肽 L2 (50 μ M) —起在 37 °C 和 5%C02 下溫育5小時。然后，按照所報道的(Vancurova等人，2001，Journal of BiologicalChemistry, 276:19746-19752),進行胞質蛋白質和核蛋白質的細胞分級分離。使用抗-C0MMD1抗體，通過“Western印跡”來進行C0MMD1的檢測。圖2B顯示了在用肽L2處理的SW948細胞中C0MMD1的核定位。為了檢驗所述細胞分級分離，使用β _肌動蛋白作為細胞質級分的對照，和使用人核糖核蛋白(hnRNP)作為核級分的對照。實施例3.肽L552的優(yōu)化以用于C0MMD1的核積累。假定肽L2與C0MMD1蛋白相互作用并且這與C0MMD1的核定位相關，那么從L2(SEQID No. I)開始設計不同的肽，其目的是以所述肽變體加強C0MMD1的核積累。使用固相方法來合成本發(fā)明的肽。將粗制的肽用30%乙酸溶液進行提取，凍干，然 后通過反向色譜法RP-HPLC進行純化。借助于質譜法來驗證經(jīng)純化的肽的分子量。所得的制備物對于其在動物和人中的施用來說是非抗原性的、非致熱性的和藥學上可接受的。如在表I中所顯示的，通過在原始肽序列L2 (其序列為HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ IDNo. I 中在特定位置處引入D-構型的氨基酸，在特定位點處進行置換。在一種情況下，還通過乙?；忾]了 N-末端。表I.在本發(fā)明中所使用的肽的序列
權利要求
1.用于癌癥治療的方法，其特征在于，增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位，這引起所述細胞的增殖的降低或阻斷。
2.根據(jù)權利要求I的方法，其特征在于，使癌細胞與增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑相接觸，或者向受試者施用包含增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑的組合物。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑包括具有標識為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其特征在于，抑制與炎癥相關的腫瘤的發(fā)展以及其轉移。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其特征在于，所述與炎癥相關的腫瘤以及其轉移位于結腸、直腸、食道、肺、前列腺、乳腺、胰腺或肝臟中。
6.根據(jù)權利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑包括哺乳動物細胞表達載體，其包含編碼含有核定位序列(NLS)的COMMDl蛋白的DNA序列。
7.增加COMMDl蛋白的核定位的試劑在制備用于癌癥治療的藥物中的用途。
8.根據(jù)權利要求7的用途，其中所述增加COMMDl蛋白的核定位的試劑為蛋白質、合成肽、核酸或用于基因療法的載體。
9.根據(jù)權利要求8的用途，其中所述合成肽為具有標識為SEQIDNo. 3的氨基酸序列的肽。
10.根據(jù)權利要求8的用途，其中所述用于基因療法的載體為哺乳動物細胞表達載體，其包含編碼含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列。
11.用于癌癥治療的藥物組合物，其包含一種或多種增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑，以及藥學上可接受的賦形劑或載體。
12.權利要求11的組合物，其中所述增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑為具有標識為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽。
13.權利要求11的組合物，其中所述增加在癌細胞中COMMDl蛋白的核定位的試劑為哺乳動物細胞表達載體，其包含編碼含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列。
14.用于治療癌癥的藥物組合，其包含一種或多種增加COMMDl蛋白的核定位的試劑，以及一種或多種對于癌癥的標準化學療法特異的藥物。
15.權利要求14的藥物組合，其中所述增加COMMDl蛋白的核定位的試劑包括具有標識為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽，并且所述對于標準化學療法特異的藥物選自順鉬和5-FU。
16.權利要求14的藥物組合，其中構成所述藥物組合的一部分的所述試劑和所述藥物在同一治療過程中同時地、分開地或順次地進行施用。
17.用于預防與慢性炎癥相關的癌癥的方法，其特征在于，增加在細胞中COMMDl蛋白的 核定位。
18.權利要求17的方法，其中在細胞中COMMDl蛋白的核定位的增加通過向有此需要的個體施用具有標識為SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽或包含所述肽的組合物來實現(xiàn)。
19.用于確定癌癥患者的預后的方法，其特征在于，通過測定在所述患者的樣品中COMMDl的核定位的存在或不存在，來將COMMDl用作預后標志物。
20.具有與COMM結構域結合的能力的肽，其特征在于，所述肽具有標識為SEQID No. 3的氨基酸序列。
21.權利要求20的肽用于治療疾病的用途，其中COMMD家族的成員牽涉所述疾病的進展。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于通過增加COMMD1蛋白的核定位來治療癌癥的方法，這與癌細胞增殖的降低或阻斷相關。此外，本發(fā)明涉及增加COMMD1蛋白的核定位的試劑在制備用于癌癥治療的藥物中的用途。除了其他化合物之外，所述試劑尤其可以為肽或蛋白質。本發(fā)明還涉及從序列HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW開始進行肽的優(yōu)化，以增加COMMD1蛋白的核定位，并從而提高所述肽的抗腫瘤效應。
文檔編號A61P35/00GK102917725SQ201180026853
公開日2013年2月6日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權日2010年5月31日
發(fā)明者M·古埃拉巴萊斯皮, J·R·費爾南德斯馬索, A·穆薩奇奧拉薩, J·希爾巴爾德斯, O·雷伊斯阿考斯塔, B·M·奧利瓦阿古雷斯 申請人:遺傳工程與生物技術中心