專利名稱：含有香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物。
背景技術(shù)：
豆具有豐富的營養(yǎng)價值且包含各種生理活性和生理功能的物質(zhì)。尤其，由于豆中所含的植物雌激素(/7知與哺乳動物的雌激素在結(jié)構(gòu)上相似，因此它們具有預(yù)防慢性疾病如荷爾蒙失調(diào)的效果。通常，所述植物雌激素包括大豆異黃酮、香豆雌酚和木脂素。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明在于提供用于抑制脂肪細(xì)胞的分化、增強免疫力、對有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒且預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病的組合物，該組合物含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物。技術(shù)方案
在一方面，本發(fā)明提供用于抑制脂肪細(xì)胞的分化的組合物，該組合物含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物。在一方面，本發(fā)明提供用于增強免疫力的組合物，該組合物含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物。在一方面，本發(fā)明提供用于對有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒組合物，該組合物含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物。在另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病的組合物，該組合物含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物。有益效果
本發(fā)明中一個實施例的含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物，具有抑制脂肪細(xì)胞的分化、增強免疫力、對有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒以及預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病的效果。所述組合物能應(yīng)用于食品或藥品領(lǐng)域。


圖I展示了通過香豆雌酚對脂肪細(xì)胞分化的抑制。圖2展示了通過香豆雌酚的脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)的降低。
具體實施例方式這里使用的“提取物”是指從自然物質(zhì)中提取的物質(zhì)，不論提取方法或成分。所述術(shù)語是在廣義上使用，其包括如通過使用水或有機溶劑從天然物質(zhì)中提取的可溶于所述溶劑的成分，或從中提取的天然物質(zhì)的特定成分，如油類。
下面將更為詳細(xì)地描述本發(fā)明。在一方面，本發(fā)明提供含有作為活性成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物。香豆雌酚{CMS; 3，9- 二羥基-6H-苯并呋喃(3, 2~c) (I)苯并呋喃~6~酮)具有化學(xué)式I的結(jié)構(gòu)
化學(xué)式I
O'
V。、
香豆雌酚是一種植物雌激素(/7知且通常在豆科或菊科植物的種子、根部或葉子中發(fā)現(xiàn)。它可被歸類為coumestan類異黃酮iso/yarafloit/)，并且 已知其具有雌激素的效果。在本發(fā)明的一個實施例中，所述組合物包含香豆雌酚、含有香豆雌酚的自然物質(zhì)或其提取物。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述含有香豆雌酚的自然物質(zhì)可以為選自大豆(^soybean)、iUJKpea)、綠豆Onung bean)以及使之發(fā)芽的發(fā)芽豆中的一種或多種豆類、紅三葉草Cret/ c7or6 r)、苜猜(aJ/aJTa)、抱子甘藍(lán)(Ζ τ 5·5· 75· sprout')等。在本發(fā)明的另一個實施例中，含有香豆雌酚的自然物質(zhì)可以為豆。在本發(fā)明的一個實施例中，所述豆可以為含有香豆雌酚的任何豆科植物，并且對其沒有特別限制。例如，本發(fā)明所用的豆可以為用于豆瓣醬、豆腐、豆芽、煮飯或未成熟的豆的豆。用于豆瓣醬或豆腐的豆的品種包括大豐、湖醬、狀元、大黃、小膽、松鶴、大元、真品、蛋白、豆油、新八達(dá)、太光、萬里、長壽、無限、白云、鳥卵、黃金和長葉。用于豆芽的豆的品種包括神話、小圓、安平、西南、多彩、小綠、小湖、疏明、多元、豐產(chǎn)豆芽、益山豆芽、小白豆芽、光安、短葉和銀河。用于煮飯的豆的品種包括青磁、黑青、褐味、鮮黑、黑豆和一品黑豆。此外，用于未成熟的豆的豆的品種包括多兀、新綠、新乙、黑乙、夕涼未熟豆、華嚴(yán)未熟豆和大乙。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述豆可以為能夠發(fā)芽且對疾病和害蟲的侵害具有抵抗力的豆。所述豆的品種包括如神話、小圓、安平、西南、多彩、小綠、小湖、疏明、多元、豐產(chǎn)豆芽、益山豆芽、小白豆芽、光安、短葉和銀河。在本發(fā)明的一個實施例中，所述自然物質(zhì)或其提取物可以包含大量的香豆雌酚。具體地，它可以包含占所述自然物質(zhì)或其提取物總重量的O. 01-50wt%的香豆雌酚，優(yōu)選為
O.l-30wt%o在本發(fā)明的一個實施例中，含有香豆雌酚的自然物質(zhì)的提取物可以在常溫或升高的溫度下通過水或乙醇提取所述含有香豆雌酚的自然物質(zhì)并將所得提取物進(jìn)行完全濃縮，然后在水中再次分散，用等量的選自己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇和水中的一種或多種的溶劑對其進(jìn)行分餾。然而，所述提取方法不會局限于此，即可使用任何提取方法。在本發(fā)明的一個實施例中，所述含有作為有效成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物可以為用于抑制脂肪細(xì)胞分化的組合物。香豆雌酚能夠抑制脂肪細(xì)胞的分化，并能降低脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸合成的分子標(biāo)記的mRNA的表達(dá)。因此所述含有香豆雌酚的組合物可以抑制脂肪細(xì)胞的分化且預(yù)防或改善肥胖以及各種由肥胖引起的疾病。這些疾病包括2型糖尿病、脂肪肝或心血管疾病，但不限于這些疾病。所述心血管疾病包括高脂血癥、高血壓、心絞痛、心肌梗塞和動脈硬化中的一種或多種疾病。在本發(fā)明的一個實施例中，所述含有作為有效成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取 物的組合物可以為用于增強免疫力的組合物。香豆雌酚將通過增殖免疫細(xì)胞來增強免疫力且激活免疫細(xì)胞。因此，含有香豆雌酚的組合物可以增強免疫力，從微生物、細(xì)菌、病毒等中保護(hù)身體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述含有作為有效成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物可以為用于對有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒的組合物。所述組合物可以對攝入體內(nèi)的有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒。特別地，它具有良好的去除尼古丁的能力。尼古丁是香煙中包含的誘導(dǎo)成癮性物質(zhì)，而且可以通過刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)而對心血管產(chǎn)生負(fù)面影響。香豆雌酚通過從尼古丁和其他有毒物質(zhì)中保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞來提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。因此，所述含有香豆雌酚的組合物可以去除攝入體內(nèi)的尼古丁或其他有毒物質(zhì)，從而預(yù)防或改善由所述有毒物質(zhì)引起的血管疾病。所述血管疾病包括血液循環(huán)障礙、高血壓或動脈硬化，但不限于這些疾病。在本發(fā)明的一個實施例中，所述含有作為有效成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的組合物可以為用于預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病。所述神經(jīng)退行性疾病是因神經(jīng)或神經(jīng)細(xì)胞受到退行性損傷和功能衰退而引發(fā)的疾病。所述神經(jīng)退行性疾病可以包括青光眼、重癥肌無力、糖尿病性神經(jīng)病、腦血管意外(cerebrovascular acciden t)、脊髓損傷、葛雷克氏癥(肌萎縮側(cè)索硬化癥，ALS)、帕金森氏癥，阿爾茨海默氏癥或特發(fā)性老年癡呆癥，但不限于這些疾病。香豆雌酚通過從神經(jīng)毒素中保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞來提高它們的存活率，而且能清除神經(jīng)毒素生產(chǎn)的活性氧。因此所述含有香豆雌酚的組合物可以通過抑制神經(jīng)毒素的作用來預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病。本發(fā)明中一個實施例的組合物可以包含占所述組合物總重量的O. 001-30wt%的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物，具體為O. 01-10wt%，有選為O. l-5wt%。當(dāng)所述香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物在上述范圍時，不僅能充分地實現(xiàn)本發(fā)明所預(yù)想的效果并同時滿足穩(wěn)定性和安全性，而且可以取得良好的成本效益。在另一方面，本發(fā)明提供含有香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的食品組合物。所述食品組合物可以為保健食品、功能性食品或食品添加劑組合物。在對預(yù)期效果不會產(chǎn)生負(fù)面影響的條件下，所述食品組合物可以包含能提供協(xié)同效果的其他成分。例如，進(jìn)一步可以包括香料、色素、滅菌劑、抗氧化劑、防腐劑、保濕劑、增稠劑、乳化劑、合成聚合物等的添加劑。此外，進(jìn)一步可以包括水溶性維生素、脂溶性維生素、聚合物肽、高分子多糖、海藻提取物等的輔料。根據(jù)所用的特別劑型及目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地選取這些成分。在對本發(fā)明的目的和效果不產(chǎn)生負(fù)面影響的條件下，確定所述添加劑的用量。本發(fā)明的組合物可以被制成各種劑型，其包括溶液、乳液、粘稠性混合物，片劑，粉末劑等。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍之內(nèi)確定所述有效成分的劑量。例如，所述劑量可以為O. l-5000mg/kg/天,優(yōu)選為50_500mg/kg/天,但不限于此,而且可以根據(jù)受試者的年齡、身體狀況、并發(fā)癥等的各種因素而有所不同。在另一方面，本發(fā)明提供含有香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的藥物組合物。所述藥物組合物可以進(jìn)一步包括佐劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、乳化促進(jìn)劑、用于控制滲透壓的鹽和/或緩沖劑等，或者其他治療上有用的物質(zhì)，而且所述藥物組合物可以被制成各種用于口服或腸胃外給藥的劑型。所述用于口服給藥的劑型可以包括，如片劑，丸劑，硬或軟膠囊劑、液體、懸浮液、乳液、糖漿、粉末劑、粉劑、顆粒劑、微丸劑等。除了所述活性成分，這些劑型可以包含表面活性劑、稀釋劑(如乳糖、葡萄糖、鹿糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維素或甘氨酸)或潤滑劑(如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其鎂或鈣鹽或者聚乙二醇)。所述片劑可以包含粘合劑如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷酮，并且根據(jù)情況可以包含藥物添加劑，如淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽的崩解劑、吸收劑、著色劑、調(diào)味劑、甜味劑等。用于腸胃外給藥的劑型可以包括，例如注射劑、滴劑、軟膏、洗劑、凝膠、霜、噴劑、 懸浮液、乳液、栓劑、貼劑等，但不限于這些劑型。所述活性成分的醫(yī)藥學(xué)上可接受的用量，即給藥劑量將根據(jù)受試者的年齡、性別和體重、具體疾病的嚴(yán)重程度或病理情況、給藥途徑和醫(yī)生的診斷而有所不同。根據(jù)口服給藥時已知的香豆雌酚的生物利用度(約11. 7%)以及上述因素，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定所述劑量。例如，通常的給藥劑量可以為O. 01-1000mg/kg/天,優(yōu)選為l_40mg/kg/天。然而，所述給藥劑量不會以任何方式受限于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明將通過測試實施例詳細(xì)地描述本發(fā)明的特征和效果。然而，所提供的下列測試實施例僅用于說明為目的，不會用來限制本發(fā)明的范圍。[測試實施例I]對脂肪細(xì)胞分化的抑制效果的評估
為了評估抑制脂肪細(xì)胞分化的效果，對小鼠進(jìn)行IOM香豆雌酚(CMS)連續(xù)給藥，而3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞(CL-173，ATCC)被分化成脂肪細(xì)胞。將IM的已知能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的羅西格列酮(Rosi)用作陽性對照組，IOM的已知能抑制脂肪細(xì)胞分化的黃連素(BBR)用作陰性對照組。脂肪細(xì)胞分化開始起第I天、第2天、第4天和第6天，對受試對象進(jìn)行給藥，而后更換培養(yǎng)基。陽性對照組內(nèi)的脂肪細(xì)胞的分化完成為止，所述脂肪細(xì)胞的分化大約進(jìn)行了 7天。然后，用油紅O (Sigma)將所述細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯進(jìn)行染色并確認(rèn)脂肪細(xì)胞的分化程度。其結(jié)果在圖I中展示。如圖I所示，用香豆雌酚處理的組比用陽性對照組的羅西格列酮或陰性對照組的黃連素處理的組展示出更少的染色區(qū)。這表明，香豆雌酚能顯著地降低脂肪細(xì)胞的分化且其效果比黃連素的效果更為優(yōu)秀。另外，用熒光定量PCR調(diào)查所述脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)程度。評估相對未處理組的每組的表達(dá)水平且其結(jié)果圖2中展示。所測的基因為aP2 (脂肪酸結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞的特定類型)、Acrp30 (脂聯(lián)素)、PPAR (過氧化物酶體增殖劑激活受體)、SREBPIc (固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C)和FAS (脂肪酸合成酶)，這些被用作脂肪細(xì)胞分化及脂肪酸合成的分子標(biāo)記。如圖2所示，香豆雌酚能使脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸合成的分子標(biāo)記的mRNA的表達(dá)顯著降低，而且其效果比黃連素的效果更好。由此，香豆雌酚能抑制脂肪細(xì)胞的分化和脂肪酸的合成。因此，含有香豆雌酚的組合物可以預(yù)防或改善肥胖，從而可以預(yù)防或改善由肥胖引發(fā)的2型糖尿病、脂肪肝、心血管
疾病等。[測試實施例2]對免疫細(xì)胞的激活效果的評估
在無菌條件下，從通過頸椎脫曰法處死的ICR小鼠體內(nèi)取出脾臟。用RPMI1640溶液清洗所述脾臟，然后用無菌玻璃棒輕輕地?fù)v碎，以分離所述小鼠脾臟細(xì)胞。將分離的細(xì)胞懸浮液通過200目不銹鋼篩網(wǎng)(Sigma化學(xué)有限公司，圣路易斯，密蘇里州，美國)，然后在4°C下采用每分鐘轉(zhuǎn)3000的50mL的離心管中離心10分鐘。將所得的細(xì)胞團在裂解緩沖液(Tris-緩沖氯化銨；0. 87%的NH4Cl,pH值為7. 2)中懸浮5分鐘，以除去紅血球。通過離心分離洗滌法用RPMI將所述細(xì)胞清洗2次后，在10%FBS的RPMI1640內(nèi)將其稀釋至5. OxlO6個/mL并接種于96孔板中，每孔90 μ L，以測定細(xì)胞增殖活性。待準(zhǔn)備完濃度為O. I或I μ M的香豆雌酚的儲備溶液向每孔中加入10 μ L后，將所述細(xì)胞培養(yǎng)44小時，然后測定脾臟細(xì) 胞的增殖活性(CCK-8,Dojindo Laboratories,日本)。將 10 μ L 的 10 μ g/mL 的 LPS 用作陽性對照組。測量相對于未處理組的每組中免疫細(xì)胞的增殖活性(％)，其結(jié)果在表I中展示。[表 I]
—I免疫細(xì)胞的增殖活性(%) ~
呆處理組100
LPS, 10 μ g/mL(陽性對照組) 275
香豆雌酉分，O. I μ M_278_
香豆雌酸，I μ M_283_
如表I所示，香豆雌酚能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，并且其效果比具有更高濃度的陽性對
照組更好。因此，所述含有香豆雌酚的組合物通過激活免疫細(xì)胞來提供增量免疫力的效果。[測試實施例3]對尼古丁的去除效果的評估
人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，CRL-2873，ATCC)是用來評估香豆雌酚對香煙中含有的主要毒性物質(zhì)尼古丁起的效果。在37°C和5%的CO2的條件下，通過使用微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基-2 (EGM-2)培養(yǎng)HUVECs。將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔2X IO4個細(xì)胞，然后在含有10% FBS的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)約24小時，直到匯合至約80%。待處理尼古丁至濃度為25mM后，除了陰性對照組，將細(xì)胞培養(yǎng)24小時至香豆雌酚變?yōu)镺. I、I或10 μ M。評估相對于未處理組的血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率(％)，其結(jié)果見表2。[表2]
I血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率(%)
未處理組_100_
陰性處理組瓦.I—
香豆雌酸,O. I μ M 67. 2_
香豆雌酸,I μ M 72. 2_
香豆雌酸，10 μ M 88. 9_
如表2所示，香豆雌酚將通過去除尼古丁來提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。因此，所述含
有香豆雌酚的組合物可以對攝入體內(nèi)的有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒，而且能預(yù)防或提高由此引起的
血管疾病。[測試實施例4]對神經(jīng)毒素的抑制效果的評估I · 從神經(jīng)毒素中保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效果的評估
SH-SY5Y細(xì)胞(CRL-2266，ATCC)是用來評估香豆雌酚從神經(jīng)毒素中保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效果。在37°C和5%的CO2的條件下，在含有90%的DMEM、10%的胎兒小牛血清、100IU/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長并匯合時，用胰蛋白酶將其分離且在96孔板中稀釋至每孔IxlO4個細(xì)胞，而后移植至培養(yǎng)皿內(nèi)。過24小時后，處理培養(yǎng)的細(xì)胞，使香豆雌酚變?yōu)镺. 01、0. I或I μ M，待2小時后，用50 μ M的6-羥多巴胺(6-OHDA)處理所述細(xì)胞，以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。只用50 μ M的6-OHDA處理過的組作為陰性對照組。待24小時后，用MTT分析法測定神經(jīng)細(xì)胞的存活率(％)，其結(jié)果在表3中展示。此夕卜，通過JC-I熒光試劑(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)測定所述細(xì)胞的線粒體膜電位。在表4中展示抑制線粒體膜電位下降的效果。[表3]
權(quán)利要求
1.用于抑制脂肪細(xì)胞分化的組合物，該組合物含有香豆雌酚，或者含有包含香豆雌酚的豆提取物，所述香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述組合物可以預(yù)防或改善肥胖、2型糖尿病和脂肪肝中的一種或多種疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述組合物可以預(yù)防或改善由肥胖引發(fā)的心血管疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述心血管疾病包括高脂血癥、高血壓、心絞痛、心肌梗塞和動脈硬化中的一種或多種疾病。
5.用于增強免疫力的組合物，該組合物含有香豆雌酚，或者含有包含香豆雌酚的豆提取物，所述香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物作為活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述組合物可以激活免疫細(xì)胞。
7.用于對有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒的組合物，該組合物含有香豆雌酚，或者含有包含香豆雌酚的豆提取物，所述香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物作為活性成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物用于對尼古丁進(jìn)行解毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物用于預(yù)防或改善由有毒物質(zhì)引起的血管疾病。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述血管疾病包括血液循環(huán)障礙、高血壓或動脈硬化。
11.用于預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病的組合物，該組合物含有香豆雌酚，或者含有包含香豆雌酚的豆提取物，所述香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物作為活性成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述組合物可以抑制神經(jīng)毒素的作用。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述神經(jīng)退行性疾病包括老年癡呆癥、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥中的一種或多種疾病。
14.根據(jù)權(quán)利要求I 13中任何一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物為食品組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求I 13中任何一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物為藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括作為有效成分的香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物，該組合物可以抑制脂肪細(xì)胞的分化、增強人體的免疫系統(tǒng)、對有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒以及預(yù)防或改善神經(jīng)退行性疾病。
文檔編號A61P3/00GK102905715SQ201180027113
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者田熙英, 申賢貞, 徐大方, 呂炫周, 李尚駿 申請人:株式會社愛茉莉太平洋