專利名稱：新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于生產(chǎn)水包油乳液(具體地，包含角鯊烯的亞微米水包油乳液)的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)水包油乳液的方法。生產(chǎn)方法公開在0tt等人，2000(The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparationmethods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine,第 42 卷，第 12章，第 211-228 頁]，Ott 等人，1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe an·dPotent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and AdjuvantApproach [Pharmaceutical Biotechnology 第6卷]Powel I 和 Newman 編，W006/10011OA I,以及 Lidgate 等人,1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion.Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)。水包油乳液經(jīng)常作為佐劑用于疫苗/免疫原性組合物中。由于這些乳液被施用給人類，因而所述乳液必須是無菌的。用作佐劑的水包油乳液是亞微米乳液，且油微滴足夠小以穿過0. 2Mffl過濾器進(jìn)行無菌過濾。本發(fā)明的一個目的是，提供一種用于生產(chǎn)水包油乳液的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)亞微米水包油乳液，尤其是包含角鯊烯的亞微米水包油乳液的方法。具體地，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)水包油乳液的方法，所述方法包括步驟a)通過在含有油相的罐中施加正壓，將油相引入混合裝置中。


圖I :乳液微滴的Z-平均直徑隨著穿過次數(shù)并在過濾以后的發(fā)展。誤差棒是標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2:乳液微滴的多分散性隨著穿過次數(shù)并在過濾以后的發(fā)展。誤差棒是標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3 :乳液在3次穿過以后的濾過率，表示為過濾能力，通過在150 cm2膜上或在1300 cm2膜上測得。誤差棒是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實施例方式通過將油相(其包含一種或多種油和任選的一種或多種表面活性劑)與包含表面活性劑的水相進(jìn)行組合和混合，制備水包油乳液。所述表面活性劑和微流態(tài)化允許形成穩(wěn)定的乳液，即不會在至少3年內(nèi)分離成油相和水相的乳液。發(fā)明人已經(jīng)證實，與通過例如膜泵引入油相而產(chǎn)生的水包油乳液相比，通過在包含油相的貯器(例如進(jìn)料罐)中施加正壓而將油相引入混合裝置中，會產(chǎn)生具有減小的多分散性、減小的微滴尺寸和提高的濾過率的水包油乳液。因此，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)水包油乳液的方法，所述方法包括步驟a):通過在含有油相的罐中施加正壓，將油相引入混合裝置中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定引入油相和/或水相時的壓力。在本發(fā)明方法的一個具體實施方案中，通過調(diào)節(jié)壓力至約2-6巴，例如約4巴至約5巴，例如4. 5巴，將油相和/或水相引入混合裝置中。為了使任意水包油組合物適合對人施用，所述油相必須包含可代謝的油(即可生 物降解的)。所述油可以是任意植物油、魚油、動物油或合成油，其對受體無毒，且能夠通過代謝進(jìn)行轉(zhuǎn)化。堅果、種子和谷物是植物油的常見來源。合成油也是合適的。因此，本發(fā)明的水包油乳液包含可代謝的油，在一個具體實施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含角鯊烯(例如約4%至6% [v/V]) ο所述油相可以包含一種或多種可代謝的油。在一個具體實施方案中，所述油相包含角鯊烯或角鯊?fù)椋绕涫墙酋徬?。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述油相包含母育酚，在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述油相包含Ct -生育酹。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述油相包含角鯊烯和α-生育酚。所述油相可以進(jìn)一步包含表面活性劑。合適的表面活性劑是技術(shù)人員眾所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)、脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)、磷脂酰膽堿(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚和辛苯昔醇-9(TRITON X-100)。在一個具體實施方案中，所述油相包含脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述油相包含角鯊烯和脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤 85)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟b):通過在含有水相的罐中施加正壓，將水相引入所述混合裝置中。在本發(fā)明的方法中使用的水相可以是水，例如注射用水(WFI)。但是，優(yōu)選地，本發(fā)明的水相包括緩沖液。合適的緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括但不限于磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、馬來酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液。在一個具體實施方案中，所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、改進(jìn)的PBS (PBS-mod)和檸檬酸鹽緩沖液。在一個具體實施方案中，所述水相包括這樣的緩沖液當(dāng)與所述油相混合時，會產(chǎn)生基本上等滲的水包油乳液。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述水相包含一種或多種本文所述的表面活性齊U。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述水相包含表面活性劑聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，水相的引入[步驟b)]和油相的引入[步驟a)]基本上同時地進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本文所述的水相和油相以約90:10或約95:5或約97. 5:2. 5或約98. 75:1. 25 (v/v百分比)的比例引入。本文使用的術(shù)語“混合裝置”是指，適用于混合油相和水相以形成乳液的裝置。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述混合裝置是高剪切混合裝置。合適的高剪切混合裝置是技術(shù)人員已知的，包括但不限于高速槳葉勻衆(zhòng)器、直列勻衆(zhòng)器(inline homogeniser)、膠體磨或聲譜顯示儀(sonolator)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述混合裝置是高壓勻漿器。合適的高壓勻漿器是技術(shù)人員已知的，包括但不限于固定幾何形狀的微射流機(jī)(microfluidiser)或可變幾何形狀的高壓勻衆(zhòng)器。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟c):混合所述油相和水相，以形成水包油乳液。在步驟c)中混合以后，如果在例如高剪切混合裝置中混合的話，所述水包油乳液可以是粗的水包油乳液。為了減小水包油乳液中的油微滴的尺寸使得它適合無菌過濾，例如，可以在例如高壓勻漿器中進(jìn)一步加工得自步驟c)的乳液。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了本文所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟d):對步驟c)的水包油乳液進(jìn)行高壓勻漿化，以形成亞微米水包油乳液。
通過改變?nèi)橐捍┻^高壓勻漿器的次數(shù)，技術(shù)人員可以實現(xiàn)所需的油微滴尺寸，因 為油微滴大小在每個循環(huán)以后都會減小。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了如本文所述的方法，其中對所述乳液進(jìn)行高壓勻漿化[步驟f)] 1、2、3、4、5、6、7、8或更多次。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述高壓勻漿化是在約10000至約20000、約12000至約18000、約14000至約16000或約15000±1000 psi的壓力進(jìn)行。在高壓勻漿化過程中，所述水包油乳液的溫度通常升高，因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，在對所述乳液進(jìn)行高壓勻漿化一次或多次以后，但是至少在最后一次以后，將所述水包油乳液冷卻至約15°C至約30°C、約16°C至約29°C、約17°C至約28°C、約16°C至約27°C、或約 16°C 至約 28 °C。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括下述步驟
e.預(yù)過濾所述水包油乳液；和
f.通過無菌級過濾器，過濾根據(jù)步驟e)濾過的水包油乳液。“無菌級過濾器”是指，在大于或等于lxlOVcm2有效過濾面積的挑戰(zhàn)水平，用微生物挑戰(zhàn)以后，產(chǎn)生無菌流出液的過濾器。無菌級過濾器是本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，且具有約0. 2Mffl的孔徑，因而包括具有約0. 22ΜΠ1孔徑的過濾器。在預(yù)過濾中使用的過濾器(即在步驟e中使用的過濾器)可以具有這樣的孔所述孔的大小范圍是從無菌級過濾器的孔徑(即約0. 至約2Mm的孔徑。在一個具體實施方案中，所述預(yù)濾器的孔徑范圍是從無菌級過濾器的孔徑至約IMffl的大小。例如，在步驟e)中使用的過濾器的孔徑是約2Mm、約2. 5Mm、約IMm、約0. 9Mm、約0. 8Mm、約0. 9Mm、約0. 7Mm、約0. 6Mm、約0. 5Mm、0. 45Mm或無菌級,例如約0. 2Mm,例如0. 22Mm。所述過濾器的膜可以由技術(shù)人員已知的任意合適的材料制成，例如，但不限于醋酸纖維素、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一個或多個或所有本發(fā)明的過濾器膜包含聚醚砜，例如親水性聚醚砜。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述亞微米水包油乳液包含約2%至約15%、約4%至約12%的油、約5%至約10%、約4%至約6%、約8%至約12%、例如約5%或10% (v/v)的油。與借助于諸如膜泵引入油相而生產(chǎn)的水包油乳液相比，本發(fā)明的方法生產(chǎn)這樣的水包油乳液其中油微滴更小，多分散性減小，和/或所述水包油乳液更容易濾過。因此，本發(fā)明提供了通過本文所述方法生產(chǎn)的水包油乳液。
本發(fā)明的水包油乳液可以用作佐劑，且可以與多種或多種抗原相組合，以生成免疫原性組合物。因此，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其包含通過本文所述方法生產(chǎn)的水包油乳液和抗原。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含i)通過本文所述方法生產(chǎn)的水包油乳液；和Qi)抗原。適用于本發(fā)明的免疫原性組合物或試劑盒中的抗原包括但不限于源自流感病毒的抗原。具體地，所述流感抗原是亞單位的或裂解的流感病毒。所述流感抗原是卵衍生的，或尤其是細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的。本發(fā)明的水包油乳液還可以包含母育酚。母育酚是本領(lǐng)域眾所周知的，且描述在EP0382271中。具體地，所述母育酚是α -生育酚或其衍生物，諸如α -生育酚琥珀酸鹽(也稱作維生素E琥珀酸鹽)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供了包含角鯊烯(例如約5% [v/v])和α -生·育酚(例如約5% [v/v])的本發(fā)明的水包油乳液。本發(fā)明的水包油乳液包含一種或多種表面活性劑。合適的表面活性劑是技術(shù)人員眾所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)、脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)、磷脂酰膽堿(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚和辛苯昔醇-9 (TRITON X-100)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)和其它表面活性劑，尤其是脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[吐溫80、聚山梨酯80])。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[吐溫80、聚山梨酯80])和任選的第二種表面活性劑(例如脫水山梨糖醇三油酸酯[司盤85])。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚)和疏水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[(吐溫80、聚山梨酯80)])或脫水山梨糖醇三油酸酯[司盤85])。本文所述的水包油乳液和免疫原性組合物適合用于藥物中，特別是用于預(yù)防和/或治療疾病。因此，提供了用于藥物中的通過本文所述的任意方法生產(chǎn)的水包油乳液或本文所述的免疫原性組合物。在另一個實施方案中，提供了用于預(yù)防和/或治療哺乳動物(尤其是人)的疾病的通過本文所述的任意方法生產(chǎn)的水包油乳液或本文所述的免疫原性組合物。在另一個實施方案中，提供了通過本文所述的任意方法生產(chǎn)的水包油乳液或本文所述的免疫原性組合物在生產(chǎn)藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療哺乳動物(尤其是人)的疾病。
在另一個實施方案中，提供了一種治療方法，所述方法包括下述步驟給哺乳動物(尤其是人)施用通過本文所述的任意方法生產(chǎn)的水包油乳液或本文所述的免疫原性組合物。在本文中與本發(fā)明的“疫苗組合物”有關(guān)的實施方案也適用于與本發(fā)明的“免疫原性組合物”有關(guān)的實施方案，反之亦然。在每種情況下，本發(fā)明人在本文中意圖任選地用術(shù)語“由……組成”、“由……構(gòu)成”分別替代術(shù)語“包含”、“包括”。與數(shù)字值z有關(guān)的術(shù)語“約”是指z±5%或10%。
實施例
方法
通過混合注射用水、磷酸鹽緩沖鹽水和吐溫，在罐2中制備水相。通過混合生育酚和角 鯊烯，在罐I中制備油相。攪拌兩相，直到得到均質(zhì)。用氮沖洗整個裝置，以避免生育酚氧化。用膜泵給高壓勻漿器供料。以需要的流量比，一起進(jìn)料兩相。首先使兩相穿過高剪切勻漿器，在這里得到粗乳液。然后，與高剪切勻漿器連通地，產(chǎn)物進(jìn)入高壓勻漿器，在這里得到細(xì)乳液。在混合裝置的出口處，將產(chǎn)物收獲在罐3中(第I次穿過)。當(dāng)罐2和I空時，將來自罐3的乳液導(dǎo)向混合裝置的入口，進(jìn)行第2次穿過。在第2次穿過結(jié)束時，將產(chǎn)物收獲在罐2中。當(dāng)罐3空時，將來自罐2的乳液導(dǎo)向混合裝置的入口，進(jìn)行第3次穿過。將乳液收犾在te 3中，并在過濾以如在氣下保減。為了評估進(jìn)料方法的影響，還在對整個裝置施加正進(jìn)料壓的情況下，進(jìn)行所述方法。為了實現(xiàn)該目的，用氮或空氣給罐加壓。結(jié)果
通過動態(tài)光散射(一種基于光漫射的方法)，測量大小。與對整個裝置施加正壓的方法相比，使用膜泵進(jìn)料的方法得到的Z-平均直徑更小。在所述方法開始時(第I次穿過)，該差異更大，但是在所述方法結(jié)束時(過濾產(chǎn)物)，該差異傾趨向于消失。另外，當(dāng)整個系統(tǒng)處于正壓下進(jìn)行進(jìn)料時，當(dāng)增加穿過次數(shù)時，尺寸的變異性也減少。當(dāng)使用膜泵時，則并非如此。參見圖I。無論進(jìn)料方法如何，多分散性是在相同范圍內(nèi)，但是，當(dāng)對整個裝置施加正壓來實現(xiàn)該方法時，再現(xiàn)性要好得多。參見圖2。與用膜泵進(jìn)料的方法相比，當(dāng)對整個裝置施加正壓來實現(xiàn)該方法時，濾過率增加，最重要的是，再現(xiàn)性提高。參見圖3。結(jié)論
通過對整個裝置施加正壓來給混合裝置供料，允許得到更小的微滴尺寸和提高的濾過率。此外，還會提高該方法的再現(xiàn)性，因為與用膜泵進(jìn)料的方法相比，得到的ZAD、PDI和濾過率的標(biāo)準(zhǔn)偏差都更小。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)水包油乳液的方法，所述方法包括步驟a):通過在含有油相的罐中施加正壓，將油相引入混合裝置中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述方法包括步驟b):通過在含有水相的罐中施加正壓，將水相弓I入所述混合裝置中。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中通過調(diào)節(jié)壓力至約2-6巴，例如約4巴至約5巴，例如4. 5巴，將所述油相和/或水相引入所述混合裝置中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中步驟a)和b)基本上同時地進(jìn)行。
5.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中以約90:10、95:5或98.75:1. 25 (v/v百分比)的比例，引入所述水相和油相。
6.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述混合裝置是高剪切勻漿器或高壓勻漿器。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項所述的方法，所述方法包括步驟c):混合所述油相和水相，以形成水包油乳液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟d):對步驟c)的水包油乳液進(jìn)行高壓勻漿化，以形成亞微米水包油乳液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟d)進(jìn)行2、3、4、5或6次。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中在約IOOOOpsi至約20000psi、約12000psi至約18000psi、約HOOOpsi至約16000psi或約15000±1000 psi進(jìn)行所述高壓勻漿化。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項所述的方法，其中在每次進(jìn)行步驟d)以后，將水包油亞微米乳液冷卻到 15°C至 30°C、16°C至 29°C、17°C至 28°C、16°C至 27°C、或 16°C至 28V。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11中任一項所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括下述步驟 e.預(yù)過濾所述水包油乳液；和 f.通過無菌級過濾器，過濾根據(jù)步驟b)濾過的水包油乳液。
13.前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含2%至8%(v/v)的油。
14.前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含4%至6%(v/v)的油。
15.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含8-12%(v/v)的油。
16.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述油相包含角鯊烯。
17.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述油相包含表面活性劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述表面活性劑是脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤 85)。
19.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述油相包含母育酚。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述母育酚是α-生育酚。
21.根據(jù)權(quán)利要求2-20中任一項所述的方法，其中所述水相包含水溶液和表面活性劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)。
23.通過根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項所述的方法生產(chǎn)的水包油乳液。
24.一種免疫原性組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求23所述的水包油乳液和抗原。
25.用于藥物中的根據(jù)權(quán)利要求23所述的水包油乳液或根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物。
26.用于預(yù)防和/或治療疾病的根據(jù)權(quán)利要求23所述的水包油乳液或根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的水包油乳液或根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物在生產(chǎn)藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療疾病。
28.一種治療方法，所述方法包括下述步驟給哺乳動物、例如人施用根據(jù)權(quán)利要求23所述的水包油乳液或根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物。
29.—種試劑盒，其包含i)根據(jù)權(quán)利要求23所述的水包油乳液；和(ii)抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的免疫原性組合物或根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述抗原源自流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)水包油乳液的方法，所述方法包括步驟a)通過在含有油相的罐中施加正壓，將油相引入混合裝置中。
文檔編號A61K39/00GK102917689SQ201180028584
公開日2013年2月6日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者V.德庫佩雷, V.曼庫索 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司