專利名稱：改進的重組人促卵泡激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促性腺激素領(lǐng)域。特別地，提供了改進的重組人促卵泡激素(rhFSH)。這種改進的rhFSH可用于不育癥的治療，特別是用于人類患者。
背景技術(shù)：
促性腺激素是一組蛋白質(zhì)激素，其調(diào)控雄性和雌性的性腺功能，因此在人類能育中起到重要作用。其是由脊椎動物腦垂體的促性腺細(xì)胞在受到促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激后分泌的。促性腺激素為異二聚體糖蛋白，包括促卵泡激素(FSH)、促黃體激素(LH)及絨毛促性腺激素(CG)。這些促性腺激素具有相同的α-亞基，但包含不同的β_亞基，后者能確保其的受體結(jié)合特異性。FSH包含一個92個氨基酸的α -亞基以及一個111個氨基酸的β-亞基，后者賦予其對FSH受體的特異性結(jié)合。所述天然蛋白質(zhì)的兩個亞基都受到糖基化修飾。α-亞基在Asn52和Asn78處而β -亞基在Asn7和Asn24處進行天然糖基化。在細(xì)胞中兩種亞基都是以前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生然后加工并分泌的。FSH調(diào)控身體的發(fā)育、生長、青春期成熟及生殖過程。特別地，其刺激生殖細(xì)胞的成熟并因此參與精子發(fā)生及卵泡發(fā)生。卵泡發(fā)生是由FSH誘導(dǎo)的，例如通過FSH對粒層細(xì)胞表面上的FSH受體的結(jié)合。FSH受體為G蛋白偶聯(lián)受體，其在FSH結(jié)合時激活偶聯(lián)的G蛋白。然后所述G蛋白進而激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cAMP——種二級信使分子的產(chǎn)生。細(xì)胞中cAMP濃度的增加激活數(shù)種下游靶標(biāo)，特別是cAMP依賴的蛋白質(zhì)激酶，后者然后引起黃體酮和雌激素的合成。黃體酮和雌激素是由粒層細(xì)胞分泌的，誘導(dǎo)卵泡發(fā)生。在粒層細(xì)胞受到FSH刺激時，其還釋放抑制素-B，這形成了一個負(fù)反饋 環(huán)，從而抑制垂體中FSH的產(chǎn)生和分泌。已有顯示抑制素B為很好替代標(biāo)記物，提示有FSH造成的卵巢刺激。FSH在對不育癥的治療中有廣泛使用，可以單獨或與其他試劑(特別是LH)組合使用。在本領(lǐng)域中，通用已經(jīng)使用了純化自絕經(jīng)期后人尿液的FSH (尿FSH)或由中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞重組產(chǎn)生的FSH用于人類治療。然而，由于存在不同異構(gòu)體，所以有極大的與不同F(xiàn)SH制備相關(guān)的異質(zhì)性。個體FSH異構(gòu)體顯示相同的氨基酸序列，但在其糖基化程度和本質(zhì)上有差異。具體的異構(gòu)體的特征在于碳水化合物支鏈結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性以及不同量的唾液酸(一種帶負(fù)電的末端單糖單元)，這二者都影響了異構(gòu)體的特異生物活性。因此，F(xiàn)SH的糖基化形式對其生物學(xué)活性有顯著的影響。然而，來自不同供體和不同制備物的尿液FSH在其碳水化合物結(jié)構(gòu)上有顯著的變化，形成高度的批-批變化?？紤]到尿液制品中病毒的存在，還存在安全問題。進一步地，獲自CHO細(xì)胞的FSH顯示的糖基化形式特異于這些倉鼠細(xì)胞，這與人類糖基化形式不相同。這些差異導(dǎo)致所獲得的FSH有變化的生物學(xué)活性及副作用，因此要施用于患者的藥用制備物也具有這些性質(zhì)。鑒于此，本發(fā)明的一個目標(biāo)就是提供改進的FSH制備物。進一步地，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供具有新型治療或藥用特征的FSH制備物。進一步地，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供具有改進的糖基化形式的FSH制備物。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)獲自人類細(xì)胞的改進的FSH制備物(優(yōu)選地，是以優(yōu)化的糖基化水平選擇的制備物)能夠以比對應(yīng)的獲自人尿液或CHO細(xì)胞的FSH制備物更低的濃度誘導(dǎo)性類固醇如雌激素和黃體酮的分泌。因此，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物具有可用于治療的驚人的特征。本發(fā)明在第一方面提供了重組的FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20%;(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30%;和/或(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30% ;和/或(iv)其為多樣的糖基化形式。在第二方面，本發(fā)明提供了重組FSH制備物，其可通過在人類細(xì)胞或人類細(xì)胞系中生產(chǎn)而獲得，特別是細(xì)胞系GT-5s (DSM ACC3078,保藏于2010年7月28日)。據(jù)發(fā)現(xiàn)在各細(xì)胞系中產(chǎn)生的FSH產(chǎn)生了改進的糖基化譜，如上文和下文所描述的。還提供了一種藥用組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的重組FSH。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物，用于治療不育癥。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物，用于不依賴于cAMP而誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌。一些實驗顯示根據(jù)本發(fā)明的FSH的低濃度效應(yīng)在特定環(huán)境中不依賴于靶標(biāo)細(xì)胞中的cAMP信號傳導(dǎo)。因此，這些實驗表明根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH制備物可在一定濃度下誘導(dǎo)性類固醇如黃體酮的分泌而不增加cAMP的分泌。因此，認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH制備物的特定實施方式能夠誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而導(dǎo)致性類固醇的分泌，所述通路不同于對通常使用的FSH制備物所描述的使用cAMP作為第二信使的已知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物用于通過不依賴于cAMP信號的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細(xì)胞的成熟。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物用于誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌的用途，在這些FSH濃度下不會誘導(dǎo)顯著的cAMP釋放。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征、優(yōu)勢及方面通過以下描述及附隨的權(quán)利要求對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。然而，要理解的是以下描述、附隨的權(quán)利要求及指出本應(yīng)用優(yōu)選的實施方式的特異實施例都只是以示例說明的方式給出。在閱讀下文后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易理解在所公開的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾。發(fā)明詳述定義如本文所使用的，以下詞語通常優(yōu)選地具有下文提出的意義，除非其使用的上下文中另有指出。如本文所使用的，詞語“包含”除了其常規(guī)意義外還包括并特異性指代詞語“基本上由……組成”及“由…… 組成”。因此，詞語“包含”指的是這樣的實施方式，其中“包含”特異性列出的元素的主題物質(zhì)不包含其他元素，還包括這樣的實施方式，其中“包含”特異性列出的元素的主體物質(zhì)可能和/或確實包含其他元素。術(shù)語“FSH”指的是促卵泡激素，一種促性腺激素。FSH為一種糖蛋白，其包含兩個亞基的糖蛋白，標(biāo)記為α和β亞基。優(yōu)選地，F(xiàn)SH為人類FSH，特別是由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的α亞基和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的β亞基組成的人類FSH。然而，在其中一個或兩個亞基中可能存在一個或多個，如I個、I或2個、多至3個、多至5個、多至10個或多至20個氨基酸的置換、添加和/或刪除。優(yōu)選地，α亞基的氨基酸序列與根據(jù)SEQ ID NO:1的氨基酸序列共有的整體同源性或同一性為至少80%、更優(yōu)選地至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。進一步地，β亞基的氨基酸序列與根據(jù)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列共有的整體同源性或相同性優(yōu)選為至少80%、更優(yōu)選地至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。所述FSH的亞基優(yōu)選地為兩條分離的多肽鏈，然而，如本文所使用的，術(shù)語“FSH”還包括這樣的實施方式，其中這兩個亞基共價地彼此相連，例如通過交聯(lián)試劑或連接多肽鏈，還包括這樣的實施方式，其中一個或兩個亞基被進一步劃分為數(shù)條多肽鏈。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的FSH能夠結(jié)合及/或激活FSH受體，優(yōu)選地為人類FSH受體。如本文所使用的，術(shù)語“FSH”具體指代制備物中的所有FSH蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語“FSH”具體指代FSH制備物或組合物中所有FSH蛋白質(zhì)的全體。
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優(yōu)選地，所述FSH蛋白質(zhì)的兩個亞基都包含一個或多個連接于多肽鏈的碳水化合物結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，這些碳水化合物結(jié)構(gòu)是連接于這些亞基的天冬氨酸殘基上的。在尤其優(yōu)選的實施方式中，ct亞基包含兩個碳水化合物結(jié)構(gòu),分別連接于Asn52和Asn78,而/或β亞基含兩個碳水化合物結(jié)構(gòu)，分別連接于Asn7和Asn24。攜帶這些碳水化合物結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基以相對于根據(jù)SEQ ID N0:1和2的相應(yīng)α和β亞基的人類氨基酸序列的方式進行標(biāo)注。人類FSH的糖部分優(yōu)選地由果糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺和/或唾液酸構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明使用的FSH優(yōu)選地為重組FSH，更優(yōu)選地為重組人類FSH。術(shù)語“重組FSH”指的是FSH并非由活的人類或動物體天然產(chǎn)生并因此獲自來源于其的樣品，如尿液、血液或其他體液、排泄物或人類或動物體的組織。優(yōu)選地，重組FSH獲自經(jīng)過生物技術(shù)工程改造的細(xì)胞，特別是以編碼FSH或者FSH的α或β亞基的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，重組FSH獲自包含編碼FSH的外源核酸的人類細(xì)胞。相應(yīng)的外源核酸可例如通過使用一種或多種表達(dá)載體而引入，其可例如經(jīng)由轉(zhuǎn)染而引入宿主細(xì)胞。用于重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)和FSH的相應(yīng)方法在在先技術(shù)中已熟知，無需其他描述。根據(jù)本發(fā)明的FSH優(yōu)選地為FSH，更優(yōu)選地為人類FSH，可通過在人類細(xì)胞，優(yōu)選地為人類細(xì)胞系中產(chǎn)生而獲得。所述人類細(xì)胞系優(yōu)選地來源于人類血細(xì)胞，特別是髓細(xì)胞系，優(yōu)選地為髓性白血病細(xì)胞系。所述細(xì)胞系優(yōu)選地是永生化的。在一個優(yōu)選的實施方式中，用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的FSH的細(xì)胞系為細(xì)胞系GT-5s (其根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議于2010年7月28日以登記號DSM ACC3078保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstraβ e7B, 38124Braunschweig(DE)),保藏人為 Glycotope GmbH, Robcrt-Rosslc-Str.10, 13125Berlin(DE))或來源于此的細(xì)胞系，或同源細(xì)胞系。GT-5s為一種永生化人類髓性白血病細(xì)胞系，能夠提供如本文所描述的特異糖基化形式。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“GT-5s”和“GT-5s細(xì)胞系”還包括來源于GT-5s的細(xì)胞或細(xì)胞系。來源于GT-5s的細(xì)胞系可例如通過隨機或特異性地從GT-5s培養(yǎng)物中選擇單一克隆或一組細(xì)胞而獲得，任選地在之前已經(jīng)對GT-5s細(xì)胞進行了增強突變率的處理，或通過遺傳改變GT-5s細(xì)胞系而獲得。所選擇的克隆或一組細(xì)胞可進一步如上文所述的方法進行處理和/或可進行其他的篩選輪。同源于GT-5s的細(xì)胞系特別是永生化人類髓細(xì)胞系。優(yōu)選地，來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系能夠提供的FSH具有的糖基化形式類似于獲自GT-5s的形式。優(yōu)選地，由來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系產(chǎn)生的FSH具有一種或多種本文所描述的糖基化特征，特別是攜帶N-平分型乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20% ;和/或攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30%;和/或2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30% ;及/或多樣的糖基化形式。根據(jù)一個實施方式，來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系能夠表達(dá)具有如本文描述的優(yōu)選糖基化形式的FSH，特別是選自表I的糖基化形式。由來源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系產(chǎn)生的FSH的類似的糖基化形式優(yōu)選地與獲自GT-5s的FSH的糖基化形式在一種或多種，優(yōu)選地為所有糖基化特性上的差異為20%或更少、更優(yōu)選地為15%或更少、10%或更少或5%或更少，所述糖基化特性選自bisGlcNAc的相對量、唾液酸化聚糖的相對量、硫酸化聚糖的相對量、2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量、果糖相對量、四天線型聚糖的相對量、攜帶半乳糖的聚糖支鏈相對量及Z數(shù)。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的FSH優(yōu)選地為FSH，更優(yōu)選地為人類FSH，其具有一種或多種本文公開的特異性糖基化特征，優(yōu)選地具有選自表I的糖基化形式。細(xì)胞系GT-5s以及由其來源的細(xì)胞系及與其同源的細(xì)胞系尤其有優(yōu)勢，因為其提供了非常穩(wěn)定和均一的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，尤其是就FSH蛋白質(zhì)而言。其具有很好的批次一致性，即，從不同生產(chǎn)運行中獲得的或以不同規(guī)模和/或用不同培養(yǎng)步驟所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)及其糖基化形式是類似的。特別地，如本文所描述的多樣的糖基化形式在使用這些細(xì)胞系表達(dá)FSH的不同生產(chǎn)運行中是高度可復(fù)制的。根據(jù)本發(fā)明的FSH是糖基化的，S卩，其是由一個或多個，優(yōu)選地為四個連接于多肽鏈的寡糖修飾的。這些寡糖，即聚糖或碳水化合物可以為線性或分支的糖鏈，并且優(yōu)選地為復(fù)合型N-連接寡糖鏈。根據(jù)寡糖的分支數(shù)，稱為單_、二 _、三-或四天線型(或甚至五天線型)。單天線型寡糖是不分支的，而二 _、三-或四天線型寡糖分別具有一個、兩個或三個分支。因此具有更多天線的糖蛋白具有更多的寡糖終點并可攜帶更多的功能性末端糖單元，如唾液酸。如本文所使用的，“至少三天線型”指的是具有至少3個天線的寡糖，包括三天線型、四天線型和五天線型寡 糖。如本文所使用的，“至少四天線型”指的是具有至少4個天線的寡糖，包括四天線型和五天線型寡糖。對于復(fù)合型N-聚糖，優(yōu)選地認(rèn)為平分型GIcNAc殘基不是分支或天線，因此不加到FSH的天線之內(nèi)。本文所指代的FSH的糖基化形式特別指的是根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物中所有FSH蛋白質(zhì)的整體糖基化形式。特別地，在糖基化形式中考慮到并反映了 FSH制備物中在FSH蛋白質(zhì)中包含并由此連接于FSH多肽鏈的任何聚糖結(jié)構(gòu)。術(shù)語“唾液酸”特別指代任何神經(jīng)氨酸的N-或O-置換衍生物。其可指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸或5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，但優(yōu)選地僅僅指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸。唾液酸，特別是5-N-乙酰神經(jīng)氨酸，優(yōu)選地通過2，3-或2，6-連接與碳水化合物鏈相連。優(yōu)選地，本文描述的FSH制備物中存在有2，3-及2，6-偶聯(lián)唾液酸二者。FSH的唾液酸化程度通常以Z數(shù)表示。Z數(shù)表示糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)上的相對負(fù)電荷。Z數(shù)是通過以下公式計算的Z=A1%*I+A2%*2+A3%*3+A4%*4
其中Al%為帶-1電荷的聚糖的百分比，A2%為帶_2電荷的聚糖的百分比，A3%為帶-3電荷的聚糖的百分比，而A4%為帶-4電荷的聚糖的百分比。這些百分比是相對連接于FSH的所有聚糖計算的，包括帶電及不帶電的聚糖。聚糖的的電荷可由聚糖中包含的任何帶電的單糖單元或置換物提供，尤其是由唾液酸殘基和/或硫酸基團和/或磷酸基團提供。由于FSH的聚糖的電荷通常只是通過其的唾液酸殘基確定而FSH通常具有四個聚糖結(jié)構(gòu)，所以Z數(shù)指示了 FSH上的唾液酸的量或FSH的酸性。然而，當(dāng)FSH還包括顯著量的硫酸聚糖時，Z數(shù)指示了唾液酸和硫酸基團的組合量。根據(jù)本發(fā)明，“聚糖的相對量”指代連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物中FSH糖蛋白的聚糖的特定百分比或百分比范圍。特別地，聚糖的相對量指的是FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物的FSH多肽鏈的所有聚糖的特定百分比或百分比范圍。100%的聚糖指的是分別連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物中的FSH糖蛋白的所有聚糖。例如，攜帶平分型GIcNAc的聚糖的相對量為60%指的是這樣的FSH制備物，其中FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH多肽鏈的所有聚糖中的60%包含平分型GIcNAc殘基，而FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH多肽鏈的所有聚糖中的40%不包含平分型GlcNAc殘基。本文給出的數(shù)值，特別是特異糖基化特性的相對量優(yōu)選地理解為近似數(shù)值。特別地，這些數(shù)值優(yōu)選地可高出或低于多至10%，特別是高出或低于多至9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 或 1%。“FSH制備物”可為任何包含或由FSH構(gòu)成的組合物或物質(zhì)。其可為固態(tài)或液態(tài)形式，可包含F(xiàn)SH之外的其他成分。特別地，F(xiàn)SH制備物可為溶液，包含F(xiàn)SH及合適溶劑如水和/或乙醇，或為例如含有FSH的溶液凍干后獲得的粉末。FSH制備物的合適實例為在細(xì)胞中表達(dá)FSH后獲得的組合物，特別是在FSH的純化之后，或包含F(xiàn)SH的藥用組合物。FSH制備物可在FSH之外含有例如溶劑、稀釋劑、輔料、穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽、佐劑和/或表面活性劑。術(shù)語“FSH制備物”在本文使用的意義特別是“包含F(xiàn)SH的組合物”。這些術(shù)語優(yōu)選地在本文以同義詞使用?！?，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量”指代為2，6-偶聯(lián)唾液酸的唾液酸的總量的特定百分比或百分比范圍。因此2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為100%意味著所有唾液酸為2，6-偶聯(lián)唾液酸。例如，2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為60%指的是這樣的FSH制備物，其中FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH蛋白質(zhì)的寡糖鏈的所有唾液酸中的60%是以2，6-連接而連接，而FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH蛋白質(zhì)的寡糖鏈的所有唾液酸中的40%不是以2，6-連接而連接，而是經(jīng)由2，3-連接或2，8-連接而連接·術(shù)語“多樣糖基化形式”特別指的是制備物或組合物中FSH蛋白質(zhì)的糖基化形式，這些糖基化形式包含多種不同的聚糖結(jié)構(gòu)。不同的聚糖結(jié)構(gòu)為寡糖結(jié)構(gòu)在至少一個寡糖單元的存在/不存在、量和/或位置及/或至少一種化學(xué)修飾例如硫酸殘基、乙酰殘基等等上有差異。特定的“不同聚糖結(jié)構(gòu)”優(yōu)選地在其相對量為糖基化形式中聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少
O.02%、更優(yōu)選地至少O. 03%、至少O. 05%、至少O. 07%、至少O. 1%、至少O. 15%、至少O. 2%、至少O. 25%、至少O. 3%或者至少O. 5%時只以這方面考慮。多樣糖基化形式特別是包含至少5種不同聚糖結(jié)構(gòu)的糖基化形式。優(yōu)選地，多樣糖基化形式包含至少7、更優(yōu)選地至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55且最優(yōu)選地至少60種不同的聚糖結(jié)構(gòu)。多樣糖基化形式特別還指代制備物或組合物中FSH的糖基化形式，所述糖基化形式包含比在相應(yīng)制備物或組合物中獲自CHO細(xì)胞的的FSH更多的不同聚糖結(jié)構(gòu)。特別地，糖基化形式比獲自CHO細(xì)胞的FSH包含的不同聚糖結(jié)構(gòu)多至少10%、優(yōu)選地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%且最優(yōu)選地至少100%。術(shù)語“核酸”包括單鏈和雙鏈核酸及核糖核酸，以及脫氧核糖核酸。其可包含天然發(fā)生的及合成的核苷酸，也可天然或人工修飾，例如有甲基化、5’ -和/或3’ -帽化。術(shù)語“載體”在本文使用的是其最通用的意義，包含核酸的任何中間媒介物，其能使得所述核酸例如引入原核及/或真核宿主細(xì)胞，并在恰當(dāng)?shù)臅r候整合入宿主細(xì)胞的基因組中。此種類型的載體優(yōu)選地在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。載體優(yōu)選地包含一種或多種選擇標(biāo)記物以選擇包含所述載體的宿主細(xì)胞。合適的選擇標(biāo)記物為抗性基因，其為宿主細(xì)胞提供例如針對特異抗生素的抗性。其他合適的選擇標(biāo)記物為例如酶類基因如DHFR或GS。使得重組蛋白質(zhì)(包括FSH)能夠表達(dá)的載體以及能夠使得重組蛋白質(zhì)在宿主中以高產(chǎn)量表達(dá)的合適的表達(dá)盒及表達(dá)元件在在線技術(shù)中已熟知，也是商業(yè)可得的，因此無需在本文進行詳細(xì)描述。術(shù)語“細(xì)胞”和“多個細(xì)胞”以及“細(xì)胞系”可交換使用，優(yōu)選地指代一種或多種哺乳動物細(xì)胞，特別是人類細(xì)胞。該術(shù)語包括細(xì)胞的子代或細(xì)胞群體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到“多個細(xì)胞”包括單一細(xì)胞的子代，而由于天然、偶然、或認(rèn)為突變和/或改變的原因，子代不必(在形態(tài)或總DNA互補物上)完全相同于起始親本細(xì)胞。“細(xì)胞”優(yōu)選地指代分離的細(xì)胞核/或培養(yǎng)的細(xì)胞，其沒有并入活的人類或動物體。術(shù)語“患者”根據(jù)本發(fā)明指的是人類、非人靈長動物或其他動物，特別是哺乳動物如奶牛、馬、豬、綿羊、山 羊、狗、貓或嚙齒動物如小鼠和大鼠。在一個具體優(yōu)選的實施方式中，患者為人類。在人類患者的情況下，F(xiàn)SH優(yōu)選地為人類FSH?；颊呖梢詾樾坌曰虼菩?，優(yōu)選地為雌性。術(shù)語“藥用組合物”特別指代適合施用于人類或動物的組合物，即含有藥用可接受組分的組合物。優(yōu)選地，藥用組合物包含活性化合物或鹽或其原藥，以及載體、稀釋劑或藥用輔料如緩沖液、防腐劑及張力調(diào)節(jié)劑。FSH的國際單位(IU)指的是人尿液FSH和LH的第四套國際標(biāo)準(zhǔn)(the fourthInternational Standard for Human Urinary FSH and LH) (Storring, P. L. &GainesDas, R. E. (2001) Journal of Endocrinology 171, 119-129)，是根據(jù)增廣卵巢增重法(aaugmented ovarian weight gain method)石角定的(Steelman, S. L. &Pohley, F. M. (1953)Endocrinology53, 604-616)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“不育癥治療”指的是對人類或動物受試者生殖或能育性相關(guān)的功能不良或疾病的治療。特別地，不育癥治療包括輔助生殖技術(shù)、排卵誘導(dǎo)、體外受精、宮腔內(nèi)人工受精以及生殖細(xì)胞成熟如卵泡發(fā)生或精子發(fā)生的實現(xiàn)或改進。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“其中未釋放顯著量的cAMP”或類似的詞語特別指的是細(xì)胞或組織釋放的cAMP的量占由以導(dǎo)致最大cAMP釋放的濃度的FSH刺激后的細(xì)胞或組織獲得的cAMP釋放量的少于25%、優(yōu)選地為少于20%、更優(yōu)選地為少于15%、少于10%、少于7. 5%、少于5%或少于2. 5%。這些細(xì)胞或組織易感或敏感于FSH的刺激,如粒層細(xì)胞或睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell)。不依賴于FSH的cAMP釋放，即在FSH不存在時也會發(fā)生的cAMP釋放不應(yīng)當(dāng)在這一方面考慮。優(yōu)選地，“釋放顯著量的cAMP”或“cAMP的顯著釋放”是高于FSH不存在時cAMP釋放的任何cAMP釋放，特別是在測量的不精確度之上的任何可檢測的cAMP釋放。用于測量cAMP釋放的標(biāo)準(zhǔn)步驟在實施例中有所描述，可用于確定顯著或不顯著的cAMP釋放?！癱AMP的釋放”指的是cAMP的細(xì)胞內(nèi)釋放及/或cAMP的細(xì)胞外釋放或分泌，優(yōu)選地只指代cAMP的分泌。cAMP指代環(huán)磷酸腺苷，其在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起第二信使分子的作用。cAMP是由腺苷環(huán)化酶從ATP合成的。“不依賴cAMP信號傳導(dǎo)”的生物學(xué)過程或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑優(yōu)選地不涉及腺苷環(huán)化酶的活化?！靶灶惞檀肌?，也稱為性腺類固醇或性激素，特別指代與脊椎動物的雄激素和雌激素受體相互作用的類固醇激素。術(shù)語“性類固醇”包括雄性激素如合成代謝類固醇、雄烯二酮、脫氫表雄酮、二氫睪丸酮和睪丸酮；雌激素如雌二醇、雌三醇和雌素酮；以及黃體酮。優(yōu)選地，性類固醇指代天然發(fā)生的性類固醇，更優(yōu)選地指代天然人類性類固醇。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的性類固醇為雌二醇和黃體酮，尤其是黃體酮。本發(fā)明根據(jù)一個方面基于的是一項發(fā)現(xiàn)，具有優(yōu)化糖基化形式的改進的重組FSH制備物能夠在低的不誘導(dǎo)顯著cAMP釋放的FSH濃度下誘導(dǎo)性類固醇如黃體酮的分泌。特別地，在此特定方面，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH在比通常所用的尿液FSH或獲自CHO細(xì)胞的重組FSH低很多的濃度下誘導(dǎo)性類固醇分泌。因此，改進的FSH可以低很多的劑量施用，這減少了副作用的風(fēng)險，并進一步降低了生產(chǎn)成本。進一步地，如果以可比的劑量施用，在此實施方式中改進的FSH比通常使用的FSH在患者體內(nèi)提供更長久的活性，因為在施用一段很長的時間后只有很低濃度的FSH留存在循環(huán)系統(tǒng)中，但是根據(jù)本發(fā)明的這個實施方式的FSH仍然發(fā)揮其生物學(xué)活性并優(yōu)選地刺激或共刺激生殖細(xì)胞成熟和/或釋放性類固醇。此夕卜，在高濃度下，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH以及通常使用的尿液或來源于CHO的FSH顯示出可比的效應(yīng)。因此，相比于通常使用的FSH，劑量過大沒有其他風(fēng)險。進一步地，本發(fā)明者已經(jīng)在獼猴中證明根據(jù)本發(fā)明的改進FSH與通常使用的尿液或來源于CHO的FSH相比具有類似甚至 較高的藥學(xué)效應(yīng)。這一點尤其意外，因為根據(jù)本發(fā)明的FSH在大鼠和猴中顯示了比獲自尿液或CHO細(xì)胞的常用FSH制備物更低的最大血清濃度(Cmax)及循環(huán)半衰期。雖然改進的FSH的生物可及性較低，但卻具有類似或更高的藥學(xué)效應(yīng)，因此可以推論根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH具有比尿液或CHO來源的FSH更高的特異性治療活性。根據(jù)所獲得的臨床數(shù)據(jù)，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH在人類中比常用FSH制備物有顯著更高的Cmax ;然而，改進的FSH的循環(huán)半衰期稍低卻也是可比的。最意外的是，根據(jù)本發(fā)明的改進FSH制備物甚至在只施用了單次劑量之后都在人類中顯示出治療效應(yīng)，特別是卵泡生長的效應(yīng)。相反，以單次劑量施用常用FSH制備物后未觀察到任何效應(yīng)。因此，預(yù)期的是以所述改進的FSH可對患者進行更精確的治療。特別地，有可能使用確切定時、定量的劑量治療并改進患者的不育癥，也可能不需要長期的連續(xù)治療。因此，也減少了多胎妊娠的風(fēng)險?？傊?，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH制備物更加有效。因此，可對患者施用較小的劑量，這引起更少的副作用，對患者更加方便也花費更少。進一步地，用改進的FSH可設(shè)計更特異和詳細(xì)的劑量方案。進一步地，減少的半衰期可減少不期望的副作用并進一步使得治療終止后FSH能更快從人體移除。不受此理論的約束，本發(fā)明的發(fā)明人推論根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物的更高的特異性治療活性是基于改進的糖基化形式。特別地，高量的平分型GIcNAc殘基和/或高量的2，6-偶聯(lián)唾液酸以及高量的硫酸化聚糖可產(chǎn)生高的活性。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物還顯示了更多樣復(fù)雜的糖基化形式，意味著相比于例如來源于CHO細(xì)胞的常規(guī)FSH制備物，所述制備物中存在更多不同的聚糖結(jié)構(gòu)。據(jù)相信，CHO來源的FSH只能在靶標(biāo)細(xì)胞中激活單一的通路，而根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH由于其由獨特的糖基化形式，顯然是經(jīng)由多種不同通路發(fā)揮其生物學(xué)活性，產(chǎn)生增加的生物學(xué)應(yīng)答。如本文實驗數(shù)據(jù)所示，這些途徑中有一些涉及cAMP信號傳導(dǎo)，而其他的新型通路是不依賴于cAMP的。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在第一個方面提供了 FSH制備物，其中制備物中的FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征⑴攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20%;(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30%;和/或(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30% ;和/或(iv)其為多樣的糖基化形式。在特定實施方式中，本發(fā)明提供了 FSH制備物，其中制備物中的FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少35%;(ii)攜帶果糖的聚 糖的相對量為至少60%;和/或(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30% ；優(yōu)選地，所述FSH為重組FSH，因此其可通過宿主細(xì)胞中的重組生產(chǎn)而獲得，后者優(yōu)選地為人類宿主細(xì)胞。合適的提供相應(yīng)糖基化形式的人宿主細(xì)胞隨后有描述。優(yōu)選地，所述糖基化形式包含特征(i)、(ii)和(iii)的至少兩種(特別是特征
(i)和(ii)、(i)和(iii)、或(ii)和(iii))，更優(yōu)選地包含全部特征(i)、(ii)和(iii)。進一步地，所述糖基化形式可進一步包含至少四天線型的聚糖，其相對量為至少15%，和/或攜帶一個或多個唾液酸殘基的聚糖，其相對量為至少80%，和/或攜帶半乳糖的聚糖，其相對量為至少95%，和/或攜帶末端半乳糖單元的聚糖分支，其相對量為至少60%，和/或攜帶硫酸基團聚糖，其相對量為至少1%，優(yōu)選地為至少2. 5%。所述末端半乳糖單元任選地進一步攜帶唾液酸殘基。所述組合物中的重組FSH優(yōu)選地具有Z數(shù)為至少200。攜帶bisGlcNAc的聚糖的相對量優(yōu)選地為至少25%、至少27%、至少30%、至少35%、至少38%或至少40%。更優(yōu)選地，其的范圍為大約25%-大約60%，特別是大約35%-大約60%的范圍或大約38%-大約50%的范圍，或大約40%-大約45%的范圍。根據(jù)一個實施方式，為大約42%。攜帶一個或多個唾液酸殘基的聚糖的相對量優(yōu)選地為至少83%、至少85%或至少88%，更優(yōu)選地為大約85%-大約98%的范圍或大約88%-大約95%的范圍，最優(yōu)選地為大約90%。Z數(shù)優(yōu)選地為至少210、更優(yōu)選地至少215、至少220、至少230或至少240。較高的Z數(shù)可例如通過在FSH制備物中富集酸性和/或負(fù)電FSH蛋白質(zhì)而獲得。優(yōu)選地，至少四天線型聚糖的相對量為至少16%、至少17%、至少18%或至少19%、更優(yōu)選地至少20%或至少21%。至少三天線型聚糖，特別是三-和四天線型聚糖的相對量優(yōu)選地為至少25%、至少30%、至少35%或至少40%、更優(yōu)選地至少45%、至少50%或至少55%。優(yōu)選地，攜帶果糖的聚糖的相對量為至少35%、至少40%、至少50%、至少60%或至少70%、更優(yōu)選地至少75%或至少78%。其可為大約70%-大約90%的范圍，特別是大約75%-大約85%的范圍。優(yōu)選地，2，6-偶聯(lián)的唾液酸的相對量為至少40%、至少45%、至少50%、至少53%、至少55%、至少60%或至少65%，特別是大約40%-大約99%的范圍，優(yōu)選地為大約40%-大約80%、大約50%-大約60%或大約53%-大約70%的范圍。優(yōu)選地，2，3-偶聯(lián)唾液酸對2，6-偶聯(lián)唾液酸的比率范圍為大約1:10-大約7:3，更優(yōu)選地為大約1:5_大約3:2或大約1:2_大約1:1，最優(yōu)選地為大約2:3-大約1:1。在優(yōu)選的實施方式中，2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量超過2，3-偶聯(lián)唾液酸的量。攜帶半乳糖的聚糖的相對量優(yōu)選地為至少97%，最優(yōu)選地為大約98%。優(yōu)選地，攜帶半乳糖單元(任選地由唾液酸殘基修飾)的聚糖分支的相對量為至少65%、更優(yōu)選地至少70%或至少73%。其優(yōu)選地范圍為大約60%-大約95%，更優(yōu)選地范圍為大約70%-大約80%。優(yōu)選地，攜帶硫酸基團的聚糖(硫酸聚糖)的相對量為至少1%、至少1. 5%、至少2%、至少2. 5%、至少3%或至少5%、更優(yōu)選地至少7%、至少10%或至少12%。根據(jù)一個實施方式，攜帶硫酸基團的聚糖的相對量不超過50%，優(yōu)選地不超過40%、35%、30%、25%或20%。在優(yōu)選的實施方式中，制備物中的FSH具有多樣糖基化形式，其中制備物中FSH包含至少45或優(yōu)選地至少50種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少O. 05%。根據(jù)一個實施方式，制備物中FSH包含至少35或優(yōu)選地至少40種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少O. 1% ;和/或制備物中FSH包含至少20或優(yōu)選地至少25中不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少
0.5%。在一個進一步的實施方式中，制備物中的FSH比相應(yīng)制備物中獲自CHO細(xì)胞的FSH包含的不同聚糖結(jié)構(gòu)多至少40%，優(yōu)選地至少50%，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有相應(yīng)制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少O. 05%,O. 1%或O. 5%。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)或可檢測量的Neu Gc。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地還不含有Galili表位(Gal α I, 3-Gal結(jié)構(gòu))或可檢測量的Galili表位。本發(fā)明特別提供了具有人類糖基化形式的FSH。由于這些糖基化特性，不存在誘導(dǎo)副作用的外源免疫原性非人結(jié)構(gòu)，這意味著避免了已知由特定外源糖結(jié)構(gòu)如免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal結(jié)構(gòu))(所述二者對于嚙齒動物生產(chǎn)系統(tǒng)也是已知的)或其他結(jié)構(gòu)如已知來自酵母系統(tǒng)的免疫原性高甘露糖結(jié)構(gòu)引起的不期望的副作用或不利之處。在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制備物中重組FSH的糖基化形式包含一種或多種，優(yōu)選地包括全部的以下特征⑴攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量范圍為大約25%-大約 50%;(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少35%;(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少53%;(iv)攜帶一個或多個唾液酸的聚糖的相對量為至少88%;以及(V)至少四天線型聚糖的相對量為至少16%.在特定的優(yōu)選實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物具有下文表I中列出的糖基化形式之一表1:特異糖基化參數(shù)
權(quán)利要求
1.重組FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征 (i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20%;和/或 ( )攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30%;和/或 (iii)2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30% ;和/或 (iv)其為多樣的糖基化形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組FSH制備物，其中糖基化形式包括特征(i)、(ii)和(iii)中至少兩項，優(yōu)選地包括全部特征(i)、(ii)和(iii)。
3.重組FSH制備物，其可通過在人細(xì)胞系GT-5s或來源于其的細(xì)胞系或同源于其的細(xì)胞系中生產(chǎn)而獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項的重組FSH制備物，其包含一種或多種以下特征 (a)糖基化形式包含攜帶一種或多種唾液酸殘基的聚糖的相對量為至少85%; (b)糖基化形式包含至少四天線型聚糖的相對量為至少18%； (c)Z數(shù)為至少200; (d)其為人重組FSH;和/或 (e)其由人細(xì)胞系或人類細(xì)胞產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項的重組FSH制備物，其中糖基化形式包含一種或多種以下特征 (i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量范圍為大約25%-大約50%; (ii)至少四天線型聚糖的相對量為至少16%； (iii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少35%； (iv)2，6-偶聯(lián)唾液酸相對量為至少53%; (v)攜帶一種或多種唾液酸殘基的聚糖的相對量為至少88%； (vi)Z數(shù)為至少220; (vii)攜帶半乳糖的聚糖的相對量為至少95%; (viii)攜帶任選地由唾液酸殘基修飾的末端半乳糖單位的聚糖分支的相對量為至少60% ； (ix)攜帶硫酸基團的聚糖的相對量為至少3%; (x)其包含至少45種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對量為制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O. 05% ； (xi)其包含至少35種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對量為制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O. 1% ； (xiii)其包含至少20種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對量為制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O. 5% ;和/或 (xiv)其包含相比于對應(yīng)制備物中獲自CHO細(xì)胞的FSH多出至少40%的不同聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對量為相應(yīng)制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O.05%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項的重組FSH制備物，其中糖基化形式包含以下特征(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量范圍為大約25%-大約50%; (ii)至少四天線型聚糖的相對量為至少16%; (iii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少35%; (iv)2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對量范圍為大約53%-大約99%;且 (v)攜帶一種或多種唾液酸殘基的聚糖的相對量為至少88%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項的重組FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有根據(jù)表I中列出的任何一個實施方式的糖基化形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的重組FSH制備物，其中所述FSH能夠 (a)以不釋放顯著量的cAMP的濃度；及/或 (b)通過誘導(dǎo)不依賴于cAMP信號傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 刺激粒層細(xì)胞中黃體酮的釋放。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項的重組FSH制備物，其中所述FSH能夠通過不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細(xì)胞成熟。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項的重組FSH制備物，其中FSH具有一種或多種以下可在粒層細(xì)胞測定中確定的特征 (a)其能夠以低于誘導(dǎo)粒層細(xì)胞釋放cAMP所需的最小濃度的濃度刺激粒層細(xì)胞中黃體酮的釋放； (b)其能夠以不誘導(dǎo)cAMP釋放或誘導(dǎo)cAMP的釋放低于10pmol/ml的FSH濃度刺激大約5*104-大約1*105粒層細(xì)胞/ml中釋放至少200ng/ml的黃體酮； (c)其能夠以低于人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細(xì)胞中的重組FSH(Gonal F)所需濃度的濃度刺激大約5*104-大約1*105粒層細(xì)胞/ml中釋放至少100ng/ml的黃體酮；及/或 (d)其能夠以人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細(xì)胞中的重組FSH(Gonal F)不產(chǎn)生相應(yīng)的黃體酮釋放的濃度刺激大約5*104-大約1*105粒層細(xì)胞/ml中釋放至少100ng/ml的黃體酮。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項的重組FSH制備物，其中FSH能夠在單次劑量施用后誘導(dǎo)雌性人類中的卵泡生長，其中所述單次劑量優(yōu)選地包含25-500IU FSH且優(yōu)選地是腸道外施用的，特別是通過皮下注射而施用。
12.藥用組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11的重組FSH制備物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于不育癥治療。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組FSH制備物或藥用組合物，其中要施用于患者的劑量使得患者循環(huán)系統(tǒng)中FSH濃度范圍為大約O. 05-大約2IU/L，優(yōu)選地為大約O.1-大約1IU/L。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于也不依賴cAMP而誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于通過不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細(xì)胞成熟。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-11的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于以不誘導(dǎo)顯著cAMP釋放的FSH濃度誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任何一項的重組FSH制備物或藥用組合物用于不育癥治療，其中不育癥的治療包括輔助生殖技術(shù)、排卵誘導(dǎo)、體外受精例如通過胞漿內(nèi)單精子注射的體外受精、配子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移、宮腔內(nèi)人工受精，對女性無卵障礙的治療、對女性卵子成熟的嚴(yán)重激素缺陷障礙的治療、對男性精子產(chǎn)生缺陷的治療和/或?qū)ι臣?xì)胞成熟如卵泡發(fā)生或精子發(fā)生的實現(xiàn)或改進，尤其是例如在體外受精刺激操作流程中和/或進行無卵障礙治療時實現(xiàn)或改進女性卵泡成熟。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-18中任何一項的重組FSH制備物或藥用組合物，其中重組FSH制備物或藥用組合物具有一種或多種以下特征 (i)其能夠在僅施用單次劑量后誘導(dǎo)卵泡生長和/或卵子成熟'及/或 (ii)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中比獲自人尿液及/或表達(dá)于CHO細(xì)胞中的FSH制備物具有更低的循環(huán)半衰期；及/或 (iii)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中比獲自人尿液及/或表達(dá)于CHO細(xì)胞中的FSH制備物具有更低的生物利用率；及/或 (iv)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中具有的治療效力與獲自人尿液及/或表達(dá)于CHO細(xì)胞中的FSH制備物類似或比其更高。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于誘導(dǎo)卵泡生長和/或卵子成熟的用途，及/或如權(quán)利要求13-19中任何一項限定的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進的FSH制備物，其能夠以比通常使用的尿液FSH或獲自CHO細(xì)胞的重組FSH低得多的濃度刺激性類固醇的釋放，且其不依賴cAMP信號傳導(dǎo)而起作用。這些改進的FSH制備物可用于不育癥的治療。
文檔編號A61K38/24GK103068839SQ201180037096
公開日2013年4月24日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者S·戈勒茲, L·施特克爾 申請人:葛萊高托普有限公司