專利名稱：用于由纖維化組織再生正常組織的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于由纖維化組織再生正常組織的組合物及方法。
背景技術(shù)：
組織的纖維化是由于以膠原為中心的細(xì)胞外基質(zhì)過剩地產(chǎn)生并蓄積在組織中而產(chǎn)生的。當(dāng)組織由于氧化應(yīng)激、低氧狀態(tài)、炎癥、凋亡等刺激而受到損傷時，雖然通過用細(xì)胞外基質(zhì)將損傷組織置換而試圖進(jìn)行修復(fù)，但當(dāng)損傷很嚴(yán)重時或者該刺激變?yōu)槁曰瘯r等，細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積變得過剩，組織無法充分地發(fā)揮其功能。纖維化在肝、胰、肺、腎、骨髓、心臟等各種臟器中可見，可以認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞等膠原產(chǎn)生細(xì)胞與疾病狀態(tài)是有關(guān)的。以往一直認(rèn)為纖維化是不可逆的現(xiàn)象，一旦發(fā)生了纖維化的組織是不會返回至原樣的，但最近有一些報告顯示了纖維化是可逆的，當(dāng)上述纖維化刺激消失時，蓄積在組織中的細(xì)胞外基質(zhì)會減少(參照非專利文獻(xiàn)I 3)。但是，并沒有關(guān)于在病態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)蓄積減少后的組織中具體地發(fā)生了什么的詳細(xì)報告，到目前為止完全不清楚在這樣的纖維化組織中發(fā)生了正常組織的再生，也完全不清楚能夠引起正常組織的再生。另外，組織的纖維化中不僅包括由于病毒感染、飲酒、藥物等所導(dǎo)致的纖維化等病因明確且能夠?qū)⑵涑サ那闆r，還包括直接病因并不清楚的纖維化、例如特發(fā)性肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性骨髄纖維化等；或者雖然直接病因清楚但其病因的原因并不清楚的情況；或者除去困難的情況、例如原發(fā)性膽汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝炎(NASH)來源的肝纖維化、原發(fā)性硬化性膽管炎等。這種病因除去困難的纖維化所存在的組織一直處于暴露在纖維化刺激下的狀態(tài)，但到目前為止完全不知道在這樣的纖維化組織中可減少病態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積，更不用說能夠?qū)⒔M織再生。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:1ssa et al. , Gastroenterology. 2004; 126 (7) : 1795-808非專利文獻(xiàn)2 :1redale, J Clin Invest. 2007; 117(3) :539-48非專利文獻(xiàn)3 :Sato et al. , Nat Biotechnol. 2008; 26 (4) : 431-4
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供用于在纖維化所存在的組織中治療性地再生正常組織的組合物及方法。用于解決技術(shù)問題的手段本發(fā)明人等為了解決上述課題持續(xù)進(jìn)行了深入研究，在此過程中發(fā)現(xiàn)即便在持續(xù)受到纖維化刺激的纖維化組織中也可減少蓄積在組織中的膠原，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)通過將蓄積于組織中的膠原除去并確保干細(xì)胞可進(jìn)行增殖分化的空間，則可以由纖維化組織再生正常的組織，從而完成了本發(fā)明。如上所述，已知在纖維化刺激消失時，蓄積在組織中的細(xì)胞外基質(zhì)能夠減少，但到目前為止完全不清楚在持續(xù)受到纖維化刺激的纖維化組織中可以使蓄積在組織中的膠原減少，也完全不清楚通過將蓄積在組織中的膠原積極地除去而可以由纖維化組織再生正常組織，因而這是令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。(I) 一種用于由纖維化組織再生正常組織的藥物組合物，其含有膠原減少物質(zhì)。( 2 )上述(I)所述的藥物組合物，其中，膠原減少物質(zhì)選自抑制利用膠原產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行膠原產(chǎn)生的物質(zhì)、促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)以及抑制膠原分解阻礙物質(zhì)的物質(zhì)。( 3 )上述(I)或(2 )所述的藥物組合物，其進(jìn)一步含有針對纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑。( 4)上述(3 )所述的藥物組合物，其中，靶向劑為類視黃醇。(5)上述(I) (4)中任一項所述的藥物組合物，其中，纖維化組織持續(xù)地受到纖維化刺激。(6)上述(I) (5)中任一項所述的藥物組合物，其用于在通過減少蓄積于纖維化組織中的膠原而產(chǎn)生的干細(xì)胞的增殖和分化用的空間內(nèi)由纖維化組織再生正常組織。(7)上述(2) (6)中任一項所述的藥物組合物，其中，抑制利用膠原產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行膠原產(chǎn)生的物質(zhì)選自TGF β阻礙物質(zhì)、HGF或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、PPAR Y配體、血管緊張素阻礙物質(zhì)、PDGF阻礙物質(zhì)、松弛肽或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、阻礙細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生和分泌的物質(zhì)、細(xì)胞活性抑制物質(zhì)、細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)以及凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)。(8)上述(2) (6 )中任一項所述的藥物組合物，其中，促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)為膠原酶或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)。(9)上述(2) (6)中任一項所述的藥物組合物，其中，抑制膠原分解阻礙物質(zhì)的物質(zhì)為TIMP阻礙物質(zhì)。發(fā)明效果由本發(fā)明可知，能夠由之前認(rèn)為不會發(fā)生正常組織再生的纖維化組織再生正常組織。由此，使得能夠由纖維化組織治療性地再生正常組織，使得纖維化疾病的新型再生治療成為可能。另外，通過本發(fā)明，使持續(xù)地受到纖維化刺激的纖維化組織的治療變得可能，使包括以往不存在有效治療方法的纖維化疾病或者僅有臟器移植的治療方法的纖維化疾病在內(nèi)的所有纖維化疾病的內(nèi)科治療得以實現(xiàn)，因而對醫(yī)療和動物醫(yī)療可期待巨大的貢獻(xiàn)。


圖1為表示由受試大鼠采集的肝臟的整體外觀及其代表性切片的偶氮卡紅染色圖像的照片圖。圖2為表示由受試大鼠采集的肝臟的代表性切片中a -SMA的局部存在的照片圖。圖3為表示肝干細(xì)胞移植部位上的DAPI和GFP的局部存在的熒光圖像。圖4為肝干細(xì)胞移植部位的明視野圖像和GFP熒光圖像。圖5Α為對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與GFAP抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖(倍率為200倍)。
圖5B為對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與GFAP抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖(倍率為400倍)。圖6為以200倍倍率對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與a -SMA抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖。圖7為以200倍倍率對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與白蛋白抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖。圖8為以倍率200倍對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與CK19抗體所形成的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖。圖9A為對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與ve_CAD抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖(倍率為200倍)。圖9B為對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與ve_CAD抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖(倍率為400倍)。圖10為以200倍倍率對VA-1ip siRNAgp46投予組的未移植肝干細(xì)胞的部位的DAP1、GFP的熒光圖像與白蛋白抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的照片圖。圖11為表示大鼠胰腺星狀細(xì)胞中經(jīng)FAM標(biāo)記的siRNA的細(xì)胞內(nèi)分布的熒光圖像。圖12為表示與攝入到大鼠胰腺星狀細(xì)胞中的siRNA有關(guān)的FACS分析的結(jié)果的圖表。由上開始依次分別表示未處理組、LipsiRNAgp46_FAM處理組、VA-1ip siRNAgp46-FAM + RBP 抗體處理組、Lip siRNAgp46_FAM + RBP 抗體處理組的結(jié)果。圖13為表示由siRNAgp46所產(chǎn)生的大鼠胰腺星狀細(xì)胞中g(shù)p46的表達(dá)抑制的Western blot圖像。A表示 由VA-1ip siRNAgp46的濃度不同所導(dǎo)致的抑制效果的差異，B表示抑制效果的持續(xù)時間。圖14為對未處理細(xì)胞以及分別用VA-1ip siRNAgp46和VA-1ip siRNArandom進(jìn)行了處理的細(xì)胞的72小時后的膠原產(chǎn)生量進(jìn)行了定量的圖表。圖15為表示VA-1ip siRNAgp46向DBTC處置大鼠的胰腺星狀細(xì)胞的特異性傳遞的照片圖。A和B為分別用VA-1ip siRNAgp46-FITC和Lip siRNAgp46_FITC每隔I天處置3次的大鼠的胰腺切片的抗a -SMA抗體和抗FITC抗體的免疫染色圖像。右側(cè)的a d的染色圖像是用對應(yīng)于左側(cè)染色圖像的符號表示的區(qū)域的放大圖像。C為用VA-1ip siRNAgp46-FITC每隔I天處置3次的大鼠的肝臟切片的利用偶氮卡紅-Mallory染色、抗a -SMA抗體染色或抗FITC抗體染色所獲得的染色圖像。D F為用抗CD68抗體或抗FITC抗體將靜脈內(nèi)投予了 VA-1ip siRNAgp46-FITC的24小時后的大鼠的肺、脾臟和視網(wǎng)膜進(jìn)行了染色的染色圖像。圖16 為表示 DBTC 處置后第 14 天投予了 VA-lip siRNAgp46 (siRNA 為 O. 75mg/kg)的大鼠的VA-lip siRNAgp46投予后第0、1、2、3和4天的胰腺中的gp46蛋白質(zhì)的表達(dá)的圖。A表示胰腺細(xì)胞破碎物的Western blotting的結(jié)果，B表示用β-肌動蛋白進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的定量性濃度分析的結(jié)果。圖17為表示DBTC誘導(dǎo)性胰纖維化中VA-lip siRNAgp46的效果的圖。A表示投予了 10次VA-lip siRNAgp46、Lip siRNAgp46或PBS后的DBTC處置大鼠的胰腺切片的偶氮卡紅-Mallory染色圖像。B為利用計算機(jī)圖像分析對A的偶氮卡紅-Mallory染色圖像中顯示陽性的區(qū)域進(jìn)行了定量的圖表。數(shù)據(jù)是由各組6只大鼠隨機(jī)抽取的6個視野進(jìn)行計算，用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。C為表示胰腺中的羥脯氨酸的含量的圖表。數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差來表不。圖18為表示DBTC誘導(dǎo)性胰纖維化中VA-lip siRNAgp46的效果的圖。A表示VA-lip siRNAgp46處置后的DBTC處置大鼠的胰腺的a-SMA染色圖像。B為利用計算機(jī)圖像分析對A中的a-SMA陽性區(qū)域進(jìn)行了定量化的圖表。數(shù)據(jù)是由各組6只大鼠隨機(jī)抽取的6個視野進(jìn)行計算，用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。圖19為表示利用VA-lip siRNAgp46由纖維化胰組織再生正常組織的圖。A為向DBTC處置大鼠投予10次VA-lip siRNAgp46 (右)和Lip siRNAgp46 (左)后的胰腺的蘇木素-伊紅染色圖像。下圖分別為上圖的a和b區(qū)域的放大圖。B為表示DBTC處置大鼠的胰腺重量的圖表。圖20為表示干細(xì)胞周圍的空間的有無對干細(xì)胞的分化所造成的影響的圖表。縱軸表示白蛋白陽性集落的面積。圖21為表示干細(xì)胞周圍的空間的有無對干細(xì)胞的增殖所造成的影響的圖表?？v軸表示干細(xì)胞的增殖率的指標(biāo)。
具體實施例方式本發(fā)明涉及含有膠原減少物質(zhì)的用于由纖維化組織再生正常組織的組合物。本發(fā)明中“膠原減少物質(zhì)”是指可減少蓄積在組織中的膠原的量的任意物質(zhì)。雖然并不是說要限于特定的理論，但可以認(rèn)為纖維化組織中的膠原蓄積的原因之一是膠原的產(chǎn)生和分解的平衡偏向于產(chǎn)生一側(cè)，因此膠原減少物質(zhì)不僅包含抑制膠原產(chǎn)生的物質(zhì)，還可包含促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)和對阻礙促進(jìn)膠原分解物質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)行抑制的物質(zhì)。因此，作為膠原減少物質(zhì)并無限定，例 如可舉出抑制利用膠原產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行膠原產(chǎn)生的物質(zhì)、促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)、抑制膠原分解阻礙物質(zhì)的物質(zhì)等。本發(fā)明中的膠原并無特別限定，優(yōu)選與纖維化有關(guān)的膠原、例如1、II1、V型膠原等，特別優(yōu)選在纖維化組織中最大量存在的I型膠原。本發(fā)明中，膠原產(chǎn)生細(xì)胞是指在纖維化組織中產(chǎn)生膠原的任意細(xì)胞，并無限定，例如包含活化星狀細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等?；罨菭罴?xì)胞和肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是纖維化組織中主要的膠原產(chǎn)生源，特征是a-SMA(a平滑肌肌動蛋白)的表達(dá)。因此，本發(fā)明中的活化星狀細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞可通過使用了經(jīng)可檢測地標(biāo)記的抗a -SMA抗體的免疫染色等來進(jìn)行鑒定。抑制利用膠原產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行膠原產(chǎn)生的物質(zhì)包含直接或間接地抑制與纖維化組織中的膠原蓄積有關(guān)的該細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生理性作用等的任意藥物，并無限定，例如包含TGFP (Transforming growth factor-beta,轉(zhuǎn)化生長因子β )阻礙物質(zhì)、HGF(Hepatocyte growth factor,肝細(xì)胞生長因子)或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、PPAR Y (Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,過氧化物酶體增殖物激活受體Y )配體、血管緊張素阻礙物質(zhì)、PDGF (Platelet-derived growth factor,血小板衍生生長因子)阻礙物質(zhì)、松弛肽或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、阻礙細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生和分泌的物質(zhì)、細(xì)胞活性抑制物質(zhì)、細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)、凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)等。
作為TGFP阻礙物質(zhì)并無限定，例如可舉出剪切型TGFP II型受體(Qi etal. , Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96 (5) : 2345-9)、可溶性 TGF β II 型受體(George etal. ,Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96 (22) : 12719-24)、抗 TGF β 抗體等 TGF β 活性阻礙物質(zhì)、或針對TGFii的RNAi分子、核酶、反義核酸等TGFii產(chǎn)生阻礙物質(zhì)、表達(dá)這些物質(zhì)的載體、以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。本發(fā)明的一個方式中，TGFP阻礙物質(zhì)阻礙TGF^ I的活性和/或產(chǎn)生。作為HGF或松弛肽的產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)并無限定，例如可舉出編碼HGF或松弛肽的核酸、包含其的表達(dá)構(gòu)建物、包含它們的表達(dá)載體以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。作為PPARy配體并無限定，例如可舉出15-脫氧-Λ 12，14-前列腺素J2、硝基亞油酸、氧化LDL (Low density lipoprotein,低密度脂蛋白)、長鏈脂肪酸、類花生酸等內(nèi)源性配體、曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮、巴格列酮、來格列酮等噻唑烷二酮系藥劑、非甾體類抗炎藥等外源性配體等。作為血管緊張素阻礙物質(zhì)并無限定，例如可舉出替米沙坦、氯沙坦、纈沙坦、坎地沙坦酯、奧美沙坦酯、厄貝沙坦等血管緊張素受體拮抗物質(zhì)等。血管緊張素包括血管緊張素1、I1、III和IV。另外，作為血管緊張素受體并無限定，例如可舉出血管緊張素I型受體(ATI)等。作為PDGF阻礙物質(zhì)并無限定，例如可舉出抗TOGF抗體等TOGF活性阻礙物質(zhì)、針對TOGF的RNAi分子、核酶、反義核酸等TOGF產(chǎn)生阻礙物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。作為阻礙細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生和分泌的物質(zhì)并無限定，例如可舉出抑制膠原、葡糖胺多糖、肌腱蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)的RNAi分子、核酶、反義核酸等物質(zhì)，或者顯性負(fù)突變體等具有顯性負(fù)效應(yīng)的物質(zhì)、表達(dá)它們的 載體、以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。作為阻礙膠原的產(chǎn)生和分泌的藥物并無限定，例如可舉出作為在各種類型的膠原合成過程中通用的細(xì)胞內(nèi)輸送和分子成熟化所必需的膠原特異性分子伴侶的HSP (Heat shock protein,熱休克蛋白)47的阻礙物質(zhì)，例如針對HSP47的RNAi分子、核酶、反義核酸等HSP47表達(dá)阻礙物質(zhì)、或者HSP47的顯性負(fù)突變體等具有顯性負(fù)效應(yīng)的物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。作為細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)并無限定，例如可舉出烷基化劑(例如異環(huán)磷酰胺、尼莫司汀、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、美法侖、雷莫司汀等)、抗腫瘤性抗生素(例如伊達(dá)比星、表柔比星、道諾霉素、阿霉素、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、米托蒽醌、絲裂霉素C等)、代謝拮抗劑(例如吉西他濱、依諾他濱、阿糖孢苷、喃氟啶·尿嘧啶、替吉奧配伍劑、去氧氟尿苷、羥基尿素、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巰嘌呤等)、依托泊苷、伊立替康、長春瑞濱、多西他賽、紫杉醇、長春新堿、長春地辛、長春花堿等生物堿、以及卡鉬、順鉬、奈達(dá)鉬等鉬絡(luò)合物、洛伐他汀、辛伐他汀等他汀等。作為細(xì)胞活性抑制物質(zhì)并無限定，例如可舉出鈉離子通道阻礙物質(zhì)等。作為凋亡誘導(dǎo)劑并無限定，例如可舉出COmpOUnd861、膠霉毒素、阿托伐他汀等。作為促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)并無限定，例如可舉出各種膠原酶或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)等。作為膠原酶的例子并無限定，例如可舉出MMP (Matrix metalloproteinase,基質(zhì)金屬蛋白酶)1、2、3、9、13、14等MMP家族等。作為膠原酶的產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)并無限定，例如可舉出編碼膠原酶的核酸、含有其的表達(dá)構(gòu)建物、含有它們的表達(dá)載體以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。作為阻礙促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)的物質(zhì)并無限定，例如可舉出TIMP (Tissueinhibitor of metalloproteinase,金屬蛋白酶組織抑制劑，TIMPl和TIMP2等)。因此，作為阻礙該物質(zhì)的物質(zhì)并無限定，例如可舉出抗TIMP的抗體等TIMP活性阻礙物質(zhì)、針對TIMP的RNAi分子、核酶、反義核酸等 ΜΡ產(chǎn)生阻礙物質(zhì)、表達(dá)它們的載體、以及用它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的細(xì)胞等。本發(fā)明的RNAi 分子中還包含 siRNA(小干擾 RNA, small interfering RNA)>miRNA(微 RNA, micro RNA)、shRNA (短發(fā)夾 RNA, short hairpin RNA)、ddRNA (DNA 指導(dǎo) RNA,DNA-directed RNA)、piRNA (Piwi 相互作用 RNA, Piw1-1nteracting RNA)> rasiRNA (重復(fù)相關(guān)小干擾RNA,repeat associated siRNA)等RNA以及它們的修飾體。另外，本發(fā)明中的核酸包含RNA、DNA、PNA或它們的復(fù)合物。本發(fā)明中“纖維化組織”是指以膠原為中心的細(xì)胞外基質(zhì)比正常更多地蓄積的組織。作為細(xì)胞外基質(zhì)，除了膠原之外并無限定，例如可舉出葡糖胺多糖、肌腱蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、彈性蛋白等。蓄積于組織中的膠原的量例如可以以組織中的羥脯氨酸的量為指標(biāo)、或者通過對組織實施膠原染色(例如馬松三色染色、偶氮卡紅染色、天狼星紅染色、E. V. G染色等)并進(jìn)行圖像解析等來定量化。本發(fā)明的纖維化組織中的細(xì)胞外基質(zhì)的量與正常組織相比可以為5%以上、10%以上、25%以上、50%以上、100%以上、200%以上、300%以上、400%以上或500%以上。由于認(rèn)為利用活化星狀細(xì)胞和/或肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行的膠原產(chǎn)生有助于組織的纖維化，因此本發(fā)明的纖維化組織典型地含有活化星狀細(xì)胞和/或肌成纖維細(xì)胞。纖維化組織只要具有上述特征則可以是體內(nèi)的任何組織，并無限定，例如包含肝、胰、肺、腎、骨髄、聲帶、喉頭、口腔、心臟、脾臟、縱膈、后腹膜、子宮、皮膚、乳腺、腸道等。

因此，纖維化組織可以是各種臟器纖維化的患部。作為臟器纖維化的例子并無限定，例如可舉出肝纖維化、肝硬化、聲帶瘢痕形成、聲帶粘膜纖維化、喉頭的纖維化、肺纖維化、胰纖維化、骨髄纖維化、心肌梗塞、心肌梗塞后的心肌纖維化、心肌纖維化、心內(nèi)膜心肌纖維化、脾纖維化、縱膈纖維化、舌粘膜下纖維化、腸道纖維化(例如伴隨炎癥性腸疾病的腸道纖維化等)、后腹膜纖維化、子宮纖維化、硬皮病、乳腺纖維化等。本發(fā)明中的肝纖維化和肝硬化不僅包含由于B型和C型肝炎病毒等病毒感染、飲酒、脂肪肝、寄生蟲感染、先天性代謝異常、肝毒性物質(zhì)等所導(dǎo)致的肝纖維化和肝硬化，還包含原因未被特定的肝纖維化和肝硬化。因此，本發(fā)明中的肝硬化并無限定，例如包含Charcot肝硬化、Todd肝硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、單葉性肝硬化、繼發(fā)性膽汁性肝硬化、阻塞性肝硬化、膽細(xì)管性肝硬化、膽汁性肝硬化、萎縮性肝硬化、營養(yǎng)性肝硬化、壞死后性肝硬化、肝炎后肝硬化、結(jié)節(jié)性肝硬化、混合型肝硬化、小結(jié)節(jié)性肝硬化、代償性肝硬化、大結(jié)節(jié)性肝硬化、中隔性肝硬化、特發(fā)性肝硬化、非代償性肝硬化、門靜脈周圍性肝硬化、門靜脈性肝硬化、酒精性肝硬化等。本發(fā)明中，肺纖維化不僅包含狹義的肺纖維化，還包含包括與間質(zhì)性肺炎并存的廣義肺纖維化。本發(fā)明中的肺纖維化可以是由于任意的間質(zhì)性肺炎、例如伴有病毒性肺炎、真菌性肺炎、支原體性肺炎等的感染性間質(zhì)性肺炎，伴有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性硬皮病、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、混合結(jié)締組織病(MCTD, Mixed connective tissue disease)等膠原病的間質(zhì)性肺炎，伴有放射線暴露的間質(zhì)性肺炎，由于博來霉素等抗癌劑、小柴胡湯等中藥、干擾素、抗生素、百草枯等所導(dǎo)致的藥劑性間質(zhì)性肺炎，特發(fā)性肺纖維化、非特異性間質(zhì)性肺炎、急性間質(zhì)性肺炎、特發(fā)性器質(zhì)性肺炎、呼吸性細(xì)支氣管炎相關(guān)間質(zhì)性肺病、脫屑性間質(zhì)性肺炎、淋巴細(xì)胞間質(zhì)性肺炎等特發(fā)性間質(zhì)性肺炎等所引起的，因此包含這些間質(zhì)性肺炎發(fā)生慢性化的病癥。本發(fā)明中，骨髄纖維化不僅包含原發(fā)性骨髄纖維化，還包含二次性骨髄纖維化。二次性骨髄纖維化并無限定，包含急性骨髄性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性骨髄性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥等疾病或者繼發(fā)于放射線照射等的疾病。本發(fā)明中的腎纖維化可以是由于任意的間質(zhì)性腎炎、例如伴有鏈球菌腎炎、葡萄球菌腎炎、肺炎球菌性腎炎、水痘、B型肝炎、C型肝炎、HIV等的病毒性腎炎，瘧疾等由寄生蟲感染導(dǎo)致的腎炎，伴有真菌性腎炎、支原體性腎炎等的感染性間質(zhì)性腎炎，伴有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(狼瘡腎炎)、全身性硬皮病(膠原病的腎病變)、干燥綜合征等膠原病的間質(zhì)性腎炎，紫斑病性腎炎、多發(fā)性動脈炎、快速進(jìn)行性腎小球腎炎等伴有血管的免疫疾病的腎炎，伴有放射線暴露的間質(zhì)性腎炎，由金制劑、NSAIDs、青霉胺、博來霉素等抗癌劑、抗生素、百草枯等導(dǎo)致的藥劑性間質(zhì)性腎炎，由于昆蟲的刺傷、花粉、漆樹科的植物等導(dǎo)致的過敏性腎炎，伴有腎淀粉樣變、糖尿病性腎病、慢性腎小球腎炎、惡性腎硬化癥、多發(fā)性嚢胞腎病等的腎炎，尿細(xì)管間質(zhì)性腎炎、伴有妊娠中毒癥或癌癥的腎炎、膜增生性腎小球腎炎、IgA腎病、混合型冷球蛋白血癥腎炎、肺出血腎炎綜合征腎炎、韋格納肉芽腫性腎炎、急性間質(zhì)性腎炎等特發(fā)性間質(zhì)性腎炎等引起，因此包含這些間質(zhì)性腎炎發(fā)生慢性化的病癥。本發(fā)明的一個方式中，纖維化組織持續(xù)地受到纖維化刺激。本發(fā)明中，纖維化刺激是指誘導(dǎo)纖維化的任意刺激，并無限定，例如包含氧化應(yīng)激、低氧狀態(tài)、炎癥、凋亡等(參照Ghiass1-Nejad et al. , Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2 (6) : 803-16)。作為這樣的組織，例如可舉出發(fā)生 慢性炎癥的纖維化組織、不斷暴露于細(xì)胞障礙性物質(zhì)的組織(例如由于膽管疾病等引起膽汁淤積的肝組織)等。另外，這樣的組織還包含直接病因不清楚的纖維化、例如特發(fā)性肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性骨髄纖維化等，或者雖然清楚直接的病因但其病因的原因并不清楚的纖維化，或者除去困難的纖維化、例如原發(fā)性膽汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝炎(NASH)來源的肝纖維化、原發(fā)性硬化性膽管炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎來源的肺纖維化、原發(fā)性骨髄纖維化、特發(fā)性間質(zhì)性腎炎來源的腎纖維化、炎癥性腸疾患(例如克羅恩病、潰瘍性大腸炎等)、全身性硬皮病等中患病的組織等。本發(fā)明中“由纖維化組織再生正常組織”是指使由于纖維化而發(fā)生變質(zhì)的組織至少恢復(fù)到纖維化更為輕度的狀態(tài)。即，隨著纖維化的發(fā)展，組織被置換成以細(xì)胞外基質(zhì)為中心的纖維組織，而逆轉(zhuǎn)該趨勢、將增生的纖維組織置換成本來的正常組織即為本發(fā)明的由纖維化組織再生正常組織。因此，本發(fā)明的由纖維化組織再生正常組織不僅包含使纖維化組織完全地恢復(fù)至原本狀態(tài)，還包含使纖維化組織部分地恢復(fù)至原本狀態(tài)。正常組織的再生程度可利用活檢試樣等的組織學(xué)檢查，根據(jù)組織結(jié)構(gòu)的正?；?、纖維組織所占區(qū)域的縮小、正常組織所占區(qū)域的擴(kuò)大等進(jìn)行評價，當(dāng)在利用本組合物進(jìn)行處置之前可見纖維化所導(dǎo)致的生物化學(xué)指標(biāo)的異常時，也可通過該指標(biāo)的改善等進(jìn)行評價。本發(fā)明的一個方式中，正常組織的再生還可以是通過在由于蓄積于纖維化組織中的膠原減少而產(chǎn)生的空間內(nèi)干細(xì)胞發(fā)生增殖和分化從而發(fā)生的再生。因此，本發(fā)明的一個方式涉及用于在通過減少蓄積于纖維化組織中的膠原而生成的干細(xì)胞的增殖和分化用的空間內(nèi)由纖維化組織再生正常組織的上述藥物組合物。這里，干細(xì)胞并無限定，例如包含在已經(jīng)纖維化的組織中本來存在的干細(xì)胞(肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、肺干細(xì)胞、腎干細(xì)胞、骨髄干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、脾臟干細(xì)胞、子宮干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、乳腺干細(xì)胞、腸道干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等)或從體內(nèi)的其他位置移動而來的干細(xì)胞、以及治療性投予的干細(xì)胞等。另外，“空間”不僅包含組織內(nèi)的空隙，還包含具有細(xì)胞可擴(kuò)大和增殖的余地的空間、例如減少了細(xì)胞間壓力的空間或具有柔軟性的空間等。本發(fā)明的組合物在其一個方式中進(jìn)一步包含針對纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑。通過含有靶向劑，能夠?qū)⒁阅z原產(chǎn)生細(xì)胞為靶的膠原減少物質(zhì)、例如阻礙細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生和分泌的物質(zhì)、HGF或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、MMP或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、TIMP阻礙物質(zhì)、TGFP產(chǎn)生阻礙物質(zhì)、松弛肽或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)等(但對其并無限定)特異性地送達(dá)至作為靶細(xì)胞的膠原產(chǎn)生細(xì)胞中，可以提高所使用的膠原減少物質(zhì)的效果。本發(fā)明的一個方式中，針對膠原產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑為類視黃醇。利用類視黃醇的革巴向化機(jī)制雖尚未完全清楚，但可以認(rèn)為是例如與RBP(Retinol binding protein,視黃醇結(jié)合蛋白)特異性結(jié)合的類視黃醇介由位于纖維化組織中膠原產(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞表面上的某種受體而被攝入到該細(xì)胞內(nèi)。類視黃醇可作為靶向膠原產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑發(fā)揮功能的事實記載于W02006/068232、日本特開2009-221164、日本特開2010-59124等中。類視黃醇是具有4個類異戊二烯單元頭對尾式地連接而成的骨架的化合物群中的 I 員(參照 G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,，，2ndEd. Portland Press, pp. 247-251 (1992))，維生素A是定性地表示視黃醇的生物學(xué)活性的類視黃醇的通常描述符號。作為本發(fā)明中可使用的類視黃醇并無特別限定，例如可舉出視黃醇(包含全反式視黃醇)、視 黃醛、視黃酸(包含維甲酸)、視黃醇與脂肪酸的酯、脂肪族醇與視黃酸的酯、依曲替酯(也稱為阿維A酯)、異維甲酸、阿達(dá)帕林、阿維A、他扎羅汀、棕櫚酸視黃醇酯等類視黃醇衍生物、以及芬維A胺(4-HPR)、蓓薩羅丁等維生素A類似物。其中，從特異性地將物質(zhì)送達(dá)至纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞的送達(dá)效率的方面出發(fā)，優(yōu)選視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸的酯(例如視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇硬脂酸酯和視黃醇月桂酸酯等)和脂肪族醇與視黃酸的酯(例如維甲酸乙酯
-rf* ) O包含類視黃醇的順式-反式的所有異構(gòu)體都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。類視黃醇還會被I個或2個以上的取代基取代。本發(fā)明的類視黃醇當(dāng)然包含經(jīng)分離的狀態(tài)的類視黃醇，還包含溶解或混合在能夠?qū)⑵淙芙饣虮３值慕橘|(zhì)中的狀態(tài)的類視黃醇。本發(fā)明的組合物的上述方式可以僅由作為有效成分的以膠原產(chǎn)生細(xì)胞為靶的膠原減少物質(zhì)和作為靶向劑的類視黃醇構(gòu)成，還可含有與它們不同的其他的載體構(gòu)成成分。作為本方式的載體構(gòu)成成分并無特別限定，可以使用在醫(yī)藥和/或藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任意物質(zhì)，優(yōu)選至少可包含類視黃醇或者能夠與其結(jié)合的物質(zhì)。
作為這種成分，可舉出脂質(zhì)，例如甘油磷脂等磷脂、鞘磷脂等鞘脂類、膽固醇等固醇、大豆油、罌粟油等植物油、礦物油、蛋黃卵磷脂等卵磷脂類、聚合物等，但并不限定于這些。其中，優(yōu)選可構(gòu)成脂質(zhì)體的物質(zhì)，例如卵磷脂等天然磷脂，二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)等半合成磷脂，二油?；字Ｒ掖及?DOPE )、二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC )、膽固醇等。作為特別優(yōu)選的成分，可舉出能夠避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲的成分，例如^(0-三甲基銨乙?；?-雙十二烷基-0-氯化谷氨酸(丁獻(xiàn)6)4^’’4’’’-四甲基州，N，，N”，N，，，-四棕櫚基精胺(TMTPS)、2，3-二油酰氧基-N-[2 (精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨(D0SPA)、N-[1- (2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(D0TMA)、雙十八烷基二甲基氯化銨(D0DAC)、雙十二烷基溴化銨(DDAB)、1，2-二油酰氧基-3-三甲銨基丙烷(DOTAP)、3i3-[N- (N’，N’- 二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol )、1，2- 二肉豆蘧酰氧基丙基-3- 二甲基羥基乙基銨(DMRIE)、0，O’ -雙十四?；?N- ( α-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等陽離子性脂質(zhì)。上述載體還可具有特定的3維結(jié)構(gòu)。作為該結(jié)構(gòu)并無限定，可舉出直鏈狀或支鏈狀的線狀結(jié)構(gòu)、膜狀結(jié)構(gòu)、球狀結(jié)構(gòu)等。因此，載體并無限定，可舉出膠束、脂質(zhì)體、乳液、微小球、納米小球等任意的3維形態(tài)。類視黃醇和/或有效成分在載體上的結(jié)合或包含可通過利用化學(xué)和/或物理的方法使類視黃醇結(jié)合或包含于載體來進(jìn)行?；蛘?，類視黃醇和/或有效成分在載體上的結(jié)合或包含還可通過將類視黃醇和/或有效成分與載體構(gòu)成成分進(jìn)行混合來實施。本發(fā)明的組合物中的類視黃醇的量例如可以為O. 01 IOOOnmol/μ1、優(yōu)選為O.1 IOOnmol/μ I。另夕卜，本發(fā)明的組合物中的有效成分的量例如可以為I IOOOOng/μ1、優(yōu)選為10 IOOOng/μ I，或者可以為I 1000000 μ g/kg體重、優(yōu)選為10 100000 μ g/kg體重。類視黃醇或有效成分的量根據(jù)這些成分的活性或組合物的投予路徑、投予頻率、投予對象等，還有成為上述范圍外的情況，但此情 況仍然包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。類視黃醇和/或有效成分在載體上的結(jié)合或包含還可以在將有效成分擔(dān)載于該載體之前進(jìn)行，還可通過同時混合載體構(gòu)成成分、類視黃醇和有效成分等來進(jìn)行，或者可通過將已經(jīng)擔(dān)載有有效成分的狀態(tài)的載體與類視黃醇混合等來進(jìn)行。因此，本發(fā)明還涉及用于由纖維化組織再生正常組織的藥物組合物的制造方法，其包含使類視黃醇結(jié)合在現(xiàn)有的任意的藥物結(jié)合于載體或藥物封裝載體、例如DaunoXome 、Doxil、Caelyx 、Myocet 等脂質(zhì)體制劑的工序。本發(fā)明的組合物的形態(tài)只要是能夠?qū)⑺璧挠行С煞诌\(yùn)送至作為靶的纖維化組織的膠原產(chǎn)生細(xì)胞中，則可以是任一種形態(tài)，例如并無限定地可以是高分子膠束、脂質(zhì)體、乳液、微小球、納米小球等中的任一種形態(tài)。本發(fā)明中，從運(yùn)送效率高、可運(yùn)送的物質(zhì)的選項寬或制劑的容易性等觀點出發(fā)，優(yōu)選其中的脂質(zhì)體的形態(tài)，其中特別優(yōu)選含有陽離子性脂質(zhì)的陽離子性脂質(zhì)體。當(dāng)組合物為脂質(zhì)體的形態(tài)時，類視黃醇與脂質(zhì)體構(gòu)成脂質(zhì)的摩爾比如果考慮到類視黃醇在載體上的結(jié)合或包含的效率性時，優(yōu)選為8 :1 1:4、更優(yōu)選為4 I 1:2。本發(fā)明的組合物可以在內(nèi)部含有有效成分，還可以有效成分附著在外部，還可以與有效成分相混合。因此，本發(fā)明的組合物可以采取脂質(zhì)體與有效成分的復(fù)合體、即復(fù)合物的形態(tài)，還可根據(jù)投予路徑或藥物釋放模式等用適當(dāng)?shù)牟牧?、例如腸溶性包衣或定時崩解性材料將上述組合物包覆，還可組裝到適當(dāng)?shù)乃幬镝尫畔到y(tǒng)中。含有類視黃醇作為靶向劑時，其在本組合物中以作為靶向劑發(fā)揮功能的形態(tài)存在。這里，作為靶向劑發(fā)揮功能是指含有類視黃醇的組合物比不含類視黃醇的組合物更為迅速和/或大量地到達(dá)和/或被攝入到作為靶細(xì)胞的纖維化組織的膠原產(chǎn)生細(xì)胞中，這可通過例如將帶有標(biāo)記或含有標(biāo)記的組合物添加至靶細(xì)胞的培養(yǎng)物中，在規(guī)定時間后對標(biāo)記的存在部位進(jìn)行分析來容易地確認(rèn)。從結(jié)構(gòu)上來說，只要例如類視黃醇最晚在到達(dá)靶細(xì)胞之前、至少部分地露出在組合物的外部，則可滿足上述要件。類視黃醇是否露出至組合物的外部可以通過使組合物與特異性結(jié)合類視黃醇的物質(zhì)、例如視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)等相接觸、調(diào)查在組合物上的結(jié)合來進(jìn)行評價。使類視黃醇最晚在到達(dá)靶細(xì)胞之前、至少部分地露出在組合物的外部例如可以通過調(diào)節(jié)類視黃醇與載體構(gòu)成成分的配比等來達(dá)成。另外，作為載體利用脂質(zhì)體等脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體時，例如在對脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體和類視黃醇進(jìn)行復(fù)合體化時，使用首先將脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體稀釋在水性溶液中、接著將其與類視黃醇相接觸、混合等的手法。此時，類視黃醇還可處于溶解在溶劑、例如DMSO等有機(jī)溶劑中的狀態(tài)。這里，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)體是指具有任意的3維結(jié)構(gòu)、例如線狀、膜狀、球狀等形狀的含有脂質(zhì)作為構(gòu)成成分的結(jié)構(gòu)體，并無限定地包含脂質(zhì)體、膠束、脂質(zhì)微小球、脂質(zhì)納米小球、脂質(zhì)乳液等。例如，在Zhao and Lee, Adv Drug DelivRev.2004;56 (8):1193-204、Temming et al. , Drug Resist Updat. 2005;8(6):381-402 等中記載了也可將同樣對脂質(zhì)體進(jìn)行靶向化的靶向劑適用于其他的藥物載體。本發(fā)明的組合物除了膠原減少物質(zhì)以外，還可進(jìn)一步含有減少纖維化刺激的物質(zhì)作為有效成分，還可與該物質(zhì)進(jìn)行并用。作為減少纖維化刺激的物質(zhì)并無限定，例如可舉出抗氧化劑、血液循環(huán)促進(jìn)劑、抗炎劑、抗病毒劑、抗生素、抗寄生蟲劑、護(hù)肝劑、利膽劑、凋亡抑制物質(zhì)等。這些物質(zhì)可根據(jù)成為對象的組織或病態(tài)來適當(dāng)選擇。本發(fā)明的組合物還可含有標(biāo)記。通過標(biāo)記化，可以監(jiān)測能否運(yùn)送至靶細(xì)胞或者監(jiān)測靶細(xì)胞的增減等，不僅在試驗和研究水平上有用，在臨床水平上也有用。標(biāo)記可以從本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任意物質(zhì) 、例如任意的放射性同位素、磁性體、結(jié)合于標(biāo)記化物質(zhì)的物質(zhì)(例如抗體)、熒光物質(zhì)、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和酶等中選擇。標(biāo)記在將本發(fā)明組合物的構(gòu)成成分的至少I個、例如類視黃醇作為靶向劑含有時，可以附于有效成分、類視黃醇和載體構(gòu)成成分的I個或2個以上，還可以作為與它們不同的其他成分含有在組合物中。本發(fā)明中“纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞用”或“纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞運(yùn)送用”是指適于將纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞作為靶細(xì)胞使用，其包含例如能夠比其他細(xì)胞例如正常細(xì)胞更為迅速、高效和/或大量地將物質(zhì)運(yùn)送至該細(xì)胞中。例如，纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞用的載體或纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞運(yùn)送用的載體能夠?qū)⒂行С煞忠耘c其他細(xì)胞相比為1.1倍以上、1. 2倍以上、1. 3倍以上、1. 5倍以上、2倍以上、進(jìn)而3倍以上的速度和/或效率運(yùn)送至纖維化組織的膠原產(chǎn)生細(xì)胞中。本發(fā)明的組合物通過含有針對纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑，可以制成纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞用或纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞運(yùn)送用的組合物。本發(fā)明的組合物可以作為藥品使用(即藥物組合物)，包含經(jīng)口和非經(jīng)口這兩者在內(nèi)的各種路徑并無限定，例如可以通過經(jīng)口、經(jīng)腸、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、肝內(nèi)、膽管內(nèi)、肺內(nèi)、氣道內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)鼻、直腸內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、骨髄內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腦內(nèi)、髄液腔內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)和子宮內(nèi)等路徑進(jìn)行投予，還可制成適于各投予路徑的劑型。這樣的劑型和制劑方法可以適當(dāng)采用任意的公知劑型和制劑方法(例如參照標(biāo)準(zhǔn)藥劑學(xué)，渡邊喜照等編，南江堂，2003年等)。例如作為適于經(jīng)口投予的劑型并無限定，可舉出散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、液齊U、混懸劑、乳劑、凝膠劑、糖漿劑等，作為適于非經(jīng)口投予的劑型，可舉出溶液性注射劑、混懸性注射劑、乳濁性注射劑、用時調(diào)制型注射劑等注射劑。非經(jīng)口投予用制劑可以是水性或非水性的等滲性無菌溶液或混懸液的形態(tài)。本發(fā)明的組合物可以以任一種形態(tài)供給，但從保存穩(wěn)定性的觀點出發(fā)，可以以能夠用時調(diào)制的形態(tài)、例如在醫(yī)療現(xiàn)場或其附近可由醫(yī)師和/或藥劑師、護(hù)士或其他的輔助醫(yī)務(wù)人員等調(diào)制的形態(tài)來提供。此時，本發(fā)明的組合物以在其中含有至少I個必需構(gòu)成要素的I個或2個以上的容器的形式提供，在使用前、例如24小時前以內(nèi)、優(yōu)選3小時前以內(nèi)、更優(yōu)選在馬上要使用前進(jìn)行調(diào)制。在調(diào)制時，可適當(dāng)使用在進(jìn)行調(diào)制的場所處通?？色@得的試劑、溶劑、調(diào)劑器具等。因此，本發(fā)明還涉及包含單獨(dú)或組合含有有效成分和/或任意的靶向劑或載體構(gòu)成物質(zhì)的I個或2個以上容器的組合物的調(diào)制試劑盒、以及以這種試劑盒的形態(tài)提供的組合物的必要構(gòu)成要素。本發(fā)明的試劑盒除了上述之外，還可含有與本發(fā)明組合物的調(diào)制方法或投予方法等有關(guān)的說明書或CD、DVD等電子記錄介質(zhì)等。另外，本發(fā)明的試劑盒可含有用于完成本發(fā)明組合物的所有構(gòu)成要素，但并非必須含有所有的構(gòu)成要素。因此，本發(fā)明的試劑盒也可不含在醫(yī)療現(xiàn)場或?qū)嶒炘O(shè)施等中可通常獲得的試劑或溶劑、例如無菌水或生理鹽水、葡萄糖溶液等。本發(fā)明還涉及用于由纖維化組織再生正常組織的方法，其包含將本發(fā)明的組合物或膠原減少物質(zhì)的有效量投予至需要其的對象的工序。這里，有效量例如是指抑制纖維化組織中的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的量增大的量、優(yōu)選為減少細(xì)胞外基質(zhì)的量的量、更優(yōu)選為在纖維化組織中引起正常組織的再生的量。

細(xì)胞外基質(zhì)的量可通過各種手法、例如并無限定地利用細(xì)胞外基質(zhì)的特殊染色圖像的圖像解析或細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物的測定等來進(jìn)行定量。例如，膠原可通過測定羥脯氨酸等膠原標(biāo)記物的量、或?qū)M織實施膠原染色(例如馬松三色染色、偶氮卡紅染色、天狼星紅染色、E. V. G染色等)并進(jìn)行圖像解析等來進(jìn)行定量。纖維化組織中的細(xì)胞外基質(zhì)的減少率與未投予本發(fā)明組合物的情況相比，例如可以為10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、進(jìn)而75%以上。這里，未投予本發(fā)明組合物時，不僅包括不進(jìn)行投予本身的情況，還包括僅投予媒介物介質(zhì)、投予除了不含效成分以外與本發(fā)明組合物相當(dāng)?shù)慕M合物、在本發(fā)明的組合物含有靶向劑時投予除了不含靶向劑以外與本發(fā)明組合物相當(dāng)?shù)慕M合物等情況(所謂的陰性對照)。另外，正常組織的再生可通過組織學(xué)觀察或?qū)⒔?jīng)標(biāo)記的干細(xì)胞投予至纖維化組織并對其進(jìn)行追蹤調(diào)查等來進(jìn)行評價。上述有效量優(yōu)選不會發(fā)生超過投予所帶來的利益的不良影響的量。該量可通過使用培養(yǎng)細(xì)胞等的體外(in vitro)試驗、或利用小鼠、大鼠、狗或豬等模型動物的試驗來適當(dāng)決定，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這樣的試驗方法。另外，本發(fā)明的方法中所用藥物的用量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的或者可利用上述試驗等適當(dāng)決定。作為纖維化的模型動物，可利用四氯化碳(CCl4)、豬血清、二甲基亞硝胺(DMN)、蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(MCDD )、伴刀豆球蛋白A (Con A)、膽管結(jié)扎等制得的肝硬化模型、利用博來霉素(BLM)等制得的肺纖維化模型、利用二丁基二氯化錫等制得的胰纖維化模型、促血小板生成素(TPO)轉(zhuǎn)基因小鼠(LeukemiaResearch29: 761-769, 2005)等骨髄纖維化模型等各種模型。本發(fā)明的方法中投予的組合物或膠原減少物質(zhì)的具體用量可以考慮與需要處置的對象有關(guān)的各種條件、例如癥狀的嚴(yán)重程度、對象的一般健康狀態(tài)、年齡、體重、對象的性另IJ、飲食、投予的時期和頻率、并用的藥品、對治療的反應(yīng)性以及對治療的依從性等來決定。作為投予路徑，包括包含經(jīng)口和非經(jīng)口這兩者的各種路徑、例如經(jīng)口、經(jīng)腸、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、肝內(nèi)、膽管內(nèi)、肺內(nèi)、氣道內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)鼻、直腸內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、骨髄內(nèi)、淋巴節(jié)內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腦內(nèi)、髄液腔內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)和子宮內(nèi)等路徑。投予頻率根據(jù)所用組合物的性狀或上述的對象條件的不同而不同，例如可以為I天多次(即I天2、3、4次或5次以上)、1天I次、數(shù)天I次(即每2、3、4、5、6、7天I次等)、1周數(shù)次(例如I周2、3、4次等)、每周I次、每數(shù)周I次(即每2、3、4周I次等)。本發(fā)明的方法中，用語“對象”是指任意的生物個體，優(yōu)選動物、更優(yōu)選哺乳動物、進(jìn)一步優(yōu)選人的個體。本發(fā)明中，對象可以是健康的，也可以是患有任意疾病的，典型地是指具有纖維化組織或者具有組織發(fā)生纖維化的風(fēng)險的對象。作為這樣的對象，例如并無限定地可舉出患有上述臟器纖維化或有患上上述臟器纖維化的風(fēng)險的對象、組織受到纖維化刺激或者具有受到纖維化刺激的風(fēng)險的對象等。本發(fā)明還涉及用于由纖維化組織再生正常組織的方法，其包含減少纖維化組織中的膠原的工序和/或在纖維化組織中生成細(xì)胞增殖和分化用的空間的工序。本方法中，纖維化組織中的膠原的減少和細(xì)胞增殖和分化用空間的生成可通過將本發(fā)明的組合物或上述的膠原減少物質(zhì)投予至纖維化組織來進(jìn)行。

實施例通過以下的例子更為詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些不過是示例，絕不是限定本發(fā)明。以下的例子中，數(shù)據(jù)以平均值(土標(biāo)準(zhǔn)偏差)來表示。對照組和與其他組的多個比較通過Dunnett檢驗來進(jìn)行。例1. VA-lip siRNA 的調(diào)制(I) siRNA 的調(diào)制以作為膠原(I IV型)的通用分子伴侶的人HSP47的大鼠同源物、gp46(GenBankAccession No. M69246)的喊基序列為祀的 siRNA(北海道 System Science, Sapporo, Japan)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)褂靡韵碌逆湣 GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG (從gp46的堿基序列上的第757個堿基開始的正義鏈siRNA，序列號I)B GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU (反義鏈 siRNA，序列號 2)作為siRNArandom (siRNA 隨機(jī)組,有時也稱作 siRNAscramble (siRNA 零亂對照組))使用以下者。C CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (正義鏈 siRNA，序列號 3)D GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (反義鏈 siRNA，序列號 4)在有幾個實驗中使用了 6’ -羧基熒光素(6-FAM)或異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合在5，末端的正義鏈。這些序列經(jīng)確認(rèn)，在BLAST檢索中與已知的其他的大鼠mRNA沒有同源性。(2) VA-lip siRNA 的調(diào)制作為陽離子性脂質(zhì)，從北海道System Science (Sapporo, Japan)購入以4 3 3的摩爾比含有0，O’-雙十四?；?N- ( α -三甲基銨基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)、膽固醇和二油?；字Ｒ掖及?DOPE)的陽離子性脂質(zhì)體(LipoTrust)。脂質(zhì)體在使用前通過在攪拌條件下在經(jīng)冷凍干燥的脂質(zhì)混合物中添加重蒸水(DDW)而調(diào)制成ImM (DC-6-14)的濃度。為了調(diào)制VA結(jié)合脂質(zhì)體，將溶解于DMSO的200nmol的維生素A (視黃醇，Sigma,USA)與脂質(zhì)體混懸液(以DC-6-14計為IOOnmol)在1. 5ml管中一邊攪拌一邊在25°C下混合。為了調(diào)制擔(dān)載siRNAgp46的VA結(jié)合脂質(zhì)體(VA_lip-siRNAgp46)，將siRNAgp46溶液(DDff中為580pmol/ml)—邊攪拌一邊在室溫下添加至視黃醇結(jié)合脂質(zhì)體溶液中。siRNA與DC-6-14的摩爾比為1:11。為了獲得在體外(in vitro)的使用中所優(yōu)選的用量，用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)再次構(gòu)成VA-lip siRNA。例2.利用肝纖維化模型大鼠的再生治療實驗(I)肝纖維化模型大鼠的制作肝纖維化模型大鼠是通過對雄性SD大鼠(體重為150 200g) (Sic Japan,Shizuoka, Japan)實施總膽管結(jié)扎來制作,將結(jié)扎后第28天的個體供于本實驗。本模型大鼠中，由于總膽管結(jié)扎而發(fā)生膽汁的淤積，肝組織成為持續(xù)暴露在纖維化刺激下的狀態(tài)。(2) GFP標(biāo)記大鼠肝干細(xì)胞的調(diào)制GFP標(biāo)記大鼠肝干細(xì)胞由4周齡的GFP轉(zhuǎn)基因大鼠(Sic Japan)的肝臟采集。首先，向GFP轉(zhuǎn)基因大鼠灌流EGTA溶液和膠原酶溶液后，采集肝臟，將所采集的肝臟切碎后，用細(xì)胞篩網(wǎng)(孔徑為100 μ m)進(jìn)行過濾。向所得細(xì)胞混懸液添加Hanks平衡鹽液(HBSS) +0. 25%牛血清白蛋白(BSA)溶液，在4°C、500rpm下離心2分鐘。采集上清，在4°C、1300rpm下離心5分鐘。將上清除去后，在沉淀中添加MACS (Magnetic Activating Cell Sorting)緩沖液(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)進(jìn)行混合。對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)后,使用FITC結(jié)合小鼠抗⑶45抗體(BD Pharmingen)、兔多克隆抗⑶133抗體(Abcam)和小鼠單克隆抗EpCAM抗體(Santa Cruz)進(jìn)行MACS ，采集CD 133陽性、EpCAM陽性、CD45陰性細(xì)胞，作為大鼠肝干細(xì)胞用于本實驗。(3)肝纖維化模型大鼠的處置將(2)中調(diào)制的GFP標(biāo)記肝干細(xì)胞在200 μ I的DME/F12培養(yǎng)基中以2X IO6個的濃度局部移植至(I)中制作的肝纖維化模型大鼠中。從肝干細(xì)胞移植后第24個小時開始，每隔I天尾靜脈投予維生素A結(jié)合脂質(zhì)體內(nèi)包 siRNAgp46 (VA-lip siRNAgp46)或作為空白對照的 VA-lip siRNAscramble,共計投予12次。所投予的siRNA的濃度相對于大鼠體重以0. 75mg/kg來使用。維生素A與脂質(zhì)體(LipoTrust,北海道 System Science, Sapporo, Japan)與 siRNA 的摩爾比為 11. 5 :11. 5 :1。(4)組織染色

在(3)中的第12次VA-lip siRNAgp46投予結(jié)束的24小時后(即總膽管結(jié)扎后第52天)，采集移植了 GFP表達(dá)肝干細(xì)胞的總膽管結(jié)扎大鼠的肝臟。使用OCT復(fù)合物對所采集的肝臟進(jìn)行包埋后制作凍結(jié)切片。用4%多聚甲醛固定肝臟切片。切片的一部分通過常規(guī)方法供至偶氮卡紅染色。切片的其他一部分用帶有5%山羊血清的PBS實施封閉，用PBS洗滌后，使用小鼠單克隆抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Sigma)、小鼠單克隆抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維性酸性蛋白質(zhì)(GFAP)抗體(Sigma)、兔多克隆抗白蛋白抗體(MP Biomedicals)、小鼠單克隆抗CK19抗體(Novocastra)或小鼠單克隆抗血管內(nèi)皮f丐粘著蛋白(ve_CAD, VascularEndothelial Cadherin)抗體(Santa cruz)在 4°C下反應(yīng)一晚。用 PBS 洗漆后，使 Alexa555標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體或Alexa555標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(均為Invitrogen)在室溫下反應(yīng)60分鐘。用PBS洗漆后,使用ProLongwGold with DAPI (Invitrogen)進(jìn)行封片,用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。切片的一部分與a-SMA抗體(Dako)反應(yīng)后，代替與山羊抗兔抗體的反應(yīng)，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)使其顯色，然后用蘇木精進(jìn)行核染色。益果圖1表示由受試大鼠采集的肝臟的外觀及其代表性切片的偶氮卡紅染色圖像。在投予了 VA-lip siRNAscramble的組中,肝臟萎縮,表面不規(guī)整,在組織中大范圍可見在偶氮卡紅染色圖像中被染成藍(lán)色的細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積，肝小葉結(jié)構(gòu)也混亂。與此相對，在投予了VA-lip siRNAgp46的組中，未見外觀上的萎縮，表面光滑，在組織中幾乎未見細(xì)胞外基質(zhì)的蓄積，與VA-lip siRNAscramble投予組相比,可見纖維化區(qū)域的明顯縮小。另外，明確地可見恢復(fù)了肝血竇由中心靜脈呈放射狀行走的正常肝小葉結(jié)構(gòu)。圖2為C1-SMA抗體的DAB染色圖像。藍(lán)色的部分表示用蘇木精進(jìn)行了染色的核，深褐色部分是a-SMA陽性區(qū)域。a-SMA作為活化星狀細(xì)胞的標(biāo)記物是已知的，認(rèn)為在α-SMA陽性區(qū)域存在活化星狀細(xì)胞。在VA-lip siRNAgp46投予組中，與VA-1ipsiRNAscramble相比,可見顯著的活化星狀細(xì)胞的減少。圖3為GFP標(biāo)記肝干細(xì)胞移植部位的DAPI和GFP的熒光圖像。在VA-1ipsiRNAgp46投予組中約80%的區(qū)域內(nèi)可見GFP的顯色,而VA-lip siRNAscramble投予組中幾乎未觀察到。圖4為GFP標(biāo) 記肝干細(xì)胞移植部位的明視野圖像和GFP熒光圖像。在VA-1ipsiRNAscramble投予組中，特別是由于細(xì)胞外基質(zhì)在血管周圍等的沉積，因此細(xì)胞的形狀模糊，肝血竇也胡亂的行走，與此相對，在VA-lip siRNAgp46投予組中可見清楚的細(xì)胞形狀和由中心靜脈呈放射狀行走的肝血竇結(jié)構(gòu)。另外，VA-lip siRNAscramble投予組中未見GFP的顯色，而VA-lip siRNAgp46投予組中，遍及整個組織可見GFP的顯色。圖5為對VA-lip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與GFAP抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的圖(圖5A為200倍倍率，圖5B為400倍倍率)。GFAP是作為休眠狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞的標(biāo)記物已知的蛋白質(zhì)。表達(dá)GFAP的細(xì)胞不表達(dá)GFP。圖6為以200倍倍率對VA-lip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與a-SMA抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的圖。表達(dá)a-SMA的細(xì)胞不表達(dá)GFP。圖5和6的結(jié)果表明肝星狀細(xì)胞并非來源于肝干細(xì)胞。圖7為以200倍倍率對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與白蛋白抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的圖。白蛋白是肝實質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，表達(dá)GFP的細(xì)胞大多表達(dá)白蛋白。圖8為以200倍倍率對VA-1ip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與CK19抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的圖。CK19是膽管上皮細(xì)胞的標(biāo)記物，構(gòu)成膽管的CK19陽性細(xì)胞表達(dá)GFP。圖9為對VA-lip siRNAgp46投予組的DAP1、GFP的熒光圖像與ve_CAD抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的圖(圖9A為200倍倍率，圖9B為400倍倍率)。ve-CAD作為血管上皮細(xì)胞的標(biāo)記物是已知的，在表達(dá)GFP的細(xì)胞的一部分中觀察到了表達(dá)ve-CAD的細(xì)胞。圖10為以200倍倍率對VA-lip siRNAgp46投予組的未進(jìn)行細(xì)胞移植的部位的DAPI, GFP的熒光圖像與白蛋白抗體的熒光染色圖像進(jìn)行了比較的圖。未進(jìn)行細(xì)胞移植的部位上未觀察到GFP表達(dá)細(xì)胞。由于表達(dá)GFP的細(xì)胞 是來自所移植的肝干細(xì)胞的細(xì)胞，因此通過VA-1ipsiRNAgp46的投予，在細(xì)胞移植部位處隨著纖維化區(qū)域的縮小，肝干細(xì)胞向肝實質(zhì)細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞分化，由此表明了正常的肝臟組織得以再生。即可知利用VA-lip siRNAgp46投予進(jìn)行的治療不僅治愈了肝纖維化，還誘發(fā)了肝再生。另外，在VA-1ipsiRNAscramble投予組中未能檢測到肝干細(xì)胞(圖3),這表明由VA-lip siRNAgp46導(dǎo)致的纖維化區(qū)域的縮小與肝干細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)。例3.利用VA進(jìn)行星狀細(xì)胞的特異性運(yùn)送(1)大鼠胰腺星狀細(xì)胞(PSC)的分離按照現(xiàn)有報道(Apte et al. Gutl998; 43:128-133)，使用濃度梯度離心分離法分離出大鼠胰腺星狀細(xì)胞(PSC)。純度通過顯微鏡觀察、內(nèi)源性VA的自身熒光和使用了抗作為肌肉肌動蛋白交聯(lián)蛋白的結(jié)蛋白的單克隆抗體(1:25，Dako)的免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行分析。細(xì)胞的活力通過臺盼藍(lán)排斥進(jìn)行分析。細(xì)胞純度和活力均大于95%。細(xì)胞在添加有10%胎牛血清(FBS)的伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基(Iscove，s modified Dulbecco，smedium IMDM)中于37°C、95%大氣/5%C02的加濕環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。(2) VA-lip siRNAgp46-FAM 的細(xì)胞內(nèi)分布分析將大鼠pPSC (初代胰腺星狀細(xì)胞，primary PSC)按照每腔室達(dá)到I X IO4個的方式接種在Lab-Tek腔室蓋玻片上。向細(xì)胞中添加VA-lip siRNAgp46_FAM或LipsiRNAgp46-FAM以使最終siRNA濃度達(dá)到50nM。將細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)30分鐘，將培養(yǎng)基更換成新鮮的培養(yǎng)基。在處理后30分鐘和2小時時，用PBS洗滌細(xì)胞3次，用4%的多聚甲醛在25°C下處理15分鐘進(jìn)行固定。固定后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，暴露于ProLongwGold with DAPI (Invitrogen) I 分鐘,進(jìn)行核染色。使用突光顯微鏡(Keyence, BZ-8000)分析FAM標(biāo)記siRNAgp46的細(xì)胞內(nèi)局部存在。(3) VA-1ip siRNAgp46-FAM 的 FACS 分析在10%FBS 的存在下用 VA-lip siRNAgp46_FAM (50nM 的 siRNA)處理大鼠 pPSC(I X IO4個)，培養(yǎng)30分鐘。為了進(jìn)行封閉分析，在添加VA-lipsiRNAgp46-FAM前，用小鼠抗 RBP 抗體(10 μ g/ml, BD Pharmingen)或作為陰性對照的小鼠 IgG1 (10 μ g/ml, Dako )對 I X IO4 個的細(xì)胞處理 30 分鐘。使用 FACScalibur with CellQuest software (BectonDickinson)對VA-lip siRNAgp46_FAM處理細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)進(jìn)行分析。(4) Western blotting為了評價siRNAgp46的基因抑制效果,進(jìn)行Western blotting實驗。具體地說,用4/20SDS-聚丙烯酸胺凝膠對用 VA-lip siRNAgp46 (1ηΜ、5ηΜ、50ηΜ)、VA-lip-siRNArandom(50nM)和Lip-siRNAgp46 (50nM)分別處理了 30分鐘的PSC的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)印至硝化纖維素膜上，利用抗HSP47 (gp46)的抗體(Stressgen)或抗β -肌動蛋白的抗體(Cell Signaling)進(jìn)行探測后,標(biāo)記過氧化物酶結(jié)合抗體(Oncogene Research Product,Boston, MA)作為二抗。最終，利用 ECL Western blotting 檢測系統(tǒng)(Amersham LifeScience, Arlington Heights, IL)將細(xì)胞可視化。另外，為了確認(rèn)gp46的表達(dá)抑制的持續(xù)時間，用VA-lip siRNAgp46 (50nM)對PSC處理30分鐘后，在培養(yǎng)了 24小時、48小時、72小時和96小時后提取蛋白質(zhì)，與利用VA-lip-siRNArandom (50nM)處理后30分鐘的樣品一起，與上述同樣地進(jìn)行Westernblotting 實驗。(5)膠原產(chǎn)生的定量以在含10%FBS的DMEM中5 X IO4個/孔的密度將大鼠pPSC接種于6孔組織培養(yǎng)板中。培養(yǎng) 24 小時后，利用 VA-lip siRNAgp46(50n]\^3siRNA)*VA-lip siRNArandomC50nM的siRNA)對大鼠pPSC進(jìn)行處理。在含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘，之后將培養(yǎng)基更換成新鮮的培養(yǎng)基。在處理72小時后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，按照現(xiàn)有報道(Williamset al. Gut2001; 49:577-583)用天狼星紅(Biocolor，Belfast, UK)對沉降在孔內(nèi)的膠原進(jìn)行染色。將未結(jié)合的染料洗滌除去，將結(jié)合復(fù)合體溶解在0. 5%的氫氧化鈉中。通過540nm的吸光光度分析對膠原進(jìn)行定量，將結(jié)果用相對于未處理對照的百分比來表示。MS圖11為表示經(jīng)FAM標(biāo)記的siRNA的細(xì)胞內(nèi)分布的熒光圖像。左側(cè)2個為用VA-1ipsiRNAgp46-FAM進(jìn)行了處理的PSC的熒光圖像，右側(cè)2個為用Lip siRNAgp46_FAM進(jìn)行了處理的PSC的熒光圖像。上面2個為分別處理30分鐘后的圖像，下面2個為處理2小時后的圖像。VA-lip siRNAgp46-FAM中，在處理后30分鐘時在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到模糊的顆粒狀圖案的FAM的綠色熒光，在處理 后2小時時在核周邊區(qū)域觀察到更濃的顆粒狀圖案。與其相比，在Lip siRNAgp46-FAM處理組中，在處理后30分鐘時未觀察到綠色熒光，處理后2小時時核周邊的熒光是模糊的。圖12為表示FACS分析的結(jié)果的圖表。從上開始依次分別表示未處理組、LipsiRNAgp46-FAM 處理組、VA-lip siRNAgp46_FAM 處理組、VA-lip siRNAgp46_FAM + RBP 抗體處理組、Lip siRNAgp46-FAM + RBP抗體處理組的結(jié)果。FACS分析的結(jié)果是，在VA-1ipsiRNAgp46-FAM + RBP抗體處理組中，與VA-1ip siRNAgp46_FAM處理組相比，熒光強(qiáng)度被抑制至與Lip siRNAgp46_FAM處理組相同的水平,這表明VA-lip siRNAgp46在PSC中的攝入是RBP受體介導(dǎo)性的。圖13A表示抑制效果因濃度不同所帶來的差異的Western blotting結(jié)果。在經(jīng)VA-lip siRNAgp46處理的細(xì)胞中，觀察到依賴于VA-lip siRNAgp46濃度的gp46的表達(dá)抑制，在50nM時表達(dá)幾乎被完全地抑制,而在VA-lip siRNArandom和Lip siRNAgp46中未觀察到表達(dá)抑制。圖13B表示確認(rèn)抑制效果的持續(xù)時間的Western blotting的結(jié)果。用VA-1ipsiRNAgp46處理時，至處理后培養(yǎng)72小時的細(xì)胞可觀察到gp46的顯著抑制。因此，確認(rèn)了gp46的表達(dá)抑制效果持續(xù)至處理后至少72小時。圖14為對未處理細(xì)胞以及分別用VA-lip siRNAgp46和VA-lip siRNArandom進(jìn)行了處理的細(xì)胞的72小時后的膠原產(chǎn)生量進(jìn)行了定量的圖表。在利用VA-lip siRNAgp46處理時，與未處理細(xì)胞和用VA-lip siRNArandom處理的細(xì)胞相比,確認(rèn)可顯著的膠原產(chǎn)生抑制?？疾煊缮鲜鼋Y(jié)果可知在體外，VA-lip siRNAgp46通過RBP受體介導(dǎo)性的攝入被特異性地攝入到PSC中而抑制gp46的表達(dá)，結(jié)果顯著地抑制膠原的產(chǎn)生。這表明，VA-1ipsiRNAgp46在患有胰纖維化的胰腺中可減少膠原。例4.在胰腺纖維化模型大鼠中的再生治療實驗(I)胰腺纖維化模型大鼠的制作使用體重為150 200g的雄性Lewis大鼠(Charles River)。按照現(xiàn)有報道(Inoue et al. Pancreas2002; 25: e64-70),調(diào)制將二丁基 二氯化錫(Dibutyltindichloride, DB·TC)溶解在I份的乙醇中后與2份的甘油和2份的二甲基亞砜(DMSO)混合而得到的溶液(DBTC溶液)，使用注射器將相當(dāng)于5mg (DBTC)/kg (體重)的量從大鼠右頸動脈投予。(2)大鼠胰腺和其他組織中的VA-lip siRNAgp46-FITC的體內(nèi)局部存在在距離DBTC投予開始43天后，在觀察到嚴(yán)重的胰腺纖維化時，從尾靜脈對DBTC處置大鼠投予 I μ Ι/g 體重的 VA-lip siRNAgp46-FITC 或 Lip siRNAgp46_FITC。投予在常壓下進(jìn)行，每隔I天投予每次O. 75mg/kg的siRNA,投予3次。在最后投予的24小時后,通過生理鹽水灌流將大鼠處死，采集胰腺和其他的臟器(肝臟、肺、脾臟和視網(wǎng)膜)。用10%的多聚甲醛固定臟器標(biāo)本，使用偶氮卡紅-Mallory染色對石蠟包埋切片進(jìn)行染色。通過分別使用了單克隆抗a-SMA抗體(1:1000^8111&)、抗0)68抗體(1 :500，Dako)和抗FITC抗體(1:500,Abeam)的 Dextran Polymer 法和 Envision Kit (Dako)進(jìn)行免疫組織染色,接著進(jìn)行利用DAB (和光純藥工業(yè)，Osaka, Japan)的顯色和利用吉爾氏蘇木精液(和光純藥工業(yè))的核染色。(3) Western blotting為了評價在體內(nèi)的由siRNAgp46抑制表達(dá)的持續(xù)時間，與例3. (4)同樣地對來自VA-lip siRNAgp46的靜脈內(nèi)投予后0、1、2、3、4天后的胰腺的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行Westernblotting。(4)體內(nèi)的 siRNAgp46 處置組織學(xué)評價中使用3組的大鼠(每組η = 6)。在DBTC投予的43天后，分別用PBS、VA-lip siRNArandom 和 VA-lip siRNAgp46 的 10 次投予(O. 75mg/kg 的 siRNA,每隔 I 天投予3次)對各組進(jìn)行處置。全部的投予為由尾靜脈在常壓下以I μ Ι/g體重的量進(jìn)行。利用10%的多聚甲醛固定胰腺，進(jìn)行石蠟包埋后，使用偶氮卡紅-Mallory染色和蘇木素-伊紅染色對切片進(jìn)行染色。免疫組織染色通過使用了單克隆抗α-SMA抗體(1:1000，Sigma)的Dextran Polymer法和Envision Kit (Dako)進(jìn)行,接著進(jìn)行利用DAB (和光純藥工業(yè)，Osaka, Japan)的顯色和利用吉爾氏蘇木精液(和光純藥工業(yè))的核染色。為了對利用偶氮卡紅-Mallory、蘇木素-伊紅和a -SMA的染色區(qū)域進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，對各大鼠的每個胰腺切片隨機(jī)地選擇6個低倍率視野(X 100)，利用顯微鏡(Axioplan2，Carl Zeiss.1nc)進(jìn)行觀察。利用使用了數(shù)碼 TV 照相系統(tǒng)(Axiocam High Resolution color, Carl Zeiss.1nc.)的錄像記錄系統(tǒng)對數(shù)碼圖像進(jìn)行拍攝。使用自動軟件分析程序(KS400, Carl Zeiss.1nc.)確定數(shù)碼顯微鏡照片中的被偶氮卡紅-Mallory和a -SMA染色了的區(qū)域的比例。(5)羥脯氨酸分析羥脯氨酸含量按照現(xiàn)有報道(Weidenbachet al. Digestionl997; 58:50-57)通過Weidenbach法來確定。簡單地說，以3000rpm將胰腺的細(xì)胞破碎物離心15分鐘，在6N的HCl中、在96°C下將料粒完全地水解16小時，將pH調(diào)節(jié)至6. 5 7. 5后，再次離心(3000rpm下15分鐘)。在60°C下干燥25 μ I的小份，將沉淀物溶解在1. 2ml的50%異丙醇中，在200ml的帶有O. 56%chloramine T Solution (Sigma)的醋酸_朽1樣酸緩沖液(ρΗ6· O)中進(jìn)行孵育。在25°C下孵育10分鐘后，添加Iml的歐氏試劑，在50°C下孵育混合物90分鐘。冷卻后測量560nm波長的吸收。(6)胰腺的細(xì)胞破碎物的膠原酶活性膠原酶活性的測量通過現(xiàn)有報道(Iredale et al. J. Clin.1nvest. 1998;102:538-549)的改良方法進(jìn)行。簡單地說，在含有絲氨酸和巰基蛋白酶抑制劑(PMSFO.1mM、亮抑酶肽10 μ Μ、胃酶抑素AlO μ Μ、抑肽酶25 μ g/ml、碘乙酰胺O.1mM)的樣品緩沖液(50mM Tris、ρΗ7· 6、0· 25%Triton Χ_100、0· 15Μ NaClUOmM CaCl2)中，在冰上破碎從野生型大鼠和胰腺纖維化模型大鼠采集的經(jīng)液氮冷凍的胰腺。將細(xì)胞破碎物在4°C、14000g下離心30分鐘,將細(xì)胞殘洛和蛋白質(zhì)凝集體除去。使用EnzCheck CollagenaseAssay Collagen Conjugate kit (Molecular Probes)按照操作說明書確定胰腺的細(xì)胞破碎物中的膠原酶活性。平行地使用適當(dāng)?shù)年幮詫φ蘸完栃詫φ?細(xì)菌性膠原酶)進(jìn)行分析，將結(jié)果用每mg蛋白質(zhì)的分解膠原的熒光(通過與血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)相比較的280nm的光學(xué)濃度來確定)來表不。MS在胰腺的各連 續(xù)部分中對活化星狀細(xì)胞和siRNAgp46_FITC進(jìn)行免疫染色的結(jié)果是，在VA-lip siRNAgp46-FITC投予組中，在活化星狀細(xì)胞(a -SMA陽性的細(xì)胞)聚集的區(qū)域內(nèi)鑒定了 FITC陽性的細(xì)胞，而在LipsiRNAgp46-FITC投予組中在a-SMA陽性區(qū)域內(nèi)鑒定的FITC陽性細(xì)胞極少(圖15Α和B)。在肝臟標(biāo)本中也觀察到a -SMA陽性區(qū)域的FITC陽性細(xì)胞(圖15C)。該結(jié)果與通過DBTC不僅可誘導(dǎo)胰纖維化、還可誘導(dǎo)肝硬化的發(fā)現(xiàn)相一致。在包含肺和脾臟的大鼠其他臟器中，在巨噬細(xì)胞浸潤的區(qū)域(CD68陽性細(xì)胞)內(nèi)，被FITC染色的細(xì)胞很少(圖MD和Ε)，由此說明了由巨噬細(xì)胞帶來的siRNAgp46-FITC的非特異性攝入。視網(wǎng)膜對FITC染色是陰性的(圖15F)，這與使用了肝硬化的VA-lip siRNAgp46-FAM的發(fā)現(xiàn)是一致的。認(rèn)為大概其原因是由于血液-視網(wǎng)膜屏障的低透過性，眼球構(gòu)建了獨(dú)立的體系。Western blotting的結(jié)果確認(rèn)了，即便在體內(nèi)，由siRNAgp46帶來的gp46的表達(dá)抑制效果至少持續(xù)3天(圖16A和B)。通過偶氮卡紅-Mallory染色對進(jìn)行了 VA-lip siRNAgp46的10次投予的DBTC處置大鼠進(jìn)行評價(圖17A)。對于利用計算機(jī)圖像分析所確定的纖維化區(qū)域，與對照組標(biāo)本相t匕，在VA-lip siRNAgp46投予組的標(biāo)本中顯著地減少(P < 0. 01)(圖17B)。該結(jié)果與顯示在VA-lip siRNAgp46投予組的胰腺中羥脯氨酸的明顯抑制的數(shù)據(jù)(圖17C)相一致。為了評價VA-lip siRNAgp46處置后的大鼠胰腺中星狀細(xì)胞的變化，進(jìn)行了 VA-1ipsiRNAgp46處置后大鼠的胰腺標(biāo)本的a-SMA染色，結(jié)果與Lip siRNAgp46處置和PBS處置過的大鼠相比，a-SMA陽性的細(xì)胞數(shù)顯著減少(圖18Α和B)?；谘装Y細(xì)胞和PSC自身來源的膠原酶是否會與通過VA-lip siRNAgp46投予而抑制由PSC分泌新的膠原之后的纖維化改善有關(guān)的推測，將對野生型大鼠和VA-1ipsiRNAgp46處置過的DBTC處置大鼠的胰腺細(xì)胞破碎物的膠原酶活性進(jìn)行測量的結(jié)果示于下表。表I大鼠胰腺細(xì)胞破碎物中的膠原酶活性
權(quán)利要求
1.一種用于由纖維化組織再生正常組織的藥物組合物，其含有膠原減少物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，膠原減少物質(zhì)選自抑制利用膠原產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行膠原產(chǎn)生的物質(zhì)、促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)和抑制膠原分解阻礙物質(zhì)的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其進(jìn)一步含有針對纖維化組織中的膠原產(chǎn)生細(xì)胞的靶向劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中，靶向劑為類視黃醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項所述的藥物組合物，其中，纖維化組織持續(xù)受到纖維化刺激。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項所述的藥物組合物，其用于在通過減少蓄積于纖維化組織中的膠原而生成的干細(xì)胞增殖和分化用的空間內(nèi)由纖維化組織再生正常組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 6任一項所述的藥物組合物，其中，抑制利用膠原產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行膠原產(chǎn)生的物質(zhì)選自TGFii阻礙物質(zhì)、HGF或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、PPAR Y配體、血管緊張素阻礙物質(zhì)、PDGF阻礙物質(zhì)、松弛肽或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)、阻礙細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生和分泌的物質(zhì)、細(xì)胞活性抑制物質(zhì)、細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)以及凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 6任一項所述的藥物組合物，其中，促進(jìn)膠原分解的物質(zhì)為膠原酶或其產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2 6任一項所述的藥物組合物，其中，抑制膠原分解阻礙物質(zhì)的物質(zhì)為 ΜΡ阻礙物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有膠原減少物質(zhì)的用于由纖維化組織再生正常組織的藥物組合物及方法。通過本發(fā)明，能夠由纖維化組織治療性地再生正常組織。
文檔編號A61K47/12GK103068402SQ20118003857
公開日2013年4月24日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者新津洋司郎, 米田明弘, 石渡?？?申請人:日東電工株式會社