專利名稱：使用了酶的蛋殼膜的溶解方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用了酶的蛋殼膜的溶解方法。詳細地說，涉及使用了蛋白質分解酶的蛋殼膜溶解方法及其用途。本申請基于2010年8月31日申請的日本專利申請第2010 —195076號主張優(yōu)先權，該專利申請的全部內容通過參照的方式援用于此。
背景技術：
雞肉和雞蛋在日本國內的消耗量巨大，據(jù)稱一年分別達到220萬噸、250萬噸。在全世界的消耗量中，雞肉約為8300萬噸，雞蛋約為5600萬噸。另一方面，還大量排出非食用部分的羽毛和蛋殼膜。羽毛和蛋殼膜的90%以上由蛋白質構成，羽毛的主要成分是角蛋白，蛋殼膜的主要成分是膠原蛋白樣蛋白質。已知均大量含有半胱氨酸(約10%)、其分解物具有抗氧化作用等多種生理功能。蛋殼膜在雞蛋中包裹卵細胞(蛋黃)和蛋白，并與蛋殼一起將蛋黃和蛋白與外界物理性地隔離，保護雞蛋免受有害的紫外線、氧和干燥。另外，還有防御病原菌、病毒等外來生物的感染的重要作用。此外，蛋殼膜中含有抗菌物質和溶菌酶、β —N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶等抗菌酶。進而，據(jù)稱蛋殼膜中含有其它特殊的蛋白質，其功能性備受關注。已知使用了蛋殼膜的各種功能物。例如，已知在燙發(fā)劑中為了保護毛發(fā)外皮層而加入蛋殼膜(日本特開2000 - 128744)，為了治療創(chuàng)傷而在護創(chuàng)膏中加入蛋殼膜分解物(日本特開 2003 - 225298)等?，F(xiàn)狀是大部分蛋殼膜未被利用而 被廢棄處理。作為其理由，可舉出由于是難分解性而難以處理，沒有有效率的溶解方法。目前主流的蛋殼膜處理技術是基于酸和堿處理的技術，但伴有茶褐色的著色、氨基酸分解所導致的發(fā)生異臭的問題。此外，還存在因過度反應導致的有用成分低收率化的問題。作為替代技術，研究了利用蛋白質分解酶(蛋白酶)進行的處理(例如參照專利文獻I 4)，但存在如下問題(I)需要粉末化、超聲波處理、沸騰處理之類的前處理；(2)需要長時間的處理；(3)分解率低(約20% )。酶反應由于在比較溫和的條件下進行，所以能夠期待有效成分的高收率化，但由于上述問題而沒有確立實用的技術。專利文獻專利文獻1:日本特開2008 - 118887號公報專利文獻2 :日本特開2008 - 061514號公報專利文獻3 日本特開平09 - 040564號公報專利文獻4 :日本特開2008 - 007419號公報

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的課題在于提供一種能夠解決以往的處理方法(利用酸、堿進行的處理，利用蛋白質分解酶進行的處理)所存在的上述問題中的至少一個問題的蛋殼膜溶解方法及其用途等。
本發(fā)明人為了解決上述課題而反復進行了深入研究。其結果發(fā)現(xiàn)通過將蛋白質分解酶(蛋白酶)和還原劑聯(lián)用、特別是在還原劑共存的條件下使蛋白質分解酶發(fā)生作用，能夠使蛋殼膜極其有效率地溶解。令人驚訝的是，顯示出還能夠達到對于利用了酶的以往方法而言難以達到的完全溶解，并且在采用了酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶中的任一種的情況下，盡管在溫和的PH條件下，也看到良好的溶解。經過進一步研究，成功地確定對溶解有效的各種條件。另一方面，研究了通過本方法得到的蛋殼膜溶解物的特性，結果確認了有用物質的存在，明確了該溶解物的利用價值高。主要基于以上成果，完成了以下本發(fā)明。[I] 一種蛋殼膜溶解方法，其特征在于，將蛋白質分解酶和還原劑聯(lián)用。[2]如[I]所述的蛋殼膜溶解方法，包括在還原劑共存的條件下使蛋白質分解酶作用于蛋殼膜的工序。[3]如[I]所述的蛋殼膜溶解方法，包括以下的工序(I)和(2)(I)在溶劑中準備蛋殼膜的工序；(2)向所述溶劑添加還原劑和蛋白質分解酶，使之反應的工序。[4]如[3]所述的蛋殼膜溶解方法，其中，工序(2)的反應溶液的pH為4. 5 9. 5。[5]如[3]或[4]所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述還原劑的濃度為5mM 1M。[6]如[3] [5]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，繼續(xù)所述工序(2)的反應，直至確認不到固態(tài)物。[7]如[3] [6]中任一`項所述的蛋殼膜溶解方法，還包括以下的工序(3)(3)將工序(2)后的溶液過濾，除去固態(tài)物的工序。[8]如[I] [7]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶為堿性蛋白酶或中性蛋白酶。[9]如[I] [7]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶是選自絲氨酸內肽酶、半胱氨酸內肽酶、金屬內肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸內肽酶中的一種以上的酶。[10]如[I] [7]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶是選自糜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶(bacillolysin)、^·蘿蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶中的一種以上的酶。[11]如[I] [7]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶是選自 BIOSORK、PROLEATHER FG — F、PAPAINW40、PROTEASE N、BROMELAIN F、UMAMIZYME G、THERMOASE YlOO、ProteAX、PROTEASE S、SUMIZYME LP500、DESKIN C、PROTIN NY10、PROTINPClO, SUMIZYME MP、PROTIN AY以及蛋白酶K中的一種以上的酶。[12]如[I] [11]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述還原劑是選自亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、L 一半胱氨酸、N —乙?；?L 一半胱氨酸、2 —巰基乙醇、谷胱甘肽以及DTT中的一種以上的還原劑。[13]如[I] [11]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述還原劑為亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉。[ 14]如[I ]所述的蛋殼膜溶解方法，包括以下的工序(I)和(2’)(I)在溶劑中準備蛋殼膜的工序；
(2’ )向所述溶劑添加還原劑而使之反應后，除去還原劑，接著添加蛋白質分解酶，使之反應的工序。[15] 一種蛋殼膜溶解劑，是將蛋白質分解酶和還原劑組合而成的。[16]如[15]所述的蛋殼膜溶解劑，其特征在于，含有蛋白質分解酶和還原劑。[17]如[15]所述的蛋殼膜溶解劑，其特征在于，是由含有蛋白質分解酶的第I構成組分、以及含有還原劑的第2構成組分構成的試劑盒。[18]—種蛋殼膜溶解物，是通過[I] [13]中任一項所述的蛋殼膜溶解方法得到的。[19]如[18]所述的蛋殼膜溶解物，其中，含有選自溶菌酶、β — N—乙?；被咸烟擒彰浮⑼该髻|酸、硫酸軟骨素以及硫酸皮膚素中的一種以上的成分。[20]如[18]所述的蛋殼膜溶解物，其中，顯示選自抗氧化活性和血管緊張素轉化酶抑制活性中的一種以上的活性。[21] —種蛋殼膜溶解物，是通過[14]所述的蛋殼膜溶解方法得到的。

[22]如[21]所述的蛋殼膜溶解物，其中，含有賴氨酰氧化酶。[23]如[18] [22]中任一項所述的蛋殼膜溶解物，其中，是蛋殼膜的完全溶解物。[24] 一種組合物，含有[18] [23]中任一項所述的蛋殼膜溶解物。[25]如[24]所述的組合物,其中，是醫(yī)藥品、準醫(yī)藥品(quasi drug)、食品或化妝
品O[26]—種蛋殼膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i)和(ii):(i)采用[I] [13]中任一項所述的方法的溶解工序；(ii)將在所述溶解工序中得到的蛋殼膜溶解物純化的工序。[27]如[26]所述的蛋殼膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii )中被純化的成分是選自溶菌酶和β — N—乙?；被咸烟擒彰钢械拿?、或者選自透明質酸、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素中的酸性粘多糖。[28]通過[27]所述的方法得到的溶菌酶、β — N—乙?；被咸烟擒彰?、透明質酸、硫酸軟骨素或硫酸皮膚素。[29]—種蛋殼膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i’)和(ii):( i ’)利用[14]所述的方法的溶解工序；(ii)將在所述溶解工序中得到的蛋殼膜溶解物純化的工序。[30]如[29]所述的蛋殼膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii )中被純化的成分
為賴氨酰氧化酶。[31]通過[30]所述的方法得到的賴氨酰氧化酶。[32]通過[26]或[29]所述的蛋殼膜有用成分的提取方法得到的蛋殼膜提取物。


[圖1]單獨使用酶制劑(BIOSORK)將蛋殼膜分解的結果。[圖2]將酶制劑(BIOSORK)和還原劑(DTT)聯(lián)用而將蛋殼膜分解的結果。[圖3]表示進行了試驗的還原劑的種類和有無蛋殼膜溶解(分解)的表。
[圖4]表示將酶制劑(BIOSORK)和還原劑(亞硫酸鈉)聯(lián)用時的pH條件與溶解程度的關系的圖表。[圖5]利用SDS-PAGE測得的蛋殼膜溶解物的分析結果。[圖6]表示蛋殼膜溶解中的還原劑濃度依賴性的圖表。左側是使用了BIOSORK時的結果，右側是使用了 PROLEATHER FG-F時的結果。[圖7]使用了亞硫酸鈉和BIOSORK時的蛋殼膜的溶解。[圖8]使用了亞硫酸鈉和PROLEATHER FG — F時的蛋殼膜的溶解。[圖9]表示蛋殼膜濃度與溶解時間的關系的圖。左側表示反應前后的蛋殼膜的狀態(tài)。右側是將在各蛋殼膜量下完全溶解所需要的時間進行標繪而得的圖表。[圖10]將胃蛋白酶和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖11]將SUMIZYMELP500和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖12]將DESKINC和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖13]將PROTINNYlO和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖14]將PROTINPClO和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖15]將胰蛋白酶和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖16]將SUMIZYMEMP和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖17]將PROTI NAY和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖18]將蛋白酶K和還原劑聯(lián)用時的蛋殼膜的溶解。[圖19]使用N—乙?；?L 一半胱氨酸作為還原劑時的蛋殼膜的溶解。[圖20]使用2—巰基乙醇作為還原劑時的蛋殼膜的溶解。[圖21]表示蛋殼膜溶解物中的硫酸化糖胺聚糖(GAG)含量的表。[圖22]表示蛋殼膜溶解物中的透明質酸含量的表。[圖23]表示蛋殼膜溶解物的賴氨酰氧化酶活性的圖表。[圖24]表示蛋殼膜溶解物的溶菌活性的圖表。[圖25]表示蛋殼膜溶解物的自由基清除活性的圖表。[圖26]表示蛋殼膜溶解物的Cu2+還原活性的圖表。[圖27]表示蛋殼膜溶解物的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制率的圖表。
具體實施例方式1.蛋殼膜溶解方法本發(fā)明的第一方面涉及蛋殼膜的溶解方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，在避免因茶褐色的著色、氨基酸分解所導致的異臭發(fā)生的問題的同時，能夠有效率地溶解蛋殼膜。此外，即使不進行前處理，也能夠實現(xiàn)高的溶解(分解)率。在本說明書中，所謂“蛋殼膜”是存在于雞、鵪鶉、烏雞、鴨、鵝、鴕鳥等鳥類的蛋的外殼內側的膜。在本發(fā)明的溶解方法中，將蛋白質分解酶和還原劑聯(lián)用而對蛋殼膜進行處理、溶解。供給處理的蛋殼膜的狀態(tài)沒有特別限定。例如，可以使用從外殼分離后，實施過干燥處理(日光干燥、熱風干燥、真空干燥、抽吸干燥、凍干等)的蛋殼膜(干燥狀態(tài))、實施干燥處理前的蛋殼膜(濕潤狀態(tài))、干燥處理后使其膨潤而得的蛋殼膜(濕潤狀態(tài))。此外，也可以為實施了破碎、粉碎等處理而得的蛋殼膜(例如粉末狀)。另外，還可以使用在不與殼分離的狀態(tài)下的蛋殼膜。本發(fā)明中的“將蛋白質分解酶和還原劑聯(lián)用”是指在利用還原劑的作用的同時使蛋白質分解酶作用于蛋殼膜。只要形成能夠利用這種還原劑的作用的環(huán)境，使蛋白質分解酶作用于蛋殼膜的時機(時候)和使用還原劑的時機(時候)就沒有受到特別限定。為了更有效率地溶解蛋殼膜，優(yōu)選使還原劑的作用和蛋白質分解酶的作用得到同時發(fā)揮。典型的是，在還原劑共存的條件下使蛋白質分解酶作用于蛋殼膜。在該方式中，例如，實施下面的工序(I)和(2)。(I)在溶劑中準備蛋殼膜的工序(2)向上述溶劑中添加還原劑和蛋白質分解酶，使之反應的工序就工序(1)中使用的溶劑而言，只要發(fā)生酶反應，就沒有特別限定，但是為了容易進行PH調整以及所需的pH維持，優(yōu)選使用緩沖液。在工序(2)中，還原劑和蛋白質分解酶的添加時機以及順序沒有特別限定，優(yōu)選同時添加還原劑和蛋白質分解酶、或者在添加還原劑后添加蛋白質分解酶(優(yōu)選迅速添加)，以使得聯(lián)用效果充分地發(fā)揮。若利用前者的方法，則添加操作為1次，在操作性方面是有利的。與上述方式不同，也可以使蛋白質分解酶作用于用還原劑處理后的蛋殼膜。在該方式的情況下，例如，實施下面的工序(1)和(2)。應予說明，該方式特別適合于獲得含有維持活性的賴氨酰氧化酶的蛋殼膜溶解物的目的。(1)在溶劑中準備蛋殼膜的工序(2’)向上述溶劑中添加還原劑而使之反應后，除去還原劑，接著添加蛋白質分解酶，使之反應的工序就本發(fā)明中使用的蛋白質分解酶而言，只要能夠實現(xiàn)蛋殼膜的有效率的溶解，就沒有特別限定。作為蛋白質分解酶，可以使用市售的酶制劑。若列舉酶制劑的例子，則可以使用 BIOSORK、NEWLASE F3 — G,NEffLASE A、PROTEASE A “AMANO，，G、PROTEASE N “AMANO，，G、PROTEASE S “AMAN0”G、PAPAIN W — 40、BROMELAIN F,PROTIN NY10,PROTIN PC10,PROTINAY,PROTIN SD - NY10,PROTIN SD - PCIOF,THERMOASE PC10F,PROTIN SD - AC10F,PROTINSD - AYlO、PROLEATHER FG — F、PROTEASE P “AMANO” 3G、PROTEASE M “AMAN0”G、ProteAX(以上，天野酶公司)；M0LSIN F (KIKK0MAN FOOD PRODUCTS 公司)；SUMIZYME AP、SUMIZYMELP、SUMIZYME LP500、SUMIZYME FP、SUMIZYME LPL, SUMIZYME MP (以上，新日本化學工業(yè)公司);DENAPSIN2P、DENATYME AP, BIOPRASE OP, BIOPRASE AL — 15FG、BI0PRASE30G、BI0PRASEAPL - 30、BI0PRASE OR 一 10G、BI0PRASE30L、BI0PRASE XL 一 416F、BI0PRASE SP 一 20FG、BI0PRASE SP — 4FG、PROTEASE CL — 15 (以上，Nagese ChemteX 公司)；0RIENTASE20A、TETRASE S、NUCLEICIN、ORIENTASEIONL、0RIENTASE90N、0RIENTASE ONS, 0RIENTASE22BF(以上，HBI Enzymes 公司)；BREWERS CLAREX, VARIDASE AFP、VARIDASE FP60、BREWERSPROTEASE、ACCELERZYME NP50. 000、DELV0LASE、VARIDASETSP200、BAKEZYME PPU95. 000、BAKEZYME B500、C0LLUPULINE、VARIDASE PAPAIN SF、VARIDASE BROMELAIN (以上，DSMJapan )；PR0TEASE YP — SS、PANTIDASE NP - 2, PANT IDASE P, AROASE AP- 10, AROASE NP —10、AROASE NS、AROASE XA — 10、PROTEASE AL (以上，Yakult Pharmaceutical Industry公司)；PR0M0D223LP、PR0TEX7L、PR0TEX14L、Alkaline Protease GL、PR0TEX6L、PR0TEX89L、PURAFE C T、PURAFECT OX、PR0PERASE、PROTEX 0XG、PR0TEX40L (以上，Genencor Kyowa 公司)、PTN、NEWTRASE、ESPERASE、SAV INASE、ALCA LASE, CLEARLENSff PRO、EVERLRAAAV SE、KANNASE、POLARZYME、FLAVOURZYME、PROTAMEX、NOVOLAN (以上，Novozymes Japan) ；PAPAINF.、TRYPSIN4. OT、COROLASE N、VERON L10、C0R0LASE LlO、C0R0LASE7089、VERON W (以上，樋口商會)；ENZYLON NBS, ENZYLON SA, MAGNAX MT (以上，洛東化成工業(yè)公司)；K0KULASE P(Mitsubish1-Kagaku Foods 公司);ACTINASE AS、ACTINASE AF (以上，Kaken Pharma 公司)；GRINDAMYL PR59、GRINDAMYL PR43 (以上，Danisco Japan)；SOFTERGEN M2 (Taisho TechnosCo.，Ltd.);蛋白酶K (和光純藥工業(yè)公司)；DESKIN C (大和化成公司)等。如后述的實施例所示，使用BIOSORK、PROLEATHER FG 一 F、PAPAIN W40、PROTEASEN、BROMELAIN F、UMAMIZYME G、THERMOASE YlOO、ProteAX、PROTEASE S 時，能夠在短時間內將蛋殼膜完全溶解。此外，使用 SUMIZYME LP500、DESKIN C、PR0TINNY10、PROTIN PC10、SUMIZYME MP、PROTIN AY及蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶時，也看到蛋殼膜的有效率的溶解?；谶@些結果，在優(yōu)選的方式中，采用從這些酶制劑或酶中選擇的I種以上的酶制劑作為蛋白質分解酶。在此，在構成這些酶制劑的酶中，包括最適PH范圍為堿性且被分類為絲氨酸內肽酶的糜蛋白酶、最適PH范圍為堿性且被分類為絲氨酸內肽酶的枯草桿菌蛋白酶、最適PH范圍為中性且被分類為半胱氨酸內肽酶的木瓜蛋白酶、最適pH范圍為中性且被分類為金屬內肽酶的芽孢桿菌蛋白酶、最適PH范圍為中性且被分類為半胱氨酸內肽酶的莖菠蘿蛋白酶、最適PH范圍為中性且被分類為氨基肽酶的亮氨酰氨基肽酶。此外，胃蛋白酶的最適pH范圍為酸性且被分類為天冬氨酸內肽酶，胰蛋白酶的最適pH范圍為中性且被分類為絲氨酸內肽酶。由這些事實可知，在本發(fā)明優(yōu)選的一種方式中，使用選自絲氨酸內肽酶、半胱氨酸內肽酶、金屬內肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸內肽酶中的一種以上的酶。更具體地說，使用選自糜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶、莖菠蘿蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶中的一種以上的酶。另一方面，從許多堿性蛋白酶和中性蛋白酶實現(xiàn)了良好的溶解的事實出發(fā)(參照后述的實施例)，作為優(yōu)選的一種方式，采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶。如后述的實施例所示，當采用BIOSORK、PROLEATHER FG — F和PAPAIN W40時，能夠在極短的時間內將蛋殼膜完全溶解。因此，特別優(yōu)選采用這些酶制劑的I種以上、或者構成這些酶制劑的酶(即 ，糜蛋白酶(BIOSORK的成分)、枯草桿菌蛋白酶(PROLEATHER FG-F的成分)及木瓜蛋白酶(PAPAIN W40的成分))的I種以上作為蛋白質分解酶。在最優(yōu)選的方式中，采用在最短時間內看到蛋殼膜完全溶解的BIOSORK或作為其成分的糜蛋白酶作為蛋白質分解酶的至少一種。本發(fā)明中使用的蛋白質分解酶也可以不是純化品。例如，植物提取物、動物提取物、利用微生物的培養(yǎng)提取物、或者它們的部分純化物等，只要能夠實現(xiàn)蛋殼膜的有效率的溶解，也能夠作為蛋白質分解酶使用。作為還原劑，使用例如亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽。此處的鹽例如是堿金屬鹽或堿土金屬鹽或者銨鹽(具體地說，是鈉鹽、鉀鹽、單乙醇胺鹽等)。更優(yōu)選使用亞硫酸鹽(例如亞硫酸鈉)。還可以使用硫醇類或膦類作為還原劑。硫醇類的例子是半胱氨酸及其衍生物(例如N-乙?；腚装彼?、半胱胺及其衍生物(作為衍生物的例子，可舉出C1-C4?；苌?，更具體地，可舉出N-乙?；腚装泛蚇-丙?；腚装返?、硫代乳酸及其酯(作為硫代乳酸的酯，例如有單硫代乳酸甘油酯等)、巰基乙醇酸及其酯(作為巰基乙醇酸的酯，例如可舉出單巰基乙醇酸甘油酯或單巰基乙醇酸乙二醇酯等)和硫甘油以及它們的混合物。若示出硫醇類的具體例，則為N-巰基烷基酰胺類、N-(巰基烷基)ω -羥基烷基酰胺類、N-單-或N, N- 二烷基巰基-4- 丁基酰胺類、氨基巰基烷基酰胺類、以及烷基氨基巰基烷基酰胺類、2 —巰基乙醇。作為N-巰基烷基酰胺類，例如可以使用N-(巰基-2-乙基)葡糖酰胺、β -巰基丙酸及其衍生物、硫代蘋果酸、泛酰巰基乙胺。作為N-(巰基烷基)ω-羥基烷基酰胺類，例如可以使用日本特開平2 - 104515號中記載的化合物。作為N-單-或N，N- 二烷基巰基-4-丁基酰胺類，例如可以使用日本特開平2 — 196711號中記載的化合物。作為氨基巰基烷基酰胺類，例如可以使用日本特開平3 - 170411號中記載的化合物。作為烷基氨基巰基烷基酰胺類，例如可以使用日本特開平5 - 279322號中記載的化合物。作為膦類，例如可舉出三(羥基甲基)膦、三(羥基丙基)膦、雙(羥基甲基)(苯基)膦、烯丙基二苯基膦、芐基二苯基膦、雙(3，4，5 —三甲氧基苯基)氯化膦、雙(3，4，5 —三甲氧基苯基)膦、芐氧基(二異丙基氨基)甲基膦、雙(二異丙基氨基)氯化膦、雙(2—氰基乙基)膦、雙(3，5—二叔丁基苯基)氯化膦、雙(3，5—二叔丁基苯基)膦、雙(二乙基氨基)甲基膦、雙(二乙基氨基)氯化膦、雙(二乙基氨基)苯基膦、雙(3，5—二甲基一 4 一甲氧基苯基)氯化膦、雙(3，5—二甲基一 4 一甲氧基苯基)膦、雙(3，5—二甲基苯基)氯化膦、雙(3，5 —二甲基苯基)二乙基氨基膦、雙(3，5 —二甲基苯基)膦、雙(3，5 —二(三氟甲基)苯基)氯化膦、雙(3，5—二(三氟甲基)苯基)膦、雙(4 一氟苯基)氯化膦、雙(2—呋喃基)氯化膦、雙(2 —呋喃基)膦、雙(羥基甲基)苯基膦、雙(4 一甲氧基苯基)苯基膦、雙(3，5—二甲基苯基)膦、雙(3，5—二叔丁基苯基)氯化膦、雙(3，5—二叔丁基苯基)膦、雙(3，5 —二(三氟甲基)苯基)氯化膦、雙(3，5 —二(三氟甲基)苯基)膦、雙(4 一氟苯基)氯化膦、雙(4 -甲氧基苯基)氯化膦、雙(4 -甲氧基苯基)苯基膦、雙(4 一甲基苯基)氯化膦、雙(4 一甲基苯基)膦、雙(4 一三氟甲基苯基)氯化膦、雙(4 一三氣甲基苯基)勝、雙(―乙基氣基)甲基勝、雙(―乙基氣基)苯基勝、雙(輕基甲基)苯基膦、雙(鄰甲苯基)氯化膦、雙(鄰甲苯基)膦、雙(吡咯烷基)甲基膦、丁基二氯化膦、丁基二苯基膦、叔丁基二苯基膦、環(huán)己基(二乙基氨基)氯化膦、環(huán)己基(二甲基氨基)氯化膦、環(huán)己基二氯化膦、環(huán)己基二苯基膦、2—氯乙基二苯基膦、2 —(二環(huán)己基膦基)聯(lián)苯、2—二環(huán)己基勝基一 2’ — (Ν，Ν—二甲基氛基)聯(lián)苯、二乙基氛基二乙基勝、二甲基氛基二氯化膦、(4 一二甲基氨基苯基)二苯基膦、N — [ ( 二苯基氧膦基)甲基]一 N —甲基苯胺、鄰一二苯基膦基苯甲酸、2 —甲氧基(二氯膦基)苯、4 一甲氧基苯基(二乙基氨基)氯化膦、4 一甲氧基苯基(二甲基氨基)氯化膦、(2—甲氧基苯基)甲基苯基膦、2—甲氧基膦基苯、(5 —甲基一 2 —異丙基環(huán)己基)二苯基膦、三苯基膦、二烯丙基苯基膦、二節(jié)基膦、二丁基苯基膦、二丁基膦、二環(huán)己基氯化膦、二環(huán)己基苯基膦、二環(huán)己基膦、二乙基氯化膦、二乙基苯基膦、二乙基膦、二異丁基膦、二異丙基氯化膦、二異丙基膦、二甲基(苯基)膦、二甲基(二甲基甲娃焼基)勝、—甲基氣化勝、—苯基(鄰甲苯基)勝、—苯基(對甲苯基)勝、—苯基(二甲基甲娃焼基)勝、—苯基氣化勝、—苯基勝、—苯基丙基勝、—苯基乙稀基勝、二叔丁基氯化膦、二叔丁基羥基膦、二叔丁基甲基膦、二叔丁基苯基膦、二叔丁基膦、二乙烯基苯基勝、乙基—氣化勝、乙基—苯基勝、異丙基—氣化勝、甲氧基—乙氧基勝、甲基—氣化勝、甲基—苯基勝、甲基苯基氣化勝、苯基勝、丙基—氣化勝、叔丁基雙(二甲基甲娃焼基)膦、叔丁基二氯化膦、叔丁基二乙基膦、叔丁基二苯基膦、叔丁基膦、三(間甲苯基)膦、三(鄰甲苯基)膦、三(對甲苯基)膦、三環(huán)己基膦、三環(huán)戊基膦、三乙基膦、三異丁基膦、三異丙基膦、三甲基膦、三正丁基膦、三正辛基膦、三丙基膦、三(I 一萘基)膦、三(2，4，6 —三甲基苯基)膦、三(2，6—二甲氧基苯基)膦、三(2—羰基乙基)膦、三(2—氰基乙基)膦、三(2 —呋喃基)膦、二(2 —甲氧基苯基)膦、二(2 —二乙基)膦、二(3, 5 一二甲基一 4 一甲氧基)膦、三(3 —氯苯基)膦、三(3 —氟苯基)膦、三(3 -甲氧基苯基)膦、三(3 -甲氧基丙基)膦、二(4 一氯苯基)膦、二(4 一氟苯基)膦、二(4 一甲氧基苯基)膦、二(4 一嗎啉基)膦、三(羥基甲基)膦、三(三甲基甲硅烷基)膦、三[3，5 —雙(三氟甲基)苯基]勝、二一叔丁基勝、2 —氰基乙基二苯基勝、2 —二環(huán)己基勝基一 2’ —甲基聯(lián)苯、雙(2,4,6 —二甲基苯基)勝、2 — ( _■叔丁基勝基)聯(lián)苯等。在優(yōu)選的一種方式中，采用通過其使用而可看到良好溶解的還原劑(參照后述的實施例)，即亞硫酸鹽(例如亞硫酸鈉)、亞硫酸氫鹽(例如亞硫酸氫鈉)、L 一半胱氨酸、L 一半胱氨酸鹽酸鹽、N —乙?；?L 一半胱氨酸、2 —巰基乙醇、谷胱甘肽(可以使用含有谷胱甘肽的酵母提取物)或DTT。應予說明，只要能獲得本發(fā)明所需要的作用和效果，則也可以將2種以上的還原劑聯(lián)用。工序(2)的反應優(yōu)選在弱酸性pH 弱堿pH條件下(具體是ρΗ4· 5 9. 5)進行。更優(yōu)選在中性PH條件下進行。此處的中性pH條件下是指pH為6. O 8. O。優(yōu)選在pH調整為7. O 7. 5的反應液中進行反應。工序(2)的反應的時間可以在例如10分鐘 24小時的范圍內任意設定。根據(jù)本發(fā)明的方法，由于進行有效率的溶解，所以能夠在短時間內將蛋殼膜溶解。優(yōu)選以能夠實現(xiàn)蛋殼膜的完全溶解的方式設定反應時間。為了提高反應效率，也可以加以攪拌、振蕩等。對于溫度條件也沒有特`別的制約，在對使用的蛋白質分解酶的作用沒有抑制的范圍下進行設定即可。若舉出溫度條件的例子，則為30°c 80°C。優(yōu)選的溫度條件為40°C 70。。。就蛋白質分解酶的使用量(添加濃度)而言，只要能夠進行蛋殼膜的有效率的溶解，就沒有特別限定。最佳的使用量一般根據(jù)使用的酶的種類不同而異，但是例如，使用反應液中的蛋白水解酶的濃度成為0.01% (W/W) 20% (W/W)的量的酶。反應液中的蛋白質分解酶的濃度優(yōu)選為O. 1% (W/W) 20% (W/W)，更優(yōu)選為O. 1% (W/W) 10% (WO。只要充分獲得與蛋白質分解酶的聯(lián)用效果，則還原劑的使用量也沒有特別限定。最佳的使用量一般根據(jù)使用的還原劑的種類不同而異，但是例如，使用反應液中的還原劑的濃度成為5mM IM的量的還原劑。反應液中的還原劑的濃度優(yōu)選為IOmM 500mM，更優(yōu)選為 50mM 500mM。就最佳條件(pH、反應時間、溫度、酶使用量、還原劑使用量等)而言，若參考本說明書的教導事項，則可以通過預實驗來容易地確定。應予說明，以上的各種條件也適合工序(2’)的反應。如后述的實施例示出的實驗結果所證明，利用本發(fā)明的方法時，盡管操作簡便，但也能夠實現(xiàn)蛋殼膜的完全溶解?！暗皻つさ耐耆芙狻笔侵傅皻つけ环纸獾街辽偻ㄟ^目視確認不到固態(tài)物的程度。在本發(fā)明的方法中，“蛋殼膜的完全溶解”不是必需的，但在蛋殼膜中的有用成分能夠不浪費地提取這點、不需要殘渣的除去等這點等上，優(yōu)選以實現(xiàn)“蛋殼膜的完全溶解”的方式設定條件。因此，在本發(fā)明的一種方式中，繼續(xù)工序(2)(或(2’))的反應，直至確認不到固態(tài)物。與此相反，在本發(fā)明的另一方式中，以固體成分殘存的狀態(tài)結束工序(2 )(或(2 ’))，然后，過濾溶液，除去固體成分(工序(3 ))。該方式在例如為了獲取容易分解或失活的成分方面是有用的。2.蛋殼膜溶解劑本發(fā)明的第2方面涉及蛋殼膜溶解劑。本發(fā)明的蛋殼膜溶解劑的特征點在于是將蛋白質分解酶和還原劑組合而成的。換言之，在本發(fā)明的蛋殼膜溶解劑中，將蛋白質分解酶和還原劑聯(lián)用。典型的是，本發(fā)明的蛋殼膜溶解劑被以將蛋白質分解酶和還原劑混合而成的配合劑的形式提供。另一方面，例如，也可以以由含有蛋白質分解酶的組分(第I構成組分)以及含有還原劑的組分(第2構成組分)構成的試劑盒的形式提供本發(fā)明的蛋殼膜溶解劑。還可以將2種以上的蛋白質分解酶聯(lián)用。同樣地也可以將2種以上的還原劑聯(lián)用。應予說明，對于蛋白質分解酶和還原劑，由于與本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法的情況相同，所以省略重復的說明。就本發(fā)明的蛋殼膜溶解劑而言，除了含有有效成分(蛋白質分解酶和/或還原劑)以外，還可以含有賦形劑、緩沖劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等。作為賦形齊IJ，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。3.蛋殼膜溶解物及含有其的組合物本發(fā)明的進一步的方面是提供 通過本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法得到的蛋殼膜溶解物。作為優(yōu)選的一種方式，提供蛋殼膜的完全溶解物。根據(jù)本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法，能夠在溫和的條件下將蛋殼膜溶解。因此，利用該方法得到的蛋殼膜溶解物大量含有在蛋殼膜中含有的有用成分(蛋白質(包括賴氨酰氧化酶、溶菌酶、β — N—乙?；被咸烟擒彰傅让?、膠原蛋白)、糖蛋白、肽(包括膠原蛋白肽)、糖肽、氨基酸、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等酸性粘多糖等)。在一種方式中，利用本發(fā)明的方法得到的蛋殼膜溶解物含有選自溶菌酶、β - N —乙?；被咸烟擒彰浮⑼该髻|酸、硫酸軟骨素以及硫酸皮膚素中的一種以上的成分。此外，利用本發(fā)明的方法得到的蛋殼膜溶解物通過顯示抗氧化活性和/或顯示血管緊張素轉化酶抑制活性而能被賦予特征。另一方面，另外一種方式的蛋殼膜溶解物的特征點是含有賴氨酰氧化酶。含有賴氨酰氧化酶的該蛋殼膜溶解物典型的是采用包括上述工序(I)和(2 ’)的蛋殼膜溶解方法而得到。本發(fā)明還提供含有蛋殼膜溶解物的組合物。本發(fā)明的組合物的用途沒有特別限定，優(yōu)選為醫(yī)藥品、準醫(yī)藥品、食品或化妝品。即，作為優(yōu)選的方式，本發(fā)明提供含有蛋殼膜溶解物的醫(yī)藥組合物、準醫(yī)藥組合物、食品組合物以及化妝品組合物。作為本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準醫(yī)藥組合物的用途或效果的例子，可舉出抗氧化、抗菌、抗炎癥、創(chuàng)傷治療、降血壓、毛發(fā)生長、營養(yǎng)補充。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準醫(yī)藥組合物的制劑化可以依照常法來進行。進行制劑化時，可以含有制劑上容許的其它成分(例如，載體、賦形劑、崩解劑、緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、鎮(zhèn)痛劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等)。作為賦形劑，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作為崩解劑，可以使用淀粉、羰甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為乳化劑，可以使用阿拉伯膠、藻酸鈉、黃芪膠等。作為懸浮劑，可以使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羰甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為鎮(zhèn)痛劑，可以使用芐醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。進行制劑化時的劑型也沒有特別限定，例如可以以片劑、粉劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、注射劑、外用劑以及栓劑等的形式提供本發(fā)明的醫(yī)藥組合物或準醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中含有為了獲得所期待的治療效果、預防效果所必需的量(即治療上有效量)的有效成分。同樣地，本發(fā)明的準醫(yī)藥組合物中含有為了獲得所期待的治療效果、預防效果所必需的量的有效成分。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物或準醫(yī)藥組合物中含有的有效成分量一般根據(jù)劑型、形式不同而異，但是將有效成分量以能夠達到所需的給藥量的方式，在例如約O.1重量％ 約95重量％的范圍內進行設定。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準醫(yī)藥組合物根據(jù)其劑型、形式而通過經口或非經口(靜脈內、動脈內、皮下、肌肉、或腹腔內注射、經皮、經鼻、經粘膜、涂布等)方式應用于對象。此處的“對象”沒有特別限定，包括人以及人以外的哺乳動物(包括動物寵物、家畜、實驗動物。具體為例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、猴子、牛、豬、山羊、綿羊、狗、貓、雞、鵪鶉等)。在優(yōu)選的一種方式中，應用對象是人。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準醫(yī)藥組合物的給藥量、使用量以能獲得所期待的效果的方式設定。在有效給藥量的設定中，一般考慮應用對象的癥狀、年齡、性別、體重等。應予說明，只要是本領域技術人員，就能夠考慮這些情況而設定適當?shù)慕o藥量。作為給藥時間表，可以采用例如一天一次 數(shù)次、二天一次、或者三天一次等。在給藥時間表的制作方面，可以考慮應用對象的癥狀、有效成分的效果持續(xù)時間等。如上所述， 本發(fā)明的一種方式是含有通過本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法得到的蛋殼膜溶解物的食品組合物。作為本發(fā)明中的“食品組合物”的例子，可舉出普通食品(谷類、蔬菜、食用肉、各種加工食品、點心類、牛奶、清涼飲用水、酒精飲料等)、營養(yǎng)補充食品(以抗氧化、抗菌、抗炎癥、創(chuàng)傷治療、降血壓、防老化等為目的的補充物或營養(yǎng)飲料等)、食品添加物。在為營養(yǎng)補充食品或食品添加物時，可以以粉末、顆粒、片劑、糊、液體等形狀提供。通過以食品組合物的形式提供由本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法得到的蛋殼膜溶解物，能夠日常攝取蛋殼膜溶解物，或者持續(xù)地攝取蛋殼膜溶解物。蛋殼膜溶解物的添加量能夠根據(jù)目的而任意地設定。例如，在對本發(fā)明的食品組合物期待有助于維持或增進健康或者治療或預防特定的疾病、病癥的效果時，優(yōu)選含有足以發(fā)揮該效果的量的蛋殼膜溶解物。添加量可以考慮食品的種類、食品的消費者(性別、年齡、體重等)、對食品所期待的效果等來確定。如上所述，本發(fā)明的一種方式是含有通過本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法得到的蛋殼膜溶解物的化妝品組合物。本發(fā)明的化妝品組合物可以通過配合蛋殼膜溶解物與在化妝品中通常使用的成分、基材(例如，各種油脂、礦物油、凡士林、角鯊烷、羊毛脂、蜂蠟、改性醇、棕櫚酸糊精、甘油、脂肪酸甘油酯、乙二醇、對羥基苯甲酸酯、樟腦、薄荷醇、各種維生素、氧化鋅、氧化鈦、苯甲酸、依地酸、洋甘菊油、角叉菜膠、甲殼質粉、殼聚糖、香料、著色料等)而得至|J。作為化妝品組合物的形式，可以例示臉或身體用的乳液、化妝水、膏、乳液(lotion)、精華液、油、美容涂敷劑(pack)、美容貼膜(sheet)、清潔劑等?；瘖y品組合物中的蛋殼膜溶解物的添加量沒有特別限定。例如，可以以成為O.1重量％ 60重量％的方式添加蛋殼膜溶解物。作為本發(fā)明的化妝品組合物的用途或效果的例子，可舉出保濕、浸潤、防止皮膚粗糙、美肌、防止皺紋、防止下垂、防止老化。除了上述以外，本發(fā)明的蛋殼膜溶解物還可以在金屬離子的回收、保濕劑、吸水齊U、抗菌劑、毛發(fā)生長劑等方面使用。4.蛋殼膜有用成分的提取方法本發(fā)明還提供應用了本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法的蛋殼膜有用成分的提取方法。在本發(fā)明的蛋殼膜有用成分的提取方法中，進行以下的工序(i)和(ii)。(i)基于本發(fā)明的蛋殼膜溶解方法的溶解工序(ii)將上述溶解工序中得到的蛋殼膜溶解物純化的工序在工序(ii)中， 適當組合過濾、離心處理、脫鹽、硫酸銨沉淀等鹽析、透析、各種色譜(離子交換色譜、疏水色譜、親和色譜等)等來進行純化。作為純化目標的有用成分，可例示溶菌酶、賴氨酰氧化酶、β - N —乙酰基氨基葡萄糖苷酶等酶、透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等酸性粘多糖。也可以階段性地純化，獲取2種以上的有用成分。采用本發(fā)明的方法得到的蛋殼膜有用成分與蛋殼膜溶解物的情況相同，可以用作在醫(yī)藥品、食品、化妝品等中使用或添加的成分。實施例1.利用蛋白質分解酶的蛋殼膜溶解的研究將雞蛋打破后取出蛋液，然后將帶蛋殼I旲的蛋殼在4重量％的乙酸水溶液中浸潰5 10分鐘左右，用手剝離蛋殼膜并取之。使用如下的蛋殼膜將剝取的蛋殼膜進行水洗，并充分去除水分。以蛋殼膜為基質，研究利用現(xiàn)有酶制劑能否將蛋殼膜溶解。使用市售的15種酶制劑(NEWLASE F3G、PROTEASE M、PROTEASE N、PROTEASE P3G、PROTEASE S、BROMELAIN F、PROLEATHER FG — F、肽酶 R、UMAMIZYME G、THERMOASE YlOO、ProteAX、PROTEASE A、PAPAINW40、PANCREATIN8AP、BI0S0RK)，在各種pH條件下(ρΗ4· 0 13. 0)進行反應。各pH范圍的緩沖液如下所述。PH4. 0,5. O使用IOOmM的NaOAc緩沖液，pH6. O使用IOOmM的MES-NaOH緩沖液，pH7. O使用IOOmM的HEPES-NaOH緩沖液，pH8. O使用IOOmM的Tris-HCl緩沖液，pH9. O 12. O使用IOOmM的甘氨酸-NaOH緩沖液，pH13. O使用IOOmM的KCl-NaOH緩沖液。酶量為0. l%(w/v)，蛋殼膜量為1. 0%(w/v)，反應溫度為60°C，孵育72小時。圖1表示使用BIOSORK作為試驗酶制劑時的結果。如該結果所示，即使進行了 72小時反應，在目視上也無法確認蛋殼膜的溶解(分解)。其它的14種酶制劑在目視上也未見溶解。2.基于蛋白質分解酶和還原劑共存的蛋殼膜溶解的研究由于單獨使用酶制劑時未見蛋殼膜的溶解，所以研究了與還原劑組合所帶來的效果。在本試驗中，使用BIOSORK和PROLEATHER FG-F作為對象酶制劑。使用IOOmM的甘氨酸-NaOH pH9. O作為緩沖液，在添加了 IOmM DTT或未添加的條件下嘗試溶解。酶量為0. l%(w/v)，蛋殼膜量為1. 0%(w/v)，反應溫度為60°C，進行孵育。圖2表示使用BIOSORK作為試驗酶制劑時的結果。如圖2所示，單獨使用DTT和單獨使用酶制劑時未見蛋殼膜的溶解，但在DTT與酶制劑共存的條件下在1. 5小時這樣的短時間內就看到溶解。此外，使用PROLEATHER FG-F時也獲得同樣的結果，完全溶解所需的時間比BIOSORK長(約2小時)。認為是還原劑使構成蛋殼膜的蛋白質中存在的二硫鍵開裂，結果變得容易溶解。此外，認為由于溶解被作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的PMSF所抑制，所以該試驗中的蛋殼膜的溶解是由蛋白酶所致的。3.基于蛋白質分解酶和還原劑(食品添加物)共存的蛋殼膜溶解的研究考慮安全性和成本，從食品添加物中探索能進行蛋殼膜的溶解的還原劑。首先，使用BIOSORK作為試驗酶制劑，分別添加10種還原劑(亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、L 一抗壞血酸、L 一半胱氨酸鹽酸鹽、亞硝酸鈉、硝酸鈉、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、DTT、硼氫化鈉、HITHIONEXTRACT YH_8、HITHI0N EXTRACT YH-15,HITHION EXTRACT YH-D12)，嘗試溶解。亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、L 一抗壞血酸、亞硝酸鈉、硝酸鈉、DTT、硼氫化鈉的試驗濃度為1、10、IOOmM0 L 一半胱氨酸鹽酸鹽、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽的試驗濃度為1、10、20、50mM。ΗΙΤΗΙ0ΝEXTRACT YH-8、HITHION EXTRACT YH-15, HITHION EXTRACT YH-D12 的試驗濃度為 1、5、10%(w/v)。緩沖液的pH條件分別在4. O 13. O下進行，并使用與前述相同的緩沖液。酶量為O. 1%或O. 5%(w/v)，蛋殼膜量為1. 0%(w/v)，反應溫度為600C，孵育6小時或12小時。在亞硫酸鈉存在的條件下基于PH變化的分解能力的比較中，亞硫酸鈉的濃度為IOOmM,使用ρΗ4· O 13. O的各緩沖液(IOOmM)進行試驗。在使用了 BIOSORK和PROLEATHER FG-F的試驗中，ρΗ4· O 5. 5使用NaOAc緩沖液，ρΗ5· 5 6. 5使用MES-NaOH緩沖液，ρΗ6· 5
7.5使用HEPES-NaOH緩沖液，ρΗ7· 5 9. O使用Tris-HCl緩沖液，ρΗ9. O 12. 5使用甘氨酸-NaOH緩沖液，ρΗ12. 5 13. O使用KCl-NaOH緩沖液。在使用了其它的13種酶制劑的試驗中，使用NaOAc緩沖液(ρΗ4. 0,5. 0)、MES-NaOH緩沖液(ρΗ6. 0)、HEPES-NaOH緩沖液(ρΗ7· 0)、Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8. 0)、甘氨酸-NaOH 緩沖液(ρΗ9. 0)進行。酶量為 0. l%(w/V)，蛋殼膜量為1.0%(w/v)，反應`溫度為60°C，進行孵育，測定完全溶解所需的時間。在分解模式的確認中，以BIOSORK和PROLEATHER FG-F為對象酶制劑，在各pH條件下以最終濃度成為ImM的方式向反應后的溶液中添加PMSF，從而使反應停止，將各樣品提供給SDS-PAGE分析。圖3表示試驗還原劑的種類和添加所致的蛋殼膜溶解(分解)的有無。在食品添加物中，亞硫酸鹽和亞硫酸氫鹽在IOOmM的濃度條件下顯示出顯著的效果。使用亞硫酸鈉時，在PH6. O 8. O下看到蛋殼膜被效率良好地溶解。使用L-半胱氨酸時，看到部分溶解。接著，在亞硫酸鈉存在的條件下，進行基于pH變化的分解能力的比較。圖4表示使用BIOSORK時的結果，橫軸表示反應pH，縱軸表示蛋殼膜完全溶解所需的時間。橫軸的反應pH不是調整時的pH,而是表示實際反應時的pH。表I示出調整時的pH與反應時的pH的對應表。[表I]
權利要求
1.一種蛋殼膜溶解方法，其特征在于，將蛋白質分解酶和還原劑聯(lián)用。
2.如權利要求1所述的蛋殼膜溶解方法，其中，包括在還原劑共存的條件下使蛋白質分解酶作用于蛋殼膜的工序。
3.如權利要求1所述的蛋殼膜溶解方法，其中，包括以下工序(I)和(2): (1)在溶劑中準備蛋殼膜的工序； (2)向所述溶劑添加還原劑和蛋白質分解酶，使之反應的工序。
4.如權利要求3所述的蛋殼膜溶解方法，其中，工序(2)的反應溶液的pH為4.5 9. 5。
5.如權利要求3或4所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述還原劑的濃度為5mM 1M。
6.如權利要求3 5中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，繼續(xù)所述工序(2)的反應，直至確認不到固態(tài)物。
7.如權利要求3 6中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，還包括以下的工序(3) (3 )將工序(2 )后的溶液過濾、除去固態(tài)物的工序。
8.如權利要求1 7中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶為堿性蛋白酶或中性蛋白酶。
9.如權利要求1 7中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶是選自絲氨酸內肽酶、半胱氨酸內肽酶、金屬內肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸內肽酶中的一種以上的酶。
10.如權利要求1 7中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶是選自糜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶、莖菠蘿蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的一種以上的酶。
11.如權利要求1 7中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述蛋白質分解酶是選自 BIOSORK、PROLEATHER FG — F、PAPAINW40、PROTEASE N、BROMELAIN F、UMAMIZYMEG,THERMOASE YI00、ProteAX、PROTEASE S、S UMIZ Y ME LP500,DESKIN C、PR0TIN NY10,PROTINPC 10, SUMIZYME MP、PROTIN AY以及蛋白酶K中的一種以上的酶。
12.如權利要求1 11中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述還原劑是選自亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、L 一半胱氨酸、N —乙?；?L 一半胱氨酸、2 —巰基乙醇、谷胱甘肽以及DTT中的一種以上的還原劑。
13.如權利要求1 11中任一項所述的蛋殼膜溶解方法，其中，所述還原劑為亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉。
14.如權利要求1所述的蛋殼膜溶解方法，其中，包括以下的工序(I)和(2’) (1)在溶劑中準備蛋殼膜的工序； (2’)向所述溶劑添加還原劑而使之反應后，除去還原劑，接著添加蛋白質分解酶，使之反應的工序。
15.一種蛋殼膜溶解劑，是將蛋白質分解酶和還原劑組合而成的。
16.如權利要求15所述的蛋殼膜溶解劑，其特征在于，含有蛋白質分解酶和還原劑。
17.如權利要求15所述的蛋殼膜溶解劑，其特征在于，是由含有蛋白質分解酶的第I構成組分、以及含有還原劑的第2構成組分構成的試劑盒。
18.—種蛋殼膜溶解物，是通過權利要求1 13中任一項所述的蛋殼膜溶解方法得到的。
19.如權利要求18所述的蛋殼膜溶解物，其中，含有選自溶菌酶、β— N—乙?；被咸烟擒彰?、透明質酸、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素中的一種以上的成分。
20.如權利要求18所述的蛋殼膜溶解物，其中，顯示選自抗氧化活性和血管緊張素轉化酶抑制活性中的一種以上的活性。
21.一種蛋殼膜溶解物，是通過權利要求14所述的蛋殼膜溶解方法得到的。
22.如權利要求21所述的蛋殼膜溶解物，其中，含有賴氨酰氧化酶。
23.如權利要求18 22中任一項所述的蛋殼膜溶解物，其中，是蛋殼膜的完全溶解物。
24.一種組合物，含有權利要求18 23中任一項所述的蛋殼膜溶解物。
25.如權利要求24所述的組合物，其中，是醫(yī)藥品、準醫(yī)藥品、食品或化妝品。
26.一種蛋殼膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i)和(ii) (i)利用權利要求1 13中任一項所述的方法的溶解工序； ( )將在所述溶解工序中得到的蛋殼膜溶解物純化的工序。
27.如權利要求26所述的蛋殼膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被純化的成分是選自溶菌酶和β — N—乙?；被咸烟擒彰钢械拿福蛘哌x自透明質酸、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素中的酸性粘多糖。
28.通過權利要求27所述的方法得到的溶菌酶、β— N—乙?；被咸烟擒彰?、透明質酸、硫酸軟骨素或硫酸皮膚素。
29.一種蛋殼膜有用成分的提取方法，其特征在于，包括以下的工序(i’)和(ii) (i’)利用權利要求14所述的方法的溶解工序； (ii)將在所述溶解工序中得到的蛋殼膜溶解物純化的工序。
30.如權利要求29所述的蛋殼膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被純化的成分為賴氨酰氧化酶。
31.通過權利要求30所述的方法得到的賴氨酰氧化酶。
32.通過權利要求26或29所述的蛋殼膜有用成分的提取方法得到的蛋殼膜提取物。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供一種蛋殼膜溶解方法，其能夠解決利用酸和/或堿的處理、利用蛋白質分解酶的現(xiàn)有處理方法所具有的問題中的至少一個，即，(1)需要粉末化、超聲波處理、沸騰處理之類的前處理；(2)需要長時間的處理；(3)分解率低(約20％)。通過將蛋白質分解酶和還原劑聯(lián)用，將蛋殼膜有效率地溶解。
文檔編號A61K35/54GK103069000SQ20118004000
公開日2013年4月24日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者田中俊一 申請人:天野酶株式會社