專利名稱：在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組adamts13的方法
在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組ADAMTS13的方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2010年7月8日提交的美國臨時專利申請系列號61/362，635的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容特此以引用的方式整體并入本文用于所有目的。
背景技術(shù)：
治療性蛋白在細胞培養(yǎng)物(特別是大規(guī)模細胞培養(yǎng)物，包括真核細胞培養(yǎng)物和更具體的哺乳動物細胞培養(yǎng)物)中的重組表達，需要使用特殊培養(yǎng)基，所述特殊培養(yǎng)基為細胞的有效生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。經(jīng)常給細胞培養(yǎng)基制劑補充多種添加劑，包括胎牛血清(FCS)、動物衍生的蛋白和/或牛源蛋白水解物以及從植物或酵母衍生出的蛋白水解物。使用這種培養(yǎng)物的一項挑戰(zhàn)是，甚至當(dāng)細胞培養(yǎng)基的制劑沒有變化時，在不同的細胞培養(yǎng)物之間，蛋白的量和生產(chǎn)的蛋白的總活性和比活性經(jīng)常會變化。在使用10升至超過20，000升的細胞培養(yǎng)體積的大規(guī)模生產(chǎn)工藝的情況下，該變化性是特別明顯的。含有水解物的細胞培養(yǎng)基特別易于隨細胞培養(yǎng)物不同而變化，從而導(dǎo)致減少的總蛋白產(chǎn)量以及降低的總活性和比活性。在不同的細胞培養(yǎng)物之間看到的變化性的一個潛在原因是，在添加劑(諸如水解物)中的污染物隨批次不同而變化。一般而言，血清或血清衍生的物質(zhì)(例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素)可以包含不想要的試劑，所述試劑可污染細胞培養(yǎng)物和由其獲得的生物制品。此外,必須針對所有已知病毒(包括可通過血清傳播的肝炎病毒和HIV)測試人血清衍生的添加劑。此外，牛血清和從其衍生的制品具有BSE污染的風(fēng)險。此外，所有血清衍生的制品可被未知物質(zhì)污染。當(dāng)使用血清或從細胞培養(yǎng)中的人或動物來源衍生的蛋白添加劑時，存在許多問題(例如，不同批次的組合物的不同質(zhì)量以及被支原體屬、病毒或BSE污染的風(fēng)險)，特別是如果細胞被用于制造用于人施用的藥物或疫苗時。因此，已作出許多努力以提供不需要血清或其它動物蛋白化合物的有效宿主系統(tǒng)和培養(yǎng)條件。已基于衍生自植物或酵母的蛋白提取物開發(fā)了這樣的無血清培養(yǎng)基。例如，已知大豆水解物對于發(fā)酵方法是有用的，并且可增強許多需要復(fù)雜營養(yǎng)的生物體、酵母和真菌的生長。WO 96/26266描述了大豆粉(soy meal)的木瓜蛋白酶消化物是碳水化合物和氮的來源，并且許多組分可用于組織培養(yǎng)。Franek等人(BiotechnologyProgress (2000) 16，688-692)描述了確定的大豆和小麥水解物肽級分的生長和生產(chǎn)力促進效應(yīng)。WO 96/15231公開了由合成的最低必需培養(yǎng)基和酵母浸出物組成的無血清培養(yǎng)基，其用于脊椎動物細胞的繁殖和病毒生產(chǎn)過程。由基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基(其包含水稻肽和酵母提取物及其酶消化物)和/或用于培養(yǎng)動物細胞的植物脂質(zhì)組成的培養(yǎng)基制劑公開于WO98/15614中。用于培養(yǎng)重組細胞的包含純化的大豆水解物的培養(yǎng)基公開于WO 01/23527中。WO 00/03000公開了包含大豆水解物和酵母提取物的培養(yǎng)基，但是該培養(yǎng)基也需要重組形式的動物蛋白(例如生長因子)的存在。EP-A-O 481 791描述了用于培養(yǎng)工程改造的CHO細胞的生物化學(xué)成分確定(biochemically defined)的培養(yǎng)基,其不含從動物來源分離的蛋白、脂質(zhì)和碳水化合物，其還包含重組胰島素或胰島素類似物、1%至0.025%w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。WO 98/08934描述了一種無血清真核細胞培養(yǎng)物，其包含水解的大豆肽(1-1OOOmg/L)、0.01-lmg/L腐胺和多種動物衍生的組分(包括白蛋白、胎球蛋白、多種激素和其它蛋白)。在該背景下，應(yīng)當(dāng)指出，還已知腐胺以0.08mg/L的濃度包含在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(如DMEM/Ham’s F12)中。然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其它未知組分和污染物的成分不明確的混合物。此外，水解物的商購可得批次的質(zhì)量變化極大。因此，重組蛋白或病毒產(chǎn)物的產(chǎn)量隨著所使用的水解物的批次而存在較大變異(最高達3倍的變異)(“批間變異”)。該缺點會影響細胞的增殖以及每種細胞的蛋白表達。US 2007/0212770描述了不同的不含動物蛋白的且不含寡肽的化學(xué)成分確定(chemically defined)的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基可用于重組蛋白生物藥劑的大規(guī)模生產(chǎn)。止血包含不同止血反應(yīng)途徑的相互作用，最終導(dǎo)致血栓形成。血栓是血液組分在血管壁的表面上的沉著物，其主要由聚集的血小板和不溶性的交聯(lián)的纖維蛋白組成。纖維蛋白形成是凝血酶(一種凝結(jié)酶)對纖維蛋白原的限制性蛋白酶解的結(jié)果。凝血酶是凝血連鎖和多種血管細胞的終產(chǎn)物，所述凝血連鎖是在活化的血小板和白血球的表面上發(fā)生的一系列酶原活化(綜述參見:K.G.Mann等人，Blood, 1990，第76卷，第1-16頁)。凝血連鎖的一項重要功能是，通過活化的因子IX(因子IXa)和活化的因子VIII (因子VIIIa)的復(fù)合物對因子X的活化。該復(fù)合物的組分的缺乏或功能障礙與稱作血友病的血液疾病有關(guān)(J.E.Sadler 和 E.W.Davie:HemophiIia A, Hemophilia B, and vonffillebrand, s Disease, G.Stamatoyannopoulos 等人(編):The molecular basis ofblood diseases, ff.B.Saunders C0., Philadelphia, 1987,第 576-602 頁)。A 型血友病是與因子VIII活性的缺乏有關(guān)，而B型血友病與因子IX缺乏有關(guān)。當(dāng)前的治療包括補償療法，其中使用包含正常凝血因子的藥物制劑。在這些血小板病中，A型血友病更經(jīng)常地發(fā)生，影響大約1/10,000的人。A型血友病患者的補償療法包括:通過靜脈內(nèi)輸注，重復(fù)施用含有正常因子VIII的制劑。輸注之間之間隔隨血液循環(huán)中的因子VIII活性的降解而變化。在輸注以后因子VIII活性的半衰期隨個體不同而異，在10-30小時的范圍內(nèi)。因而，預(yù)防性治療需要每2-3天輸注I次。這對血友病患者的生活造成沉重負擔(dān)，具體地，如果靜脈接入已經(jīng)變得困難(由于靜脈內(nèi)輸注進行頻繁的針穿刺以后造成的局部citratization)。如果通過使用具有延長的半衰期的因子VIII來降低輸注頻率，將是特別有利的。本領(lǐng)域眾所周知的是，未活化的因子VIII異源二聚體的半衰期強烈地依賴于vonWillebrand因子的存在，所述von Willebrand因子表現(xiàn)出對因子VIII的(但是對因子VIIIa則沒有)強親和力并充當(dāng)載體蛋白(J.E.Sadler和E.W.Davie:HemophiIiaA, Hemophilia B and von Willebrand, sDisease, G.Stamatoynnopoulos 等人(編):The molecularbasis of blood diseases, ff.B.Saund ersC0., Philadelphia, 1987,第 576-602 頁)。已知的是，遭受3型von Willebrand氏病的患者(其在血液循環(huán)中不具有可檢測的vonWillebrand因子)也遭受繼發(fā)性的因子VIII缺乏。另外，靜脈內(nèi)地施用的因子VIII在這些患者中的半衰期是2-4小時，這比在A型血友病患者中觀察到的10-30小時明顯更短。從這些發(fā)現(xiàn)得出結(jié)論:因子VIII傾向于從血液循環(huán)中快速地清除，并且該過程在某種程度上受到與它的天然載體von Willebrand因子的復(fù)合物形成的抑制。Von Willebrand因子(vWF)是一種作為一系列多聚體在血衆(zhòng)中循環(huán)的糖蛋白，所述多聚體的大小范圍通常是約500-20，OOOkD (或vWF的2_40 二聚體)。二聚體和多聚體形式的vWF由通過二硫鍵連接到一起的250kD多肽亞基組成。vWF介導(dǎo)血小板向損傷的血管壁的內(nèi)皮下膜的初始附著；不過，更多的多聚體也表現(xiàn)出止血活性。多聚化的VWF會結(jié)合血小板表面糖蛋白Gplb α (通過在VWF的Al結(jié)構(gòu)域中的相互作用)，以便促進血小板附著。假定內(nèi)皮細胞分泌大聚合形式的vWF，并且具有低分子量的這些vWF形式(低分子量vWF)已經(jīng)從蛋白水解性裂解產(chǎn)生。具有大分子質(zhì)量的多聚體被儲存在內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體中，并在受:到刺激以后釋放。FVIII結(jié)合活性的降低(由于降低的vWF蛋白水平或降低的FVIII結(jié)合親和力)會導(dǎo)致3類von Willebrand氏病之一。額外地或或者，某些類型的von Willebrand氏病的特征在于，Gplb α介導(dǎo)的血小板結(jié)合水平的增加或降低，即在2Α、2Β和2Μ型中(總結(jié)在:Castaman 等人，Disorders of Hemostasis88 (I): 94-108 (2003))。這樣，vWF 與 FVIII 和Gplba的相互作用的調(diào)控，是用于治療血友病和von Willebrand氏病的可行策略。鑒于vWF的生物學(xué)重要性，本領(lǐng)域不斷地需要改進生產(chǎn)用于治療用途的vWF的方法。眾所周知，vWF可以分離自內(nèi)源來源諸如人血漿。分離的vWF的有利方面是，它具有高比活性用于實現(xiàn)它的生物學(xué)功能，且因此可以有效地用作治療性蛋白用于治療相關(guān)疾病諸如von Willebrand氏病。通常，血漿vWF具有約lOOmU/μ g的利托菌素比活性，但是從人血漿中分離具有缺點，因為例如，所述血漿可以含有多種病毒，諸如HIV和/或肝炎病毒，所述病毒可傳遞至患者。此外，血漿是有限的資源，并且因而血漿的短缺在提供足夠用于治療的vWF中可以成為問題。這樣，在解決與依賴于血漿作為vWF來源有關(guān)的一些問題中，用于生產(chǎn)vWF的重組方法是有利的。就重組生產(chǎn)而言，克隆vWF的全長cDNA ;前多肽與全長前原-vWF 的氨基酸殘基 23-764 相對應(yīng)(Eikenboom 等人，(1995) Haemophilial, 77-90)。不幸的是，vWF是具有復(fù)雜的翻譯后修飾的分子。并且，vWF 二聚體在高爾基體中向大型和超大型多聚體的多聚化，是在哺乳動物細胞中表達的一項挑戰(zhàn)。例如，在細胞培養(yǎng)物(例如，人(原代)內(nèi)皮細胞的細胞培養(yǎng)物)中表達的高分子量vWF依賴于超大型vWF分子在Weibel-Palade小體中的專門儲存。這樣的細胞培養(yǎng)物不適用于生產(chǎn)治療性蛋白。其它細胞培養(yǎng)方法已經(jīng)見諸報道，并且已知細胞培養(yǎng)條件可以以多種方式影響vWF的生產(chǎn)。例如，已經(jīng)證實，高濃度的銨(NH4+)會擾亂翻譯后修飾。Mayadas等人(J.Biol.Chem.，264(23): 13497-13503, 1989)證實，25mM的銨水平會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞中減少的vWF多聚化，其也不利地影響重組vWF的利托菌素比活性。多聚化的減少通常與重組vWF的活性(特別是利托菌素比活性)的降低有關(guān)。仍然難以預(yù)測哪些參數(shù)可以積極地或消極地影響特定蛋白(特別是復(fù)雜的糖蛋白，如因子VIII和vWF)的生產(chǎn)。例如，已經(jīng)證實，細胞培養(yǎng)基的某些組分會影響因子VIII的生產(chǎn)。如在美國專利號5，804，420中公開的，多元醇、銅和其它微量金屬的加入，可以積極地影響因子VIII的生產(chǎn)產(chǎn)率。也如在WO 2009/086309中描述的，已經(jīng)證實，使用銅的細胞培養(yǎng)方法會提高因子VIII的生產(chǎn)。Mignot等人(1989)也已經(jīng)報道了 vWF在重組CHO細胞中的表達。但是，這些實例都沒有提供關(guān)于vWF的比活性或它的多聚體分布的信息。

ADAMTS(具有I型凝血酶敏感蛋白基序的解聚素和金屬蛋白酶)蛋白是包含許多保守結(jié)構(gòu)域(包括鋅依賴性的催化結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、解聚素樣結(jié)構(gòu)域和至少一個(在大多數(shù)情況下多個)I型凝血酶敏感蛋白重復(fù)的金屬蛋白酶家族(關(guān)于綜述，參見 Nicholson 等人，BMC Evol Biol.2005Feb4; 5 (I): 11)。在進化上與金屬蛋白酶的 ADAM和 MMP 家族相關(guān)的這些蛋白(Jones GC, Curr Pharm Biotechnol.2006Feb; 7 (I): 25-31)是已經(jīng)與許多疾病和病癥相關(guān)聯(lián)的分泌型酶，所述疾病和病癥包括:血栓性血小板減少性紫癜(TTP)(Moake JL, Semin Hematol.2004Jan;41(I):4-14)、結(jié)締組織障礙、癌癥、炎癥(Nicholson等人)和嚴(yán)重的惡性瘧原蟲瘧疾(Larkin等人，PLoSPathog.2009Mar;5(3):el000349)。由于這些關(guān)聯(lián)，ADAMTS酶已被公認為許多病理學(xué)的潛在治療靶標(biāo)(Jones GC, Curr Pharm Biotechnol.2006Feb; 7 (I): 25-31)。因此，需要生產(chǎn)大量具有高比活性的ADAMTS蛋白的方法，所述蛋白不含污染物諸如病毒、BSE和病原體如支原體屬細菌。
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一個ADAMTS家族成員ADAMTS13在殘基Tyrl605和Metl606之間切割VonWillebrand因子(vWF)，該功能負責(zé)在體內(nèi)降解大vWF多聚體。ADAMTS13活性的喪失已經(jīng)與許多病癥相關(guān)聯(lián)，所述病癥例如 TTP (Moake JL, Semin Hematol.2004Jan;41 (I):4_14)、急性和慢性炎癥(Chauhan等人，JExpMed.2008S印I; 205 (9): 2065-74)以及最近嚴(yán)重的惡性瘧原蟲瘧疾(Larkin 等人，PLoS Pathog.2009Mar; 5 (3):el000349)。ADAMTS13蛋白酶是主要由肝產(chǎn)生的190kDa糖基化的蛋白(Levy等人，Nature.200I;413:488-494;Fujikawa等人，Blood.2001;98:1662-1666;Zheng等人，J Biol Chem.200I; 276:41059-41063; Soejima 等人，J Biochem (Tokyo)。2001; 130:475-480 ;和 Gerritsen等人，Blood.2001; 98:1654-1661)。與高階rVWF多聚體非常類似，大ADAMTS13在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的重組表達存在許多挑戰(zhàn)。因此，需要提供細胞培養(yǎng)條件，特別是大規(guī)?！どa(chǎn)性的培養(yǎng)條件，所述條件會提供在不同細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的蛋白之間一致的總蛋白產(chǎn)率和/或一致的總活性和比活性。在大規(guī)模生產(chǎn)工藝中培養(yǎng)物之間的一致性，在治療性蛋白的生產(chǎn)中具有重要性。也需要用于大規(guī)模生產(chǎn)rVWF的細胞培養(yǎng)條件，所述rVWF具有與在正常人血漿中存在的VWF相當(dāng)或比其更高的多聚體分布和利托菌素比活性。類似地，由于ADAMTS蛋白·已經(jīng)涉入許多疾病和病癥,本領(lǐng)域需要大規(guī)模生產(chǎn)具有高比活·性的重組ADAMTS蛋白的方法，所述重組ADAMTS適合用于藥物制劑和施用。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域內(nèi)對重組Von Willebrand因子和重組ADAMTS13的生產(chǎn)的這些和其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
在某些方面，本發(fā)明是基于下述令人驚奇的發(fā)現(xiàn):用于表達重組Von Willebrand因子(rVWF)和重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)基的補充，會產(chǎn)生顯著提高的蛋白表達和酶活性。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)重組Von Willebrand因子(rVWF)組合物的方法，所述方法包括下述步驟:(a)提供基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基；(b)給所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，以提供至少2.4 μ g/L的最終銅濃度；(C)提供一個或多個細胞，所述細胞包含編碼rVWF蛋白的核酸；(d)在補充了銅的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一個或多個細胞，使得所述細胞表達rVWF并將其分泌進培養(yǎng)物上清液中；和(e)回收所述培養(yǎng)物上清液的至少一部分，其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素輔因子比活性為至少30mU/l.! g rVWF。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述方法另外包括下述步驟:在培養(yǎng)所述一個或多個細胞之前，用水解物補充所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述水解物是植物水解物。在一個具體實施方案中，所述水解物是大豆水解物。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是不含動物蛋白的培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是不含蛋白的培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述補充銅的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少4 μ g/L銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述補充銅的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是 2.4 μ g/L 至 20 μ g/L 銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，補充基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的銅以銅鹽、銅螯合物或它們的組合的形式提供。在上文提供的方法 的一個實施方案中，所述銅鹽選自:硫酸銅、醋酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅和氧化銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述一個或多個細胞是哺乳動物細胞。在一個具體實施方案中，所述哺乳動物細胞是CHO細胞。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)所述一個或多個細胞包括:所述細胞的分批培養(yǎng)。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)所述一個或多個細胞包括:所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)。在一個具體實施方案中，所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)以恒化模式進行。在另一個具體實施方案中，所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)以灌注模式進行。在上文提供的方法的一個實施方案中，在至少100L所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一個或多個細胞。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于2.5xl06個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于2.0xlO6個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于1.5xl06個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述回收培養(yǎng)物上清液的至少一部分的步驟包括過濾或離心，以從培養(yǎng)物上清液的一部分中除去細胞。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述回收的上清液的rVWF的利托菌素輔因子比活性為至少^mU/yg rVWF。在一個具體實施方案中，所述回收的上清液的rVWF的利托菌素輔因子比活性為至少50mU/l.! g rVWF。在一個更具體的實施方案中，所述回收的上清液的rVWF的利托菌素輔因子比活性為至少eOmU/yg rVWF。在一個更具體的實施方案中，所述回收的上清液的rVWF的利托菌素輔因子比活性為至少70mU/l.! g rVWF。在一個更具體的實施方案中，所述回收的上清液的rVWF的利托菌素輔因子比活性為至少80mU/l.! grVWF。在上文提供的方法的一個實施方案中，上清液中至少10%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在一個具體實施方案中，至少15%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在另一個具體實施方案中，至少20%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在另一個具體實施方案中，至少25%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在另一個具體實施方案中，至少30%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述上清液含有14-22個二聚體的高分子量VWF多聚體。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于IOmM的濃度。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于4mM的濃度。在上文提供的方法的一個實施方案中，rVWF是與重組因子VIII(rFVIII)共表達。在一個具體實施方案中，所述方法另外包括下述步驟:從回收的上清液中存在的至少50%的rFVIII中，純化出rVWF。在一個實施方案中，在所述純化步驟以后，rVWF與rFVIII之比是至少10:1。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述方法另外包括rVWF富集步驟。在第二方面，本發(fā)明提 供了通過本文提供的方法制備的重組Von Willebrand因子(rVWF)組合物。在上面提供的組合物的一個實施方案中，所述組合物另外包含重組因子VIII (rFVIII)。在一個具體實施方案中，rVWF與rFVIII之比是至少10:1。在上面提供的組合物的一個實施方案中，所述組合物配制成用于藥物給藥。在一個具體實施方案中，所述組合物配制成用于靜脈內(nèi)給藥。在第三方面，本發(fā)明提供了一種包含重組Von Willebrand因子(rVWF)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液是通過本文提供的方法制備。在第四方面，本發(fā)明提供了一種包含重組Von Willebrand因子(rVWF)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液中至少10%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在一個具體實施方案中，所述上清液中至少15%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在另一個具體實施方案中，所述上清液中至少20%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在另一個具體實施方案中，所述上清液中至少25%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在另一個具體實施方案中，所述上清液中至少30%的rVWF是以超過10個二聚體的高分子量VWF多聚體的形式存在。在上面提供的上清液的另一個具體實施方案中，所述上清液是根據(jù)本文提供的方法制備。
在第五方面，本發(fā)明提供了一種包含重組Von Willebrand因子(rVWF)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少0.4IU利托菌素輔因子活性。在一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少0.5IU利托菌素輔因子活性。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少0.6IU利托菌素輔因子活性。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少0.7IU利托菌素輔因子活性。在上面提供的上清液的另一個具體實施方案中，所述上清液是根據(jù)本文提供的方法制備。在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)重組ADAMTS13(rA13)組合物的方法，所述方法包括下述步驟:(a)提供基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基；(b)給所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，以提供至少1.0 μ g/L的最終銅濃度；(c)提供一個或多個細胞，所述細胞包含編碼rA13蛋白的核酸；(d)在補充了銅的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一個或多個細胞，使得所述細胞表達rA13并將其分泌進培養(yǎng)物上清液中；和(e)回收所述培養(yǎng)物上清液的至少一部分，其中在所述回收的培養(yǎng)物上清液中存在每天每升經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基至少1500單位FRETS-VWF73 活性。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是不含動物蛋白的培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是不含蛋白的培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少I μ g/L銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少2 μ g/L銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少4 μ g/L銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是I μ g/L至6 μ g/L銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是2 μ g/L至4 μ g/L銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，補充基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的銅以銅鹽、銅螯合物或它們的組合的形式提供。在一個具體實施方案中，所述銅鹽選自:硫酸銅、醋酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅和氧化銅。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述一個或多個細胞是哺乳動物細胞。在一個具體實施方案中，所述哺乳動物細胞是CHO細胞。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)所述一個或多個細胞包括:所述細胞的分批培養(yǎng)。在上文提供的方法的一個實施 方案中，所述培養(yǎng)所述一個或多個細胞包括:所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)。在一個具體實施方案中，所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)以恒化模式進行。在另一個具體實施方案中，所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)以灌注模式進行。
在上文提供的方法的一個實施方案中，在至少100L所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一個或多個細胞。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于4.0xlO6個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于3.5xl06個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于3.0xlO6個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于2.5xl06個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于2.0xlO6個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，細胞密度維持在小于1.5xl06個細胞/mL。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述回收培養(yǎng)物上清液的至少一部分的步驟包括過濾或離心，以從培養(yǎng)物上清液的一部分中除去細胞。在上文提供的方法的一個實施方案中，在所述回收的培養(yǎng)物上清液中存在每天每升經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在上文提供的方法的一個實施方案中，在所述回收的培養(yǎng)物上清液中存在每天每升經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基至少2500單位FRETS-VWF73活性。

在上文提供的方法的一個實施方案中，所述回收的上清液的rA13的FRETS-VWF73比活性為至少800mU/ μ g。在上文提供的方法的一個優(yōu)選的實施方案中，所述回收的上清液的r A13的FRETS-VWF73 比活性為至少 1200mU/y g。在上文提供的方法的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述回收的上清液的rA13的FRETS-VWF73 比活性為至少 1600mU/y g。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于IOmM的濃度。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于5mM的濃度。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于4mM的濃度。在上文提供的方法的一個實施方案中，所述方法另外包括rA13富集步驟。在第七方面，本發(fā)明提供了一種包含重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液是通過本文提供的方法制備。在第八方面，本發(fā)明提供了一種包含重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少5UFRETS-VWF73活性。在一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少6 U FRETS-VWF73活性。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少7 U FRETS-VWF73活性。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少8 UFRETS-VWF73活性。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少9 U FRETS-VWF73活性。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少10 U FRETS-VWF73活性。在上面提供的上清液的另一個具體實施方案中，所述上清液是根據(jù)本文提供的方法制備。在第九方面，本發(fā)明提供了一種包含重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少2yg rA13。在一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少3yg rA13。在另一個具體實施方案中,所述上清液每mL含有至少4 μ g rA13。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少5μ g rA13。在另一個具體實施方案中，所述上清液每mL含有至少6yg rA13。在上面提供的上清液的另一個具體實施方案中，所述上清液是根據(jù)本文提供的方法制備。在第十方面，本發(fā)明提供了通過根據(jù)任一種上述方法的方法制備的重組ADAMTS13 (rA13)組合物。在上面提供的組合物的一個實施方案中，所述組合物配制成用于藥物給藥。在一個具體實施方案中，所述組合物配制成用于靜脈內(nèi)給藥。


圖1.(IA)如實施例2所述，在有低(1.0 μ g/L)和高(4.3 μ g/L)銅濃度存在下，在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表達的rVWF的低分辨率(1%)瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)當(dāng)指出，培養(yǎng)第3天相當(dāng)于表7和表8的分批培養(yǎng)第I天。(IB)如由圖1A限定的帶指示的，通過密度計分析量化的具有1-10個二聚體(帶編號I)和超過10個二聚體(帶編號2)的VWF多聚體的相對量。圖2.(2A)在有高或低水平的銅存在下，以高和低細胞密度培養(yǎng)的rVWF細胞培養(yǎng)物上清液中存在的平均rVWF比活性的區(qū)間圖。(2B)在有高或低水平的銅存在下，以高和低細胞密度培養(yǎng)的rVWF細胞培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)的平均NH4+濃度的區(qū)間圖。

圖3.通過SDS-PAGE分析研究了在有遞增水平的銅存在下表達重組ADAMTS13的細胞培養(yǎng)物的上清液。通過(3A)銀染色和(3B)抗-A13蛋白印跡法，在SDS-PAGE以后顯影的rA13。圖4.體積生產(chǎn)率(P Frets)數(shù)據(jù)相對于銅濃度的關(guān)系圖，其顯示了對rA13生產(chǎn)率的最佳銅濃度效應(yīng)的外推(實線)。圖5A-K.表達rA13的連續(xù)懸浮(恒化器)細胞培養(yǎng)物在8周培養(yǎng)時間內(nèi)的條形圖，所述條形圖對比了基礎(chǔ)銅水平(0.66 μ g/L)的影響和補充至2 μ g/L銅的終濃度的培養(yǎng)物的影響。每個條代表恒化培養(yǎng)I周的平均數(shù)據(jù)。圖例表示在數(shù)據(jù)中代表的特定周。圖6.(6A)如實施例3所述，在高和低細胞密度下，在有低(1.0 μ g/L)和高(4.3 μ g/L)銅濃度存在下，在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表達的rVWF的低分辨率(1%)瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)當(dāng)指出，培養(yǎng)第8天和第17天(“CST81P“CST17”)相當(dāng)于表10至表13的第8天和第17天。(6B)如由圖6A限定的帶指示的，通過密度計分析量化的具有1-10個二聚體和超過10個二聚體的VWF多聚體的相對量。
具體實施例方式1.前言
通過在大規(guī)模哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表達，可以生產(chǎn)重組vWF(rVWF)和重組ADAMTS13 (rA13)。但是，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)的細胞培養(yǎng)條件生產(chǎn)時，這些蛋白的活性經(jīng)常在細胞培養(yǎng)物之間變化，甚至當(dāng)培養(yǎng)基的一般配方?jīng)]有變化時，且重組蛋白的比活性經(jīng)常不等于從血漿衍生出的vWF和rA13的比活性。另外，在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表達的rVWF傾向于生產(chǎn)具有低(低于10%)百分比的高階多聚體(高階多聚體包括含有超過10個VWF 二聚體的分子)的蛋白組合物。在rVWF和rA13的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)方法中的這些缺點，在開發(fā)用于大規(guī)模生產(chǎn)的培養(yǎng)物(即10至超過20，000升培養(yǎng)物)時尤其成問題。在不同細胞培養(yǎng)物批次中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的變化性的一種可能原因是，在細胞培養(yǎng)基的組分中存在污染物。在不同批次中可能存在不同量的這些污染物，從而引起rVWF和rA13生產(chǎn)中的變化結(jié)果。在研究于各種細胞培養(yǎng)基添加劑中發(fā)現(xiàn)的不同污染物后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，水解物的存在會引起細胞培養(yǎng)基中銅濃度的變化。深入研究得出以下驚人的結(jié)果:在細胞培養(yǎng)基中補充銅濃度以生成至少約I μ g/L至約20 μ g/L的總銅濃度，可一致地增加rVWF和rA13的總活性和比活性，和/或也可引起總蛋白產(chǎn)率增加。因而，本發(fā)明提供了用于高產(chǎn)率生產(chǎn)具有高比活性的rVWF和rA13蛋白的方法和組合物。在一個方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)大量rVWF和rA13的細胞培養(yǎng)方法和組合物，所述rVWF和rA13的活性與血漿衍生的vWF(pdVWF)或血漿衍生的ADAMTS13 (pdA13)相當(dāng)或比其更高。在其它方面，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的rVWF和rA13蛋白一致地表現(xiàn)出比使用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)方法在未補充銅或本文中進一步詳述的其它補充物的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的蛋白更高的活性。有利的是，在本文中提供的方法和組合物的某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的rVWF和rA13蛋白一致地表現(xiàn)出比使用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)方法在未補充銅或本文中進一步詳述的其它補充物的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的蛋白更高的比活性(即U/mg蛋白)。同樣地，與利用未補充銅或本文中進一步詳述的其它補充物的培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)方法相比，本文中提供的用于生產(chǎn)rVWF和rA13的方法會提供更高的每體積培養(yǎng)物的活性產(chǎn)率(即U/L/D)。在另一個方面，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)方法，其中給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總濃度為至少約I μ g/L。在其它實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總濃度為至少約2μ g/L。在其它實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總濃度為至少約I μ g/L至約20 μ g/L。在一些實施方案中，所述銅的總濃度為約1.5-4.5 μ g/L。在某些實施方案中，補充細胞培養(yǎng)基，達到約 1、1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,2.2,2.4,2.6,2.8、3、3.2,3.4,3.6,3.8、4,4.2,4.4,4.6,4.8,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20μ g/L銅或更高?；A(chǔ)細胞培養(yǎng)基通常具有低于I μ g/L的微量銅濃度。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)方法，其中給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充約1.0 μ g/L至約20 μ g/L銅以用于生產(chǎn)rVWF。在其它實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充約1.5-15,2.0-10,2.5-8,3.0-6,4.0-5.0 μ g/L銅以用于生產(chǎn)rVWF。在其它實施方案中，除補充的銅外，基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基還包括一種或多種水解物。 在其它實施方案中，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)方法，其中給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充約1.5 μ g/L至約4 μ g/L銅以用于生產(chǎn)rA13。在其它實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充約 1.6-3.8,1.7-3.6,1.8-3.4,1.9-3.2,2.0-3.0,2.1-2.8,2.2-2.6,2.3-2.4 μ g/L 銅以用于生產(chǎn)rA13。在其它實施方案中，除補充的銅外，基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基還包括一種或多種水解物。在其它實施方案中，除銅和/或一種或多種水解物外，基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基包括約1.0至約30 μ M鋅。在其它實施方案中，除銅和/或一種或多種水解物和/或鋅外，基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基另外包括約0.5至約5.0mM鈣。在其它方面且根據(jù)任一上述方面，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)方法，其中細胞培養(yǎng)溶液的銨水平較低(低于10mM)。在某些實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法利用具有超過1、2、3、4或5 μ g/L銅和低水平的銨的細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法和組合物的優(yōu)點之一是，它們可勝任大規(guī)模細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)。這些大規(guī)模細胞培養(yǎng)物大規(guī)模細胞培養(yǎng)物是至少10L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、750L、
I,000LU, 500L、2, 000L、5, 000LU0, 000L 或 20，000 升培養(yǎng)物。在某些方面，本發(fā)明的方法不一定生產(chǎn)總量更高的重組蛋白，但所生產(chǎn)的重組蛋白(rVWF或rA13)顯示出的總活性和比活高于使用標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的蛋白，尤其于細胞培養(yǎng)基未補充額外銅的細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)的蛋白。在其它方面，與于未補充銅的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞相比，于補充銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中生產(chǎn)的rVWF和rA13蛋白一致地顯示出每升細胞培養(yǎng)物的活性提高。在其它方面，與未補充銅的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的補充銅的培養(yǎng)基導(dǎo)致蛋白產(chǎn)率增加、培養(yǎng)物中的細胞數(shù)目增加和/或每升培養(yǎng)物的總活性提聞。本發(fā)明的方法和組合物的其它優(yōu)點是，它們可生產(chǎn)含有高百分比(超過10%)的高度多聚化的rVWF的蛋白群。盡管本文中關(guān)于ADAMTS蛋白的大部分論述是關(guān)于ADAMTS13 (Al3)，應(yīng)當(dāng)理解，因為所有ADAMTS蛋白享有共同核心結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)和共同結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，所以本文所述的方法和組合物適用于生產(chǎn)任何ADAMTS蛋白，而不僅僅限于rA13。I1.定義

本文使用的“重組vWF”包括經(jīng)由重組DNA技術(shù)獲得的vWF。在某些實施方案中，本發(fā)明的vWF蛋白可以包含構(gòu)建體，例如如在下述文獻中制備:1986年10月23日公開的WO 1986/06096，和1990年7月23日以Ginsburg等人名義提交的美國專利申請系列號07/559，509(其關(guān)于生產(chǎn)重組vWF的方法的內(nèi)容以引用的方式并入本文中)。本發(fā)明的vWF可以包括所有可能形式，包括單體形式和多聚體形式。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明涵蓋組合使用的不同形式的vWF。例如，本發(fā)明的vWF可以包括不同多聚體、不同衍生物和生物活性衍生物與非生物活性衍生物。在關(guān)于例如細胞或核酸、蛋白或載體使用時，術(shù)語“重組”表示這樣的細胞、核酸、蛋白或載體:其已通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白而修飾，或從經(jīng)如此修飾的細胞獲得所述細胞。因此，例如，重組細胞表達在細胞的天然(非重組)形式內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因，或表達否則會異常表達、表達不足或完全不表達的天然基因。在本發(fā)明范圍內(nèi)，重組vWF涵蓋來自例如哺乳動物(諸如靈長類動物、人、猴、兔、豬、嚙齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬、貓)的vWF家族的任何成員及其生物活性衍生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，重組VWF為人VWF。也涵蓋具有活性的突變體和變體vWF蛋白，以及vWF蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本發(fā)明的vWF可另外包含有助于純化、檢測或兩者的標(biāo)簽。本文中所描述的vWF可進一步用治療性部分或適于活體外或活體內(nèi)成像的部分修飾。術(shù)語“高度多聚的vWF”、“高分子量vWF”和“HMW VWF”可互換使用，且表示含有超過10個VWF 二聚體的共價連接的vWF多聚體。在某些實施方案中，HMW VWF含有至少11個VWF 二聚體或至少 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或更多個 VWF 二聚體。本文使用的“ADAMTS蛋白”表示，具有I型凝血酶敏感蛋白基序的解聚素和金屬蛋白酶的多肽的金屬蛋白酶家族。該家族的成員包括:人蛋白ADAMTSI (NM_006988)、ADAMTS2 (NM_014244;NM_021599)、ADAMTS3 (ΝΜ_014243)、ADAMTS4 (NM_005099)、ADAMTS5 (NM_007038)、ADAMTS6 (NM_014273)、ADAMTS7 (NM_0142727)、ADAMTS8 (NM_007037)、ADAMTS9(NM_182920;NM_18292 I;NM_020249)、ADAMTS10 (NM_030957)、ADAMTS12 (匪_030955)、ADAMTS 13 (NM_139025 ; NM_139026 ;匪_139027 ; NM_139028)、ADAMTS14(NM_139155;M1_080722)、ADAMTS15 (NM_139055)、ADAMTS16 (NM_139056)、ADAMTS17 (NM_139057)、ADAMTS 18 (NM_199355 ; NM_139054)、ADAMTS 19 (NM_133638)和ADAMTS20(NM_025003、NM_175851)。ADAMTS蛋白包括:全長蛋白和顯示至少部分生物活性的部分多肽，所述部分生物活性例如由全長蛋白顯示的活性的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多，特別是由全長蛋白顯示的蛋白酶活性。在某些情況下，ADAMTS蛋白將在活體內(nèi)或在活體外進行翻譯后修飾，例如通過酶方式或化學(xué)方式。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的ADAMTS蛋白包括交替剪接的異形體、保守修飾的蛋白、實質(zhì)上相同的蛋白、同系物等。在本發(fā)明范圍內(nèi)，ADAMTS蛋白涵蓋來自例如哺乳動物(諸如靈長類動物、人、猴、兔、豬、哨齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬、貓)的ADAMTS家族的任何成員及其生物活性衍生物。也涵蓋具有活性的突變體和變體ADAMTS蛋白，以及ADAMTS蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本發(fā)明的ADAMTS蛋白可另外包含有助于純化、檢測或兩者的標(biāo)簽。本文中所描述的ADAMTS蛋白可進一步用治療性部分或適于活體外或活體內(nèi)成像的部分修飾。本文使用的“ADAMTS13蛋白”表示，具有ADAMTS13活性、特別是切割在VWF的殘基Tyr-842和Met_843之間的肽鍵的能力的任何蛋白或多肽。在一個示例性的實施方案中，ADAMTS13蛋白表示，其氨基酸序列與NP_620594(ADAMTS13異形體1，前蛋白原)或NP_620594的氨基酸75-1427 (ADAMTS13異形體1，成熟多肽)高度類似的多肽。在另一個實施方案中，ADAMTS13蛋白表示，其氨基酸序列與NP_620596(ADAMTS13異形體2，前蛋白原)或NP_620594的氨基酸75-1371 (ADAMTS13異形體2，成熟多肽)高度類似的多肽。在另一個實施方案中，ADAMTS13蛋白包括:其氨基酸序列與NP_620595(ADAMTS13異形體3，前蛋白原)或NP_620595的氨基酸75-1340 (ADAMTS13異形體I，成熟多肽)高度類似的多肽。本文使用的ADAMTS13蛋白包括具有vWF切割活性的天然變體和具有vWF切割活性的人造構(gòu)建體。如本發(fā)明中所用，ADAMTS13涵蓋保留一些基本活性的任何天然變體、替代性序列、異形體或突變蛋白。在人群體中發(fā)現(xiàn)的ADAMTS13突變的實例包括，但不限于:R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T1961、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1123C、C1213Y、T12261、G1239V、R1336W，已發(fā)現(xiàn)其中的許多個與血栓性血小板減少性紫癜(TTP)有關(guān)。ADAMTS13蛋白也包括含有翻譯后修飾的多肽。例如，已經(jīng)證實，ADAMTS13在殘基614、667和1354處被N-乙?；咸?胺(GlcNAc)修飾，且預(yù)期還以此方式修飾殘基 142、146、552、579、707、828 和 1235。如在Plaimauer 等人(2002，Blood.15; 100 (10): 3626-32)和 US2005/0266528 (其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)中所描述，通過于哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表達，可以制備蛋白水解活性的重組ADAMTS13。用于在細胞培養(yǎng)物中表達重組 ADAMTS13 的方法公開于 Plaimauer B, Scheiflinger F.(Semin Hematol.2004 年 I月；41(1):24-33和US2011/0086413中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。在用于ADAMTS蛋白的背景中時，本文使用的術(shù)語“生物活性衍生物”也涵蓋經(jīng)由重組DNA技術(shù)獲得的多肽。這可以包括本領(lǐng)域已知的用于達成以下目的的任何方法:(i)通過基因工程，例如經(jīng)由RNA反轉(zhuǎn)錄和/或DNA擴增，生產(chǎn)重組DNA ； (ii)通過轉(zhuǎn)染，即經(jīng)由電穿孔或顯微注射，將重組DNA引入原核或真核細胞中；(iii)以例如連續(xù)或分批方式培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細胞；(iv)例如組成性地或在誘導(dǎo)后，表達ADAMTS蛋白；和(V)分離所述ADAMTS蛋白，例如與培養(yǎng)基分離，或通過收獲轉(zhuǎn)化的細胞，從而(vi)獲得實質(zhì)上純化的重組ADAMTS蛋白，例如經(jīng)由離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、親和色譜法、疏水相互作用色譜法等。術(shù)語“生物活性衍生物”也包括嵌合分子，諸如ADAMTS蛋白或其功能性片段，其與第二多肽(例如免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域或白蛋白結(jié)構(gòu)域)組合以改良生物學(xué)/藥理學(xué)性質(zhì)，例如ADAMTS蛋白在哺乳動物(尤其人)的循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期。術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物學(xué)上純的”表示這樣的物質(zhì):其實質(zhì)上或基本上不含通常在其天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)伴隨其的組分。通常，使用分析化學(xué)技術(shù)(諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法)，測定純度和均質(zhì)性。在一個實施方案中，rVWF為實質(zhì)上純化的制劑中存在的主要物質(zhì)。在另一個實施方案中，rA13為實質(zhì)上純化的制劑中存在的主要物質(zhì)。在一些實施方案中，術(shù)語“純化的”表示，核酸或蛋白在電泳凝膠中基本上生產(chǎn)I條帶。在其它實施方案中，其是指，核酸或蛋白的純度為至少50%，更優(yōu)選為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在其它實施方案中，“純化”是指，從待純化組合物中除去至少一種污染物。在此意義上，純化無需所純化化合物為均質(zhì)，例如100% 純。通過已知的活體外測定法，可以測量vWF的生物活性。例如，利托菌素輔因子測定法是基于在vWF存在下抗生素利托菌素誘導(dǎo)的新鮮或福爾馬林固定的血小板的凝集。血小板凝集度取決于vWF濃度，且可通過比濁法測量，例如通過使用凝集計(Weiss 等人,J.Clin.1nvest.52:2708-2716, 1973;Macfarlane 等人,Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308, 1975)。如本文中提供的，以使用活體外測定法測得的mU/μ g vWF的方式，描述本發(fā)明vWF的利托菌素輔因子比活性。本文使用的“ I單位ADAMTS活性”定義為，ImL匯集的正常人血漿中的活性量，與所用測定無關(guān)。例如，當(dāng) ADAMTS蛋白為ADAMTS13時，I單位ADAMTS13 FRETS-VWF73活性為切割與ImL匯集的正常人血漿切割相同量的FRETS-VWF73底物所需的活性量(Kokame等人，Br J Haematol.2005年4月；129 (I): 93-100)。方便地，通過功能測定，諸如使用經(jīng)修飾的Von Willebrand因子肽作為ADAMTS13的底物的功能測定(Tripodi等人，J Thromb Haemost.2008 年 9 月；6 (9): 1534-41)，可以確定 ADAMTS13 活性。一種測定重組人ADAMTS13活性的優(yōu)選方法公開于Gerritsen等人(Assay of von Willebrandfactor(vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinityof degraded vWF:a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenicpurpura (TTP).Thromb Haemost 1999;82:1386-1389)中。在一個實施方案中，為了視作如上文所定義的ADAMTS13蛋白，多肽或蛋白必須具有天然ADAMTS13的vWF切割活性的至少1%。在其它實施方案中，ADAMTS13蛋白將含有天然ADAMTS13活性的至少10%。在其它實施方案中，ADAMTS13蛋白將含有天然ADAMTS13活性的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%,80%,90% 或 100%ο 通過測量 ADAMTS13 抗原，例如使用在 Rieger 等人(2006, ThrombHaemost.200695(2):212-20)中公開的ELISA方法，也可以確定ADAMTS13蛋白的量。本領(lǐng)域中的公認約定為，ImL匯集的正常人血漿含有I μ g ADAMTS13。因此，本領(lǐng)域中的約定為，I μ g血漿衍生的ADAMTS13具有I單位ADAMTS13活性。術(shù)語“細胞培養(yǎng)溶液”、“細胞培養(yǎng)基或培養(yǎng)基”和“細胞培養(yǎng)物上清液”表示，在本領(lǐng)域中通常熟知的細胞培養(yǎng)過程的方面。在本發(fā)明范圍內(nèi)，細胞培養(yǎng)溶液可以包括細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)物上清液。細胞培養(yǎng)基任選地與補充物一起從外部添加至細胞培養(yǎng)溶液中，以提供用于培養(yǎng)表達rVWF或rA13的細胞的營養(yǎng)物和其它組分。細胞培養(yǎng)物上清液表示包含來自細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)物和其它組分以及在培養(yǎng)期間從細胞釋放、代謝和/或分泌的產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)溶液，但其不含細胞本身。因此在一種情形下，細胞培養(yǎng)物上清液可指細胞培養(yǎng)溶液的液相(即排除細胞的細胞培養(yǎng)溶液)。例如，培養(yǎng)物上清液的銨濃度通常表示細胞培養(yǎng)溶液中存在的銨濃度。在其它情形下，細胞培養(yǎng)物上清液表示已除去細胞的細胞培養(yǎng)溶液(即回收的細胞培養(yǎng)物上清液)。本文使用的術(shù)語“維生素B3”、“煙酰胺”、“尼克酸”和“煙酸”可互換使用以表示維生素B3家族的任何成員。因此，該家族中的任何成員均可用于補充本發(fā)明方法中所用的培 養(yǎng)基。本文使用的術(shù)語“化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基”表示，其中所有組分的身分和濃度均為已知的合成生長培養(yǎng)基?；瘜W(xué)成分確定的培養(yǎng)基不含細菌、酵母、動物或植物提取物，但其可以包括或不包括個別植物或動物衍生的組分(例如蛋白、多肽等)。商購可得的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的非限制性實例包括各種Dulbecco氏改良的伊格爾(DME)培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc)、Ham 氏營養(yǎng)物混合物(Sigma-AldrichCo; SAFC Biosciences, Inc)、它們的組合等。本領(lǐng)域中已知制備化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的方法，例如在美國專利號6，171，825和6，936，44UW0 2007/077217和美國專利申請公開號2008/0009040和2007/0212770 (它們的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)中的方法。本文使用的術(shù)語“無寡肽培養(yǎng)基”表示不包含寡肽(例如從蛋白水解物衍生的寡肽)的無蛋白培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含具有20個或更多個氨基酸的寡肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含具有15個或更多個氨基酸的寡肽。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含具有10個或更多個氨基酸的寡肽。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含具有7個或更多個氨基酸的寡肽。在另一個實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含具有5個或更多個氨基酸的寡肽。在另一個實施方案中，所述培養(yǎng)基不包含具有3個或更多個氨基酸的寡肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，培養(yǎng)基不包含具有2個或更多個氨基酸的寡肽。本領(lǐng)域中已知制備無寡肽培養(yǎng)基的方法，例如在美國專利號 6，171，825 和 6，936，441、WO 2007/077217 和美國專利申請公開號 2008/0009040 和2007/0212770 (其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)中的方法。本文使用的術(shù)語“無血清培養(yǎng)基”表示未補充動物血清的培養(yǎng)基。盡管通常無血清培養(yǎng)基為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，但無血清培養(yǎng)基可補充有個別動物或植物蛋白或蛋白級分。本領(lǐng)域中已知制備無血清培養(yǎng)基的方法，例如在美國專利號6，171，825和6，936，441、WO 2007/077217和美國專利申請公開號2008/0009040和2007/0212770 (其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)中的方法。本文使用的術(shù)語“無動物蛋白培養(yǎng)基”表示未補充動物血清、蛋白或蛋白級分的培養(yǎng)基。盡管通常無動物蛋白培養(yǎng)基為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，但無動物蛋白培養(yǎng)基可以含有植物或酵母水解物。本領(lǐng)域中已知制備無動物蛋白培養(yǎng)基的方法，例如在美國專利號 6，171，825 和 6，936，441、WO 2007/077217 和美國專利申請公開號 2008/0009040 和2007/0212770(其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)中的方法。本文使用的術(shù)語“基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基”表示化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基、無寡肽培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基或無動物蛋白培養(yǎng)基，其未補充水解物，例如植物或酵母水解物?；A(chǔ)培養(yǎng)基為本領(lǐng)域中所熟知，例如，DMEM、Ham氏F12、DMEM/Ham氏F12、培養(yǎng)基199、McCoy或RPMI?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以包括許多成分，包括氨基酸、維生素、有機和無機鹽以及碳水化合物來源。各成分可以以支持細胞培養(yǎng)的量存在，這些量通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。培養(yǎng)基可以包括輔助物質(zhì)，諸如緩沖物質(zhì)(例如碳酸氫鈉)、抗氧化劑、用于抵消機械應(yīng)力的穩(wěn)定劑或蛋白酶抑制劑。必要時，可添加非離子型表面活性劑，諸如聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物和/或混合物。II1.細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)物上清液本發(fā)明的一個方面涉及用于生產(chǎn)rVWF和/或rA13的細胞培養(yǎng)基，所述rVWF和/或rA13與用基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)的rVWF和rA13相比活性增加。在一個方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)rVWF和/或rA13的細胞培養(yǎng)基，其中基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充有一種或多種其它物質(zhì)。在特定實施方案中且如下文進一步詳細論述的，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)條件包括經(jīng)補充具有至少1.0 μ g/L銅的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基。在其它實施方案中，本發(fā)明中所用細胞培養(yǎng)基和從所述方法衍生出的上清液也 包含低水平(低于IOmM)的銨。在一個具體實施方案中，控制用于表達rVWF和/或rA13的細胞培養(yǎng)條件，使得細胞培養(yǎng)物上清液維持低水平的銨，即小于IOmM和優(yōu)選地小于5mM。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以基于本領(lǐng)域中熟知的合適基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如，DMEM、Ham氏F12、DMEM/Ham氏F12、培養(yǎng)基199、McCoy或RPMI?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以包括許多成分，包括氨基酸、維生素、有機和無機鹽以及碳水化合物來源。各成分可以以支持細胞培養(yǎng)的量存在，這樣的量通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。培養(yǎng)基可以包括輔助物質(zhì)，諸如緩沖物質(zhì)(例如碳酸氫鈉)、抗氧化劑、用于抵消機械應(yīng)力的穩(wěn)定劑或蛋白酶抑制劑。必要時，可添加非離子型表面活性劑，諸如聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物和/或混合物。通常，基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有小于I μ g/L的銅，例如DMEM/Ham氏F12具有約0.3 μ g/L的銅濃度。這樣的銅濃度提供的銅離子不足以支持顯示出高比活性的本發(fā)明rVWF和rA13蛋白的生產(chǎn)?？赏ㄟ^多種方式向本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基中提供銅，諸如通過添加培養(yǎng)基補充物。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基補充物可以含有水解物，所述水解物可以提供用于增加培養(yǎng)基中的銅濃度。水解物可以包括本領(lǐng)域中熟知的任何水解物，諸如植物水解物、大豆水解物和面筋水解物。在某些實施方案中，添加水解物可以促成約0.2至約10 μ g/L的Cu2+的增加的銅濃度。在一些實施方案中，由水解物提供的銅的量可以取決于水解物中銅的量以及添加的水解物量。通過元素分析，例如原子吸收光譜法(GFAA:石墨爐原子吸收)或質(zhì)譜分析法(例如ICP-MS)，可以確定水解物的銅含量。 在某些實施方案中，所述銅可單獨提供至培養(yǎng)基中，或除水解物外，通過提供包括合適的銅鹽或銅螯合物的培養(yǎng)基補充物來提供。合適的銅鹽可以包括但不限于:硫酸銅、醋酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅和氧化銅。合適的銅螯合劑可以包括但不限于:白蛋白、乙二胺四乙酸(EDTA)、多胺螯合劑、乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、三亞乙基二胺、四亞乙基五胺、氨基乙基乙醇胺、氨基乙基哌嗪、五亞乙基六胺、三亞乙基四胺-鹽酸鹽、四亞乙基五胺-鹽酸鹽、五亞乙基六胺-鹽酸鹽、四乙基五胺、卡托普利、青霉胺(penicilamine)、N, N’-雙(3-氛基丙基)-1，3-丙二胺、N, N-雙(2-氛基乙基)-1，3-丙二胺、1，7-二氧雜-4，10-二氮雜環(huán)十二烷、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷_5，7-二酮、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三鹽酸鹽、1-氧雜-4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷、1，4，8，12-四氮雜環(huán)五癸烷和1,4, 7，10-四氮雜環(huán)十二烷。在某些實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總銅濃度為約1.0 μ g/L至約20 μ g/L。在一個具體實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得最終濃度介于約
1.0 μ g/L至約10 μ g/L之間。在其它實施方案中，補充基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，使得最終銅濃度為約 1.0-5.0、1.2-4.0、1.3-3.0、1.4-2.9、1.5-2.8、1.6-2.7、1.7-2.6、1.8-2.5、1.9-2.4、
2.0-2.3,2.1-2.2 μ g/L銅。在其它實施方案中，補充在本發(fā)明的方法中所用的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，達到約 1.2-9.5、1.4-9、1.6-8.5、1.8-8,2.0-7.5,2.2-7,2.4-6.5,2.6-6.0,2.8-5.5、
3.0-5.0,3.2-4.5,3.4_4和2_4μ g/L銅。在其它實施方案中，補充在本發(fā)明的方法中所用的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，達到約1-6、2-5、3-4μ8/1銅。在一個實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總銅濃度為至少I μ g/L。在另一個實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總銅濃度為至少2 μ g/L。在另一個實施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總銅濃度為至少4 μ g/L。在某些實 施方案中，給基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，使得總銅濃度為至少I μ g/L 或至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μ g/L 銅或更多。在某些實施方案中且如本文中進一步詳細論述的，用于生產(chǎn)rA13的培養(yǎng)物可以含有約2-4 μ g/L的銅，而用于生產(chǎn)rVWF的培養(yǎng)物可以含有至少2 μ g/L的銅。上述濃度為呈二價銅形式(Cu2+)的純銅的各個濃度。如果使用銅衍生物(例如水合鹽)或含銅化合物(例如銅螯合物)，則所添加的衍生物或螯合物的量使得最終銅濃度在本文中所描述的范圍內(nèi)。例如，2 μ g/L的CuSO4.5Η20相當(dāng)于約0.51 μ g/L的銅濃度(無硫酸根和5H20)。有利的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)過程中使用導(dǎo)致細胞培養(yǎng)溶液中(即培養(yǎng)物上清液中)的低銨(NH4+)濃度的細胞培養(yǎng)基，可導(dǎo)致具有較高比活性的重組VWF和/或rA13的表達。因此，在某些實施方案中，上清液的NH4+濃度不超過10mM。在一個優(yōu)選的實施方案中，上清液的NH4+濃度不超過5mM。在一個優(yōu)選的實施方案中，上清液的NH4+濃度不超過4mM。在其它實施方案中，上清液的NH4+濃度不超過10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、ImM或更低。因此，在某些實施方案中，本文中提供的方法和組合物依賴于在方法中使用的補充有銅(例如，至至少2 μ g/L的終濃度)的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的應(yīng)用，所述銅使上清液中的NH4+濃度不超過10mM。在其它實施方案中，補充基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，以提供根據(jù)表I中提供的變體丨至440中任一個的最終銅和銨濃度。表1.在可用于表達本文提供的重組蛋白的培養(yǎng)基和上清液中存在的銅和銨濃度
的示例性實施方案
雜&~
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)重組ADAMTS13(rA13)組合物的方法，所述方法包括下述步驟: (a)提供基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基； (b)給所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基補充銅，以提供至少1.0 μ g/L的最終銅濃度； (c)提供一個或多個細胞，所述一個或多個細胞包含編碼rA13蛋白的核酸； (d)在補充了銅的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一個或多個細胞，使得所述細胞表達rA13并將其分泌進培養(yǎng)物上清液中；和 (e)回收所述培養(yǎng)物上清液的至少一部分， 其中在所述回收的培養(yǎng)物上清液中存在每天每升經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基至少1500單位FRETS-VWF73活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是不含動物蛋白的培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是不含蛋白的培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少I μ g/L銅。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項 所述的方法，其中所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少2 μ g/L銅。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是至少4 μ g/L銅。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是1μ g/L 至 6 μ g/L 銅。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的最終銅濃度是2μ g/L 至 4 μ g/L 銅。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中補充所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的銅以銅鹽、銅螯合物或它們的組合的形式提供。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述銅鹽選自:硫酸銅、醋酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅和氧化銅。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述一個或多個細胞是哺乳動物細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中培養(yǎng)所述一個或多個細胞包括:所述細胞的分批培養(yǎng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中培養(yǎng)所述一個或多個細胞包括:所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)以恒化模式進行。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞的連續(xù)培養(yǎng)以灌注模式進行。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其中在至少100L所述經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述一個或多個細胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其中在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，將細胞密度維持在小于4.0xlO6個細胞/mL。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，將所述細胞密度維持在小于3.5xl06個細胞/mL。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，將所述細胞密度維持在小于3.0xlO6個細胞/mL。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在培養(yǎng)所述一個或多個細胞的步驟過程中，將所述細胞密度維持在小于3.0xlO6個細胞/mL至4.0xlO6個細胞/mL。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述回收培養(yǎng)物上清液的至少一部分的步驟包括過濾或離心，以從培養(yǎng)物上清液的所述部分中除去細胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的方法，其中在所述回收的培養(yǎng)物上清液中存在每天每升經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基至少2000單位FRETS-VWF73活性。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中在所述回收的培養(yǎng)物上清液中存在每天每升經(jīng)補充的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基至少2500單位FRETS-VWF73活性。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述回收的上清液的rA13的FRETS-VWF73 比活性為至少 800mU/ii g。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述回收的上清液的rA13的FRETS-VWF73 比活性為至少 1200mU/ii g。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述回收的上清液的rA13的FRETS-VWF73 比活性為至少 1600mU/ii g。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任 一項所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于IOmM的濃度。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物上清液中的NH4+含量維持在低于5mM的濃度。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述方法另外包括rA13富集步驟。
32.一種包含重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法制備所述上清液。
33.一種包含重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少 6UFRETS-VWF73 活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少8UFRETS-VWF73 活性。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少10UFRETS-VWF73 活性。
36.一種包含重組ADAMTS13(rA13)的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少 3 u grA13。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少4u grA130
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的細胞培養(yǎng)物上清液，其中所述上清液每mL含有至少5u grA130
39.一種通過根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法制備的重組ADAMTS13(rA13)組合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述組合物配制成用于藥物給藥。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的組合物， 其中所述組合物配制成用于靜脈內(nèi)給藥。
全文摘要
除了其它方面以外，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)高分子量vWF(具體地，具有高比活性的高度多聚的WF和具有高比活性的ADAMTS13)的細胞培養(yǎng)條件。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)條件可以包括，例如，具有增加的銅濃度的細胞培養(yǎng)基和/或具有低銨(NH4+)濃度的細胞培養(yǎng)物上清液。本發(fā)明也提供了在細胞培養(yǎng)條件中培養(yǎng)細胞以表達具有高比活性的高分子量vWF和rA13的方法。
文檔編號A61K38/36GK103097522SQ201180043094
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者L·格里爾貝格爾, M·賴特爾, D·弗萊尚德爾, G·布蘭貝格爾 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司