專利名稱：結(jié)合肌肉生長抑制素的抗體、組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請一般而言涉及肌肉生長抑制素及與其結(jié)合的蛋白質(zhì)。特別地，本發(fā)明涉及肌肉生長抑制素抑制劑及其用途。
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背景技術(shù)：
也被稱為肌肉生長抑制素的生長/分化因子8(⑶F-8)是TGF-β家族成員，其大部分在發(fā)育中的和成人骨骼肌組織的細胞中表達。肌肉生長抑制素看起來在對骨骼肌生長的負控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用(McPherron等,Nature (London) 387,83-90 (1997))。肌肉生長抑制素基因中的突變已被展示于多個物種中，包括牛、豬、狗和人，并且已導(dǎo)致產(chǎn)生增加的肌肉組織(Kocamis 和 Killefer,Domestic Animal Endocrinology 23:447 ;2002)。此外，已顯示，拮抗肌肉生長抑制素能在動物中增加瘦肌肉的質(zhì)量(McFerron等,見上文；Zimmers等，Science 296:1486(2002))。已在人臨床試驗中評估了肌肉生長抑制素拮抗劑。在具有多種形式的肌營養(yǎng)不良癥的患者中評估了被稱為MY0-29的人抗體。使用該肌肉生長抑制素拮抗劑的早期臨床結(jié)果展示出良好的安全性和耐受性，而在肌肉強度或功能方面沒有顯著的改善(但該研究沒有被推動以展示療效)；在有限數(shù)量的受試者中注意到趨向于肌肉尺寸增加的趨勢(Wagner等，Ann.Neurol.63:561 ;2008)。在隨后的報道中，經(jīng)治療的患者中總的定量肌肉強度測量沒有改善，但是若干患者顯示出單根肌纖維收縮特性的改善(Krivickas等，Muscle Nerv.39:3 ；2009)。

人們相信，對肌肉生長抑制素途徑的調(diào)控需要將潛在肌肉生長抑制素復(fù)合體加工為成熟肌肉生長抑制素。潛在復(fù)合體是切割的前肽結(jié)構(gòu)域形成的，其與成熟C-末端二聚體非共價連結(jié)并且沒有生物活性。認為組織特異性因子負責(zé)將無活性復(fù)合體轉(zhuǎn)化為生物活性形式。肌肉生長抑制素還與卵泡抑素相關(guān)基因(FLRG)和生長及分化相關(guān)的因子相關(guān)的血清蛋白-1(GASP-1)形成復(fù)合體，這兩種復(fù)合體均已在血清中被鑒定。成熟的肌肉生長抑制素以高親和性與活性IIB型受體(ActRIIB)結(jié)合，并以較低的親和性與激活素(activin)受體(ActRIIA)結(jié)合。細胞內(nèi)信號傳遞通過二聚肌肉生長抑制素與ActRIIB的結(jié)合接著募集低親和性I型受體(激活素樣激酶4(ALK4)或激活素樣激酶5(ALK5))而啟動。I型受體的磷酸化導(dǎo)致負責(zé)肌肉生長抑制素生物作用的細胞內(nèi)信號傳遞途徑的啟動。肌肉生長抑制素拮抗劑的體內(nèi)利用已不僅被牽連于肌肉生長抑制素途徑的調(diào)控和信號傳遞本質(zhì)，還被牽連于肌肉生長抑制素與生長和分化因子IlteDF-1l ;也被稱為骨形態(tài)形成蛋白11或BMP-11)的高度相似性，該因子在活性結(jié)構(gòu)域中在氨基酸水平上與肌肉生長抑制素90 %相同。雖然在信號傳遞機制中的高度序列同一性和相似性暗示肌肉生長抑制素和⑶F-1I共享某些功能，但對這兩種TGF-β家族成員的靶向基因破壞卻顯示非常不同的結(jié)果。肌肉生長抑制素敲除小鼠顯示肌纖維的增生和肥大，而GDF-1l敲除小鼠則在出生后很快死亡并且具有大量的異常；雙敲除動物顯示在單敲除小鼠中未觀察到的額外異常(McPherron 等，BMC Dev Biol.9:24 ；2009)。因此，本領(lǐng)域中仍需要結(jié)合肌肉生長抑制素并且拮抗其活性、同時消除或最小化抑制其和相關(guān)途徑的不利作用的試劑。附圖簡述

圖1描述了給予肌肉生長抑制素抑制劑(抗肌肉生長抑制素抗體12Α5-5，實心菱形)的小鼠與對照(PBS ;空心圓)相比的總體重，如實施例4所示。圖2展示了通過核磁共振(NMR)測定的第4周的瘦體質(zhì)量的改變。圖3展示了具有指定的分子內(nèi)和分子間二硫鍵的成熟形式的人肌肉生長抑制素的氨基酸序列。二硫鍵Cysl5-Cys74、Cys43_Cysl06和Cys47_Cysl08形成胱氨酸結(jié)(knot)結(jié)構(gòu)。圖4描述了肽G —級結(jié)構(gòu)，其顯示二硫鍵將四個LycC肽連接到一起形成胱氨酸結(jié)，另一個二硫鍵將兩個55-78序列在Cys73連接到一起。肽G顯示與抗體結(jié)合。圖5展示了肽N—級結(jié)構(gòu)，其顯示二硫鍵將四個糜蛋白酶肽連接到一起形成胱氨酸結(jié)，另一個二硫鍵將兩個63-82序列在Cys73連接到一起。肽N不結(jié)合抗體。圖6代表了針對非還原和TCEP還原肽樣品的BIAcore 競爭檢驗的結(jié)果。肽A、C、E、G、0和P全部能結(jié)合抗體12A5-5由此防止12A5-5結(jié)合成熟肌肉生長抑制素。測試的其他肽(包括來自肽G和肽N的TC EP還原的那些，胱氨酸結(jié)糜蛋白酶肽)均不顯示與抗體
彡口口 、圖7描述了針對肽A、C、E和G以及肌肉生長抑制素的直接BIAcore 結(jié)合檢驗的結(jié)果。圖8代表了源于肌肉生長抑制素/卵泡抑素復(fù)合體的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的肌肉生長抑制素二聚體和單體的結(jié)構(gòu)(Cash等，見下文)。示出了參與二硫鍵的Cys殘基，以及被認為對于12A5-5的結(jié)合來說重要的區(qū)域中的另外的氨基酸殘基(以陰影長菱形示出)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其以小于IOOpM的Kd結(jié)合肌肉生長抑制素。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其以小于IOOpM的Kd結(jié)合肌肉生長抑制素并且以高于IOnM的Kd結(jié)合⑶F-1I。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其以是其對GDF-1l的親和性至少5000倍高的親和性結(jié)合肌肉生長抑制素。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其展示出針對肌肉生長抑制素的選擇性，該選擇性是針對⑶F-1I的至少5000倍高。在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其結(jié)合肌肉生長抑制素并且阻礙肌肉生長抑制素與ALK4的相互作用。在另一方面，提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其結(jié)合肌肉生長抑制素并阻礙肌肉生長抑制素與ALK4的相互作用但是與肌肉生長抑制素/ActRIIA復(fù)合體和/或肌肉生長抑制素/ActRIIB復(fù)合體共結(jié)合。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其結(jié)合肌肉生長抑制素，其中肌肉生長抑制素中對于肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素特異性拮抗劑的結(jié)合所需的兩個區(qū)域位于成熟肌肉生長抑制素(SEQ ID NO:25)的第21至31位和第50至60位附近的序列。還提供了一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，其與肌肉生長抑制素中位于成熟肌肉生長抑制素的第21至31位和第50至60位附近的序列的兩個區(qū)域相互作用，以防止這些區(qū)域內(nèi)肽鍵的糜蛋白酶切割。在本發(fā)明的一種實施方式中，肌肉生長抑制素特異性拮抗劑是包含至少一條輕鏈和至少一條重鏈的抗體，其中輕鏈包含恒定區(qū)和含有三個互補性決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)，并且重鏈包含恒定區(qū)和含有三個互補性決定區(qū)(⑶Rs)的可變區(qū)。該實施方式可并入本發(fā)明的前述實施方式和/或方面中的一種或多種。在某些實施方式中，重鏈和輕鏈CDRs的序列是如本文中所公開的。 在一種實施方式中，輕鏈⑶Rs是SEQ ID NO:10中公開的那些，并且重鏈⑶Rs是SEQ ID NO:20中公開的那些。在另一實施方式中，輕鏈⑶Rs選自SEQID NO:1中公開的輕鏈CDRs、SEQ ID NO:2中公開的輕鏈CDRs、SEQ ID NO:3中公開的輕鏈 CDRs、SEQ ID NO:4 中公開的輕鏈 CDRs、SEQ ID NO:5 中公開的輕鏈 CDRs、SEQ ID NO:6中公開的輕鏈CDRs、SEQ ID NQ:7中公開的輕鏈CDRs、SEQ ID NO:8中公開的輕鏈CDRs和SEQ ID NO:9中公開的輕鏈CDRs構(gòu)成的組；以及重鏈CDRs選自SEQ ID N0:11中公開的重鏈CDRs、SEQ ID NO:12中公開的重鏈CDRs、SEQ ID NO:13中公開的重鏈CDRs、SEQ IDNO:14中公開的重鏈CDRs、SEQ ID NO: 15中公開的重鏈CDRs、SEQ ID NO:16中公開的重鏈CDRs、SEQ ID NO:17 中公開的重鏈 CDRs、SEQ ID NO:18 中公開的重鏈 CDRs 和 SEQ ID NO:19中公開的重鏈⑶Rs構(gòu)成的組。在某些實施方式中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的序列是如本文所公開的。在一種實施方式中，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含SEQ IDNO:20中示出的氨基酸序列。在另一實施方式中，輕鏈可變區(qū)選自SEQ ID NO:1中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:2中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:3中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQID NO:4中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:5中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:6中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:7中公開的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:8中公開的輕鏈可變區(qū)和SEQID NO:9中公開的輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的組，并且重鏈可變區(qū)選自SEQ ID NO:11中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:12中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:13中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ IDNO:14中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO: 15中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:16中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:17中公開的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO:18中公開的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO:19中公開的重鏈可變區(qū)構(gòu)成的組。還提供了前述抗體的變體。在一種實施方式中，變體抗體與抗體之一(例如抗體12A5-5)90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。在另一實施方式中，變體抗體與前述抗體(例如12A5-5)在一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個氨基酸殘基處不同(通過氨基酸的取代或缺失)。在另一實施方式中，一個(或多個)氨基酸被翻譯后修飾(例如通過環(huán)化或轉(zhuǎn)化為另外的氨基酸；和/或通過脫酰胺化、異構(gòu)化、糖化和/或氧化)。在本發(fā)明的又一方面，抗體輕鏈恒定區(qū)選自K和λ輕鏈構(gòu)成的組，并且重鏈恒定區(qū)選自μ、δ、Υ、α和ε重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的組。又一實施方式提供了一種抗體，所述抗體屬于選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4構(gòu)成的組的亞類。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的這些方面可同等應(yīng)用于之前描述的方面和實施方式。本發(fā)明還提供了編碼任何前述肌肉生長抑制素特異性拮抗劑的分離的核酸、以及包含此類核酸的載體、用此類載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的分離的宿主細胞和用于生產(chǎn)肌肉生長抑制素特異性拮抗劑的方法，所述方法包括在促進表達的條件下培養(yǎng)此類宿主細胞以及從培養(yǎng)基中回收肌肉生長抑制素特異性拮抗劑。還提供了包含前文描述的肌肉生長抑制素特異性拮抗劑和生理上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑的組合物，以及抑制肌肉生長抑制素的至少一種活性的方法，所述方法包括將此類組合物施用至個體使得肌肉生長抑制素的至少一種活性被部分或完全抑制。在本發(fā)明的另外一些實施方式中，個體患有選自下述病況構(gòu)成的組的病況:性功能減退(包括雄激素剝奪療法導(dǎo)致的性功能減退，和年齡相關(guān)的性腺機能減少導(dǎo)致的性功能減退)，惡病質(zhì)；心源性惡病質(zhì)；腎源性惡病質(zhì)，心臟萎縮；心發(fā)育不良；心衰(heatfailure);肌肉減少癥；外傷性骨折；骨質(zhì)疏松性骨折；骨損失(例如骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)減少)；阿狄森氏?。患∥s性側(cè)索硬化或運動神經(jīng)元病(ALS ;MND ;盧格里格病)；貝爾麻痹(和/或面部神經(jīng)問題)；肉毒桿菌中毒；腦性麻痹；進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease)和其它外周神經(jīng)??；庫欣綜合征；糖尿病性神經(jīng)?。桓窳?巴利綜合征；多發(fā)性硬化；肌萎縮(包括進行性肌萎縮和脊髓性肌萎縮)；肌營養(yǎng)不良癥(其有多種形式；包括Becker型肌營養(yǎng)不良，先天性肌營養(yǎng)不良，Duchenne型肌營養(yǎng)不良，遠端型肌營養(yǎng)不良，Emery-Dreifuss型肌營養(yǎng)不良，面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥，肢帶型肌營養(yǎng)不良癥，強直性肌營養(yǎng)不良癥，眼咽型肌營養(yǎng)不良，脊髓性肌萎縮，Brown-Vialetto-Van Laere 綜合征(BVVL)、Fazio-Londe (FL)綜合征和特征在于進行性骨骼肌無力的其它綜合征，肌肉蛋白質(zhì)中的缺陷，以及肌肉細胞和組織的死亡)；重癥肌無力；脊髓灰質(zhì)炎；多肌炎；肌肉、肌腱和/或韌帶的扭傷和拉傷；中風(fēng)(和其他導(dǎo)致肌肉消耗的病況，例如長期不活動或臥床，肢固定(例如通過打石膏和/或上夾板)和太空飛行)；和可通過生長激素、胰島素生長因子-1 (IGF-1)、生長激素促分泌素和與激素-1GF-1軸相關(guān)的其他試劑治療的病況。

發(fā)明詳沭本發(fā)明提供了與和肌肉生長抑制素結(jié)合(例如抗肌肉生長抑制素抗體、抗體片段和抗體衍生物)并且至少抑制肌肉生長抑制素的生物活性的分子相關(guān)的組合物、試劑盒和方法。在本文中使用時，術(shù)語“肌肉生長抑制素拮抗劑”與“肌肉生長抑制素抑制劑”可互換使用。根據(jù)本發(fā)明的肌肉生長抑制素拮抗劑抑制或阻礙肌肉生長抑制素的至少一種活性，或者，阻礙肌肉生長抑制素或其受體的表達?？蓪崿F(xiàn)對肌肉生長抑制素活性的抑制或阻礙，例如通過利用一種或多種干擾肌肉生長抑制素與其受體的結(jié)合和/或阻礙肌肉生長抑制素與其受體的結(jié)合導(dǎo)致的信號傳導(dǎo)的抑制性試劑來實現(xiàn)。拮抗劑包括與肌肉生長抑制素自身結(jié)合的試劑，或者與肌肉生長抑制素受體結(jié)合的試劑。例如，肌肉生長抑制素拮抗劑包括但不限于:卵泡抑素、肌肉生長抑制素前結(jié)構(gòu)域(prodomain)、生長和分化因子Il(GDF-1l)前結(jié)構(gòu)域、前結(jié)構(gòu)域融合蛋白質(zhì)、與肌肉生長抑制素結(jié)合的拮抗性抗體、與激活素IIB型受體結(jié)合的拮抗性抗體或抗體片段、可溶性激活素IIB型受體、可溶性激活素IIB型受體融合蛋白質(zhì)、可溶性肌肉生長抑制素類似物(可溶性配體)、寡核苷酸、小分子、肽性模擬物和肌肉生長抑制素結(jié)合試劑。這些在下文中被更詳細地描述。本發(fā)明還提供了包含編碼與肌肉生長抑制素結(jié)合的多肽的全部或部分的核苷酸序列的核酸及其衍生物和片段，例如，編碼抗肌肉生長抑制素抗體、抗體片段或抗體衍生物的全部或部分的核酸；包含此類核酸的質(zhì)粒和載體，以及包含此類核酸和/或載體和質(zhì)粒的細胞或細胞系。提供的方法包括，例如，制造、鑒定或分離與肌肉生長抑制素結(jié)合的分子(例如抗肌肉生長抑制素抗體)的方法，測定分子是否與肌肉生長抑制素結(jié)合的方法，制造包含與肌肉生長抑制素結(jié)合的分子組合物例如藥物組合物的方法，以及用于將結(jié)合肌肉生長抑制素的分子施用至受試者的方法，例如，用于治療由肌肉生長抑制素介導(dǎo)的病況或用于體內(nèi)或體外拮抗(或抑制)肌肉生長抑制素的生物活性的方法。肌肉生長抑制素的一種此類生物活性是與肌肉生長抑制素受體的結(jié)合；另一種此類活性是對骨骼肌生長的負調(diào)控。使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母或三字母縮寫來示出多核苷酸和多肽序列。除非另有指明，每條多肽序列具有左邊的氨基末端和右邊的羧基末端；每條單鏈核酸序列以及每條雙鏈核酸序列的第一鏈(top strand)在左邊具有5’末端以及在右邊具有3’末端。還可通過解釋與參照序列有何不同來描述特定的多肽或多核苷酸序列。除非另有指明，用于本發(fā)明的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語將包括多數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。通常，本文描述的與細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)和雜交相關(guān)使用的命名法和技術(shù)是本領(lǐng)域中公知和常用的那些。

除非另有指明，本發(fā)明的方法和技術(shù)通常是根據(jù)本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法進行的，并且如在本申請文件中通篇提到和討論的多篇一般性和更具體的參考文獻所述。見例如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)，和 Harlow 和Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor7N.Y.(1990),其通過引用并入本文。酶反應(yīng)和純化技術(shù)按照廠商說明、如本領(lǐng)域通常進行的那樣或如本文所述來進行。本文所述的與分析化學(xué)、合成有機化學(xué)和醫(yī)藥和制藥化學(xué)相關(guān)使用的術(shù)語是本領(lǐng)域公知和常用的那些?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配方和遞送以及對患者的治療。除非另有指明，下述術(shù)語應(yīng)當(dāng)被理解為具有下述含義。術(shù)語“分離的分子”(其中分子例如是多肽、多核苷酸或抗體)是由于其來源或衍生的來源而(I)不與在其天然狀態(tài)下伴隨其的天然連結(jié)的組分連結(jié)，(2)基本上不含來自相同物種的其它分子，(3)通過來自不同物種的分子表達或(4)沒有人工干預(yù)時在自然界不存在的分子。因此，化學(xué)合成的、或在不同于其天然來源的細胞的細胞體系中合成的分子將是與其天然連結(jié)的組分分離的。還可使用本領(lǐng)域公知的純化技術(shù)通過分離而是分子基本上不含天然連結(jié)的組分。可通過本領(lǐng)域公知的多種手段來檢驗分子純度或同質(zhì)性(homogeneity)。例如,可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù),使用聚丙烯酰胺凝膠電泳以及對凝膠染色以觀察多肽，來檢驗多肽樣品的純度。就某些目的而言，可通過使用HPLC或本領(lǐng)域公知用于純化的其它手段來提供更高的分辨力。術(shù)語“肌肉生長抑制素抑制劑”和“肌肉生長抑制素拮抗劑”可互換使用。每種均為可檢測到抑制肌肉生長抑制素的至少一種功能的分子。相反，“肌肉生長抑制素激動劑”是可檢測到增加肌肉生長抑制素的至少一種功能的分子。肌肉生長抑制素抑制劑導(dǎo)致的抑制無須是完全的，只要其可檢測到即可，例如通過使用檢驗來檢測?？墒褂脤∪馍L抑制素功能的任何檢驗，其例子提供于本文。可被肌肉生長抑制素抑制劑抑制(或可被肌肉生長抑制素激動劑增加)的肌肉生長抑制素的功能的例子包括與肌肉生長抑制素受體(或表達此類受體的細胞)的結(jié)合，和對骨骼肌生長的負調(diào)控。肌肉生長抑制素抑制劑和肌肉生長抑制素激動劑的類型的例子包括但不限于:肌肉生長抑制素結(jié)合多肽，例如抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如肌肉生長抑制素抗原結(jié)合蛋白質(zhì))、抗體、抗體片段和抗體衍生物。術(shù)語“肽”、 “多肽”和“蛋白質(zhì)”均表示包含通過肽鍵互相相連的兩個或多個氨基酸殘基的分子。這些數(shù)據(jù)包括例如天然和人工蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和蛋白質(zhì)序列的多肽類似物(例如突變蛋白質(zhì)、變體和融合蛋白質(zhì))以及經(jīng)翻譯后修飾或共價修飾或非共價修飾的蛋白質(zhì)。肽、多肽或蛋白質(zhì)可以是單體或聚合的。術(shù)語“多肽片段”在本文中使用時表示較之相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段可以例如為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150 或 200 個氨基酸長。片段還可以例如至多 1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11 或 10 個氨基酸長。片段還可在其末
端之一或兩者處包含一個或多個額外的氨基酸，例如，來自不同的天然存在的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如Fe或亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域)或人工氨基酸序列(例如人工接頭序列或標(biāo)簽蛋白質(zhì))。本發(fā)明的多肽包括已經(jīng)以任何方式及因任何理由而被修飾的多肽，例如，以(I)降低對蛋白質(zhì)水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變親和性以形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，⑷改變結(jié)合親和性，和⑷賦予或修飾其它物理化學(xué)性質(zhì)或功能性質(zhì)。類似物包括多肽的突變蛋白質(zhì)。例如，可在天然存在的序列中(例如在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的多肽的部分中)制造單個或多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)?？墒褂霉灿行蛄衼磉x擇氨基酸殘基以進行取代；本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還可取代額外的氨基酸殘基。“保守氨基酸取代”是基本上不改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征的取代(例如，替代氨基酸不應(yīng)趨向于打破親本序列中存在的螺旋或破壞表征親本序列或?qū)ζ涔δ苄詠碚f是必要的其它類型的二級結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域認可的多肽二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的例子被描述于Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., ff.H.Freeman andCompany,New York(1984)) !Introduction to Protein Structure(C.Branden和 J.Tooze,eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991))和 Thornton et at.Nature 354:105(1991)中，它們通過引用并入本文。本發(fā)明還提供了肌肉生長抑制素結(jié)合多肽的非肽類似物。非肽類似物通常作為具有與那些模板肽類似的性質(zhì)的藥品用于藥物工業(yè)。這些類型的非肽化合物被稱為“肽模擬物(peptide mimetics) ” 或“肽性模擬物(peptidomimetics) ”，見例如 Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29 (1986) ；Veber and Freidinger TINS ρ.392 (1985)和 Evans etal.J.Med.Chem.30:1229 (1987)，它們通過引用并入本文。與治療上有用的肽結(jié)構(gòu)相似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防效果。通常，肽性模擬物與模本(paradigm)多肽(即，具有想要的生物化學(xué)性質(zhì)或藥理學(xué)活性的多肽)例如人抗體結(jié)構(gòu)上相似，但具有通過本領(lǐng)域公知的方法任選被選自一CH2NH—、一CH2S—、一CH2—CH2—、一CH = CH-(順和反)、一COCH2—、-CH(OH)CH2-和--CH2SO-構(gòu)成的組的連接替換的一個或多個肽連接。用相同類型的D-氨基酸對共有序列中一個或多個氨基酸進行系統(tǒng)性取代(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)也可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列變化的受限肽(constrained peptides)可通過本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生(Rizo andGierasch Ann.Rev.Biochem.61:387 (1992),通過引用并入本文)，例如通過添加能形成使肽環(huán)化的分子間二硫鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基來產(chǎn)生。多肽(例如抗體)的“變體”包含下述氨基酸序列，其中相對于另外的多肽序列，一個或多個氨基酸殘基插入氨基酸序列、從氨基酸序列缺失和/或取代進氨基酸序列。本發(fā)明的變體包括融合蛋白質(zhì)。

多肽的“衍生物”是已經(jīng)化學(xué)修飾的多肽(抗體)，例如通過與另外的化學(xué)基元(例如，聚乙二醇或清蛋白，例如人血清清蛋白)綴合、磷酸化和/或糖基化。除非另有指明，術(shù)語“抗體”除了包含兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈的抗體之外還包括其衍生物、變體、片段和突變蛋白質(zhì)，它們的例子在下文中描述?！翱乖Y(jié)合蛋白質(zhì)”是包含與抗原結(jié)合的部分以及任選地以允許抗原結(jié)合部分采用促進抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與抗原結(jié)合的構(gòu)象的骨架或框架部分的蛋白質(zhì)?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)的例子包括抗體、抗體片段(例如抗體的抗原結(jié)合部分)、抗體衍生物和抗體類似物?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)可包含例如具有移植的CDRs或CDR衍生物的備選的蛋白質(zhì)骨架或人工骨架。此類骨架包括但不限于，包含引入其中的突變例如用于穩(wěn)定抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的抗體衍生骨架，以及完全合成的、包含例如生物相容聚合物的骨架。見例如Korndorfer等，2003,Proteins !Structure,Function,and Bioinformatics,Volume 53,Issuel:121-129;Roque 等，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可使用肽抗體模擬物(“PAMs”)以及基于抗體模擬物的骨架，其利用纖連蛋白組分作為骨架?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)可具有例如天然存在的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)?！懊庖咔虻鞍住笔撬木鄯肿印Ｔ谔烊淮嬖诘拿庖咔虻鞍字?，每個四聚體由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成，每對具有一條“輕”(大約25kDa)鏈和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括大約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負責(zé)抗原識別。每條鏈的羧基末端部分界定主要負責(zé)效應(yīng)器功能的恒定區(qū)。人輕鏈被分類為K或λ輕鏈。人重鏈被分類為μ、δ、γ、α或ε ,并且將抗體的同種型分別界定為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG抗體在人類中可進一步分入四個亞類(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)相連，重鏈還包括大約10或更多個氨基酸的“D”區(qū)。一般參見 Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, ff.，ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))(就所有目的而言，其整體通過引用并入)。每個輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點，從而完整免疫球蛋白具有兩個結(jié)合位點。天然存在的免疫球蛋白鏈的可變區(qū)展現(xiàn)相同的一般結(jié)構(gòu)的相對保守的框架區(qū)(FR)，它們通過三個也成為互補性決定區(qū)或CDRs的高度可變區(qū)相連。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配是按照 Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd., US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication n0.91-3242，1991中的定義來進行的。用于免疫球蛋白鏈中的氨基酸的其他編號系統(tǒng)包括頂GT (國際 ImMunoGeneTics 信息系統(tǒng)；Lefranc 等，Dev.Comp.1mmunol.29: 185-203 ；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun, J.Mol.Biol.309(3):657-670 ;2001)?？蓮暮芯哂凶兓目乖禺愋缘拿庖咔虻鞍椎膩碓蠢缪寤蜓獫{中獲得抗體。如果此類抗體經(jīng)歷親和純化，它們可針對特定的抗原特異性而富集?？贵w的此類富集制劑通常由少于大約10%的具有針對特定抗原的特異性結(jié)合活性的抗體制成。將這些制劑進行若干輪的親和純化可增加具有針對抗原的特異性結(jié)合活性的抗體的比例。以這種方式制備的抗體通常被稱為“單特異性”。單特異性抗體制劑可由大約
50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或 99.9% 的具有針對特定抗原的
特異性結(jié)合活性的抗體制成。除非另有指明，“抗體”表示完整免疫球蛋白或其與完整抗體競爭特異性結(jié)合的抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分可通過重組DNA技術(shù)或通過酶促或化學(xué)切割完整抗體來產(chǎn)生?？乖Y(jié)合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fb、結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)和互補性決定區(qū)(OTR)片段、可變區(qū)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙鏈抗體(diabodies)、三鏈抗體、四鏈抗體和至少含有免疫球蛋白的足以賦予針對多肽的特異性抗原結(jié)合的部分的多肽等等。Fab片段是具有'、VH、(^和ChI結(jié)構(gòu)域的單價片段；F(ab' )2片段是具有在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；Fd片段具有Vh和ChI結(jié)構(gòu)域；Fb片段具有抗體單臂的'和Vh結(jié)構(gòu)域；以及dAb片段具有Vh結(jié)構(gòu)域、'結(jié)構(gòu)域、或Vh或'結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段(美國專利 N0.6，846，634,6, 696，245，美國申請公開 N0.05/0202512,04/0202995,04/0038291,04/0009507,03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546,1989)。單鏈抗體(s cFv)是下述抗體，其中VL和VH區(qū)經(jīng)由接頭(例如氨基酸殘基的合成序列)相連，形成連續(xù)的蛋白質(zhì)鏈，其中接頭足夠長到允許蛋白質(zhì)鏈在其自身上折回并形成單價抗原結(jié)合位點(見例如Bird等，1988, Science 242:423-26和Huston et al.,1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-83)。雙鏈抗體是二價抗體，其包含兩條多肽鏈，其中每條多肽鏈包含通過接頭相連的VH和VL結(jié)構(gòu)域，接頭很短因此不允許相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，由此允許每個結(jié)構(gòu)域與另一多肽鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對(見例如Holliger 等，1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-48 和 Poljak 等，1994, Structure2 =1121-23)。如果雙鏈抗體的兩條多肽鏈相同，則來自它們的配對的雙鏈抗體將具有兩個相同的抗原結(jié)合位點。具有不同序列的多肽鏈可用于制造具有兩個不同抗原結(jié)合位點的雙鏈抗體。類似地，三鏈抗體和四鏈抗體是分別包含三條和四條多肽鏈并且分別形成三個和四個抗原結(jié)合位點(其可以相同或不同)的抗體?？墒褂蒙衔腒abat等、上文Lefranc等和/或上文Honegger和Pluckthun等描述的系統(tǒng)，來鑒定給定抗體的互補性決定區(qū)(CDRs)和框架區(qū)(FR)?？蓪⒁粋€或多個CDRs共價或非共價并入分子使其成為抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可并入了一個或多個CDR作為更大的多肽鏈的一部分，可將一個或多個CDR共價連接至另外的多肽鏈，或者可非共價并入一個或多個CDR。CDRs允許抗原結(jié)合蛋白質(zhì)特異性結(jié)合感興趣的特定抗原?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)可具有一個或多個結(jié)合位點。如果有超過一個結(jié)合位點，結(jié)合位點可互相相同或者可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白典型地具有兩個相同的結(jié)合位點，而“雙特異性”或“雙功能”抗體具有兩個不同的結(jié)合位點。術(shù)語“人抗體”包括具有源于人免疫球蛋白序列的一個或多個可變區(qū)和恒定區(qū)的所有抗體。在一種實施方式中，所有可變和恒定結(jié)構(gòu)域都源于人免疫球蛋白序列(完全人抗體)。這些抗體可以以多種方法來制備，其例子如下文所述，包括通過用感興趣的抗原免疫經(jīng)遺傳修飾以表達源于人重鏈和/或輕鏈編碼基因的小鼠。人化抗體具有通過一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加而與源于非人物種的抗體的序列不同的序列，從而當(dāng)施用給人受試者時，較之非人物種的抗體，人化抗體較不可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和/或誘導(dǎo)較為不嚴(yán)重的免疫應(yīng)答。在一種實施方式中，非人物種抗體的重鏈和/或輕鏈的框架和恒定結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸被突變，以產(chǎn)生人化抗體。在另一實施方式中，來自人抗體的一個或多個恒定結(jié)構(gòu)域與非人物種的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域融合。在另一實施方式中，非人抗體的一個或多個CDR序列中的一個或多個氨基酸殘基被改變，以降低當(dāng)施用給人受試者時非人抗體的可能免疫原性，其中被改變的氨基酸殘基對于抗體與其抗原的免疫特異性結(jié)合不關(guān)鍵，或者進行的對于氨基酸序列的改變是保守改變，使得人化抗體對抗原的結(jié)合并不比非人抗體對抗原的結(jié)合顯著更差。如何制造人化抗體的例子可見美國專利 Nos.6，054，297,5, 886，152 和 5，877，293。術(shù)語“嵌合抗體”指 含有來自一種抗體的一個或多個區(qū)域和來自一個或多個其他抗體的一個或多個區(qū)域的抗體。在一種實施方式中，一個或多個CDRs源于人抗肌肉生長抑制素抗體。在另一實施方式中，所有CDRs源于人抗肌肉生長抑制素抗體。在另一實施方式中，來自超過一種人抗肌肉生長抑制素抗體的CDRs混合并匹配于嵌合抗體中。例如，嵌合抗體可包含來自第一人抗肌肉生長抑制素抗體的輕鏈的CDRl、來自第二人抗肌肉生長抑制素抗體的輕鏈的⑶R2和⑶R3、和來自第三抗肌肉生長抑制素抗體的重鏈的⑶Rs。其他組合也是可能的并且包括在本發(fā)明的實施方式中。此外，框架區(qū)可源于相同的抗肌肉生長抑制素抗體之一、源于一種或多種不同的抗體例如人抗體、或源于人化抗體。在嵌合抗體的一個例子中，重鏈和/或輕鏈的部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體相同、同源或源于來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體，但鏈的其余部分與來自另外的物種或?qū)儆诹硗獾目贵w類別或亞類的抗體相同、同源或源于來自另外的物種或?qū)儆诹硗獾目贵w類別或亞類的抗體。還包括此類抗體的展現(xiàn)出想要的生物活性(即，特異性結(jié)合肌肉生長抑制素的能力)的片段。見例如美國專利 N0.4，816，567 和 Morrison, 1985，Science 229:1202_07?！爸泻涂贵w”或“一致性抗體”是抑制肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素受體的相互作用的抗體，此時過量的抗肌肉生長抑制素抗體將相互作用的量降低至少大約20%，這是使用檢驗例如本文實施例中描述的那些檢驗來測量的。在多種實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)將肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素受體的相互作用降低至少3060%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%和 99.9% 抗體的片段或類似可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員遵循本申請文件的教導(dǎo)和使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)容易地制備。片段或類似物的氨基末端和羧基末端出現(xiàn)在功能性結(jié)構(gòu)域的邊界附近。結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域可通過將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公眾或私有序列數(shù)據(jù)庫進行比較而堅定。計算機比較方法可用于鑒定在已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其他蛋白質(zhì)中存在的序列基序或預(yù)測的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。用于鑒定折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是已知的，見例如Bowie等，1991, Science 253:164?！癈DR移植抗體”是下述抗體，其包含源于特定物種或同種型的抗體的一個或多個CDRs、以及相同或不同物種或同種型的另外的抗體的框架?！岸嗵禺愋钥贵w”是識別一種或多種抗原上的超過一種表位的抗體。該類型的抗體的亞類是“雙特異性抗體”，其實別相同或不同抗原上的兩種不同的表位?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)如果以I納摩爾或更低的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合至抗原，則其“特異性結(jié)合”至抗原(例如人肌肉生長抑制素)。當(dāng)針對第一抗原的解離常數(shù)顯著低于針對第二抗原的解離常數(shù)時，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可還較之第二抗原而“選擇性”或“優(yōu)先”結(jié)合至一種抗原。“選擇性”表示與抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合至第二抗原(例如高度相關(guān)的抗原)相比較的程度而言其結(jié)合至特定抗原的程度。例如，“肌肉生長抑制素特異性拮抗劑”是以I納摩爾或更低的Kd結(jié)合肌肉生長抑制素、且以IOnM或更高的Kd結(jié)合⑶F-1I的抗體。因此，較之針對GDF-1I，肌肉生長抑制素拮抗劑針對肌肉生長抑制素的選擇性可以是十倍或更高。“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗原結(jié)合區(qū)”或“抗原結(jié)合位點”是含有與抗原相互作用并貢獻于抗原結(jié)合蛋白質(zhì)對抗原的特異性和親和性的氨基酸殘基(或其他基元)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)部分。對于特異性結(jié)合其抗原的抗體而言，這將包括其至少一個⑶R結(jié)構(gòu)域的至少一部分。“表位”是被抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如抗體)結(jié)合(或與之相互作用)的分子部分。表位可包含分子的非連續(xù)部分(例如，在多肽中，在多肽的一級序列中不連續(xù)、但在多肽的三級和四級結(jié)構(gòu)范疇 下互相足夠接近從而可被抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合或與抗原結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用的氨基酸殘基)。兩條多核苷酸或多肽序列的“百分比同一性”是通過使用GAP計算機程序(GCGWesconsin軟件包,版本10.3 (Accelrys, San Diego, CA)的一部分)、使用其缺省參數(shù)來比較序列而測定的。術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在通篇中可互換使用，其包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA) ,RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸類似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸類似物)產(chǎn)生的DNA或RNA類似物、及其雜交體(hybrids)。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的。在一種實施方式中，本發(fā)明的核酸分子包含連續(xù)的開放讀碼框，其編碼本發(fā)明的抗體或其片段、衍生物、突變蛋白質(zhì)或變體。對兩條單鏈多核苷酸而言，如果其序列可以以反平行的定向比對使得一條多核苷酸中的每個核苷酸均與另一多核苷酸中其互補核苷酸相反而沒有引入缺口并且在任一序列的5’或3’端沒有未配對核苷酸的話，這兩條單鏈多核苷酸互相是“互補體”。如果兩條多核苷酸在中等嚴(yán)格條件下互相雜交，則多核苷酸與另一多核苷酸“互補”。由此，多核苷酸可與不是其互補體的另外的多核苷酸互補?！拜d體”是可用于將與其連接的另一核酸引入細胞中的核酸。一種類型的載體是“質(zhì)?！保渲钙渲锌蛇B接進額外的核酸片斷的線性或環(huán)狀的雙鏈DNA分子。另一類型的載體是病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，其中額外的DNA片斷可被引入病毒基因組。某些載體能在它們被引入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如包含病毒復(fù)制起點的病毒載體和游離的哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離哺乳動物載體)在引入宿主細胞后被整合進宿主細胞基因組，并且由此隨宿主基因組一起復(fù)制。“表達載體”是能指導(dǎo)所選的多核苷酸復(fù)制的一類載體。如果調(diào)控序列影響該核苷酸序列的表達(例如表達的水平、時機或位點)，則核苷酸序列與調(diào)控序列“可操作地連接”?！罢{(diào)控序列”是影響與其可操作地連接的核酸的表達(例如表達的水平、時機或位點)的核酸。調(diào)控序列可例如直接在被調(diào)控的核酸上施加其影響，或通過一種或多種其他分子(例如與調(diào)控序列和/或核酸結(jié)合的多肽)的作用來施加其影響。調(diào)控序列的例子包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如聚腺苷化信號)。調(diào)控序列的其他例子被描述于例如Goeddel, 1990,Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 和 Baron 等，1995, Nucleic AcidsRes.23:3605-06 中?！八拗骷毎笔强捎糜诒磉_核酸(例如本發(fā)明的核酸)的細胞。宿主細胞可以是原核細胞，例如，大腸桿菌，或者其可以是真核細胞，例如單細胞的真核細胞(例如酵母或其他真菌)、植物細胞(例如煙草或西紅柿植物細胞)、動物細胞(例如人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。宿主細胞的例子包括猴腎細胞的C0S-7系(ATCC CRL 1651)(見 Gluzman et al.，1981，Cell 23:175)，L 細胞，C 127 細胞，3T3 細胞(ATCC CCL 163)、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞或它們的衍生物，例如Veggie CHO和生長于無血清培養(yǎng)基中的相關(guān)細胞系(見Rasmussen等，1998, Cytotechnology 28:31),或DHFR缺陷的 CHO株系 DX-Bll (見 Urlaub 等，1980，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:4216-20)，Hela細胞，BHK(ATCC CRL 10)細胞系，源于非洲綠猴腎細胞系CVl (ATCC CCL 70)的CV1/EBNA細胞系(見McMahan 等，1991，EMBO J.10:2821)，人胚胎腎細胞例如 293、293EBNA 或MSR 293，人表皮A431細胞，人Colo205細胞，其它經(jīng)轉(zhuǎn)化的靈長類細胞系，正常二倍體細胞，源于原生組織的體外培養(yǎng)物的細胞株系，原生外植體，HL-60，U937，HaK或Jurkat細胞。典型地，宿主細胞是可被編碼多肽的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的細胞，其然后可表達于宿主細胞中。短語“重組宿主”可用于指已經(jīng)被待表達的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。宿主細胞還可以是下述細胞，其包含核酸但是并不以想要的水平表達該核酸，除非向宿主細胞中引入了調(diào)控序列使得其與核酸可操作地連接。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語宿主細胞不僅指特定的受試者細胞，其還指此類細胞的后代或 潛在后代。因為由于例如突變或環(huán)境影響，在以后的傳代中可能發(fā)生某些修飾，故而此類后代可能事實上不與親本細胞相同，但仍包括在本文使用的術(shù)語的范圍內(nèi)?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)在一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合肌肉生長抑制素(例如人肌肉生長抑制素)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體突變蛋白質(zhì)和抗體變體)。根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括抑制肌肉生長抑制素生物活性的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。此類生物活性的例子包括肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素受體的結(jié)合以及與表達此類肌肉生長抑制素受體的細胞的結(jié)合。其它生物活性包括肌肉生長抑制素體內(nèi)介導(dǎo)的那些，例如對骨骼肌生長的負調(diào)控。不同的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可結(jié)合肌肉生長抑制素的不同結(jié)構(gòu)域或表位或者通過不同的作用機制發(fā)揮作用。粒子包括但不限于干擾肌肉生長抑制素或肌肉生長抑制素受體的能力的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或其亞單位?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)無須完全抑制肌肉生長抑制素誘導(dǎo)的活性來在本發(fā)明中應(yīng)用；而也可考慮降低肌肉生長抑制素的特定活性的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(本文關(guān)于結(jié)合肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)在治療特定疾病中的特定作用機制僅用于闡述，本文給出的方法并非限定性的)。本發(fā)明范圍的抗肌肉生長抑制素抗體的其它衍生物包括抗肌肉生長抑制素抗體與其它蛋白質(zhì)或多肽的共價或聚集綴合物或其片段，例如通過表達包含融合至抗肌肉生長抑制素抗體多肽的N-末端或C-末端的異源多肽的重組融合蛋白質(zhì)來獲得。例如，綴合肽可以是異源信號(或前導(dǎo)序列)多肽，例如酵母α-因子前導(dǎo)序列，或肽例如表位標(biāo)簽。含有抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)可包括添加來協(xié)助對抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的純化或鑒定的蛋白質(zhì)(例如標(biāo)簽蛋白質(zhì)，例如多聚His)?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)還可連接至Hopp等,Bio/Technology6:1204,1988和美國專利5，011，912所述的FLAG 肽。FLAG 肽是高度抗原性的，并且提供被特異性單克隆抗體(HlAb)可逆結(jié)合的表位，使得能夠進行快速檢驗并且容易對表達的重組蛋白質(zhì)進行純化?？捎糜谥苽淦渲蠪LAG 肽融合至給定多肽的融合蛋白質(zhì)的試劑是可商業(yè)獲得的(Sigma-Aldrich, St.Louis MO)。含有一種或多種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的寡聚物可用作為肌肉生長抑制素拮抗劑。寡聚物可以是共價連接或非共價 連接的二聚體、三聚體或更高聚的寡聚物?？紤]使用包含兩種或多種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的寡聚物，一個例子是同源二聚體。其它寡聚物包括異源二聚體、同源三聚體、異源三聚體、同源四聚體、異源四聚體等等。一種實施方式涉及包含經(jīng)由融合至抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的肽基元之間的共價或非共價相互作用相連的多個抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的寡聚物。此類肽可以是肽接頭(間隔序列)或具有促進寡聚化的性質(zhì)的肽。亮氨酸拉鏈和源于抗體的某些多肽屬于能促進與之連結(jié)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的寡聚化的肽，如下文更詳細描述的。在一些特別地實施方式中，寡聚物包含兩個或四個抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。寡聚物的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以是任何形式的，例如上文所述的任何形式，例如變體或片段。優(yōu)選地，寡聚物包含具有肌肉生長抑制素結(jié)合活性的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，使用源于免疫球蛋白質(zhì)的多肽來制備寡聚物。已經(jīng)描述了對包含融合至源于抗體的多肽的多種部分(包括Fe結(jié)構(gòu)域)的某些異源多肽的融合蛋白質(zhì)的制備，例如，由 Ashkenazi 等，1991, PNAS USA 88:10535、Byrn 等，1990, Nature 344:677 和 Hollenbaugh 等，1992 " Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins " , inCurrent Protocols in Immunology, Supp1.4,10.19.1-10.19.11 頁描述。本發(fā)明的一種實施方式涉及包含兩個融合蛋白質(zhì)的二聚體，所述融合蛋白質(zhì)是通過將抗肌肉生長抑制素抗體的肌肉生長抑制素結(jié)合片段融合至抗體的Fe區(qū)制造的。可通過下述方式來制造二聚體:例如將編碼融合蛋白質(zhì)的基因融合子插入合適的表達載體，在經(jīng)重組表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達基因，以及允許表達的融合蛋白質(zhì)裝配得很像抗體分子，由此在Fe基元之間形成鏈間二硫鍵，以產(chǎn)生二聚體。術(shù)語“Fe多肽”在本文中使用時包括源于抗體的Fe區(qū)的多肽的天然和突變蛋白質(zhì)形式。此類多肽的含有促進二聚化的鉸鏈區(qū)的截短形式也包括在內(nèi)。包含F(xiàn)e基元的融合蛋白質(zhì)(和由其形成的寡聚體)提供了易于通過在蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G柱上進行親和色譜來純化的優(yōu)點。PCT申請WO 93/10151 (其通過引用并入本文)中描述的一種合適的Fe多肽是單練多肽，其從N-末端鉸鏈區(qū)延伸至人IgGl抗體的Fe區(qū)域的天然C-末端。另一有用的Fe多肽是美國專利5，457，035和Baum等，1994，EMBO J.13:3992-4001中描述的Fe突變蛋白質(zhì)。該突變蛋白質(zhì)的氨基酸序列除了第19位氨基酸從Leu變?yōu)锳la、第20位氨基酸從Leu變?yōu)镚lu以及第22位氨基酸從Gly變成Ala之外與WO 93/10151中呈現(xiàn)的天然Fe序列相同。突變蛋白質(zhì)顯示出針對Fe受體的降低的親和性。在其它一些實施方式中，抗肌肉生長抑制素抗體的重鏈和/或輕鏈的可變部分可取代抗體重鏈和/或輕鏈的可變部分?；蛘?，寡聚物是包含多個抗原結(jié)合蛋白質(zhì)、有或沒有肽接頭(間隔肽)的融合蛋白質(zhì)。其中合適的肽接頭是美國專利4，751，180和4，935，233描述的那些。用于制備寡聚抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的另一方面涉及亮氨酸拉鏈的使用。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域是促進其中發(fā)現(xiàn)有它們的蛋白質(zhì)的寡聚化的肽。亮氨酸拉鏈最初被鑒定于若干DNA結(jié)合蛋白質(zhì)中(Landschulz等，1988, Science 240:1759),此后還被發(fā)現(xiàn)于多種不同的蛋白質(zhì)中。已知的亮氨酸拉鏈包括天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。適用于生產(chǎn)可溶寡聚蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的例子被描述于PCT申請WO 94/10308中，源于肺表面活性蛋白質(zhì)D(SPD)的亮氨酸拉鏈被描述于Hoppe et al., 1994,FEBS Letters 344:191中，上述文獻通過引用引用并入 本文。允許融合至其的異源蛋白質(zhì)穩(wěn)定三聚化的經(jīng)修飾的亮氨酸拉鏈的用途被描述于Fanslow等，1994, Semin.1mmunol.6:267-78中。在一種方法中，包含融合至亮氨酸拉鏈肽的抗肌肉生長抑制素抗體片段或衍生物的重組融合蛋白質(zhì)被表達于合適的宿主細胞中，從培養(yǎng)物上清液中回收形成的可溶寡聚抗肌肉生長抑制素抗體片段或衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了干擾肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素受體的結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或其亞單位。例如，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可阻礙肌肉生長抑制素與ALK4的相互作用，但還可以共結(jié)合與ActRIIB復(fù)合的肌肉生長抑制素和/或與AcRIIA復(fù)合的肌肉生長抑制素。此類抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可針對肌肉生長抑制素或其片段、變體或衍生物來制造，并在傳統(tǒng)檢驗中針對干擾肌肉生長抑制素受體(或表達此類受體的細胞)的能力對其加以篩選。合適的檢驗的例子是測試抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的抑制肌肉生長抑制素與表達肌肉生長抑制素受體的細胞結(jié)合的能力的測試、或測試抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的降低此類受體和肌肉生長抑制素相互作用導(dǎo)致的生物或細胞應(yīng)答的能力的測試(即基于細胞的檢驗、體外結(jié)合檢驗，例如本文在實施例中描述的那些)。測試抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的額外檢驗包括對抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與肌肉生長抑制素多肽的結(jié)合和已知的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與肌肉生長抑制素多肽的結(jié)合進行定性或定量比較，其若干例子公開于本文中。在又一方面，本發(fā)明提供了展示出物種選擇性的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合一種或多種哺乳動物肌肉生長抑制素，例如結(jié)合人肌肉生長抑制素、和小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝和非人靈長類肌肉生長抑制素中的一種或多種。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合一種或多種靈長類肌肉生長抑制素，例如結(jié)合人肌肉生長抑制素、和獼猴、狨猴、恒河猴、絹毛猴和黑猩猩肌肉生長抑制素中的一種或多種。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)特異性結(jié)合人、獼猴、狨猴、恒河猴、絹毛猴或黑猩猩肌肉生長抑制素。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)不結(jié)合小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝和非人靈長類肌肉生長抑制素中的一種或多種。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)不結(jié)合新世界猴(New Worldmonkey)物種例如絨猴。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)不顯示出對除了肌肉生長抑制素之外的任何天然存在的蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)不顯示出對除了哺乳動物肌肉生長抑制素之外的任何天然存在的蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)不顯示出對除了靈長類肌肉生長抑制素之外的任何天然存在的蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)不顯示出對除了人肌肉生長抑制素之外的任何天然存在的蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)特異性結(jié)合來自至少一種非人靈長類(例如獼猴)的肌肉生長抑制素和人肌肉生長抑制素。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)以相似的結(jié)合親和性特異性結(jié)合非人靈長類、獼猴和人肌肉生長抑制素。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)阻礙非人靈長類、獼猴和人肌肉生長抑制素的活性。在又一實施方式中，在本文所述的檢驗中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)針對非人靈長類、獼猴和人肌肉生長抑制素具有相似的IC5tl或EC5tlt5可以使用本領(lǐng)域公知的方法，以及按照本說明書的教導(dǎo)，來測定抗原結(jié)合蛋白質(zhì)對肌肉生長抑制素的選擇性。例如，可以使用Western印跡雜交、FACS, ELISA、RIA或通過允許測定結(jié)合常數(shù)的任何合適的方法，例如Biacore㊣(其利用表面等離子共振)或 KinexA (動力學(xué)排斥檢驗(kinetic exclusion assay),見例如 Ohmura 等，，Anal.Chem.73:3392-3399,2001)來測定選擇性。在又一方面，本發(fā)明提供了具有下述特征中一種或多種的結(jié)合肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如抗肌肉生長抑制素抗體):既結(jié)合人肌肉生長抑制素又結(jié)合非人靈長類肌肉生長抑制素，抑制肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素受體的結(jié)合，抑制肌肉生長抑制素與ALK4的 結(jié)合，與肌肉生長抑制素/ActRIIB共結(jié)合，與肌肉生長抑制素/ActRIIA共結(jié)合，抑制肌肉生長抑制素負調(diào)控肌肉質(zhì)量的能力。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合片段可通過傳統(tǒng)技術(shù)來生產(chǎn)。此類片段的例子包括但不限于Fab和F(ab' )2片段。通過遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生的抗體片段和衍生物也包括在內(nèi)。另外的實施方式包括嵌合抗體，例如非人(例如鼠)單克隆抗體的人化版本。此類人化抗體可通過已知技術(shù)來制備，并且當(dāng)抗體施用給人時提供降低的免疫原性的優(yōu)點。在一種實施方式中，人化單克隆抗體包含鼠抗體的可變區(qū)(或者其抗原結(jié)合位點的全部或部分)和來自人抗體的恒定結(jié)構(gòu)域?；蛘?，人化抗體片段可包含鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合位點和源于人抗體的可變結(jié)構(gòu)域片段(缺少抗原結(jié)合位點)。用于產(chǎn)生嵌合及經(jīng)進一步工程化的單克隆抗體的流程包括 Riechmann 等，.，1988, Nature 332:323, Liu 等，，1987, Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 84:3439,Larrick 等，.，1989,Bio/Technology 7:934 和 Winter 等，.，1993，TIPS 14:139中描述的那些。在一種實施方式中，嵌合抗體是⑶R移植的抗體。用于人化抗體的技術(shù)被討論于例如美國專利申請N0.10/194，975 (2003年2月27日公開)、美國專利 N0.s5, 869，619,5, 225，539,5, 821，337,5, 859，205、Padlan 等，，1995，F(xiàn)ASEBJ.9:133-39 和 Tamura 等，，2000，J.1mmunol.164:1432-41 中。已經(jīng)開發(fā)了用于在非人動物中產(chǎn)生人或部分人抗體的流程。例如，已制備了其中一種或多種內(nèi)源免疫球蛋白基因已被多種手段失活的小鼠。人免疫球蛋白基因已被引入小鼠以代替失活的小鼠基因。動物中產(chǎn)生的抗體摻入了弓I入動物的人遺傳材料編碼的人免疫球蛋白多肽鏈。在一種實施方式中，用肌肉生長抑制素多肽對非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫，使得在動物中產(chǎn)生針對肌肉生長抑制素多肽的抗體。合適的免疫原的一個例子是可溶的人肌肉生長抑制素，例如包含肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)切割位點的多肽，或其它免疫原性片段肌肉生長抑制素。合適的免疫原的另一例子是表達高水平肌肉生長抑制素的細胞或來自其的細胞膜制備物。用于生產(chǎn)和使用用于產(chǎn)生人或部分人抗體的轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)的例子被描述于美國專利 5，814，318,5, 569，825 和 5，545，806，Davis 等，，2003，Production ofhuman antibodies from transgenic mice,于 Lo, ed.Antibody Engineering:Methodsand Protocols 中，Humana Press, NJ: 191-200, Kellermann 等，，2002, Curr OpinBiotechnol.13:593-97, Russel 等，，2000, Infect Tmmun.68:1820-26, Gallo 等，，2000,Eur J Tmmun.30:534-40, Davis 等，,1999, Cancer Metastasis Rev.18:421-25, Green,1999,J Tmmunol Methods.231:11-23,Jakobovits,1998,Adv Drug Deliv Rev 31:33-42,Green等，，1998,J Exp Med.188:483-95,Jakobovits A,1998,Exp.0pin.1nvest.Drugs.7:607-14，Tsuda 等，，1997，Genomics 42:413-21, Mendez 等，，1997，Nat Genet.15:146-56,Jakobovits,1994，Curr Biol.4:761-63, Arbones 等，，1994，Immunity.1:247-60, Green等，，1994, Nat Genet.7:13-21, Jakobovits 等，，1993, Nature 362:255-58, Jakobovits等，，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90:2551-55, Chen, J.等，，1993，Int Immunol 5:647-656,Choi等，，1993,Nature Genetics 4:117-23,Fishwild等，，1996,Nat Biotechnol14:845-51, Harding et al., 1995, Ann NY Acad Sci, Lonberg 等，，1994, Nature 368:856-59, Lonberg,1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies,于Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 中，Lonberg 等，，1995, Int RevTmmunol 13:65-93, Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14:826, Taylor 等，，1992, NucleicAcids Research 20:6287-95, Taylor 等，，1994, Int Tmmunol 6:579-91, Tomizuka 等，，1997, Nat Gen 16:133-43, Tomizuka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A.97:722-27,Tuaillon et al.,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.90:3720-24 和 Tuaillon etal.，1994，J Immunol 152:2912-20中。這些和其它例子也被討論于2007年5月3日公開的美國專利申請公開 文本2007-0098715中。在又一方面，本發(fā)明提供了結(jié)合肌肉生長抑制素的單克隆抗體。可使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來生產(chǎn)單克隆抗體，例如通過在完成免疫程序之后永生化收獲自轉(zhuǎn)基因動物的脾細胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)來永生化脾細胞，例如通過將它們與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。用于產(chǎn)生雜交瘤的融合流程的骨髓瘤細胞優(yōu)選不產(chǎn)生抗體、具有高融合效率，使得它們不能在僅支持想要的融合細胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養(yǎng)基上生長的酶缺陷。用于小鼠融合的合適的細胞系的粒子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210_Agl4、F0、NS0/U、MPC-1U MPC11-X45-GTG1.7 和S194/5XX0 Bul ;用于大鼠融合的細胞系的例子包括R210.RCY3、Y3_Ag 1.2.3、IR983F和4B210?？捎糜诩毎诤系钠渌毎凳荱-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2和UC729-6。在一種實施方式中，通過下述方式產(chǎn)生雜交瘤細胞系:用肌肉生長抑制素免疫原免疫動物(例如具有人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因動物)、從經(jīng)免疫的動物收獲脾細胞、將收獲的脾細胞融合至骨髓瘤細胞系由此產(chǎn)生雜交瘤；從雜交瘤細胞建立雜交瘤細胞系以及鑒定產(chǎn)生結(jié)合肌肉生長抑制素多肽的抗體的雜交瘤細胞系。此類雜交瘤細胞系和通過它們產(chǎn)生的抗肌肉生長抑制素單克隆抗體是本發(fā)明所包括的。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來純化通過雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體?？蛇M一步篩選雜交瘤或mAbs，以鑒定出具有特定性質(zhì)(例如阻礙肌肉生長抑制素誘導(dǎo)的活性)的mAbs。此類篩選的例子提供于下文實施例中。還可使用被稱為遺傳免疫的工藝來生產(chǎn)單克隆抗體。例如，編碼感興趣的抗原的核酸可被摻入病毒載體(例如腺病毒載體)。然后使用得到的載體在合適的宿主動物(例如非肥胖性糖尿病，或NODdn^)中發(fā)展出針對感興趣的抗原的免疫應(yīng)答。該技術(shù)被Ritter等，，Biodrugsl6(l) =3-10(2002)詳細描述，其公開內(nèi)容通過引用并入本文?？贵w結(jié)合位點中央的互補性決定區(qū)(CDRs)的分子進化也已被用于分離具有增加的親和性的抗體，例如，具有增加的針對c-erbB-2的親和性的抗體，如Schier等，，1996，J.Mol.Biol.263:551所述。因此，此類技術(shù)可用于制備針對肌肉生長抑制素的抗體。針對肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于例如檢驗中以體外或體內(nèi)檢測肌肉生長抑制素多肽或表達肌肉生長抑制素的細胞的存在?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)還可用于通過免疫親和色譜來純化肌肉生長抑制素蛋白質(zhì)。另外還能阻礙肌肉生長抑制素和肌肉生長抑制素受體(或其亞單位)的相互作用的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于抑制此類相互作用導(dǎo)致的生物活性。阻礙抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明的方法。作為肌肉生長抑制素拮抗劑發(fā)揮功能的此類抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于治療任何肌肉生長抑制素誘導(dǎo)的病況，包括但不限于肌肉減少癥、惡病質(zhì)和肌肉消耗的病況。在一種實施方式中，通過涉及對轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫的流程產(chǎn)生的人抗肌肉生長抑制素單克隆抗體被用于治療此類病況。在另一實施方式中，人化的抗肌肉生長抑制素單克隆抗體被用于治療此類病況。抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于體外流程，或體內(nèi)施用，以抑制肌肉生長抑制素誘導(dǎo)的生物活性。肌肉生長抑制素導(dǎo)致或惡化(直接或間接)的病癥(其例子提供于本文中)由此可被治療。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種治療性方法，所述方法包括以有效降低肌肉生長抑制素誘導(dǎo)的生物活性的量向需要其的哺乳動物體內(nèi)施用阻礙肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括抑制肌肉生長抑制素的生物活性的部分人單克隆抗體或完全人單克隆抗體。一種實施方式涉及至少部分阻礙人肌肉生長抑制素與肌肉生長抑制素受體(或其亞單位)的相互作用的單克隆抗體。在一種實施方式中，通過用肌肉生長抑制素免疫原免疫轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生抗體。在又一實施方式中，免疫原是人肌肉生長抑制素多肽(例如經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以表達肌肉生長抑制素的細胞，或天然表達肌肉生長抑制素的細胞)。源于此類經(jīng)免疫的小鼠的雜交瘤細胞系(其中所述雜交瘤分泌結(jié)合肌肉生長抑制素的單克隆抗體)也是本文提供的。雖然人抗體、部分人抗體或人化抗體對于很多應(yīng)用(特別是對涉及將抗體施用給人受試者的那些應(yīng)用)來說是合適的，但其他類型的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)將適合于某些應(yīng)用。本發(fā)明的非人抗體可以例如源于任何產(chǎn)生抗體的動物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢或非人靈長類(例如猴(例如獼猴或恒河猴)或猿(例如黑猩猩))。本發(fā)明的非人抗體可用于，例如，體外應(yīng)用或基于細胞培養(yǎng)的應(yīng)用，或者其中對本發(fā)明的抗體的免疫應(yīng)答將不發(fā)生、不顯著、可被預(yù)防、不成為問題或者是需要的任何其他應(yīng)用。在一種實施方式中，本發(fā)明的非人抗體施用給非人受試者。在又一實施方式中，非人抗體在非人受試者中不引發(fā)免疫應(yīng)答。在又一實施方式中，非人抗體來自與非人受試者相同的物種，例如，本發(fā)明的小鼠抗體施用給小鼠。可例如通過用想要的免疫原(例如表達肌肉生長抑制素的細胞或可溶肌肉生長抑制素多肽)免疫該物種的動物、或者使用產(chǎn)生該物種的抗體的人工系統(tǒng)(例如用于產(chǎn)生特定物種的抗體的基于細菌或噬菌體的系統(tǒng))、或者通過將來一種物種的抗體轉(zhuǎn)化為來自另一物種的抗體(通過例如用來自其他物種的恒定區(qū)替換抗體的恒定區(qū))、或通過替換抗體的一個或多個氨基酸殘基以使得其更接近來自其他物種的抗體的序列，來制造來自特定物種的抗體。在一種實施方式中，抗體是包含源于兩種或多種不同物種的抗體的氨基酸序列的嵌合抗體。可通過大量傳統(tǒng)技術(shù)中的任何來制備抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。例如，可適用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，從天 然表達它們的細胞中純化它們(例如，可從產(chǎn)生其的雜交瘤純化抗體)，或在重組表達系統(tǒng)中生產(chǎn)抗體。見例如，Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A NewDimension in Biological Analyses, Kennet 等，(eds.), Plenum Press, New York(1980)和 Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and Land(eds.) , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)。本領(lǐng)域已知的任何表達系統(tǒng)可用于制造本發(fā)明的重組多肽。通常，用包含編碼想要的多肽的DNA的重組表達載體來轉(zhuǎn)化細胞?？衫玫乃拗骷毎ㄔ松铩⒔湍富蚋呒壵婧思毎?。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或桿菌(bacilli)。高級真核生物細胞包括昆蟲細胞和建立的哺乳動物來源的細胞系。合適的哺乳動物細胞系的例子包括猴腎細胞的C0S-7系(ATCC CRL 1651) (Gluzman等，，1981，Cell23:175)兄細胞、293細胞、(:127細胞、3了3細胞(六了0: CCL 163)、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞系和源于非洲綠猴腎細胞系CVI (ATCC CCL 70)的CVI/EBNA細胞系，如McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821所述。關(guān)于使用細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的合適克隆和表達載體由Pouwels等，(Cloning Vectors:A LaboratoryManual, Elsevier, New York, 1985)所述。可在促進多肽表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，并通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化流程來回收多肽。一種此類純化流程包括使用親和色譜，例如在具有結(jié)合至其的肌肉生長抑制素的全部或一部分的基質(zhì)上。被考慮用于本文的多肽包括基本上不含污染的內(nèi)源材料的基本上均質(zhì)的重組哺乳動物抗肌肉生長抑制素抗體多肽。可通過大量已知技術(shù)中的任何來制備抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，并且針對想要的性質(zhì)加以篩選。某些技術(shù)涉及分離編碼感興趣的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如抗肌肉生長抑制素抗體)的多肽鏈(或其部分)的核酸以及通過重組DNA技術(shù)操作核酸。可將核酸融合至另外的感興趣的核酸，或?qū)ζ溥M行改造(例如通過誘變或其它傳統(tǒng)技術(shù))以例如添加、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗肌肉生長抑制素抗體的抗原結(jié)合片段。此類片段可完全由源于抗體的序列構(gòu)成或者可包含額外的序列。抗原結(jié)合片段的例子包括Fab、F(ab' )2、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和結(jié)構(gòu)域抗體。其它例子被提供于Lunde 等，,2002, Biochem.Soc.Trans.30:500-06 中。
單鏈抗體可通過下述方式形成:將重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Fv區(qū))片段經(jīng)由氨基酸橋聯(lián)(短肽接頭)連接起來，產(chǎn)生單多肽鏈。已通過融合編碼下述肽接頭的DNA制備了此類單鏈FVS(SCFVS)，所述肽接頭是編碼兩個可變結(jié)構(gòu)域多肽('和Vh)的DNA之間的。得到的多肽可折疊回到它們自身上，以形成抗原結(jié)合單體，或者它們可形成多聚體(例如二聚體、三聚體或四聚體)，這取決于兩個可變結(jié)構(gòu)域之間的柔性接頭的長度(Kortt等，,1997, Prot.Eng.10:423 ；Kortt等，,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通過組合不同的包含VJPVh的多肽，可形成與不同表位結(jié)合的多聚scFvs (Kriangkum等，，2001, Biomol.Eng.18:31-40)。開發(fā)來用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)包括美國專利 N0.4，946，778,Bird, 1988，Science 242:423,Huston 等，，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879、Ward等，，1989，Nature 334:544、de Graaf 等，，2002，Methods MolBiol.178:379-87中描述的那些。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如抗體、抗體片段和抗體衍生物)可包含本領(lǐng)域已知的任何恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)可以是例如K或λ型輕鏈可變區(qū)，例如人K或λ型輕鏈可變區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以是例如α、δ、ε、Y或μ型重鏈可變區(qū),例如人α、δ、ε、γ或μ型重鏈可變區(qū)。在一種實施方式中，輕鏈或重鏈恒定區(qū)是天然存在的恒定區(qū)的片段、衍生物、變體或突變蛋白質(zhì) 。已知有用于從感興趣的抗體獲得不同的亞類或不同的同種型的抗體的方法，SP，亞類遷移(subclass switching)。由此,例如，IgG抗體可源于IgM抗體,并且反之亦然。此類技術(shù)允許制備具有給定抗體(親本抗體)的抗原結(jié)合性質(zhì)但也顯示出與不同于親本抗體的抗體同種型或亞類相關(guān)的生物學(xué)性質(zhì)的新抗體?？衫弥亟MDNA技術(shù)。編碼特定抗體多肽的克隆的DNA可用于此類流程，例如，編碼想要的同種型的抗體的恒定區(qū)的DNA。還見Lantto 等，，2002, Methods Mol.Biol.178:303_16。此外，如果想要 IgG4 的話，還可能希望在鉸鏈區(qū)引入點突變(CPSCP->CPPCP)，如 Bloom 等，，1997，Protein Science 6:407 所述(其通過引用并入本文)，以減輕形成H鏈內(nèi)二硫鍵(可導(dǎo)致IgG4抗體中的異質(zhì)性)的趨勢。此外，還已知用于獲得具有不同性質(zhì)(即，針對其結(jié)合的抗原的變化的親和性)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的技術(shù)。一種此類技術(shù)被稱為鏈重排，其涉及在絲狀細菌噬菌體表面上展示免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域基因庫，其也被稱為噬菌體展示。鏈重排已被用于制備針對半抗原2-苯基惡唑-5-酮的高親和性抗體,如Marks等，,1992, BioTechnology, 10:779所述。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了具有從肌肉生長抑制素解離的低解離常數(shù)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有200pM的Kd，或IOOpM或更低的Kdo在又一實施方式中，Kd為IOpM或更低；在又一實施方式中，其為5pM或更低，或者其為4pM、3pM或2pM或更低。在又一實施方式中，Kd與本文在實施例中描述的抗體基本上相同。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)以與本文在實施例中描述的抗體基本上相同的Kd結(jié)合肌肉生長抑制素。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了具有比其針對GDF-1l的解離常數(shù)實質(zhì)上更低的針對肌肉生長抑制素的解離常數(shù)(Kd)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在又一實施方式中，針對肌肉生長抑制素的解離常數(shù)比針對⑶F-1l的低1000倍，或者其針對肌肉生長抑制素比⑶F-1l低 2，500,5, 000,7, 500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900 或 10，000 倍。在又一實施方式中，較之與GDF-1l的結(jié)合，與肌肉生長抑制素結(jié)合的選擇性為1，000、2，500,5,000,7，500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900 或 10，000 倍。在又一實施方式中，針對⑶F-1I的&為IOnM或更高，在又一實施方式中，其為25nM或更高，或者其為50nM、100nM、150nM、175nM或180nM或更高。在又一實施方式中，較之結(jié)合至⑶F-1l而言結(jié)合至肌肉生長抑制素的選擇性為 I, 000,2, 500,5, 000,7, 500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900或 10，000 倍。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了具有實質(zhì)上高于其針對GDF-1l的結(jié)合親和性的針對肌肉生長抑制素的結(jié)合親和性的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)針對肌肉生長抑制素的親和性是針對GDF-1l的500倍高。在又一實施方式中，針對肌肉生長抑制素的親和性是針對GDF-1l的1000倍高，或者其針對肌肉生長抑制素是針對GDF-1l 的 2，500,5, 000,7, 500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900 或 10，000 倍高。在又一方面，本發(fā)明提供了抑制肌肉生長抑制素的活性(例如，結(jié)合至肌肉生長抑制素受體(或其亞單位)、結(jié)合至表達肌肉生長抑制素受體的細胞、或肌肉生長抑制素與ALK4的結(jié)合)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有IOOOpM或更低的IC5(I。在又一實施方式中，IC5tl為500pM或更低；在又一實施方式中，IC5tl為300pM或更低，或者其為200pM或更低，或者其為IOOpM或更低。在又一實施方式中，IC5tl與本文在實施例中描述的抗體的IC5tl基本上相同。在又一實施方式中,抗原結(jié)合蛋白質(zhì)以與本文在實施例中描述的抗體的IC5tl基本上相同的IC5tl抑制肌肉生長抑制素的活性。在一種實施方式中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有IOOOpM或更低的針對肌肉生長抑制素(或表達肌肉生長抑制素的細胞)的表觀親和性。在其它一些實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)展示出500pM或更低、300pM或更低、200pM或更低、IOOpM或更低、或80pM或更低的表觀親和性。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)展示出與本文在實施例中描述的抗體的表觀親和性基本上相同的表觀親和性。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有與本文在實施例中描述的抗體的 表觀親和性基本上相同的表觀親和性。在又一實施方式中，本發(fā)明提供了與本文公開的抗體競爭結(jié)合肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。此類競爭能力可通過本領(lǐng)域公知的方法來測定，例如通過使用熒光活化細胞分選(FACS)技術(shù)或其他類似技術(shù)觀察到的在結(jié)合表達肌肉生長抑制素的細胞中的競爭、通過在檢驗例如BIACore⑧或KinExA 檢驗中的競爭、或通過在本文描述的另外的檢驗中的競爭。在一個方面，與本文公開的抗體競爭結(jié)合肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與所述抗體結(jié)合相同的表位或者重疊(或附近)表位。在又一方面，與本文公開的抗體競爭結(jié)合肌肉生長抑制素的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)抑制肌肉生長抑制素的活性。在又一方面，本發(fā)明提供了體外或體內(nèi)(例如當(dāng)施用給人受試者時)具有至少一天半壽期的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有至少三天的半壽期。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有四天或更長的半壽期。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有八天或更長的半壽期。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)被衍生或被修飾，使得其較之未經(jīng)衍生或為經(jīng)修飾的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有更長的半壽期。在又一實施方式中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)含有一處或多處點突變，以增加血清半壽期，例如2000年2月24日公開的WO 00/09560中描述的，其通過引用并入本文。本發(fā)明還提供了多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，例如雙特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，例如通過兩個不同抗原結(jié)合位點或區(qū)域結(jié)合肌肉生長抑制素的兩個不同表位、或結(jié)合肌肉生長抑制素的表位以及另一分子的表位的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。此外，本文公開的雙特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可包含來自本文所述的抗體之一的肌肉生長抑制素結(jié)合位點以及來自本文描述的另外的抗體的第二肌肉生長抑制素結(jié)合區(qū)，包括本文通過引用其他公開文獻而描述的那些。或者，雙特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可包含來自本文描述的抗體之一的抗原結(jié)合位點以及來自本領(lǐng)域已知的另外的肌肉生長抑制素抗體、或來自通過已知方法或本文描述的方法制備的抗體的第二抗原結(jié)合位點。制備雙特異性抗體的大量方法是本領(lǐng)域已知的，并被討論于2001年4月20日提交的美國專利申請09/839，632(通過引用并入本文)中。此類方法包括使用Milstein等，，1983，Nature 305:537和其它(美國專利4，474，893、美國專利6，106，833)描述的雜交體_雜交瘤，和化學(xué)偶聯(lián)抗體片段(Brennan等，.，1985, Science 229:81 ；Glennie等，,1987，J.1mmunol.139:2367 ;美國專利6，010，902)。此外，可通過重組手段來產(chǎn)生雙特異性抗體，例如通過使用亮氨酸拉鏈基元(即來自Fos和Jun蛋白質(zhì)，其優(yōu)先形成異源二聚體；Kostelny等，，1992, J.1mmnol.148:1547)或其它鎖匙相互作用結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，如美國專利U.S.Patent 5，582，996所述。另外的有用技術(shù)包括上文Kortt et al.，1997 ;美國專利5，959，083和美國專利5，807，706中描述的那些。在又一方面，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包含抗體的衍生物。衍生化抗體可包含向抗體賦予想要的性質(zhì)(例如特定用途中增加的半壽期)的任何分子或物質(zhì)。衍生化的抗體可包含例如可檢測(或標(biāo)記)基元(例如放射活性、發(fā)色、抗原性或酶分子、可檢測珠粒(例如磁性或電子致密(例如金)珠粒)或結(jié)合另外的分子的分子(例如生物素或鏈親和素))，治療性或診斷性基元(例如放射活性、細胞毒性或藥物活性基元)或增加抗體對于特定用途的適合性(例如施用給受試者，例如人受試者，或者其它體內(nèi)或體外用途)?？捎糜谘苌贵w的分子的例子包括清蛋白(例如人血清清蛋白)和聚乙二醇(PEG)?？贵w的連接清蛋白和PEG化的衍生物可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來制備。在一種實施方式中，抗體與轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白質(zhì)(TTR)或TTR變體綴合或連接?？捎美邕x自右旋糖酐、聚(η-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧丙烯/聚氧乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylate d polyols)和聚乙烯醇構(gòu)成的組的化學(xué)品修飾TTR或TTR變體。美國專利申請 N0.20030195154。本發(fā)明的另一方面包括本文描述的抗體的變體。某些變體被本文所述的共有序列包括，例如SEQ ID N0s:10和20中。另外的變體包括一個或多個氨基酸不同于本文公開的抗體的抗體，例如，變體抗體的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個氨基酸不同于公開的抗體序列。在有益實施方式中，變體與公開的抗體之一在氨基酸序列上90%相同。在又一實施方式中，變體抗體序列與本文公開的抗體之一 91%、92%、93%、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同。變體還包括其中一個或多個氨基酸已被缺失的抗體序列，例如一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸可從抗體多肽的末端缺失，或者此類缺失可在內(nèi)部進行。另外的實施方式也包括術(shù)語“抗體”中。例如，氨基酸殘基可經(jīng)歷翻譯后修飾，包括但不限于，谷氨酰胺(特別是N-末端的谷氨酰胺)可被環(huán)化或轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸；此外或或者，氨基酸可經(jīng)歷脫氨、異構(gòu)化、糖化和/或氧化。本發(fā)明的多肽可經(jīng)歷額外的翻譯后修飾，包括糖基化，例如N-連接或O-連接的糖基化，其在本領(lǐng)域公知的位點進行。由此，可在多肽的氨基酸序列中產(chǎn)生變化，以排除或最小化上述改變，或在此類加工是有益的情況下協(xié)助它們。在又一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)篩選結(jié)合肌肉生長抑制素的分子的方法。任何合適的篩選技術(shù)可以使用。在一種實施方式中，將本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的肌肉生長抑制素分子或其片段與本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)以及與另一分子接觸，其中所述另外的分子如果降低了抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與肌肉生長抑制素的結(jié)合的話，則另外的分子結(jié)合肌肉生長抑制素?？墒褂萌魏魏线m的方法Hf^BELISA)來檢測抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合。檢測抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與肌肉生長抑制素的結(jié)合可通過可檢測地標(biāo)記抗原結(jié)合蛋白質(zhì)而簡化，如上文所討論的。在又一實施方式中，肌肉生長抑制素結(jié)合分子被進一步分析，以確定其是否抑制肌肉生長抑制素活化和/或信號傳遞。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的多肽產(chǎn)品與可用于肌肉生長抑制素療法的可藥用稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載劑。此類組合物包括多種緩沖成分(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑，例如去垢劑和增溶試劑(例如Tween 80，聚山梨醇酯80)，抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)，防腐劑(例如硫柳萊(Thimersol)、苯甲 醇)和填充劑(bulking agent)(例如乳糖、甘露糖醇)，基元例如聚合物(例如聚乙二醇或其他基元)與蛋白質(zhì)的共價連結(jié)(如上文所討論的，還見例如美國專利4，179，337，其通過引用并入本文)；將材料摻入聚合化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸等等)的特定制劑或摻入脂質(zhì)體。此類組合物將影響肌肉生長抑制素的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率以及體內(nèi)清除率。見，例如Remington' s PharmaceuticalSciences, 18th Ed.(1990,Mack Publishing C0.,Easton,PA 18042) 1435-1712 頁，其通過引用并入本文。通常，本發(fā)明的肌肉生長抑制素抑制性多肽的有效量將通過接受者的年齡、體重和疾病的病況或嚴(yán)重性來確定。見Remingtons Pharmaceutical Sciences,上文，697-773頁，其通過引用并入本文。典型地，可使用大約0.001g/kg提供至大約lg/kg體重之間的劑量，但是醫(yī)師將認識到可以使用更多或更少。對于局部(即，非全身性)應(yīng)用而言，例如對于局部性應(yīng)用，給劑量可在大約0.001g/cm2至大約lg/cm2之間。給劑量可以一天一次或多次，或者頻次更少，并且可以與本文所述的其他組合物聯(lián)合。應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明不限于本文提到的劑量。本發(fā)明提供了藥物組合物和治療多種病癥的方法，其中使用肌肉生長抑制素拮抗齊U，包括肌肉生長抑制素結(jié)合試劑(或肌肉生長抑制素結(jié)合多肽，包括抗體)。本發(fā)明提供了在需要其的受試者中治療性功能減退的作用的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。在一種實施方式中，性功能減退是雄激素剝奪療法導(dǎo)致的。在第二實施方式中，性功能減退是年齡相關(guān)的性腺機能減少導(dǎo)致的。本發(fā)明還提供了在受試者中治療惡病質(zhì)的方法，所述受試者正遭受此類病況，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。所述病況可以是原發(fā)惡病質(zhì)或繼發(fā)惡病質(zhì)。在一種實施方式中，受試者患有風(fēng)濕病惡病質(zhì)或作為自身免疫病況或炎性病況(包括慢性阻塞性肺病或COPD)的并發(fā)癥或結(jié)果而發(fā)生的惡病質(zhì)。本發(fā)明還提供了在需要其的受試者中治療由于燒傷導(dǎo)致的惡病質(zhì)的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。本發(fā)明還提供了在遭受特征在于過量TNF-α的炎性病況的受試者中降低腫瘤壞死因子(TNF)-Ci的方法。本發(fā)明還提供了對需要下述治療的受試者治療由于用化學(xué)試劑(例如化療劑)治療導(dǎo)致的惡病質(zhì)的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。本發(fā)明還提供了當(dāng)惡病質(zhì)是由于癌癥或腫瘤病況導(dǎo)致時、由針對癌癥或腫瘤病況的任何治療導(dǎo)致時或是所述病況和所述治療的組合作用時，在患有癌癥或腫瘤病況的個體中治療惡病質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供了在需要下述治療的受試者中治療由于糖尿病導(dǎo)致的惡病質(zhì)的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用 載劑作為混合物施用。本發(fā)明還提供了在遭受糖尿病性神經(jīng)病的患者中治療糖尿病性神經(jīng)病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。本發(fā)明還提供了治療心源性惡病質(zhì)和/或腎源性惡病質(zhì)的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。惡病質(zhì)是慢性心衰(CHF)的常見并發(fā)癥，其與炎性細胞因子例如TNF-α的增加的血漿水平和分解代謝/合成代謝途徑的不平衡相關(guān)聯(lián)?；加新阅I衰(CRF)和/或終末期腎病(ESRD)的受試者通常也患有到惡病質(zhì)，這也可歸因于促炎性試劑的升高的水平。本文還提供了治療心臟萎縮和/或心臟發(fā)育不良的方法。心臟萎縮在患有癌癥的個體中發(fā)生，也在長期臥床或在導(dǎo)致隨意肌(voluntary muscle)萎縮的其他狀況或病況的個體中發(fā)生。此外，本發(fā)明的選擇性肌肉生長抑制素拮抗劑還可用于治療其中心肌效率降低的其他病況，例如，心衰(例如，充血性心衰)。本發(fā)明還可用于治療在飲食病癥或饑餓中發(fā)生的心臟異常。本發(fā)明還提供了治療以前通過生長激素、胰島素生長因子-1 (IGF-1)、生長激素促分泌素和與生長激素-1GF-1軸相關(guān)的其他試劑來治療的疾病或病況的備選方法。肌肉生長抑制素拮抗劑提供了治療此類病癥并且沒有這些試劑的潛在危險副作用的方法。肌肉生長抑制素拮抗劑還提供了治療生長激素抗性(被認識到的衰老中的疾病)的方法。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了治療Prader-Wi 11 i綜合征的作用的方法，所述方法在遭受此類病況的受試者中進行，包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。本發(fā)明還提供了治療肌肉減少癥(包括老年人的肌肉減少癥)以及其他肌肉疾病或病況的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗齊U，所述肌肉生長抑制素拮抗劑與可藥用載劑作為混合物施用。本發(fā)明還提供了治療老年人的虛弱的方法，包括用于復(fù)健療法，以及與力量和/或平衡訓(xùn)練聯(lián)合，以及用于降低或預(yù)防跌倒。本發(fā)明還提供了協(xié)助外傷性骨折的治愈和骨質(zhì)疏松性骨折的修復(fù)以及對一般性的骨損失(例如骨質(zhì)疏松癥和/或骨質(zhì)減少)或伴隨長期不運動或臥床和/或肢固定的結(jié)果的骨損失的治療的方法。針對病況施用肌肉生長抑制素拮抗劑能證明有益的其他病況包括阿狄森氏?。患∥s性側(cè)索硬化或運動神經(jīng)元病(ALS ；MND ;盧格里格病)；貝爾麻痹(和/或面部神經(jīng)問題)；肉毒桿菌中毒；腦性麻痹；進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥和其它外周神經(jīng)病；庫欣綜合征；糖尿病性神經(jīng)??；格林-巴利綜合征；多發(fā)性硬化；肌萎縮(包括進行性肌萎縮和脊髓性肌萎縮)；肌營養(yǎng)不良癥(其有多種形式；包括強直性肌營養(yǎng)不良癥)；重癥肌無力；脊髓灰質(zhì)炎；多肌炎；肌肉、肌腱和/或韌帶的扭傷和拉傷沖風(fēng)(和其他導(dǎo)致肌肉消耗的病況，例如長期不活動或臥床，肢固定(例如通過打石膏和/或上夾板)和太空飛行)。本發(fā)明的肌肉生長抑制素結(jié)合蛋白質(zhì)還可用于診斷方法。例如，可通過與可檢測標(biāo)志物物質(zhì)的連結(jié)來“標(biāo)記”本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如用125I進行放射性標(biāo)記或與另外的可檢測基元綴合)，以提供可用于在固體組織和液體(例如血液或尿液)樣品中檢測和定量肌肉生長抑制素的試劑。本發(fā)明還包括含有此類經(jīng)標(biāo)記的材料的試劑盒。下述實施例是闡述本發(fā)明的特定實施方式或特定的目的而提供的，其并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1抗肌肉生長抑制素抗體制備了若干變體抗肌肉生長抑制素抗體，針對活性進行了測試；它們的序列如下表I和2所示。表1:抗肌肉生長抑制素抗體重鏈序列

權(quán)利要求
1.一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體包含至少一條輕鏈和至少一條重鏈，其中所述輕鏈包含恒定區(qū)和含有三個互補性決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)，并且所述重鏈包含恒定區(qū)和含有三個互補性決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)，其中所述輕鏈⑶Rs是SEQ ID NO:10中公開的那些，并且所述重鏈⑶Rs是SEQ ID NO:20中公開的那些。
2.權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述輕鏈CDRs選自 a)SEQ ID NO:1中公開的輕鏈CDRs ； b)SEQID NO:2中公開的輕鏈CDRs ； c)SEQID NO:3中公開的輕鏈CDRs ； d)SEQ ID NO:4中公開的輕鏈CDRs ； e)SEQID NO:5中公開的輕鏈CDRs ； f)SEQ ID NO:6中公開的輕鏈CDRs ； g)SEQ ID NO:7中公開的輕鏈CDRs ； h)SEQ ID NO:8中公開的輕鏈CDRs ;和 i)SEQID NO:9中公開的輕鏈CDRs 構(gòu)成的組； 并且其中所述重鏈⑶Rs選自 a，)SEQ ID NO:11中公開的重鏈CDRs ； b，)SEQ ID NO:12中公開的重鏈CDRs ； c，)SEQ ID NO:13中公開的重鏈CDRs ； d，)SEQ ID NO:14中公開的重鏈CDRs ； e，)SEQ ID NO:15中公開的重鏈CDRs ； f，)SEQ ID NO:16中公開的重鏈CDRs ； g’ )SEQ ID NO:17中公開的重鏈CDRs ； h，)SEQ ID NO:18中公開的重鏈CDRs ;和 i’)SEQ ID NO:19中公開的重鏈CDRs 構(gòu)成的組。
3.權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO:10中示出的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:20中示出的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的抗體，所述輕鏈可變區(qū)選自 a)SEQ ID NO:1中公開的輕鏈可變區(qū)； b)SEQID NO:2中公開的輕鏈可變區(qū)； c)SEQID NO:3中公開的輕鏈可變區(qū)； d)SEQ ID NO:4中公開的輕鏈可變區(qū)； e)SEQID NO:5中公開的輕鏈可變區(qū)； f)SEQ ID NO:6中公開的輕鏈可變區(qū)； g)SEQ ID NO:7中公開的輕鏈可變區(qū)； h)SEQ ID NO:8中公開的輕鏈可變區(qū)；和 i)SEQID NO:9中公開的輕鏈可變區(qū) 構(gòu)成的組；并且其中所述重鏈可變區(qū)選自 a’ )SEQ ID NO:11中公開的重鏈可變區(qū)； b’ )SEQ ID NO:12中公開的重鏈可變區(qū)； c’ )SEQ ID NO:13中公開的重鏈可變區(qū)； d’ )SEQ ID NO:14中公開的重鏈可變區(qū)； e’ )SEQ ID NO:15中公開的重鏈可變區(qū)； f’ )SEQ ID NO:16中公開的重鏈可變區(qū)； g’ )SEQ ID NO:17中公開的重鏈可變區(qū)； h’ )SEQ ID NO:18中公開的重鏈可變區(qū)；和 i’)SEQ ID NO:19中公開的重鏈可變區(qū) 構(gòu)成的組。
5.一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體以小于IOOpi^AKd結(jié)合肌肉生長抑制素。
6.權(quán)利要求5所述的分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體以高于IOnM的Kd結(jié)合⑶F-1I。
7.一種分離的肌肉 生長抑制素特異性抗體，所述抗體以其針對GDF-1l的親和性至少5000倍的親和性結(jié)合肌肉生長抑制素。
8.一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體展示出針對肌肉生長抑制素的選擇性，所述選擇性是針對⑶F-1I的至少5000倍。
9.一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體結(jié)合肌肉生長抑制素并且阻礙肌肉生長抑制素與ALK4的相互作用。
10.權(quán)利要求9所述的分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體結(jié)合肌肉生長抑制素并阻礙肌肉生長抑制素與ALK4的相互作用，但是與肌肉生長抑制素/ActRIIA復(fù)合體和/或肌肉生長抑制素/ActRIIB復(fù)合體共結(jié)合。
11.一種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體結(jié)合肌肉生長抑制素，其中肌肉生長抑制素中肌肉生長抑制素與所述肌肉生長抑制素特異性拮抗劑的結(jié)合所需的兩個區(qū)域位于成熟肌肉生長抑制素(SEQ ID NO:25)的第21至31位和第50至60位附近的序列。
12.—種分離的肌肉生長抑制素特異性抗體，所述抗體與肌肉生長抑制素中位于成熟肌肉生長抑制素的第21至31位和第50至60位附近的序列的兩個區(qū)域相互作用，以防止對這些區(qū)域內(nèi)肽鍵的糜蛋白酶切割。
13.權(quán)利要求1-12中任意一項所述的抗體，其中所述輕鏈恒定區(qū)選自K輕鏈和λ輕鏈構(gòu)成的組，并且所述重鏈恒定區(qū)選自μ重鏈恒定區(qū)、δ重鏈恒定區(qū)、Υ重鏈恒定區(qū)、α重鏈恒定區(qū)和ε重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的組。
14.權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述抗體屬于選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4構(gòu)成的組的亞類。
15.一種分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的肌肉生長抑制素特異性拮抗劑。
16.—種包含權(quán)利要求15所述的核酸的載體。
17.—種經(jīng)權(quán)利要求16所述的抗體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的分離的宿主細胞。
18.一種用于生產(chǎn)肌肉生長抑制素特異性拮抗劑的方法，所述方法包括在促進表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17的宿主細胞以及從培養(yǎng)基中回收所述肌肉生長抑制素特異性拮抗劑。
19.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-16中任意一項所述的肌肉生長抑制素特異性拮抗劑和生理上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑。
20.一種抑制肌肉生長抑制素的至少一種活性的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物施用至個體，使得肌肉生長抑制素的至少一種活性被部分或完全抑制。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述個體患有選自下述病況構(gòu)成的組的病況:性功能減退(包括雄激素剝奪療法導(dǎo)致的性功能減退，和年齡相關(guān)的性腺機能減少導(dǎo)致的性功能減退)，惡病質(zhì)；心源性惡病質(zhì)；腎源性惡病質(zhì)，心臟萎縮；心發(fā)育不良；心衰；肌肉減少癥；外傷性骨折；骨質(zhì)疏松性骨折；骨損失(例如骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)減少)；阿狄森氏??；肌萎縮性側(cè)索硬化或運動神經(jīng)元病(ALS ；MND ;盧格里格病)；貝爾麻痹(和/或面部神經(jīng)問題)；肉毒桿菌中毒；腦性麻痹；進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥和其它外周神經(jīng)??；庫欣綜合征；糖尿病性神經(jīng)??；格林-巴利綜合征；多發(fā)性硬化；肌萎縮(包括進行性肌萎縮和脊髓性肌萎縮)；肌營養(yǎng)不良癥(包括Becker型肌營養(yǎng)不良，先天性肌營養(yǎng)不良，Duchenne型肌營養(yǎng)不良，遠端型肌營養(yǎng)不良，Emery-Dreifuss型肌營養(yǎng)不良，面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥，肢帶型肌營養(yǎng)不良癥，強直性肌營養(yǎng)不良癥，眼咽型肌營養(yǎng)不良，脊髓性肌萎縮，Brown-Vialetto-Van Laere 綜合征(BVVL)、Fazio-Londe (FL)綜合征和特征在于進行性骨骼肌無力的其它綜合征，肌肉蛋白質(zhì)中的缺陷，以及肌肉細胞和組織的死亡)；重癥肌無力；脊髓灰質(zhì)炎；多肌炎；肌肉、肌腱和/或韌帶的扭傷和拉傷；中風(fēng)(和其他導(dǎo)致肌肉消耗的病況，例如長期不活動或臥床，肢固定(例如通過打石膏和/或上夾板)和太空飛行)；和可通過生長激素、胰島 素生長因子-1 (IGF-1)、生長激素促分泌素和與激素-1GF-1軸相關(guān)的其他試劑治療的病況。
全文摘要
本發(fā)明公開了選擇性肌肉生長抑制素拮抗劑(包括抗體)、編碼它們的核酸以及制造和使用它們的方法。還公開了識別第21至31位附近和第50至60位附近的構(gòu)象表位的中和抗體。
文檔編號A61P21/00GK103221426SQ201180044739
公開日2013年7月24日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者韓匯泉, T·阿羅拉, 陳清, 盧瀗鍹, 周小嵐 申請人:安姆根公司