專利名稱：抗原特異性超聲造影劑、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及診斷性和/或治療性的抗原特異性超聲造影劑、其制備方法及其在超聲診斷成像(通常稱為超聲診斷成像)、以及在其他類型診斷成像和/或在治療中的用途。特別地，現(xiàn)已證實，由于其通過在長時間內(nèi)僅對患病組織賦予改進的造影圖像增強，從而選擇性檢測并揭示腫瘤組織/腫瘤實體，同時將其與鄰近(健康的)組織區(qū)分的能力，所述造影劑可用于將適合的藥理學物質(zhì)和或其他生物活性成分，還包括非回聲圖像造影劑，選擇性地攜帶并釋放到患病組織中。
背景技術：
超聲造影劑(或CM)是能夠增強超聲影像反差的物質(zhì)。迄今為止，在最常用的超聲造影劑中，所謂的第二代造影劑基本由包含在適合包膜中的氣體微泡組成，所述氣體優(yōu)選為惰性氣體(例如六氟化硫、全氟己烷、全氟碳化物、空氣、氮氣)；優(yōu)選所述包膜是以所謂的微膠囊/微泡/微球體/微囊泡/微氣球的形式存在，其完全或基本上由適宜的穩(wěn)定性物質(zhì)，例如磷脂或白蛋白形成。增強超聲信號的成分是氣體，其回聲系數(shù)(echogenicity coefficient)遠大于大多數(shù)生物固體和液體的回聲系數(shù)。常用的造影劑由例如包含氣體的微膠囊/微泡/微球體/微囊泡/微氣球(下文一般簡稱為微球體)組成，其特征在于特異的共振頻率f0(通常以MHz計)，即其中顆粒開始進入壓縮和稀疏(rarefaction)的循環(huán)相的振動頻率。所謂第二代造影劑特別有用的原因在于其共振頻率包含在現(xiàn)有超聲儀器已常用的超聲頻率范圍內(nèi)。在注射進入血流中后，所述造影劑在被超聲波束擊中時開始共振。因此，它們產(chǎn)生反射的超聲波束，顯示了由注射物質(zhì)的性質(zhì)或由入射的受聲波作用(insonating)的超聲波束的性質(zhì)導致的物理特征。特別是，考慮到微球體的物理特征，如果其膜的厚度和剛性較大，則相比于具有較薄因而彈性較好的膜的顆粒，其產(chǎn)生強度較小(即，用處較小的)聲波響應。另一方面，太薄的膜的缺點是過于脆弱，因而對入射超聲波束施加的壓力作用抵抗較小。在這種情況下，微球體會在很短時間內(nèi)(通過聲孔作用(sonoporation)或通過空化作用(cavitation))被破壞，以致于不能提供對診斷有用的圖像。如果與超聲波束接觸的微球體數(shù)增多，則可見單個顆粒/微球體的回聲系數(shù)線性增加。也就是說，所述系數(shù)是單個微球體系數(shù)與注射進入血流的微球體數(shù)乘積獲得的總值。對于入射超聲波束，其基本參數(shù)是頻率和聲強(通常以KPa計)。特別是，聲強在反射波束范圍和顆粒振動類型的表征中至關重要。
確切地說，如果造影劑微球體被聲壓較低(平均10-20KPa范圍內(nèi))且頻率等于造影劑(CM)共振頻率的超聲波束擊中，則其僅發(fā)生線型的形狀改變。在這種情況下，所得壓縮相平均起來與稀疏相相等，且反射超聲信號向各方向傳播(這就是所謂的散射現(xiàn)象)。相反，如果入射波束(仍保持與共振波束相等的頻率)具有較高值的聲壓(例如，40KPa-50KPa范圍內(nèi))，則所得稀疏相大于壓縮相。這種作用使微球體能夠產(chǎn)生富集在為共振頻率數(shù)倍(即，2 、3 、4 等)的系列諧波頻率的反射超聲波束。此外，更大的聲強例如高達約IMPa的聲強導致產(chǎn)生次諧波頻率(f0/2、f0/5等)。通常，大于IMPa的強度導致微球體破裂，該效應用于使用第一代CM的超聲成像技術中。反射超聲波束的強度(以Pa或dB計)與入射超聲波束的強度和造影劑的回聲系數(shù)成正比，而與構(gòu)成造影劑的微球體半徑成反比。上述諧波頻率由多倍或次倍量(sub-multiples)的受聲波作用的超聲波束基頻形成。該諧波的產(chǎn)生基本上由微球體形狀上發(fā)生的彈性改變引起的。如上所示，所述改變通過由超聲波束施加的聲壓質(zhì)量引起的微球體本身的壓縮和稀疏相產(chǎn)生。一般而言，優(yōu)選的諧波頻率為二次諧波頻率，因為其易于顯示在超聲儀器上。這是由于二次諧波頻率是與基頻最接近的頻率，因此可更適當?shù)刈R別。在接受相(receipt phase)期間得到恰當設置時,超聲探頭能夠檢測/讀取此頻率。此外，取決于所用的超聲檢測方法(借助適當?shù)能浖?，可以利用廣泛的不同技術方案，分析來自不同結(jié)構(gòu)的反射信號。例如，可以減去來自靜態(tài)組織(static tissue)的諧波,表征僅來自于血管設備的信號，調(diào)節(jié)信號相或其幅度或二者。在所有情況下，最終目的都是相對于沒有浸潰造影劑的解剖結(jié)構(gòu)，以顯著的造影增強度，單獨選擇性地識別并區(qū)分出浸潰了造影劑的解剖結(jié)構(gòu)。從技術觀點出發(fā)，當CM注射進入血流，且超聲探頭放置于要分析的特定身體組織區(qū)域上時，可以按照以下三相進行微球體移動:-動脈相(從第10至第35秒)；-軟組織相(從第40至第120秒)；-靜脈相(從第120秒開始，直至造影劑從所檢查器官的血液循環(huán)中消失)。

眾所周知，除了產(chǎn)生有效成像對比度的能力，超聲造影劑還可包含藥理學物質(zhì)和/或其他生物活性成分，包括其他類型的非超聲造影劑，并且一旦受到適合的超聲波束進行適當?shù)穆暡ㄗ饔茫茨軌驅(qū)⑦@些成分釋放到聚集這些成分的患病組織中。因此，充分穩(wěn)定且位點特異的超聲造影劑是非常有用的，例如能隨著時間的推移而必要而選擇性地將患病組織(例如，腫瘤)與鄰近的健康組織區(qū)分開來，并且能以受控，特別是可調(diào)的方式將藥理學物質(zhì)釋放到所述組織中。換句話說，一方面，穩(wěn)定且能夠至少在成功進行所需超聲診斷檢查所需的所有必要時間內(nèi)，相比于鄰近的健康組織，選擇性地對患病組織給出高造影圖像增強的超聲造影劑是非常有用。另一方面，考慮到對由所述藥物的錯誤輸液速率所引起的并發(fā)癥的補救，所述超聲造影劑是否還能夠以操作者能調(diào)節(jié)的方式將適合的藥物選擇性釋放到所述患病組織中也同樣非常重要?，F(xiàn)已嘗試對上述需求作出回應。因此，例如，已制造出包含惰性氣體的微球體，其中包含對患病/腫瘤組織中存在的一種或多種抗原特異的一種或多種受體。在現(xiàn)有技術的該類造影劑中，將所述受體(例如，單克隆和非單克隆抗體和/或它們的片段，例如，F(xiàn)ab’s，S卩，抗原結(jié)合的片段)引入微球體膜，例如，插入其磷脂鏈組分。已嘗試在灌注造影劑時，通過這種方式輔助/促使所述受體與存在于待成像組織內(nèi)的相應抗原之間形成特異且可能強烈的結(jié)合。此方法還可潛在地用于攜帶摻入到所述微球體內(nèi)的適合藥物，在通過包含所述超聲CM的血流灌注所需組織時，若對這些組織進行適合的超聲處理，即可將所述藥物連續(xù)釋放到所述組織中。迄今為止，該系統(tǒng)仍僅在實驗階段使用，還不可能在人體組織中便利地再現(xiàn)。上述系統(tǒng)的主要缺點之一在于包含在微泡內(nèi)的藥物不能以受調(diào)控的方式釋放以符合病人的需要，而是僅通過微球體與入射超聲波束之間的一次相互作用同時釋放；在必須進行低速藥物灌注或給藥的臨床情況下，例如，在頸動脈斑塊溶解血栓的治療過程中，這嚴重危害了給藥的安全性。例如，W02008/110958公開了一種包含超聲敏感性顆粒的組合物，所述超聲敏感性顆粒包含用于選擇性釋放生物物質(zhì)的由脂質(zhì)體制成的顆粒亞群(sub-group)。然而,該文獻沒有公開或暗示利用其膜在結(jié)構(gòu)上基本由對某些抗原具有特異性的受體形成的同心微泡的可能性。W02007/008220公開了一種脂質(zhì)體與中性或白蛋白包被的堿性微泡的內(nèi)部和外部結(jié)合的方法，但是其沒有記載使用多于一個界面增大聲孔作用的功效，也沒有提及或暗示利用其膜在結(jié)構(gòu)上基本或主要由對某些抗原具有特異性的受體形成的同心微泡的可能性。Liang H-D 等人("Sonoporation, d rug delivery,andgenetherapy^, Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers.Journal ofEngineering in Medicine.Part H，Mechanical Engineering Publications, Ltd., LondonGBj Vol.224n0.2，(2010.01.01)，pages434_361)詳細記載了超聲領域的最新創(chuàng)新；但沒有提及甚至沒有暗示利用其膜在結(jié)構(gòu)上基本或主要由對某些抗原具有特異性的受體形成的同心微泡的可能性。摶術問是頁因此，迄今為止，醫(yī)學領域中仍強烈而深切地需要一種超聲造影劑，其在受到適合類型的聲波作用后，能夠在足夠長/有用的時間內(nèi)，形成相比于鄰近組織(通常，健康的組織)，僅選擇性地和適當?shù)?即，足夠強地)與待成像的組織(通常，患病的組織)的結(jié)合，此后，能以收調(diào)節(jié)和控制的方式釋放與其結(jié)合的藥理學或生物活性物質(zhì)，以至少在用于成功進行所需的選擇性超聲診斷成像且同時完成所需的選擇性治療處理并根據(jù)需要調(diào)節(jié)的所有充分且必要時間內(nèi)，選擇性賦予所述(待成像的)組織顯著高的且延長的造影圖像增強性。

發(fā)明內(nèi)容
申請人:完全出乎意料地發(fā)現(xiàn)，上述技術問題可以通過制備由多個適合的不同微球體組成的超聲造影劑而得到充分解決，其中，所述微球體彼此嵌套、相對于彼此基本同心，其中，每個所述微球體均由膜包被且包含適宜的惰性氣體和適宜的生物活性成分，所述膜包含作為其組成成分的適量的對某些抗原具有抗原特異性的適合受體。因此，如所附獨立權(quán)利要求所述，本發(fā)明的一個實施方式為一種抗原特異性超聲造影劑，其由彼此不同的至少兩個微球體組成,其中一個微球體插入到另一個微球體內(nèi)，每個所述微球體由膜包被并且 包含適合的惰性氣體，所述膜由適量的高親和力受體及其穩(wěn)定劑形成，所述受體對存在于待成型組織內(nèi)的某些抗原具有特異性。然后，如所附獨立權(quán)利要求所述，本發(fā)明的一個實施方式為包含上述造影劑的超聲造影藥物組合物。
此外，如所附獨立權(quán)利要求所述，本發(fā)明的一個實施方式為用于制備上述造影劑的方法。如所附獨立權(quán)利要求所述，本發(fā)明的另一個實施方式為上述造影劑用于對組織(優(yōu)選患病/腫瘤組織)進行相對于周圍的(優(yōu)選健康的組織)組織的選擇性超聲成像的用途。如所附獨立權(quán)利要求所述，本發(fā)明的另一個實施方式為上述超聲造影劑作為藥物和/或其他生物活性成分的選擇性載體的用途。此外，如所附獨立權(quán)利要求所述，本發(fā)明的另一個實施方式為上述超聲造影劑用于以選擇性和受調(diào)節(jié)的方式向患病組織釋放藥理學活性成分的用途。本發(fā)明的其他實施方式均描述于所附的從屬權(quán)利要求中。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明，所述抗原特異性超聲造影劑由彼此不同的至少兩個(或更多)微球體組成，其中每一個微球體插入到另一個微球體內(nèi)，且每個所述微球體:由膜包被，所述膜對于每個微球體各不相同，并且基本由有效量的至少一種高親合力受體和最低有效量的至少一種穩(wěn)定劑構(gòu)成，其中，所述高親合力受體存在于待成像和/或待藥理治療的組織中的某些抗原具有特異性，所述穩(wěn)定劑與所述受體之間的重量比在10:1至1:1范圍內(nèi)；和包含惰性氣體，用于各微球體的所述惰性氣體是相同或不同的。優(yōu)選地，本發(fā)明的造影劑由彼此不同，一個放置于另一個內(nèi)部且彼此基本同心的兩個微球體組成。

包被所述至少兩個微球體中各個微球體的膜各不相同:確切地說，包被外微球體的膜與包被內(nèi)微球體的膜不同。所述膜包含有效量的至少一種抗原特異性受體，所述抗原特異性受體存在于待成像和/或藥理治療的組織中的某些抗原具有高親合力。更優(yōu)選所述膜僅包含一種單抗原特異性受體。事實上，兩個微球體均是抗原特異性的。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，所述受體對每種類型的膜都是相同的，即對包被外微球體的膜和包被內(nèi)微球體的膜是相同的。例如，所述受體可選自包括以下的組:抗體(單克隆抗體或非單克隆抗體)和/或其片段(例如Fabs)，和/或?qū)?nèi)皮細胞、心肌細胞、適當?shù)墓逃袑蛹毎?、間質(zhì)細胞、表達于動脈粥樣硬化斑塊中的細胞具有特異性的VEGFR(血管內(nèi)皮生長因子受體)受體，以及免疫球蛋白、補體片段、肽和脂質(zhì)激素、神經(jīng)遞質(zhì)的特異性受體。特別優(yōu)選的受體是對某些抗原具有特異性的具有高親合力的抗體Fab片段。相比于完整抗體，優(yōu)選使用抗體Fab片段是由于缺少其Fe片段(可結(jié)晶片段)的抗體喪失其細胞毒性和補體分子激活性。以此方式，可以去除或至少基本上減少副作用的發(fā)作。優(yōu)選包被每個所述微球體的所述膜進一步包含最低有效量的具有穩(wěn)定作用的至少一種物質(zhì)(在本發(fā)明的某些實施方式中，在任何情況下還可具有兩種或多種穩(wěn)定劑的混合物)。所述至少一種穩(wěn)定劑基本上對膜發(fā)揮其作用，但也對所述抗原特異性受體發(fā)揮其作用，因此，使膜(即，確切而言是裝配的受體-穩(wěn)定劑)在適當?shù)臅r間內(nèi)保持在組織內(nèi)基本球形結(jié)構(gòu)的完整，以便使其接近靶點并在進行診斷和/或治療步驟所需的全部時間內(nèi)與靶點有效結(jié)合。所述至少一種穩(wěn)定劑對于每種類型的膜各不相同:確切地說，包被外微球體的膜內(nèi)包含的穩(wěn)定劑與包被內(nèi)微球體的膜內(nèi)包含的穩(wěn)定劑不同。所述穩(wěn)定劑選自例如包括以下的組:白蛋白、磷脂、半乳糖、棕櫚酸、氰基丙烯酸酯(cianoacrylate)。優(yōu)選的穩(wěn)定劑是白蛋白、磷脂、棕櫚酸、半乳糖和其混合物；特別優(yōu)選的是白蛋白、磷脂和棕櫚酸/半乳糖混合物。更優(yōu)選白蛋白，因為其對蛋白質(zhì)(抗體、Fab’s等)發(fā)揮強穩(wěn)定作用，因而甚至在低劑量下也可有效地合并(amalgamate)形成微球體膜的蛋白質(zhì)分子,而不過分降低其濃度以及因此降低其功效。添加的穩(wěn)定劑的量是所需的最低量:在任何情況下，僅為以適當?shù)?所需的方式充分穩(wěn)定微球體膜的量。通常，受體:穩(wěn)定劑之間的重量比為10:1至1:1是適合的；優(yōu)選所述比在7.5:1至1.5:1之間；更優(yōu)選5:1至2:1 ;更進一步優(yōu)選4:1至2.5:1。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，所述受體:穩(wěn)定劑之間的重量比為3.5:1 ;優(yōu)選為約3:1。實際上，相對于所述膜的總重量，所述微球體膜可包含高達約91重量％的最大受體量。優(yōu)選地，取決于所需的實施方式，相對于所述膜的總重量，所述受體的量可達到約88%或83%或80%或77重量％ ;更優(yōu)選相對于所述膜的總重量為75重量％。因此，由上文清楚可見，與現(xiàn)有技術已知和實踐的相反，所述抗原特異性受體不是以平均有限的量插入膜內(nèi)或其外表面上或其內(nèi)部，而是其結(jié)構(gòu)性整體的部分，而穩(wěn)定劑的量是給予膜本身所需穩(wěn)定性所需要的最低可能量(取決于抗原特異性受體的類型)。實際上，所述非常低的穩(wěn)定劑量預想不到地顯示對于給予所述微球體膜顯著穩(wěn)定性是綽綽有余的。因此，與已知的現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明可通過完全預想不到的方式獲得非常穩(wěn)定的微球體，其中的膜主要或基本上由抗原特異性受體(優(yōu)選抗體的Fab)構(gòu)成。因此，相比于本領域已知的 包含抗原特異性受體的微泡，所述微球體對所需靶點、組織或器官具有明顯更高(至少高出10-15%，但也可能彡20%或更多)的特異性。因此，本發(fā)明特別創(chuàng)新和有優(yōu)勢的方面是獲得了預想不到地穩(wěn)定的微球體，盡管事實上其膜在結(jié)構(gòu)上是由少量穩(wěn)定劑和大量的抗原特異性受體形成，所述抗原特異性受體確保相比于現(xiàn)有技術已知的微球體明顯更好的特異性。僅作為實例，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，白蛋白是包被外微球體的膜內(nèi)包含的穩(wěn)定劑，而磷脂是包被內(nèi)微球體的膜內(nèi)包含的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方式中，則情形相反:S卩，白蛋白是包被內(nèi)微球體的膜內(nèi)包含的穩(wěn)定劑，而磷脂是包被外微球體的膜內(nèi)包含的穩(wěn)定劑。在其他優(yōu)選實施方式中，包被微球體之一的膜可例如，包含棕櫚酸/半乳糖混合物作為穩(wěn)定劑。在所述混合物中，兩種組分之間以例如10:1至1:10之間的重量比(w:w)存在；優(yōu)選5:1至1:5之間；更優(yōu)選約1:1。形成根據(jù)本發(fā)明的抗原特異性超聲造影劑的所述至少兩個基本同心的微球體的每一個中包含的氣體對于每種類型的微球體相同或不同；確切地說,外微球體內(nèi)包含的氣體與內(nèi)微球體內(nèi)包含的氣體相同或不同。所述氣體例如選擇包含以下的組:六氟化硫、全氟己烷、全氟碳化物、空氣、氮氣。特別優(yōu)選六氟化硫、空氣和全氟己烷；更優(yōu)選六氟化硫和空氣。僅作為實例，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，六氟化硫是外微球體內(nèi)包含的氣體，而空氣是內(nèi)微球體內(nèi)包含的氣體。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方式中，情形是相反的:即，六氟化硫是內(nèi)微球體內(nèi)包含的氣體，而空氣是外微球體內(nèi)包含的氣體。在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，六氟化硫或空氣或全氟己烷包含在外微球體內(nèi)或內(nèi)微球體內(nèi)。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的所述抗原特異性超聲造影劑進一步包含有效量的至少一種生物活性物質(zhì)，例如選自:與主要的抗原特異性受體不同的抗原特異性受體；藥物(僅作為說明而絕非限制，例如抗腫瘤藥物)；其他類型的物質(zhì)，如分子成像中使用的分子、用于常規(guī)放射醫(yī)學、計算機斷層攝影術(computerized tomography) >磁共振、核醫(yī)學的放射造影劑；生物活性分子如激素、維生素；遺傳物質(zhì)如核苷、核苷酸；肽的、脂質(zhì)的、糖類性質(zhì)(glucidic nature)的合成物質(zhì)，以便所得超聲造影劑(CM)可同時用作所述物質(zhì)的選擇性傳送體(transmitter)或載體。特別是，診斷成像中使用的上述的分子優(yōu)選選自:磁鐵礦納米顆粒、碘酸鹽化合物、復合的順磁性離子。優(yōu)選根據(jù)本領域已知技術，將所述至少一種生物活性物質(zhì)插入或偶聯(lián)/結(jié)合到組成本發(fā)明造影劑的所述至少兩個微球體的每個微球體。優(yōu)選將所述生物活性物質(zhì)插入包被各微球體的膜中和/或其內(nèi)部。僅作為優(yōu)選的實例而絕非限制本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，超聲造影劑由以下組成:一個外微球體，其由氣體(如空氣或六氟化硫或全氟己烷)的氣泡構(gòu)成，并由最低有效量(例如，F(xiàn)ab’s:白蛋白為3:1的優(yōu)選重量比例)的白蛋白穩(wěn)定的抗體的Fab’s的膜包被；一個內(nèi)微球體，其位于前述外微球體(基本與其同心)內(nèi)部，由氣體(如空氣或六氟化硫或全氟己烷)的氣泡構(gòu)成，并由最低有效量(例如，F(xiàn)ab’s:磷脂為3:1的優(yōu)選重量比例)的磷脂穩(wěn)定的抗體的Fab’s膜包被。所述兩個同心的微球體可進一步包含有效量的生物活性劑，例如上文所述的藥物、造影劑、生物分子等。根據(jù)需要，也可以制備相反的制劑(reverse formulation)。例如，在本發(fā)明的另一個實施方式中，可以通過顛倒所述結(jié)構(gòu)的化學組分來實現(xiàn)超聲造影劑。因此，所述造影劑將由以下組成:一個外微球體，其由磷脂穩(wěn)定的抗原特異性物質(zhì)(優(yōu)選Fab)構(gòu)成(抗原特異性物質(zhì):磷脂的重量比優(yōu)選為3:1)，并且包含作為氣體六氟化硫，并且在某些情況下，包含適量的如上所述的生物活性劑和/或藥理學物質(zhì)；一個內(nèi)微球體，其置于前述外微球體的內(nèi)部，由白蛋白穩(wěn)定的抗原特異性物質(zhì)(優(yōu)選Fab)構(gòu)成(抗原特異性物質(zhì):白蛋白的重量比優(yōu)選為3:1)，并且包含作為氣體六氟化硫，并且在某些情況下，包含適量的如上所述的生物活性劑和/或藥理學物質(zhì)。所述生物活性劑和/或藥理學物質(zhì)的優(yōu)選量可根據(jù)細胞/組織/器官和/或待治療疾病的類型而改變 ，并且在任何情況下已成為本領域技術臨床人員治療常識的一部分。始終作為進一步的實例，而絕非限制本發(fā)明，本發(fā)明的超聲造影劑可由兩個同心微球體構(gòu)成，其中:
a)外微球體包含作為惰性氣體的空氣和以上文所述的重量比存在的作為膜穩(wěn)定劑的棕櫚酸/半乳糖混合物，和內(nèi)微球體包含作為惰性氣體的六氟化硫和作為膜穩(wěn)定劑的磷脂；b)外微球體包含作為惰性氣體的空氣和作為膜穩(wěn)定劑的白蛋白，和內(nèi)微球體包含作為惰性氣體的空氣和以上文所述的重量比存在的作為膜穩(wěn)定劑的棕櫚酸/半乳糖混合物；c)外微球體包含作為惰性氣體的全氟己烷和作為膜穩(wěn)定劑的白蛋白，和內(nèi)微球體包含作為惰性氣體的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作為膜穩(wěn)定劑的棕櫚酸/半乳糖混合物；

d)外微球體包含作為惰性氣體的空氣和作為膜穩(wěn)定劑的白蛋白，和內(nèi)微球體包含作為惰性氣體的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作為膜穩(wěn)定劑的棕櫚酸/半乳糖混合物；e)外微球體包含作為惰性氣體的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作為膜穩(wěn)定劑的棕櫚酸/半乳糖混合物，和內(nèi)微球體包含作為惰性氣體的全氟己烷和作為膜穩(wěn)定劑的磷脂；f)外微球體包含作為惰性氣體的六氟化硫和以上文所述的重量比存在的作為膜穩(wěn)定劑的棕櫚酸/半乳糖混合物，和內(nèi)微球體包含作為惰性氣體的空氣和作為膜穩(wěn)定劑的磷脂；g)上述a)至f)的每一種造影劑中，外微球體的組分與內(nèi)微球體的組分已顛倒。優(yōu)選在所述a)至g)的造影劑中，穩(wěn)定膜的物質(zhì)的總量與Fab之間的重量比為約1:3,因此確認，相對于本領域的現(xiàn)有技術，完全出乎意料地使用了相當高的Fab量。更優(yōu)選地，通過采取上述相同的方式和量，所述a)至g)的造影劑進一步包含有效量的生物活性劑如藥物、造影劑、生物分子等。從尺寸的角度看，在所有可能的實施方式中，一個上述的單個微球體平均直徑在(Iym至〈7 μπι的范圍內(nèi)；更優(yōu)選所述平均直徑< 2 μ m至〈4 μ m ;更進一步優(yōu)選所述平均直徑< 3.5 μ m。這樣，所述外微球體的膜厚不超過平均400nm ;優(yōu)選其<300nm ;更優(yōu)選其<200nm。此外，所述內(nèi)微球體的膜厚不超過400nm ;優(yōu)選其<300nm ;更優(yōu)選其<200nm。因此，本發(fā)明造影劑的總平均直徑(即，構(gòu)成本發(fā)明的超聲造影劑的所述至少兩個同心微球體的基本為球形的總體)不超過8 μ m ;優(yōu)選其〈7 μ m ;更優(yōu)選其〈6 μ m。所述值不超過紅血細胞平均直徑(為約8 μ m)，因此，其保證了本發(fā)明造影劑的安全性。此外，因為小于10 μ m，其還保證了所述造影劑顆粒能跨過肺屏障。作為上述公開的結(jié)果，因此，本發(fā)明的一個實施方式還包括包含依照上述造影劑的超聲造影圖像組合物。所述造影劑優(yōu)選依照本領域已知的配制步驟制備。在本發(fā)明的一個實施方式中，可適合地將本發(fā)明造影劑的組分或前體單個制備并預包裝到適宜的試劑盒中(并以該形式分配給醫(yī)師)，以易于將其放在一起并在要使用前重構(gòu)，例如，通過適宜地混合和輕輕攪拌所述組分/前體。所述試劑盒的制備和構(gòu)建與通常制作已知和銷售的診斷試劑盒類似，并作必要的修正。優(yōu)選通過采取通常用于制備本領域已知的包含氣體的超聲造影劑微泡的已知制備技術來實施用于制備本發(fā)明微球體和造影劑的方法。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，通過傳統(tǒng)方法制備內(nèi)微球體膜，所述方法包括至少一個階段，在所述階段中，在惰性氣體(優(yōu)選六氟化硫、空氣、全氟己烷)氣氛下，將由與適量穩(wěn)定物混合的有效量的至少一種抗原特異性受體構(gòu)成的凍干物質(zhì)粉末與例如生理溶液適當攪拌足夠長的時間，以獲得由抗體/抗原特異性膜包被的所述氣體的微球體，其中，所述穩(wěn)定物選自包含以下的組:磷脂、白蛋白、半乳糖、棕櫚酸、氰基丙烯酸酯和/或其混合物(優(yōu)選磷脂、白蛋白、半乳糖、棕櫚酸)，所述膜包含所述抗原特異性受體(優(yōu)選抗體的 Fab)ο所述膜可重現(xiàn)現(xiàn)有技術中已知的某些CM的結(jié)構(gòu)，因此，通過利用通常用于其制備的新方法合成所述膜。這樣，所述外微球體膜的實施方式包括至少一個階段，其中，在惰性氣體(優(yōu)選六氟化硫、空氣、全氟己烷)氣氛下，例如，在密封的小瓶中，且在先前獲得的(內(nèi))微球體存在下，將Fab/穩(wěn)定劑的混合物(優(yōu)選重量比為3:1)的凍干粉末與生理溶液(0.9%的NaCl)混合，并在室溫下適當攪拌幾分鐘，例如手動攪拌或超聲處理，從而得到上述本發(fā)明造影劑的基本為球形的核。僅作為實例，而絕非 限制本發(fā)明，所述方法優(yōu)選包括第一階段a)，其中:a)在六氟化硫氣氛下，例如在密封的小瓶中，將由重量比為3:1的至少一種抗原特異性受體(Fab)和一定量磷脂(約10-20mg)構(gòu)成的混合物形成的凍干粉末與約2.5mL生理溶液(0.9%的NaCl)混合，在室溫下適當攪拌幾分鐘，例如手動攪拌或超聲處理，從而得到具有單磷脂膜并包含六氟化硫的所述預制超聲造影微球體(所謂的內(nèi)微球體)的第一微懸浮液。所述第一階段a)后是第二階段b)，其中:b)在六氟化硫或另一種惰性氣體的氣氛下，在具有約2.5mL生理溶液(0.9%的NaCl)的密封小瓶中，向來自前一階段a)的微球體添加由Fab/白蛋白3:lw:w(約10_20mg)構(gòu)成的凍干混合物。將其整體在室溫下適當攪拌幾分鐘，例如手動攪拌或超聲處理，從而得到包含本發(fā)明同心微球體(由一個內(nèi)微球體和與其不同的一個外微球體組成)的第二微懸浮液。—經(jīng)制備,現(xiàn)有微泡(在密封的小瓶中)的最大儲存時間為約6小時。這樣，其在外圍血血流中的持續(xù)時間為約6分鐘。相比于已知的，本發(fā)明超聲造影劑的同心微球體的平均穩(wěn)定性比現(xiàn)有微泡高出很多(優(yōu)選高出1.1至5倍)，因此也更好。本發(fā)明超聲造影劑的同心微球體在外圍血血流中的平均持續(xù)時間估計為至少7分鐘；優(yōu)選至少8分鐘；更優(yōu)選至少9分鐘；更優(yōu)選10分鐘或更長?？紤]到本發(fā)明超聲造影劑所示的上述預想不到的特征，已可預想不到地發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)可使其獲得在表達某些抗原的組織內(nèi)部特別長的特異持久性，其中，存在于本發(fā)明同心微球體劑的膜中的受體(Fab’s)對所述抗原具有特異性；或以靶向且受控的方式釋放包含在兩個微球體內(nèi)的藥物。
實際上，所述至少兩個同心微球體的膜在其化學結(jié)構(gòu)的組成方面具有實質(zhì)性的區(qū)別，并因此導致其在超聲檢驗中可見性的區(qū)別，以及對藥物釋放的有效調(diào)節(jié)。此作用發(fā)生的原因在于，有必要依據(jù)是否需要產(chǎn)生對一個膜或其他膜的空化作用(cavitation)而施加不同特征的超聲波束。換句話說，例如，對由白蛋白包被空氣制成的微球體產(chǎn)生空化作用所需要的聲功率不同于對由磷脂包被六氟化硫形成的微泡產(chǎn)生相同效應所需的聲功率。因此，在(通過施加適宜的聲功率)激發(fā)外微球體膜的空化作用，隨后相應地釋放其包含或結(jié)合的藥物后，也可以隨后(通過施加適宜的不同聲功率)產(chǎn)生內(nèi)微球體膜的空化作用，同時相應地進一步釋放其包含/或結(jié)合的藥物。相比于僅通過單個同類膜而激發(fā)釋放的情況，該方式可獲得延長更多的藥物釋放(以及，由此獲得靶組織對所述藥物延長的和逐步的吸收)。因此，使用由具有不同化學組成的膜和由相同或不同的氣體形成的本發(fā)明的至少兩個同心微球體的發(fā)明合理性在于，膜化學組成和其包含的氣體以不同方式影響了用于激發(fā)空化作用的聲束的特征。因此，有必要取決于需要進行空化作用的微球體類型(即，取決于膜和其包含的氣體的類型)，而使用具有不同效力(potency)的聲束。以該方式，可以通過改變受聲波作用波束的聲功率而對本發(fā)明的至少兩個同心微球體不同膜產(chǎn)生連續(xù)的空化作用，從而獲得更長且受調(diào)控的 藥理學釋放。受聲波作用的波束的聲功率平均在0.1至IMPa的范圍內(nèi)；優(yōu)選0.1至0.9MPa ;更優(yōu)選0.2至0.83MPa，這取決于待接受空化作用的膜的化學成分的類型(和氣體的類型)。這樣，超聲波束頻率平均在I至3MHz的范圍內(nèi)；優(yōu)選1.1至2.9MHz ;更優(yōu)選1.15至 2.85MHz ο僅作為實例而絕非束縛或限制本發(fā)明的應用范圍，對由兩個同心微球體組成的本發(fā)明超聲造影劑進行超聲處理，其中，所述兩個同心微球體的外微球體由Fab和磷脂(重量比為3:1，且包含六氟化硫和作為活性成分的一種抗腫瘤劑)形成，而內(nèi)微球體由Fab和白蛋白(重量比為3:1，且包含空氣和作為活性成分的一種抗腫瘤劑)形成。首先，使用頻率在1.10至2.85MHz范圍和聲功率在0.2至0.4MPa范圍的超聲波束(其導致外微球體磷脂膜的穿孔和隨后的空化作用，同時相應釋放其包含或結(jié)合的藥物)，然后，使用頻率相同和聲功率為0.83MPa的超聲波束(其導致內(nèi)微球體白蛋白膜的穿孔和隨后的空化作用，同時相應釋放其包含或結(jié)合的藥物)，對所述造影劑進行聲波處理。由此發(fā)現(xiàn)，可通過適宜地改變受聲波作用的波束的聲功率導致兩種不同膜的連續(xù)空化作用，并因此在造影劑產(chǎn)生極高選擇性且牢固結(jié)合的區(qū)域獲得延長的和受調(diào)控的藥理學釋放。根據(jù)本發(fā)明，由其中所有微球體均對某些抗原具有特異性的至少兩個同心微球體形成的造影劑，能保持固定在表達所述抗原的組織上的時間比傳統(tǒng)造影劑顆粒長得多。結(jié)果，相比于其他周圍的組織，所述組織的結(jié)構(gòu)對造影圖像增強的反映更積極且持續(xù)更長的時間。平均從造影劑注射開始120秒起檢測到這種選擇性且延長的造影圖像增強。這樣，所述增強的選擇性提高還以完全預想不到地方式發(fā)生在從施用開始120秒前。所有這些均可歸因于以下事實:通過本發(fā)明造影劑的創(chuàng)新性結(jié)構(gòu)(如上所述，主要由對某些抗原具有特異性的高親合力抗體形成)，可以賦予這兩種免疫學成分(抗體:抗原)優(yōu)越的結(jié)合強度，以及賦予所有微球體優(yōu)越的穩(wěn)定性。這樣，本發(fā)明的特別重要方面在于，能以受控且受調(diào)節(jié)的方式輸送包含(或結(jié)合)在至少兩個同心微球體的內(nèi)腔的藥理學物質(zhì)。這是借助于差異性聲波作用而實現(xiàn)的，其中，由兩次應用聲功率不同的超聲波束進行所述差異性聲波作用，和能以受調(diào)節(jié)的方式(即，順序地)進行同心微球體膜的聲孔作用和空化作用。確切地說，例如，為了產(chǎn)生由白蛋白包被的空氣微球體的空化作用，所需要的聲功率不同于在由磷脂包被六氟化硫形成的微球體上獲得相同效應所需的聲功率。因此，相比于在釋放僅發(fā)生于單個同類層的情況下所出現(xiàn)的狀況，在激發(fā)外微球體膜的空化作用后，可以依次激發(fā)內(nèi)微球體膜的空化作用，從而獲得延長更多的藥物釋放(并由此獲得組織對所述藥物延長的和逐步的吸收)。因此，本發(fā)明的目的還在于，以延長且逐步的方式向位點、組織或器官特異性/選擇性釋放藥物的方法，其通過將本發(fā)明造影劑施用到所述組織，然后應用效力和/或強度不同的超聲波束對其進行特異性且隨時間有差別的空化作用。

優(yōu)選地，將本發(fā)明的造影劑配制為在適宜的生理學上可接受的水性介質(zhì)中的可注射懸浮液，從而得到所需超聲造影劑。本發(fā)明的造影劑可用于很多不同的治療用途。例如，患有缺血性猝發(fā)病(ischemicictus)患者的溶解血栓治療會出現(xiàn)很多并發(fā)癥，所述并發(fā)癥與所用物質(zhì)(其產(chǎn)生公知的出血性副作用)的藥效動力學有關，也與血栓形成的溶解速度有關。因此，能調(diào)節(jié)藥物從血流到損傷的傳遞速度的治療方法可用于臨床實踐。在缺血性猝發(fā)病的治療中，具有至少兩個同心微球體的造影劑在缺血性猝發(fā)病的治療中，對聲功率不同的超聲波束應用敏感的具有至少兩個同心微球體的造影劑表現(xiàn)出了保護作用，其不僅適合于降低與灌注速率有關的危險，而且滿足使用局部區(qū)域方法(根據(jù)通過內(nèi)血管動脈進行的關于缺血性猝發(fā)血栓溶解的研究，其非常有效)的需要。相同的推理路線對肢體外周缺血或心肌缺血過程中的溶栓治療有效。此外，此類CM的各種診斷性應用還特別在于對容易通過超聲檢驗的有關器官(例如，睪丸、肝臟、甲狀腺、乳房、四肢骨骼肌)的瘤形成的表征和治療。通過這種超聲造影劑，可以借助于靶向腫瘤標記物和靶向新血管生成過程中在內(nèi)皮水平過表達(iper-expressed)的分子來表征損傷。所述造影劑還可用作藥物的載體，其中所述藥物具有對內(nèi)皮水平表達的、作為腫瘤新血管生成標記物的分子的特異性受體。類似地，還提出所述造影劑可作為腫瘤標記物的特異性造影劑，根據(jù)公知的局部微轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其激發(fā)腫瘤細胞通過血管途徑擴散到接近腫瘤的周圍區(qū)域。為了說明本發(fā)明的廣泛應用前景，下文描述了本發(fā)明超聲造影劑的可用的有利臨床應用的非限定性實例。-睪丸胚胎癌細胞對抗原如胎蛋白(AFP)和絨毛膜促性腺激素(HCG)顯陽性。通過適當?shù)厥褂帽景l(fā)明CM的抗體外膠囊(anticorpal external capsule),對這兩種抗原呈陽性的睪丸物質(zhì)的選擇性研究，可進行更好的診斷，或從診斷假設中排除混合型生殖細胞腫瘤(如，確切說是胚胎癌)，而不必被迫求助于對患者無用且危險的手術探查。
-很多上皮腫瘤表達細胞角蛋白:可根據(jù)細胞角蛋白8、18或19對諸如乳腺癌的腫瘤進行分類。此外，在鱗狀細胞癌的病例中，可檢測到細胞角蛋白5或細胞角蛋白6。-使用本發(fā)明的α-胎蛋白特異性超聲CM的研究可在肝腫瘤形成的診斷過程中提供優(yōu)點。-負載到本發(fā)明的超聲CM上的Ca125可用于研究疑似為子宮或卵巢惡性腫瘤的腫塊。-CEA(癌胚抗原)可用于確認是否存在結(jié)腸直腸癌在肝水平的轉(zhuǎn)移。

-某些⑶(分化簇)抗原的研究可幫助診斷血細胞腫瘤。-新血管生成過程中表達的分子在惡性瘤形成生長過程中是必要的和特征性的?？筕GEF抗體將有利地幫助鑒定該現(xiàn)象。特別是，可見這些超聲造影劑在兒童階段使用特別有前途，在兒童階段使用較少的入侵式診斷技術毫無疑問更符合需要而且更安全。實際上，可見本發(fā)明微泡較高的生物特異性/選擇性對于限制使用活組織檢查特別有前途；而且這當然也是兒童階段所需要的。
權(quán)利要求
1.一種抗原特異性超聲造影劑，其由彼此不同且一個位于另一個內(nèi)部的至少兩個微球體組成，其中所述微球體的每一個: -由對于每個微球體各不相同的膜覆蓋，所述膜基本由有效量的至少一種高親合力受體和有效量的至少一種穩(wěn)定劑構(gòu)成，所述受體對存在于待成像和/或藥物治療的組織內(nèi)的抗原具有特異性，所述受體:穩(wěn)定劑之間的重量比在10:1至1:1之間；和 -還包含對于每個微球體相同或不同的惰性氣體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造影劑，其由兩個微球體構(gòu)成，其中所述微球體基本是同心的。
3.權(quán)利要求1或2所述的造影劑，其中所述至少一種抗原特異性受體選自包括以下的組:單克隆和/或非單克隆抗體，和/或其片段、Fabs，和/或?qū)?nèi)皮細胞、心肌細胞、固有層細胞、間質(zhì)細胞、表達于動脈粥樣硬化斑塊中的血凝塊細胞具有特異的血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFRJP /或免疫球蛋白、補體片段、肽激素和/或脂質(zhì)激素、神經(jīng)傳遞素的特異性受體；優(yōu)選對一種抗原具有特異性的抗體的Fabs。
4.權(quán)利要求1或2所述的造影劑，其中所述至少一種穩(wěn)定劑選自包括以下的組:白蛋白、磷脂、半乳糖、棕櫚酸、氰基丙烯酸酯和/或其混合物；優(yōu)選白蛋白、磷脂、棕櫚酸、半乳糖和/或其混合物；最優(yōu)選白蛋白、磷脂和棕櫚酸/半乳糖混合物。
5.前述任一項權(quán)利要求所述的造影劑，其中所述受體:穩(wěn)定劑之間的質(zhì)量比在7.5:1至1.5:1之間;更優(yōu)選5:1至2:1。
6.前述任一項權(quán)利要求所述的造影劑，其中所述微球體的所述膜包含相對于所述膜的總重達約91重量％的量的受體。
7.前述任一項權(quán)利要求所述的造影劑，其中所述惰性氣體選自包括以下的組:六氟化硫、全氟己烷、全氟碳化物、空氣、氮氣；優(yōu)選六氟化硫、空氣和全氟己烷；最優(yōu)選六氟化硫和空氣。
8.前述任一項權(quán)利要求所述的造影劑，其中所述至少兩個微球體的任一個進一步包含或結(jié)合有效量的至少一種生物活性物質(zhì)。
9.一種超聲造影藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-8中任一項所述的造影劑的可注射水性懸浮液。
10.權(quán)利要求9所述的藥物組合物的用途，其用于選擇性和特異性將藥物和/或生物活性成分輸送到與周圍健康組織相對照的患病組織。
11.用于以延長且逐步的方式特異性/選擇性地釋放藥物到位點、組織或器官或區(qū)域的方法，其中所述方法包括向所述生物施用權(quán)利要求9所述的藥物組合物，然后通過應用效力和強度不同的超聲波束進行特異性且隨時間有差別的空化作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷和/或治療用途的抗原特異性超聲造影劑、其制備方法及其在超聲診斷成像和治療中的用途。特別是，已證明一旦其結(jié)合到所述組織并適宜地受聲波作用，所述造影劑可用于將藥物和/或其他生物活性成分選擇性輸送到患病組織并在該位點釋放。此外，通過在長時間內(nèi)單獨對患病組織賦予改進的造影圖像增強，所述超聲造影劑可以區(qū)分患病組織與周圍的(健康)組織。
文檔編號A61K49/22GK103140241SQ201180046754
公開日2013年6月5日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者朱塞佩·薩比諾 申請人:朱塞佩·薩比諾