專利名稱：具有改良的連接體的鵝膏毒素軛合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療。在一個方面，本發(fā)明涉及鵝膏毒素(amatoxin)與靶結(jié)合部分(target-binding moiety)例如抗體的軛合物,所述鵝膏毒素與祀結(jié)合部分通過包含脲部分的連接體連接，其用于癌癥的治療中。在另一方面，本發(fā)明還涉及包含該軛合物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
鵝膏毒素是由8個氨基酸組成的環(huán)肽。它們可從鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)蕈類分離或合成制備。鵝膏毒素特異性抑制哺乳動物細胞的DNA依賴性RNA聚合酶II并且由此還抑制受影響細胞的轉(zhuǎn)錄和蛋白生物合成。細胞中轉(zhuǎn)錄的抑制導致生長和繁殖的停止。盡管不是共價連接，但是鵝膏毒素與RNA聚合酶II之間的絡合是非常緊密的(Kd =3nM)。將鵝膏毒素從酶上解 離是非常緩慢的過程，因此使得受影響的細胞不可能恢復。當轉(zhuǎn)錄抑制持續(xù)太久時，細胞將經(jīng)歷程序性細胞死亡(細胞凋亡)。已經(jīng)在1981年通過用經(jīng)由偶氮化與Trp (氨基酸4 ;參見圖1)的吲哚環(huán)連接的連接體將抗Thyl.2抗體與α -鵝膏毒素偶聯(lián)而開發(fā)了鵝膏毒素作為細胞毒素部分用于腫瘤治療的用途(Davis & Preston, Science 1981，213，1385-1388)。專利申請EPl 859 811 Al (2007年11月28日公開)描述了一種軛合物，其中，β-鵝膏毒環(huán)肽的鵝膏毒素氨基酸I的YC原子直接(即無連接體結(jié)構(gòu))與白蛋白或單克隆抗體ΗΕΑ125、0ΚΤ3或PA-1偶聯(lián)。而且，這些軛合物顯示了對乳腺癌細胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤細胞(Raji)和T淋巴細胞(Jurkat)的增殖的抑制作用。雖然該申請中建議使用連接體，包括包含單元例如酰胺、酯、醚、醇醚、二硫化物、脲、硫脲、烴部分以及類似部分的連接體，但是并沒有實際上給出這樣的結(jié)構(gòu)，且沒有提供更多的詳細內(nèi)容例如在鵝膏毒素上的連接位點。已知鵝膏毒素在與大的生物分子載體例如抗體分子偶聯(lián)時是相對無毒的并且它們僅在生物分子載體被切除之后才顯現(xiàn)它們的細胞毒性?？紤]到鵝膏毒素的毒性，尤其是對肝細胞的毒性，最重要的是用于靶定的腫瘤治療的鵝膏毒素軛合物在血漿中施用之后保持高度穩(wěn)定并且在靶細胞中鵝膏毒素的釋放在內(nèi)化之后發(fā)生。在這一背景下，軛合物穩(wěn)定性的微小的改良可對用于治療途經(jīng)的鵝膏毒素軛合物的治療窗和安全性帶來顯著的結(jié)果。_6] 發(fā)明目的因此，本領域中有對在血漿中穩(wěn)定而盡量減小對非靶細胞的有害副作用的靶向結(jié)合部分鵝膏毒素軛合物的高度需要。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明涉及一種軛合物，其包含經(jīng)由連接體L與鵝膏毒素相連的靶結(jié)合部分，其中，所述連接體L經(jīng)由下列(i)、(ii)或(iii)與鵝膏毒素連接:⑴鵝膏毒素氨基酸I的Y C原子，特別是經(jīng)由酰胺鍵；
(ii)與鵝膏毒素氨基酸3的SC原子結(jié)合的氧原子，特別是經(jīng)由酯鍵、醚鍵或氨基甲酸酯鍵；(iii)鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子，特別是經(jīng)由與鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子結(jié)合的氧原子；在每種情況下，所述連接體L經(jīng)由脲部分與靶結(jié)合部分連接。在第二方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的軛合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種鵝膏毒素-軛合分子，其包含經(jīng)由下列(i)、(ii)或(iii)與鵝膏毒素相連的連接體L:⑴鵝膏毒素氨基酸I的YC原子，特別是經(jīng)由酰胺鍵；(ii)與鵝膏毒素氨基酸3的SC原子結(jié)合的氧原子，特別是經(jīng)由酯鍵、醚鍵或氨基甲酸酯鍵；(iii)鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子，特別是經(jīng)由與鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子結(jié)合的氧原子；在每種情況下，所述連接體L包含氨基甲酸衍生的-NH-C (O) -X，其中X是可以被靶結(jié)合部分的伯胺替代的離去基團。在再一個方面，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明的軛合物的方法，其包括將本發(fā)明的鵝膏毒素軛合分子與包含伯氨基基團的靶結(jié)合部分反應的步驟。


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圖1顯示不同鵝膏毒素的結(jié)構(gòu)式。黑體數(shù)字(I至8)標明形成鵝膏毒素的八個氨基酸的標準編號。還顯示了氨基酸1、3和4中的原子的標準標號(分別為希臘字母α至Y、希臘字母α至δ和從I’至7’的數(shù)字。)圖2顯示BrdU分析中使用不同連接體部分的不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物對SK0V-3細胞在孵育72小時后的細胞毒性。圖3顯示BrdU分析中使用不同連接體部分的不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物對SK-BR-3細胞在孵育72小時后的細胞毒性。圖4顯示BrdU分析中使用不同連接體部分的不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物對NC1-N87細胞在孵育72小時后的細胞毒性。圖5顯示BrdU分析中使用不同連接體部分的不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物對MDA-MB231細胞在孵育72小時后的細胞毒性。圖6和圖7顯示在血漿中孵育長達14天之后從使用不同連接體部分的不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物釋放的鵝膏毒環(huán)肽的量。圖8顯示在BrdU分析中使用不同連接體部分的不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物對SK0V-3細胞在血漿孵育之前和之后的細胞毒性的比較。圖9顯示使用不同連接體部分的兩種不同鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀軛合物在SK0V-3異種移植模型中的體內(nèi)活性的比較。
具體實施例方式在下文詳細描述本發(fā)明之前，應當理解的是本發(fā)明并不限于被本文描述的特定的方法、程序和試劑，因為它們可以發(fā)生變化。還應當理解的是本文所用的術(shù)語僅是為了描述特定的實施方案而并不是意欲限制本發(fā)明的范圍，其僅由所附的權(quán)利要求限定。除非另外說明，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本領域中普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。優(yōu)選地，本文所用的術(shù)語被定義為如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms: (IUPAC Recommendations)) ,y, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.和Kolbl, H.eds.(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)中所描述的。除非背景中另外要求，整篇說明書以及其后的權(quán)利要求書中，詞語“包含(comprise、comprises、comp·rising) ”將被理解為意指包含所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組但不包括任何其他的整體或步驟或者整體或步驟的組。本說明書文本中引用了若干文獻。本文所引用的文獻中的每一個(包括所有專利、專利申請、科學出版物、制造商說明書、技術(shù)說明書、GenBank登陸號序列提交等)，無論上文或下文中，以各專利法允許的程度通過引用將全文并入本文。本文中沒有內(nèi)容可被解釋為承認本發(fā)明無權(quán)依據(jù)發(fā)明在先而將本公開提前。現(xiàn)在將進一步描述本發(fā)明。在下文段落中更加詳細的定義了本發(fā)明的不同方面。除非有清楚的相反說明，所定義的每個方面可與任何其他一個或多個方面組合。特別是，標示為優(yōu)選或有利的任何特征可與標示為優(yōu)選或有利的任何其他一個或多個特征組合。在第一個方面，本發(fā)明涉及一種軛合物，其包含經(jīng)由連接體L與鵝膏毒素相連的靶結(jié)合部分，其中，所述連接體L經(jīng)由下列(iv)、(V)或(vi)與鵝膏毒素連接:(iv)鵝膏毒素氨基酸I的Y C原子，特別是經(jīng)由酰胺鍵；(V)與鵝膏毒素氨基酸3的δ C原子結(jié)合的氧原子，特別是經(jīng)由酯鍵、醚鍵或氨基甲酸酯鍵；(vi)鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子，特別是經(jīng)由與鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子結(jié)合的氧原子；在每種情況下，所述連接體L經(jīng)由脲部分與靶結(jié)合部分連接。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“軛合物”是指包含通過共價鍵連接的至少兩個不同分子的分子。如本文所用的，術(shù)語“靶結(jié)合部分”是指能夠與靶分子或靶表位特異性結(jié)合的任何分子或分子的一部分，在本申請的背景下優(yōu)選的靶結(jié)合部分是(i)抗體或其抗原結(jié)合片段；(ii)抗體樣蛋白；和(iii)核酸適體。適于在本發(fā)明中使用的“靶結(jié)合部分”典型地具有40 OOODa(40kDa)或更高的分子量。如本文所用的，如果第一化合物(例如抗體)與第二化合物(例如抗原，諸如靶蛋白)具有100 μ M或更少，優(yōu)選地50 μ M或更少，優(yōu)選地30 μ M或更少，優(yōu)選地20 μ M或更少，優(yōu)選地10 μ M或更少，優(yōu)選地5 μ M或更少，更優(yōu)選地I μ M或更少，更優(yōu)選地900ηΜ或更少，更優(yōu)選地800ηΜ或更少，更優(yōu)選地700ηΜ或更少，更優(yōu)選地600ηΜ或更少，更優(yōu)選地500ηΜ或更少，更優(yōu)選地400ηΜ或更少,更優(yōu)選地300ηΜ或更少,更優(yōu)選地200ηΜ或更少,甚至更優(yōu)選地IOOnM或更少，甚至更優(yōu)選地90ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選地80ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選地70ηΜ或更少,甚至更優(yōu)選地60ηΜ或更少,甚至更優(yōu)選地50ηΜ或更少,甚至更優(yōu)選地40ηΜ或更少，甚至更優(yōu)選地30nM或更少，甚至更優(yōu)選地20nM或更少以及甚至更優(yōu)選地IOnM或更少的解離常數(shù)，則其被認為與所述第二化合物“特異性結(jié)合”。在本申請的背景下，術(shù)語“靶分子”和“靶表位”分別是指分別與靶結(jié)合部分特異性結(jié)合的抗原和抗原的表位。優(yōu)選地，靶分子是腫瘤相關(guān)抗原，尤其是一種或多種腫瘤細胞類型的表面上以與非腫瘤細胞的表面相比增加的濃度和/或不同的空間構(gòu)型存在的抗原或表位。優(yōu)選地，所述抗原或表位存在于一種或多種腫瘤細胞類型的表面，但是不存在于非腫瘤細胞的表面。在特定的實施方案中，靶結(jié)合部分與HER-2/neu或上皮細胞粘附分子(EpCAM)的表位特異性結(jié)合。在其他的實施方案中，所述抗原或表位優(yōu)先在參與自身免疫性疾病的細胞上表達。在特定的這些實施方案中，靶結(jié)合部分與IL-6受體(IL-6R)特異性結(jié)合。
如本文所用的，術(shù)語“抗體或其抗原結(jié)合片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點的分子。還包括的是通過包括例如噬菌體展示的技術(shù)選擇以與靶分子例如與靶蛋白Her-2/neu或EpCAM特異性結(jié)合的免疫球蛋白樣蛋白。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、任何類(例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類的。適于在本發(fā)明中使用的“抗體和其抗體結(jié)合片段”包括但不限于多克隆的、單克隆的、單價的、雙特異性的、雜合的(heteroconjugate)、多特異性的、人的,人源的(特別是CDR移植的)、去免疫的或嵌合的抗體，單鏈抗體(例如scFv) ,Fab片段,F(ab' ) 2片段，由Fab表達文庫產(chǎn)生的片段，雙體或四體(Holliger P.et al., 1993),納米抗體,抗個體基因型(抗-1d)抗體(包括例如抗-1d抗體或本發(fā)明的抗體)以及上文中任一種的表位結(jié)合片段。在一些實施方案中，抗原結(jié)合片段是本發(fā)明的人抗原結(jié)合抗體片段并且包括但不限于Fab、Fab'和F(ab' ) 2、Fd、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs (dsFv)以及包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段。包括單鏈抗體的抗原結(jié)合抗體片段可以包括單獨的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域或與下列中的全部或部分的組合:鉸鏈區(qū)、CL、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括的是還包含一個或多個可變結(jié)構(gòu)域與鉸鏈區(qū)、CL、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合的抗原結(jié)合片段。可用于本發(fā)明的抗體可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選地，抗原來自于人、嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)肩，豬，綿羊，山羊，駱騎，牛，馬，驢，貓或犬來源。特別優(yōu)選的是抗原是人或小鼠來源。如本文所用，“人抗體”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，及包括從人免疫球蛋白文庫或從轉(zhuǎn)基因為一種或多種人免疫球蛋白且不表達內(nèi)源免疫球蛋白的動物分離的抗體，例如如Kucherlapati & Jakobovits的美國專利第5，939，598號所描述的。術(shù)語“抗體樣蛋白”是指已經(jīng)工程化(例如通過環(huán)的誘變)以與靶分子特異性結(jié)合的蛋白。通常，這樣的抗體樣蛋白包含在兩端與蛋白骨架連接的至少一個可變的肽環(huán)。這一雙重結(jié)構(gòu)限制將抗體樣蛋白的結(jié)合親和性大大增加至與抗體相當?shù)乃健？勺冸沫h(huán)的長度通常由10至20個氨基酸組成。骨架蛋白可以是具有良好溶解度特性的任何蛋白。優(yōu)選地，骨架蛋白是小的球狀蛋白。抗體樣蛋白包括但不限于親合體(affibody)、anticalin和設計的錨蛋白重復序列(綜述參見Binz et al.,2005) 抗體樣蛋白可來源于大的突變文庫，例如從大的噬菌體表達文庫淘選并且可按照類似規(guī)則的抗體的方式分離。同樣，抗體樣結(jié)合蛋白可以通過球狀蛋白中表面暴露殘基的組合誘變獲得。術(shù)語“核酸適體”是指通過多輪重復的體外選擇或SELEX (指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化)而工程化以與靶分子結(jié)合的核酸分子(綜述參見Brody和Gold，2000)。核酸適體可以是DNA或RNA分子。適體可含有修飾例如修飾的核苷酸諸如2’ -氟-取代的嘧啶。如本文所用的，化合物的“化學衍生物”(或簡短表述為:“衍生物”)是指具有與化合物相似的化學結(jié)構(gòu)但還含有至少一個化合物中不存在的化學基團和/或缺少至少一個化合物中存在的化學基團的物質(zhì)。衍生物所比較的化合物被稱為“母體”化合物。通常，“衍生物”可在一個或多個化學反應步驟中由母體化合物生產(chǎn)。如本文所用的，化合物的“類似物”與化合物結(jié)構(gòu)上相關(guān)但是不相同并且表現(xiàn)出化合物的至少一種活性。類似物所比較的化合物被稱為“母體”化合物，前文提及的活性包括但不限于:與另一種化合物的結(jié)合活性；抑制活性例如酶抑制活性；毒性作用；活化活性例如酶活化活性。不需要類似物表現(xiàn)出與母體化合物相同程度的這些活性。如果化合物表現(xiàn)出母體化合物的活性的至少1% (更優(yōu)選地至少5%、更優(yōu)選地至少10%、更優(yōu)選地至少20%、更優(yōu)選地至少30%、更優(yōu)選地至少40%和更優(yōu)選地至少50% )的程度的相關(guān)活性，那么化合物被認為是本申請背景下的類似物。因此，如其在本文所用的，“鵝膏毒素的類似物”是指結(jié)構(gòu)上與如圖1所示的α-鵝膏毒環(huán)肽(α-amanitin)、β -鵝膏毒環(huán)肽(β-amanitin)、Y -鵝膏毒環(huán)肽(Y-amanitin)、ε -鵝膏毒環(huán)肽(ε-amanitin)、鵝膏素(amanin)、三輕毒傘肽酹胺(amaninamide)、鵝膏無毒環(huán)肽(amanullin)和一輕鵝膏毒肽羧酸(amanullinic acid)結(jié)構(gòu)上相關(guān)并且表現(xiàn)出與α -鵝膏毒環(huán)肽、β -鵝膏毒環(huán)肽、Y-鵝膏毒環(huán)肽、ε -鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏素、三羥毒傘肽酚胺、鵝膏無毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸中的至少一種相比至少1% (更優(yōu)選地至 少5%、更優(yōu)選地至少10%、更優(yōu)選地至少20%、更優(yōu)選地至少30%、更優(yōu)選地至少40%以及更優(yōu)選地至少50% )的抗哺乳動物RNA聚合酶II的抑制性活性。適于在本發(fā)明中使用的“鵝膏毒素的類似物”甚至可表現(xiàn)出比α-鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏毒環(huán)肽、Y-鵝膏毒環(huán)肽、ε-鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏素、三羥毒傘肽酚胺、鵝膏無毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸中的任何一種更高的抗哺乳動物RNA聚合酶II的抑制性活性。抑制活性可通過測定發(fā)生50%抑制時的濃度(IC5tl值)來測量?？共溉閯游颮NA聚合酶II的抑制性活性可通過測量對細胞增殖的抑制活性來間接測量。適于測量細胞增殖的抑制的分析描述于實施例中?！鞍牒铣傻念愃莆铩笔侵竿ㄟ^使用來自天然來源的化合物(例如植物材料、細菌培養(yǎng)物或細胞培養(yǎng)物)作為起始原料的化學合成獲得的類似物。通常，本發(fā)明的“半合成類似物”從自鵝膏屬家族的蕈類分離的化合物起始來合成。相反，“合成類似物”是指通過從小的(通常石油化學的)結(jié)構(gòu)單元的所謂全合成來合成的類似物。通常，在沒有生物學過程輔助的情況下實行這一全合成。如本文所用的，“適體軛合物”是指靶結(jié)合部分毒素軛合物，其中靶結(jié)合部分是根據(jù)上文可選擇的(iii)的核酸適體。在本發(fā)明的背景下“連接體”是指連接兩個組成部分的分子，該組成部分的每一個與連接體的一個末端連接，所述連接體增加兩個組成部分之間的距離并緩解這些組成部分之間的空間干擾，例如在本實例中靶結(jié)合部分與鵝膏毒素之間的空間干擾。在連接體不存在的情況下，鵝膏毒素與靶結(jié)合部分的直接鍵合減小了鵝膏毒素與RNA聚合酶II反應的能力。在特定的實施方案中，連接體具有主鏈上I 30個原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個原子)的連續(xù)
的鏈，即連接體的長度被定義為由鵝膏毒素部分和靶結(jié)合部分之間的原子或鍵測量的最短的連接，其中連接體主鏈的一側(cè)已經(jīng)與鵝膏毒素反應而另一側(cè)與靶結(jié)合部分反應。在本發(fā)明的背景下，連接體優(yōu)選地是Cu-亞烷基、CV2tl-雜亞烷基、C2_20-亞烯基、C2_2(l-雜亞烯基、c2_20-亞炔基、c2_2(l-雜亞炔基、環(huán)亞烷基、雜環(huán)亞烷基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳烷基或雜亞芳烷基基團，任選地被取代。連接體可含有一個或多個結(jié)構(gòu)單元例如甲酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烴部分以及類似部分。連接體還可含有這些結(jié)構(gòu)單元中的兩個或多個的組合。這些結(jié)構(gòu)單元 中的每一個可在連接體中存在不止一次例如兩次、三次、四次、五次或六次。在某些實施方案中，連接體可包含二硫鍵。應當理解的是連接體必須在單個步驟或兩個或更多個后續(xù)步驟中與鵝膏毒素和靶結(jié)合部分連接。為了這一目的，連接體將帶有兩個基團，優(yōu)選地在近端和遠端，其可(i)與有待連接的組成部分中的一個中存在的基團優(yōu)選地鵝膏毒素或靶結(jié)合肽上的活化基團形成共價鍵或(ii)其被活化或可以被活化以與鵝膏毒素上的基團形成共價鍵。相應地，優(yōu)選的是化學基團位于連接體的遠端和近端，其可以是該偶聯(lián)反應的結(jié)果，例如酯、醚、氨基甲酸酯、肽鍵等。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“鵝膏毒素”包括如從鵝膏屬分離的并且在Wieland，T.和 Faulstich H.(Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem.1978 Dec ；5 (3):185-260)中描述的由8個氨基酸組成的所有環(huán)肽，并且還包括其所有化學衍生物；另外其所有的半合成類似物；另外其根據(jù)天然化合物(環(huán)形，8個氨基酸)的基本結(jié)構(gòu)從結(jié)構(gòu)單元建造的所有的合成類似物；另外的含有代替羥基化氨基酸的非羥基化氨基酸的所有合成或半合成的類似物，另外的所有合成和半合成的類似物(其中硫醚硫氧化物部分被硫化物、砜或者被不同于硫的原子例如在鵝膏毒環(huán)肽的卡巴類似物(carba-analogue)中的碳原子代替，在每個實例中任何這樣的衍生物或類似物通過抑制哺乳動物RNA聚合酶II而在功能上起作用。功能上，鵝膏毒素被定義為抑制哺乳動物RNA聚合酶II的肽或縮肽。優(yōu)選的鵝膏毒素是具有能夠與上文所定義的連接體分子或靶結(jié)合部分發(fā)生反應的官能團(例如羧基、氨基、羥基、硫醇或巰基捕獲基團)的那些。特別適于本發(fā)明的軛合物的鵝膏毒素是如圖1所示的α -鵝膏毒環(huán)肽、β -鵝膏毒環(huán)肽、Y -鵝膏毒環(huán)肽、ε -鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏素、三羥毒傘肽酚胺、鵝膏無毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸以及其鹽、化學衍生物、半合成類似物和合成類似物。在本發(fā)明中使用的特別優(yōu)選的鵝膏毒素是α-鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏毒環(huán)肽和三羥毒傘肽酚胺。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“經(jīng)由脲部分與靶結(jié)合部分連接”是指連接體與靶結(jié)合部分之間的連接，其中靶結(jié)合部分經(jīng)由NH-C(O)-NH-基團直接與連接體連接。在本發(fā)明的特定的實施方案中，軛合物具有選自下列結(jié)構(gòu)中的一種結(jié)構(gòu):鵝膏毒素-YC (O) -NH-L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分；鵝膏毒素-δC-O-C (O) -L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分；鵝膏毒素-δ C-O-L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分；鵝膏毒素-δC-O-C (O) -NH-L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分；和鵝膏毒素-6! C-O-L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分。
在本發(fā)明的特定的實施方案中，所述靶結(jié)合部分經(jīng)由所述靶結(jié)合部分上存在的氨基基團與連接體L連接，其中所述氨基基團形成所述脲部分的一部分。在本發(fā)明的特定的實施方案中，鵝膏毒素選自α-鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏毒環(huán)肽、Y -鵝膏毒環(huán)肽、ε -鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏素、三羥毒傘肽酚胺、鵝膏無毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或選自其鹽或類似物。在本發(fā)明的特定的實施方案中，連接體L包含一個或多個基團，具體地一個、兩個或三個基團，其選自下列:亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、雜亞烷基、雜亞烯基、雜亞炔基、雜環(huán)亞烷基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳烷基和雜亞芳烷基基團，其中每種基團任選地被獨立地取代。術(shù)語“亞烷基”是指具有I至20個碳原子的二價直鏈飽和烴基團，包括具有從I至10個碳原子的基團。在某些實施方案中，亞烷基基團可以是低級亞烷基基團。術(shù)語“低級亞烷基”是指具有I至6個碳原子、在某些實施方案中I至5或I至4個碳原子的亞烷基基團。亞烷基基團的實例包括但不限于亞甲基(-CH2-)、亞乙基(-CH2-CH2-)、亞正丙基、亞正丁基、亞正戊基和亞正己基。術(shù)語“亞烯基”是指具有2至20個碳原子的二價直鏈基團，其中碳碳鍵中的至少一個是雙鍵而其他的鍵可以是單鍵或另外的雙鍵。本文中，術(shù)語“亞炔基”是指具有2至20個碳原子的基團，其中碳碳鍵中的至少一個是三鍵，而其他的鍵可以是單鍵、雙鍵或另外的三鍵。亞烯基基團的實例包括亞乙烯基(-CH = CH-)、1-亞丙烯基、2-亞丙烯基、1-亞丁烯基、2-亞丁烯基、3-亞丁烯基以及類似物。亞炔基的實例包括亞乙炔基、1-亞丙炔基、2-亞丙塊基等等。如本文所用的，“環(huán)亞烷基”意指作為任何穩(wěn)定的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)的一部分的二價環(huán)，其中該環(huán)具有3 12碳原子但是沒有雜原子，并且其中該環(huán)是充分飽和的，而術(shù)語“環(huán)亞烯基”意指作為任何穩(wěn)定的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)的一部分的二價環(huán)，其中該環(huán)具有3 13碳原子但是沒有雜原子，并且其中該環(huán)是至少部分不飽和的(但是不包括任何亞芳基環(huán))。環(huán)亞烷基的實例包括但不限于環(huán)亞丙基、環(huán)亞丁基、環(huán)亞戊基、環(huán)亞己基和環(huán)亞庚基。環(huán)亞烯基的實例包括但不限于環(huán)亞戊烯基和環(huán)亞己烯基。如本文所用的，術(shù)語“雜環(huán)亞烷基”和“雜環(huán)亞烯基”意指作為任何穩(wěn)定的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)的一部分的二價環(huán)，其中該環(huán)具有3 12碳原子，并且其中該環(huán)由碳原子和至少一個雜原子、具體地獨立地選自由N、O和S組成的組的至少一個雜原子組成，其中，雜環(huán)亞烷基是指充分飽和的環(huán)，雜環(huán)亞烯基是指至少部分不飽和的環(huán)(但是不包括任何亞芳基或雜亞芳基環(huán))。術(shù)語“亞芳基”意指作為任何穩(wěn)定的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)的一部分的二價環(huán)，其中該環(huán)或環(huán)系統(tǒng)具有3 12碳原子但是沒有雜原子，該環(huán)或環(huán)系統(tǒng)由如“4η+2” π電子規(guī)則定義的芳香族部分組成，包括亞戍烯基。如本文所用的，術(shù)語“雜亞芳基”是指作為任何穩(wěn)定的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)的一部分的二價環(huán)，其中該環(huán)或環(huán)系統(tǒng)具有3 12碳原子，該環(huán)或環(huán)系統(tǒng)由如“4η+2”π電子規(guī)則定義的芳香族部分組成并且含有碳原子和一個或多個氮、硫和/或氧雜原子。在本發(fā)明的背景下 ，術(shù)語“取代的”意指連接體的主鏈中存在的一個或多個氫被來自所標示的一個或多個基團的選擇取代，只要不超過所標示的原子的正常效價或被取代的基團的合適的原子的效價并且取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物。如本文所定義的，術(shù)語“任選地取代”意指連接體是未取代的或被如本文所定義的一個或多個取代基取代的。當取代基是酮類(或氧雜即=O)基團、硫代或亞氨基基團或類似基團時，連接體主鏈原子上的兩個氫被代替。示例性的取代基包括例如烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、?；?、芳?；?、雜芳?；Ⅳ然?、烷氧基、芳氧基、酰氧基、芳酰氧基、雜芳酰氧基、燒氧基擬基、齒素、(硫代)酷、氛基、憐酸基、氣基、亞氣基、(硫代)酸氣基、疏基、烷基巰基、?；鶐€基、磺?；?、硫酸鹽、磺酸鹽、氨磺?；⒒酋０被?、硝基、疊氮基、齒代烷基(包括全氣燒基(例如二氣甲基))、齒代燒氧基、燒基硫燒基(alkylsulfanyl)、燒基亞磺?；?、燒基磺?；酋；被?、芳基砜氨基(arylsulfonoamino)、磷?；⒘姿猁}、碳憐酸鹽、勝、燒基竣基、燒基竣基酸胺、氧雜、輕基、疏基、氣基(任選被例如燒基、芳基、或雜芳基單-或二取代)、亞氨基、甲酰胺、甲氨酰(任選由烷基、芳基、或雜芳基單-或二取代)、脈基、氣基橫酸基、酸基氣基、芳酸基氣基、(硫代)服基、(芳基硫代)服基、燒基(硫代)脲基、環(huán)烷基(硫代)脲基、芳氧基、芳烷氧基、或-O(CH2)n-0H、-0(CH2)n-NH2、-O(CH2)nC00H、- (CH2) nC00H、-C (0) 0 (CH2) nR、- (CH2) nN ⑶ C (0) OR 或 N (R) S (0) 2R，其中 n 是 1-4 而 R 獨立地選自氧、_燒基、_稀基、_塊基、_環(huán)燒基、-環(huán)稀基、_(c_連接的雜環(huán)燒基)、-(c-連接的雜環(huán)烯基)、_芳基和-雜芳基，允許具有多種程度的取代。本領域技術(shù)人員應當理解的是如果適合那么取代基例如雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷基等或功能基團例如-OH、-NHR等自身可被取代。本領域技術(shù)人員還應當理解的是，適合時取代的部分本身可被取代。 在本發(fā)明的特 定的實施方案中，連接體L，特別是第9頁第3段或第16頁第3段中所不的連接體L,包含選自下列的m基團:亞燒基、亞稀基、亞塊基、環(huán)亞燒基、雜亞燒基、雜亞烯基、雜亞炔基、雜環(huán)亞烷基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳烷基以及雜亞芳烷基基團，其中，每個基團可任選地被獨立地取代，連接體還包含獨立選自下列部分中的一種的η部分:二硫化物(-S-S-)、醚(-0-)、硫醚(-S-)、胺(-ΝΗ-)、酯(_0_C( = O) -或-C( = O) -O-)、甲酰胺(-NH-C ( = O)-或-C ( = O) -NH-)、氨基甲酸酯(-NH-C ( = O) -O-或-0-C ( = O) -NH-)和脲部分(_NH_C( = 0)-ΝΗ-)，其中m = n+1。在特定的實施方案中，m是2且η是I或者m是3且η是2。在特定的實施方案中，連接體包含2或3個未取代的亞烷基基團以及I或2個分別連接未取代的亞烷基基團的二硫化物、醚、硫醚、胺、酯、甲酰胺、氨基甲酸酯或脲部分。在特定的實施方案中，連接體L，特別是如第9頁第3段中所示的連接體L是獨立地選自C、O、N和S的2 20個原子的直鏈，特別是2 16個原子、更特別是5 14個原子以及甚至更特別是6 12個原子。在特定的實施方案中，直鏈中至少60%的原子是C原子。在特定的實施方案中，直鏈中的原子通過單鍵連接。在特定的實施方案中，直鏈中的C原子獨立地是任選取代的亞甲基基團(-CH2-)的一部分。在這樣特定的實施方案中，任選的取代基獨立地選自鹵素和CV6-烷基，特別是甲基。在特定的實施方案中，連接體L，特別是如第9頁第3段或第16頁第3段中所示的連接體L選自下列連接體的組:鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 3-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 4-靶結(jié)合部分側(cè)
鵝膏毒素側(cè):-(CH2) 5-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 6_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 7_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2)8-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 9-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 10-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) n-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 12-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 16-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-S-S- (CH2) 2_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 3-S-S- (CH2) 2_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-S-S- (CH2) 3_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 3-S-S- (CH2) 3-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2)4-S-S-(CH2) 4_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-CMe2-S-S- (CH2) 2_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-S-S-CMe2- (CH2) 2_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-0- (CH2) 2-靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_ (CH2) 2-0- (CH2) 2-0- (CH2) 2_靶結(jié)合部分側(cè)鵝膏毒素側(cè):_(CH2) 2-0- (CH2) 2-0- (CH2) 2_0_ (CH2) 2_ 靶結(jié)合部分側(cè)鵝骨毒素側(cè):-(CH2)2_0_ (CH2) 2_0_ (CH2) 2_0_ (CH2) 2_0_ (CH2) 2_ 祀結(jié)合部分側(cè)在本發(fā)明的特定的實施方案中，所述靶結(jié)合部分與腫瘤細胞上存在的表位特異性
彡口口 在本發(fā)明的特定的實施方案中，所述靶結(jié)合部分與Her-2/neu的表位或上皮細胞粘附分子(EpCAM)特異性結(jié)合。在本發(fā)明的特定的實施方案中，所述靶結(jié)合部分選自由下列組成的組:抗體或其抗原結(jié)合片段、抗體樣蛋白和核酸適體。在本發(fā)明的特定的實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段選自雙體、四體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫抗體、人源化抗體或人抗體。在本發(fā)明的特定的實施方案中，所述抗原結(jié)合片段選自由Fab、F(ab' )2、Fd、Fv、單鏈Fv和二硫鍵連接的Fvs (dsFv)組成的組。在本發(fā)明的特定的實施方案中，抗體是赫賽汀或HEA125或者包含赫賽汀或HEA125的抗原結(jié)合片段的抗體片段。在本發(fā)明的特定的實施方案中，不止一個鵝膏毒素分子與一個靶結(jié)合部分偶聯(lián)。每個軛合物中鵝膏毒素數(shù)目的增加也會增加毒性。因此，在特定的實施方案中，靶結(jié)合部分與鵝膏毒素的比例為I個靶結(jié)合部分比2 15個鵝膏毒素分子，具體地為2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14或15個。為了計算抗體二聚體例如IgG時中的比例，二聚體被認為是一個革El結(jié)合部分。在本發(fā)明的特定的實施方案中，軛合物被用作藥物。
在本發(fā)明的特定的實施方案中，軛合物被用于在患者中治療癌癥，其中癌癥選自由胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤組成的組。如本文所用的，“患者”意指可從使用本文描述的靶結(jié)合部分毒素軛合物的治療中受益的任何哺乳動物或鳥類。優(yōu)選地，“患者”選自由實驗動物(例如小鼠或大鼠)、家畜動物(包括如豚鼠、兔、雞、豬、綿羊、山羊、駱駝、牛、馬、驢、貓或犬)或靈長類包括人組成的組。特別優(yōu)選的是“患者”是人。如本文所用的,疾病或病癥的“治療(treat、treatingtreatment) ”意指完成下列中的一項或多項:(a)降低病癥的嚴重度；(b)限制或預防所治療的一種或多種病癥的特征癥狀的發(fā)展；(C)阻止所治療的一種或多種病癥的特征癥狀的惡化；(d)限制或預防之前曾患有一種或多種病癥的患者的一種或多種病癥的復發(fā)；和(e)限制或預防之前曾具有一種或多種病癥癥狀的患者中癥狀的復發(fā)。如本文所用的，治療可包括向患者施用根據(jù)本發(fā)明的軛合物或藥物組合物，其中“施用”包括體內(nèi)施用以及直接離體施用于組織例如靜脈移植。在特定的實施方案中，使用治療有效量的本發(fā)明的軛合物。“治療有效量”是足以達到預期目的的治療劑的量。給定的治療劑的有效量會隨著不同因素例如所述劑的性質(zhì)、施用途徑、接受所述治療劑的動物的大小和物種以及施用目的而發(fā)生變化。每個個體病例的有效量可由本領域技術(shù)人員根據(jù)本領域中已經(jīng)確立的方法和經(jīng)驗來確定。在第 二方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的軛合物，其還包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解齊U、吸附劑和/或防腐劑?！八帉W上可接受的”意指由聯(lián)邦或州政府的管理結(jié)構(gòu)批準或列在美國藥典或其他公認的藥典中用于動物并且更具體地在人中使用的。在特定的實施方案中，藥物組合物以系統(tǒng)施用的藥物的形式使用。這包括胃腸外的，其除了其他之外還包括注射劑和輸注劑。注射劑可配制為一次用量針劑的形式或所謂的隨時可用的注射劑(例如隨時可用的注射器或一次用注射器)并且以及除此之外用于多次回收的穿刺瓶中。注射劑的施用可以是皮下注射(s.C.)、肌注(1.m.)、靜注(1.v.)或皮內(nèi)注射(1.e.)的形式。特別是，生產(chǎn)分別適合晶體懸浮液、溶液、納米顆粒或膠體分散系統(tǒng)例如水溶膠的注射制劑是可能的。注射制劑還可被生產(chǎn)為濃縮物，其可用含水等張稀釋劑溶解或分散。也可以等張溶液、脂肪乳液、脂質(zhì)體制劑和微乳液的形式制備輸注劑。與注射劑相似，輸注制劑也可以用于稀釋的濃縮物的形式制備。注射制劑在住院病人和流動病人治療中都還可以恒定輸注的形式使用，例如通過微型泵?？梢韵蛭改c外藥物制劑中加入例如白蛋白、血漿、膨脹劑、表面活性物質(zhì)、有機稀釋劑、影響PH值的物質(zhì)、絡合物質(zhì)或聚合物質(zhì)尤其是影響本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物對蛋白或聚合物的吸附的物質(zhì)，或者它們也可以為了減少本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物對材料像注射工具或封裝材料(例如塑料或者玻璃的)的吸附而加入。本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物可在胃腸外制劑中與微載體或納米顆粒結(jié)合像例如與基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸酯、聚乙醇酸酯、聚氨基酸或聚醚氨酯的精細分散的顆粒結(jié)合。胃腸外制劑可以被修飾為貯藏制劑，例如基于“多個單元原則”(如果本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物在藥物中被分別精細分散、分散或懸浮的形式或作為晶體的懸浮液引入)或者基于“單個單位原則”(如果本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物被包封在制劑例如隨后被植入的片劑或棒中)。這些單個單位和多個單位制劑形式的植入體或貯藏藥物經(jīng)常由所謂的生物可降解的聚合物像例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚聚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖組成。在配制胃腸外制劑的本發(fā)明的藥物組合物期間加入的佐劑和載體優(yōu)選無菌水(經(jīng)滅菌的水)，影響PH值的物質(zhì)像例如有機或無機酸或堿以及其鹽，調(diào)節(jié)pH值的緩沖物質(zhì)，用于等張化的物質(zhì)像例如氯化鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖和果糖，英文分別為tensid和surfactant的表面活性劑以及乳化劑像例如聚氧乙烯山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如Tween )或者例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如Cremophor _ ),脂肪油像例如花生油、豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯像例如油酸乙酯、豆蘧酸異丙酯和中性油(例如Miglyol )以及聚合性佐劑像例如明膠、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，增加有機溶劑溶解度的添加劑像例如丙二醇、乙醇、N, N-二甲基乙酰胺、丙二醇或絡合物形成物質(zhì)像例如檸檬酸酯和脲，防腐劑像例如苯甲酸羥丙基酯和甲酯，苯甲醇，抗氧化劑像例如亞硫酸鈉和穩(wěn)定劑像例如EDTA。當在優(yōu)選的實施方案中將本發(fā)明的藥物組合物配制為懸浮液時，加入防止本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物沉淀的增稠劑或確保沉淀物重懸性的表面活性劑和聚電解質(zhì)和/或絡合物形成劑像例如EDTA。也可獲得活性成分與多種 聚合物的絡合物。這樣的聚合物的實例是聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纖維素、Pluronics .或聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯。本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素軛合物也可以包含化合物(例如使用環(huán)糊精的)的形式摻入液體制劑中。在特定的實施方案中，分散劑可作為另外的佐劑加入。為了生產(chǎn)冷凍干燥制劑，可使用支架劑(scaffolding agent),像甘露醇、葡聚糖、鹿糖、人血白蛋白、乳糖、PVP或明膠的變體。在另一方面中，本發(fā)明涉及在有需要的患者中治療胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病或惡性淋巴瘤的方法，包括向所述患者施用有效量的本發(fā)明的軛合物或藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及作為本發(fā)明的軛合物合成的中間體的鵝膏毒素軛合分子，其中，所述鵝膏毒素軛合分子包含經(jīng)由下列(i)、( )或(iii)與鵝膏毒素連接的連接體L:(i)鵝膏毒素氨基酸I的YC原子，特別是經(jīng)由酰胺鍵；(ii)與鵝膏毒素氨基酸3的SC原子結(jié)合的氧原子，特別是經(jīng)由酯鍵、醚鍵或氨基甲酸酯鍵；(iii)鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子，特別是經(jīng)由與鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子結(jié)合的氧原子；在每種情況下，所述連接體L包含氨基甲酸衍生的-NH-C (O) -X，其中X是可以被靶結(jié)合部分的伯胺替代的離去基團。在一個實施方案中，鵝膏毒素軛合分子具有選自下列結(jié)構(gòu)中的一個結(jié)構(gòu):⑴鵝膏毒素-YC (O) -NH-L-NH-C (O) -X ；(ii)鵝膏毒素-δ C-O-C(O)-L-NH-C(O)-X ；
(iii)鵝膏毒素-δ C-O-L-NH-C(O)-X ；(iv)鵝膏毒素-δ C-O-C (O) -NH-L-NH-C (O) -X ;和(V)鵝膏毒素-6' C-O-L-NH-C (O)-X。在某些實施方案中，鵝膏毒素選自α-鵝膏毒環(huán)肽、β-鵝膏毒環(huán)肽、Υ-鵝膏毒環(huán)肽、ε -鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏素、三羥毒傘肽酚胺、鵝膏無毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者選自其鹽或類似物。在某些實施方案中，所述連接體L是亞烷基、雜亞烷基、亞烯基、雜亞烯基、亞炔基、雜亞炔基、環(huán)亞烷基、雜環(huán)亞烷基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳烷基或雜亞芳烷基基團，其任選地被取代。在某些實施方案中，所述連接體L包含選自下列部分中的一個的部分:二硫化物、醚、胺、酯、甲酰胺、氨基甲酸酯和脲部分。在某些實施方案中，官能團X選自:-叔丁氧基、-玻拍酸氧基、_1-0_玻拍酸氧基-3-磺酸酯(磺基-NHS)、-O- (4-硝基苯氧基)、-O- (3-硝基苯氧基)、-O- (2，4- 二硝基苯氧基)、-O-(2,4-_■氣-6-硝基苯氧基)、-五氣苯氧基、-五氣苯氧基、-O-(2,4,5-二氣苯氧基)、-O-(3，4- 二氫-3-羥基-4-氧雜-1，2，3-苯并三嗪_3_基)、_0_(內(nèi)-1-羥基-5-降冰片烯-2，3- 二甲酰亞胺-1-基)、-1-苯二酰亞氨氧基、-1-苯并三唑氧基、-1-(7-氮雜苯并三唑基)氧基、)和-N-咪唑基。在再一個方面，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明的鵝膏毒素的方法，其包括將本發(fā)明的鵝膏毒素軛合分子與包含伯氨基基團的靶結(jié)合部分反應的步驟。實施例

在下文中，通過非限制性實例更加詳細地解釋了本發(fā)明:實施例1α -鵝膏毒環(huán)肽赫賽汀抗體軛合物Her-DSC-30.0134的合成1.16’ -NH-boc-(6-氨基己基)-α-鵝膏毒環(huán)肽HDP 30.0132的合成
HO^OH
ho^S'η §χ°γ ^^ΒΓ Ηο^γ、'、 η 9
。Y
hoο0 ho
NH2NH2
α-鵝膏毒環(huán)肽HDP 30.0132在氬氣和室溫下，將30.0Omg (32.6 μ mol)的真空干燥的α -鵝膏毒環(huán)肽溶解于900 μ I無水二甲基亞砜(DMSO)中。加入叔丁酸鉀3.66mg(32.6 μ mol)和
73.18mg(261.2 μ mol，8當量)NH-Boc-氨基己基溴化物(Fluka 89171)。室溫6小時后，用50 μ I溶于DMSO的0.33Μ乙酸溶液將反應混合物酸化至pH = 5。在真空中蒸發(fā)揮發(fā)性物質(zhì)并且將剩余物溶解于1000 μ I甲醇并用20ml乙醚稀釋。收集沉淀物并且溶于1000 μ I甲醇中。將溶液用1000 μ I水稀釋并用LaPr印-HPLC進行純化:(柱:Kromasil 100-C18, 250mm x 20mm，10 μ m，采用甲醇/水(0.05% TFA)，流速:26ml/min,于 λ = 295nm 檢測)。溶劑A:95%水:5%甲醇:0.05%三氟乙酸溶劑B:10%水:90%甲醇:0.05%三氟乙酸梯度:0 5min 100% A ;5 20min 0% A ；20 40min 0% A收集具有19.Smin保留時間的餾分并蒸發(fā)溶劑。得到15.9mg(43%產(chǎn)率)的粉末。MS:1119 (M+H+) ；1141(M+Na+)1.2 6’ -(-6-氨基己基)-α-鵝膏毒環(huán)肽HDP 30.0134的合成
權(quán)利要求
1.一種軛合物，其包含經(jīng)由連接體L與鵝膏毒素連接的靶結(jié)合部分，其中，所述連接體L經(jīng)由下列(i)、(ii)或(iii)與所述鵝膏毒素連接: (i)鵝膏毒素氨基酸I的Y C原子，特別是經(jīng)由酰胺鍵； ( )與鵝膏毒素氨基酸3的SC原子結(jié)合的氧原子，特別是經(jīng)由酯鍵、醚鍵或氨基甲酸酯鍵； (iii)鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子，特別是經(jīng)由與鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子結(jié)合的氧原子； 在每種情況下，所述連接體L經(jīng)由脲部分與所述靶結(jié)合部分連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中，所述軛合物具有選自下列結(jié)構(gòu)中的一種的結(jié)構(gòu): (i)鵝膏毒素-YC (O) -NH-L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分； (ii)鵝膏毒素-SC-O-C(O) -L-NH-C(O) -NH-靶結(jié)合部分； (iii)鵝膏毒素-SC-O-L-NH-C(O) -NH-靶結(jié)合部分； (iv)鵝膏毒素-δC-O-C (O) -NH-L-NH-C (O) -NH-靶結(jié)合部分；和 (V)鵝膏毒素_6’ C-O-L-NH-C (O)-NH-靶結(jié)合部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的軛合物，其中，所述靶結(jié)合部分經(jīng)由存在于所述靶結(jié)合部分上的氨基基團與所述連 接體L連接，其中所述氨基基團形成所述脲部分的一部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的軛合物，其中所述鵝膏毒素選自α-鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏毒環(huán)肽、Y-鵝膏毒環(huán)肽、ε-鵝膏毒環(huán)肽、鵝膏素、三羥毒傘肽酚胺、鵝膏無毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的軛合物，其中，所述連接體L是亞烷基、雜亞烷基、亞烯基、雜亞烯基、亞炔基、雜亞炔基、環(huán)亞烷基、雜環(huán)亞烷基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳烷基或雜亞芳烷基基團，其任選地被取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的軛合物，其中，所述連接體L包含選自下列部分中的一個部分:二硫化物、醚、胺、酯、甲酰胺、氨基甲酸酯和脲部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的軛合物，其中，所述靶結(jié)合部分與存在于癌細胞上的表位特異性結(jié)合，特別是其中所述靶結(jié)合部分與上皮細胞粘附分子(EpCAM)的表位特異性結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的軛合物，其中，所述靶結(jié)合部分選自由下列(i)、(ii)和(iii)組成的組: (i)抗體或其抗原結(jié)合片段； ( )抗體樣蛋白； (iii)核酸適體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的軛合物，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自雙體、四體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫抗體、人源化抗體或人抗體
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的靶結(jié)合部分毒素軛合物，其中，所述抗原結(jié)合片段選自由Fab、F(ab' )2、Fd、Fv、單鏈Fv和二硫鍵連接的Fvs (dsFv)組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的軛合物，其用作藥物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的軛合物，其用于在患者中治療癌癥，其中所述癌癥選自由胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤組成的組。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至10中任一項所述的軛合物，并且包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑和/或防腐劑。
14.一種鵝膏毒素軛合分子，其包含經(jīng)由下列或(iii)與鵝膏毒素連接的連接體L: (i)鵝膏毒素氨基酸I的Y C原子，特別是經(jīng)由酰胺鍵； ( )與鵝膏毒素氨基酸3的SC原子結(jié)合的氧原子，特別是經(jīng)由酯鍵、醚鍵或氨基甲酸酯鍵； (iii)鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子，特別是經(jīng)由與鵝膏毒素氨基酸4的6' C原子結(jié)合的氧原子； 在每種情況下，所述連接體L包含氨基甲酸衍生的-NH-C(O)-X，其中，X是可以被靶結(jié)合部分的伯胺替代的離去基團。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的鵝膏毒素軛合分子，其中，所述X選自:_叔丁氧基、-琥珀酰氧基、-1-0-琥珀酰氧基-3-磺酸酯(磺基-NHS)、-O- (4-硝基苯氧基)、-O- (3-硝基苯氧基)、_0- (2,4- _■硝基苯氧基)、-O- (2,4- _■氣-6-硝基苯氧基)、-五氣苯氧基、-五氣苯氧基、_0-(2,4, 5-二氣苯氧基)、-O-(3,4- _■氧-3-輕基-4-氧雜_1，2,3-苯并二嗪-3-基)、-0-(內(nèi)-1-羥基-5-降冰片烯-2，3- 二甲酰亞胺-1-基)、-1-苯二酰亞氨氧基、-1-苯并三唑氧基、-1-(7-氮雜苯并三唑基)氧基、)和-N-咪唑基。
16.合成權(quán)利要求1至12中任一項所述的軛合物的方法，其包括將權(quán)利要求14或15所述的鵝膏毒素軛合分子與包含伯氨基基團的靶結(jié)合部分反應的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤治療。在一個方面，本發(fā)明涉及鵝膏毒素與靶結(jié)合部分例如抗體的軛合物，所述鵝膏毒素與靶結(jié)合部分通過包含脲部分的連接體連接，其用于癌癥的治療中。在另一方面，本發(fā)明還涉及包含該軛合物的藥物組合物。
文檔編號A61K47/48GK103153345SQ201180047591
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者揚·安德爾, 維爾納·西蒙, 克里斯托夫·米勒 申請人:海德堡醫(yī)藥有限責任公司