專利名稱：改進(jìn)的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及細(xì)胞療法。具體地，本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于造血系統(tǒng)的細(xì)胞療法。更具體地說，本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于重建個(gè)體的造血系統(tǒng)的方法。
_5] 相關(guān)領(lǐng)域描述再生醫(yī)學(xué)是開發(fā)治療以修復(fù)或恢復(fù)體內(nèi)特定的細(xì)胞，組織和器官的醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。再生療法所追求的一個(gè)方面是使用造血干細(xì)胞移植治療越來越多的癌癥和退行性疾病。根據(jù)全國(guó)骨髓捐獻(xiàn)計(jì)劃 (NiV丨DP)，估計(jì)全球每年進(jìn)行45，000至50，000例造血干細(xì)胞移植(骨髓、外周血干細(xì)胞(PBSC)，或臍帶血移植)，其中包括約20，000例異體造血干細(xì)胞移植，以治療患有危及生命的惡性及非惡性疾病的患者(Horowitz麗.Uses andGrowth of Hematopoietic Cell Transplantation.1n:Blume KG，F(xiàn)orman SJ，AppelbaumFR，eds.Thomas’Hematopoietic Cell Transplantation.3rd ed.MaldenjMassiBlackwell ；2004:9-15)。此外，每年約4，800名患者通過NMDP使用無關(guān)系的捐獻(xiàn)者或臍帶血單元進(jìn)行移植。因?yàn)殚_始運(yùn)營(yíng)于1987年，NMDP已協(xié)助超過38，000例骨髓和臍帶血移植，給予患者第二次生命的機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)上，來自骨髓的造血干細(xì)胞移植用于治療患有不同類型的白血病，貧血，淋巴瘤，骨髓瘤，免疫缺陷性疾病和實(shí)體瘤(如乳腺癌和卵巢癌)的患者。然而，骨髓移植對(duì)于捐獻(xiàn)者是痛苦的，而且，找到必要程度的HLA捐獻(xiàn)者匹配組織，尤其是在特定的民族群體中，通常是困難和耗費(fèi)時(shí)間的。此外，異體骨髓移植往往伴隨顯著的移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)病率。在許多情況下，接受造血干細(xì)胞移植的患者患有危及生命的晚期癌癥或其他代謝性疾病。因此，尋找具有適當(dāng)匹配的HLA組織類型的捐獻(xiàn)者的任何延誤都可能有危及患者的結(jié)果，往往造成死亡。因此，最近NMDP無關(guān)系的捐獻(xiàn)者移植的數(shù)量顯著增長(zhǎng)，僅2009年有4800多例，相比之下2008年有4，300例。此外，使用無關(guān)系的捐獻(xiàn)者或臍帶血單元的異體移植的比例穩(wěn)步提高。在2006年，全球范圍內(nèi)進(jìn)行的超過三分之一的異體移植使用的是無關(guān)系的捐獻(xiàn)者。2009年，75%的成年捐獻(xiàn)者——超過2，800人——通過NMDP向患者捐獻(xiàn)外周血干細(xì)胞。2009年，NMDP促成了 1，056例臍帶血移植，這占2009年NMDP移植總數(shù)的22%。這與2008年相比增長(zhǎng)18%，2008年NMDP促成898例臍血移植。已經(jīng)使用臍帶血進(jìn)行了異體造血干細(xì)胞移植，因?yàn)檠焊菀椎玫剑邮苷呋家浦参锟顾拗鞑〉娘L(fēng)險(xiǎn)較低， 對(duì)于捐獻(xiàn)者是無痛的，并且捐獻(xiàn)者和接受者之間的HLA組織類型匹配要求更低。然而，發(fā)現(xiàn)利用人類臍帶血移植存在幾個(gè)缺點(diǎn)，包括臍帶血移植的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞可能不能植入的風(fēng)險(xiǎn)。使用臍帶血移植的另一個(gè)缺點(diǎn)是，臍帶血細(xì)胞植入患者需要更長(zhǎng)的時(shí)間，將患者置于感染的高風(fēng)險(xiǎn)中。此外，臍帶血移植是較新的治療方法。因此，臨床醫(yī)生不傾向于使用它們，因?yàn)樗麄儾荒塬@得與做骨髓移植一樣多的關(guān)于臍血移植后患者的長(zhǎng)期結(jié)果的信息。此外，臍帶血移植也具有與骨髓和外周血移植全部相同的風(fēng)險(xiǎn)。 此外，使用臍帶血作為細(xì)胞源用于人血移植的重大障礙是，在單個(gè)單位的臍帶血中常常沒有對(duì)于患者的個(gè)頭而言足夠的或足以治療特定適應(yīng)癥的造血細(xì)胞。因?yàn)閱蝹€(gè)臍帶的大小(即，單個(gè)臍帶中造血細(xì)胞的數(shù)目)往往不足以血液移植，可能需要兩個(gè)臍帶，這增加了 GVHD和植入失敗的風(fēng)險(xiǎn)。因此，已經(jīng)嘗試許多方法以在離體環(huán)境中擴(kuò)增分離的移植物中臍帶血中的人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的數(shù)量，這允許使用單個(gè)臍帶移植，但這些努力鮮有成功。因此，沒有實(shí)現(xiàn)修復(fù)或再生的造血干細(xì)胞治療的承諾，在某種程度上是由于有前途的動(dòng)物模型方案向人臨床實(shí)踐轉(zhuǎn)換的困難，現(xiàn)有的臨床治療方案的低功效，并發(fā)癥(如移植物抗宿主病)的高發(fā)生率,和相對(duì)較少的充分匹配的捐獻(xiàn)者。因此，現(xiàn)有技術(shù)需要可以提高造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞向骨髓中植入的功效的方法，從而擴(kuò)大造血干細(xì)胞移植的適用性和增加造血干細(xì)胞移植的成功。本發(fā)明提供了這些問題的解決方案，并進(jìn)一步提供對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的其他的用途和優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了改進(jìn)的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞移植方法。此外，本發(fā)明提供了具有增加的植入/植入潛力和/或增加的增殖的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的優(yōu)良制劑。在多個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在體內(nèi)增殖或擴(kuò)增。在多個(gè)其它實(shí)施方案中，將細(xì)胞離體處理，給予個(gè)體并在體內(nèi)增殖或擴(kuò)增。 在一方面，本發(fā)明提供了含有細(xì)胞群體的治療組合物，所述細(xì)胞群體包含至少約一百萬個(gè)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中:a)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已經(jīng)在約37° C的溫度下與增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑離體接觸；b)與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約2倍；并且c)其中所述治療組合物包括準(zhǔn)備好向患者給藥的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療上可接受的無菌懸浮液。在具體實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述治療組合物的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍。在一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含CD34+細(xì)胞集合，其中與非接觸的CD34+細(xì)胞集合相比，所述⑶34+細(xì)胞集合中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍。在另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加約3倍至約8倍。在治療組合物的另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約4倍。在治療組合物的另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約6倍。在治療組合物的另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約7倍。
在治療組合物的另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約8倍。在治療組合物的另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約10倍。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約12倍。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相t匕，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約16倍。在一些實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，構(gòu)成治療組合物的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加約8倍至約18倍。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑選自:cAMP增強(qiáng)劑，Ga-s激活劑，和選擇性地結(jié)合PGE2EP4受體的化合物。在具體實(shí)施方案中，所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑為PGE2,或者PGE2類似物或衍生物。在更具體的實(shí)施方案中，所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑為16，16- 二甲基PGE2。在本發(fā)明的治療組合物的一實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸至少約I小時(shí)的時(shí)間。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。在具體實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約2小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。在更具體的實(shí)施方案中，構(gòu)成治療組合物的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約2小時(shí)的時(shí)間。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，構(gòu)成治療組合物的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含基因表達(dá)標(biāo)簽，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍，其中所述標(biāo)簽基因選自:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4(DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。在更具體的實(shí)施方案中，至少兩個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述兩個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少5，10，15，或20倍。在更具體的實(shí)施方案中，每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍。在多個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成治療組合物的細(xì)胞群體包含少于約0.10%,0.50%, 1.0%，3%，5%，10%, 15%，20%,或30%的⑶34+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含至少約
0.01%并且不超過約50%的⑶34+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體不被離體增殖。在多個(gè)實(shí)施方案中，在護(hù)理點(diǎn)產(chǎn)生所述治療化合物并將其給予患者而無需培養(yǎng)所述細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，在將治療組合物給予患者的24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在將治療組合物給予患者的12小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在將組合物給予患者的6小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在輸注治療組合物當(dāng)天產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，所述治療組合物基本上不含所述試劑。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述治療組合物包含懸浮于5%人血清白蛋白和葡聚糖溶液中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述治療組合物包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的間充質(zhì)干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述治療組合物包含不超過約10%的間充質(zhì)干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述治療組合物包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的內(nèi)皮祖細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述治療組合物包含不超過約10%的內(nèi)皮祖細(xì)胞。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34陽性的細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的選自以下的細(xì)胞表面標(biāo)志物陽性的細(xì)胞:CD73，CD140B，CD14 和 VWF。在具體實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明的治療組合物的細(xì)胞群體包含CD34+細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%,或5%的CD14+/CD45-細(xì)胞。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含CD34+細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%,或5%的VWF+細(xì)胞。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含⑶34+細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%，15%, 10%,或 5% 的 CD140B.細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含⑶34+造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞并且包含少于約 30%，25%, 20%, 15%, 10%,或 5% 的 CD14+/CD45-細(xì)胞，VWF+ 細(xì)胞，CD73+ 細(xì)胞和 CD140B+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34陽性的并且是選自以下的至少一種細(xì)胞表面標(biāo)志物陰性的:⑶14，VffF,⑶73和⑶140B。在其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是細(xì)胞表面標(biāo)志物⑶34陽性的并且是細(xì)胞表面標(biāo)志物⑶14，VWF，⑶73和⑶140B陰性的。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體中至少約15%的細(xì)胞表達(dá)CXCR4蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血，或動(dòng)員的外周血。在具體實(shí)施 方案中，所述細(xì)胞群體是HLA單體分型的。在更具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是基于由HLA-A，HLA-B7HLA-C,和HLA-DRBl組成的組進(jìn)行HLA單體分型的。在一些實(shí)施方案中，所述HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體匹配。在一些實(shí)施方案中，所述HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體具有4/6個(gè)HLA匹配。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有細(xì)胞群體的治療組合物，所述細(xì)胞群體包含至少約一百萬個(gè)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中:a)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已經(jīng)在約37° C的溫度下與16，16-dmPGE2離體接觸約2小時(shí)的時(shí)間；b)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含⑶34+細(xì)胞集合，其中與非接觸的⑶34+細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述⑶34+細(xì)胞集合中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍；并且c)其中所述治療組合物包括準(zhǔn)備好向患者給藥的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療上可接受的無菌懸浮液。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含⑶34+細(xì)胞集合，其中與非接觸的⑶34+細(xì)胞集合相比，所述⑶34+細(xì)胞集合中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍。在多個(gè)實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加約3倍至約8倍。在更具體的實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約4倍。在其他具體的實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相t匕，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約6倍。在其他具體的實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約7倍。在其他實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約8倍。在其他實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約10倍。在其他實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相t匕，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約12倍。在其他實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約16倍。在其他實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加約8倍至約18倍。在一些實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含基因表達(dá)標(biāo)簽，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍，其中所述標(biāo)簽基因選自:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4(DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。在其他實(shí)施方案中，至少兩個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述兩個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)相比增加至少5，10，15，或20倍。在具體的實(shí)施方案中，每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍。在其他實(shí)施方案，所述細(xì)胞群體不包含多于約0.10%,0.50%, 1.0%，3%，5%，10%，15%，20%,或30%的⑶34+細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含至少約0.01%并且不超過約50%的⑶34+細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體不被離體增殖。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血，或動(dòng)員的外周血。

在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是HLA單體分型的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有單體分型的細(xì)胞群體的治療組合物，所述細(xì)胞群體包含至少約一百萬個(gè)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中:a)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已經(jīng)在約37° C的溫度下與增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑離體接觸；b)與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約2倍；并且c)其中所述治療組合物包括準(zhǔn)備好向患者給藥的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療上可接受的無菌懸浮液。在具體的實(shí)施方案中，所述單體分型的細(xì)胞群體是基于由HLA-A，HLA-B,HLA-CJPHLA-DRBl組成的組進(jìn)行單體分型的。在更具體的實(shí)施方案中，所述單體分型的細(xì)胞群體是基于由HLA-DRB3/4/5，HLA-DQBl，和DPBl組成的組進(jìn)行單體分型的。在一些實(shí)施方案中，所述單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體匹配。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體具有4/6個(gè)HLA匹配。在一些實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍。在具體實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加約3倍至約8倍。在其他具體的實(shí)施方案中，與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約4倍。在具體實(shí)施方案中，所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑選自:cAMP類似物或增強(qiáng)劑，Ga-s激活劑，和選擇性地結(jié)合PGE2EP4受體的化合物。在更具體的實(shí)施方案中，所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑為16，16-二甲基PGE2。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含基因表達(dá)標(biāo)簽，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍，其中所述標(biāo)簽基因選自:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。在具體實(shí)施方案中，至少兩個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述兩個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少5，10，15，或20倍。在其他實(shí)施方案中，每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍。在其他實(shí)施方案中，每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì) 胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約4倍。在其他實(shí)施方案中，每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約6倍。在其他實(shí)施方案，所述細(xì)胞群體包含少于約0.10%, 0.50%, 1.0%, 3%，5%，10%, 15%，20%,或 30% 的 CD34.細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含至少約0.01%并且不超過約50%的CD34+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群體不被離體增殖。在其他實(shí)施方案中，在護(hù)理點(diǎn)產(chǎn)生所述治療化合物并將其給予患者而無需培養(yǎng)所述細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，在將治療組合物給予患者之前少于約24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在將治療組合物給予患者之前少于約12小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在將治療組合物給予患者之前少于約6小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，在輸注治療組合物當(dāng)天產(chǎn)生所述組合物。在其他實(shí)施方案中，構(gòu)成所述治療組合物的細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血，或動(dòng)員的外周血。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到制備用于造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植的治療組合物的方法，其包括:在足以改變?cè)煅杉?xì)胞或祖細(xì)胞的基因表達(dá)的條件下，在約37°C的溫度下離體或體外接觸包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體，以得到包含基因表達(dá)標(biāo)簽的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述基因表達(dá)標(biāo)簽包括與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比表達(dá)增加的一個(gè)或多個(gè)以下基因:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，F(xiàn)os相關(guān)抗原2 (F0SL2)，或CXC趨化因子受體4(CXCR4)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在個(gè)體中植入的方法，其包括:在約37°C的溫度下使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體接觸=PGE2和具有dmPGE2活性的試劑；洗滌所述細(xì)胞群體，以基本上除去所述試劑；和將所述接觸的細(xì)胞群體給予個(gè)體；其中與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相t匕，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述個(gè)體中的植入的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到治療需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體的方法，其包括:選擇需要造血重建的個(gè)體；在約37° C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體接觸=PGE2和具有dmPGE2活性的試劑；洗滌所述細(xì)胞群體以基本上除去試劑；和將所述接觸的細(xì)胞群體給予所述個(gè)體；其中與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述個(gè)體中植入的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸，從而治療所述需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到治療需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體的方法，其包括:選擇需要造血重建的個(gè)體；在約37° C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑接觸:前列腺素E2 (PGE2)或具有dmPGE2活性的試劑；洗滌所述細(xì)胞群體以基本上除去試劑；和將所述接觸的細(xì)胞群體給予所述個(gè)體；其中與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述個(gè)體中植入的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸，從而治療所述需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到制備用于增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的細(xì)胞群體的方法，包括:在約37° C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體或體外接觸:前列腺素E2 (PGE2)或具有ClmPGE2活性的試劑；其中與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸。在本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血，或動(dòng)員的外周血。 在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方案中，具有dmPGE2活性的試劑為dmPGE2，cAMP類似物或增強(qiáng)劑或者Ga-S激活劑。在某些實(shí)施方案中，所述試劑為PGE2或其類似物。在某些具體實(shí)施方案中，PGE2類似物為16，16- 二甲基PGE2。在其他具體實(shí)施方案中，所述試劑是cAMP增強(qiáng)劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，足以改變所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的基因表達(dá)，增加所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的植入或植入潛力，或者增加所述接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的增殖的條件包括:使所述細(xì)胞群體與所述一種或多種試劑接觸約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間，其中至少一種所述試劑包括增強(qiáng)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中PGE2R2或PGE2R4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑。在某些實(shí)施方案中，使所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞與濃度為約10 μ M的所述增加所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中PGE2R2或PGE2R4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑在約37° C的溫度下接觸約2小時(shí)的時(shí)間。在其他實(shí)施方案中，使所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體與約10 μ M或更高濃度的16，16- 二甲基PGE2接觸，并持續(xù)約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
在其他實(shí)施方案中，使所述細(xì)胞群體與濃度為約ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2接觸，并持續(xù)約2小時(shí)的時(shí)間。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體中的所述接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的植入潛力的增加包括:與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比，一個(gè)或多個(gè)以下基因的基因表達(dá)的增加:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型^-1(0)1^1)，？08相關(guān)抗原2$(^2)，或0乂(:趨化因子受體4似0 4);與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比，自我更新能力的增加；以及與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比，細(xì)胞活力沒有顯著的下降。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在不含內(nèi)毒素的容器中制備所述包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體，所述容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述溫度指示裝置包括至少一個(gè)產(chǎn)生指示容器溫度的信號(hào)的溫度指示器，所述經(jīng)過時(shí)間指示裝置包括至少一個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器；并且其中所述容器適于細(xì)胞貯存，細(xì)胞處理，細(xì)胞洗滌，和細(xì)胞輸注。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，包括本發(fā)明的制備用于造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植的細(xì)胞群體、和制備用于增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞增殖的細(xì)胞群體的那些方法在內(nèi)，將所述接觸的細(xì)胞群體給予有需要的個(gè)體，例如需要細(xì)胞治療的個(gè)體；并且本發(fā)明的方法還包括將所述接觸的細(xì)胞群體給予有需要的個(gè)體。在某些具體實(shí)施方案中，所述個(gè)體患有急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，青少年髓單核細(xì)胞白血病，霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，重度再生障礙性貧血,范可尼(Fanconi’s)貧血，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)，純紅細(xì)胞再生障礙，巨核細(xì)胞缺乏/先天性血小板減少癥，嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)，維斯科特-奧爾德里奇(Wiskott-Aldrich)綜合征,重度β _地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病，赫爾勒(Hurler’s)綜合征，腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓發(fā)育不良，難治性貧血，慢性髓單核細(xì)胞白血病，病因不明的髓樣化生，家族性噬紅細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥，實(shí)體瘤，慢性肉芽腫病，黏多糖癥，或戴-布二氏貧血。在某些其他具體實(shí)施方案中，所述個(gè)體患有乳腺癌，卵巢癌，腦癌，前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，皮膚癌，肝癌，胰腺癌，或肉瘤。在其他某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體經(jīng)歷了骨髓清除性或非清髓性化療或放射治療。在其他實(shí)施方案中，所述個(gè)體是骨髓捐獻(xiàn)者。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包括一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。在某些實(shí)施方案中，給予所述個(gè)體一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。在其他實(shí)施方案中，給予所述個(gè)體部分臍帶血單位。在其他具體實(shí)施方案中，給予所述個(gè)體一個(gè)臍帶血單位。在其他實(shí)施方案中，所述包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體是所述個(gè)體自體的。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是從所述個(gè)體的外周血或骨髓動(dòng)員的。

在其他實(shí)施方案中，所述包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體是所述個(gè)體異體的。
附圖簡(jiǎn)述附圖簡(jiǎn)述

圖1示出了造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中存在的前列腺素E2受體2/受體4G蛋白偶聯(lián)受體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的圖示。圖2示出了分析在不同的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定下，用16，16-二甲基PGE2處理的純化的CD34+細(xì)胞群或人臍帶血的分析的實(shí)驗(yàn)流程圖。圖3示出了在不同的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定下，用16，16-二甲基PGE2處理的⑶34+細(xì)胞的cAMP測(cè)定結(jié)果。圖4示出了用媒介物處理的⑶34+細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為X軸對(duì)用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理的⑶34+細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為y-軸的散點(diǎn)圖。注意的是，與媒介物處理的細(xì)胞相比，10 μ Μ16, 16- 二甲基PGE2處理的⑶34+細(xì)胞中CREM表達(dá)增加8倍，并且CXCR4表達(dá)增加18倍。圖5示出了對(duì)用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理的⑶34+細(xì)胞的基因表達(dá)的處理時(shí)間的分析的流程圖。圖6示出了處理時(shí)間為5，15，30，60和120分鐘的用10 μ M的16，16-二甲基PGE2處理的CD34+細(xì)胞(y-軸)對(duì)媒介物處理的細(xì)胞(X-軸)的基因表達(dá)譜。在120分鐘的孵
育期后獲得基因表達(dá)譜。圖7 示出了在 37。C用100nM，lμM，10μM或100μM的16，16-二甲基PGE2處理120分鐘的⑶34+細(xì)胞(y-軸)對(duì)媒介物處理的細(xì)胞(X-軸)的基因表達(dá)譜。圖8示出了在 37。C用100nM，lμM，10μM，25μM或50μM的16，16-二甲基PGE2處理120分鐘的從臍帶血純化的CD34+細(xì)胞(y-軸)對(duì)媒介物處理的細(xì)胞`(x_軸)的基因
表達(dá)譜。圖9示出在37° C(左圖)或4° C(右上圖)或25° C(右下圖)用ΙΟμΜ的16，16- 二甲基PGE2處理60分鐘(上圖)或120分鐘(下圖)的⑶34+細(xì)胞(y-軸)對(duì)媒介物處理的細(xì)胞(X-軸)的基因表達(dá)譜。圖10示出與用媒介物處理的細(xì)胞或用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2在4° C處理120分鐘的細(xì)胞相比，用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2在37° C孵育120分鐘的CD34+細(xì)胞并未降低細(xì)胞活力。圖11示出與用媒介物處理的細(xì)胞或用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2在4° C處理120分鐘的細(xì)胞相比，用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2在37° C孵育120分鐘的⑶34+細(xì)胞并未降低形成集落形成單位的能力。粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)，紅系集落形成單位(CFU-E);爆式紅系集落形成單位(BFU-E)，多系混合集落形成單位(CFU-GM/M/Eosi)。圖12示出了使用用16，16-二甲基PGE2處理的的人臍帶血的臨床試驗(yàn)的示意圖。圖13顯示了 16，16-二甲基PGE2處理方案的全基因組表達(dá)分析。圖13Α示出在4° C處理I小時(shí)的細(xì)胞中的基因表達(dá)。用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理的細(xì)胞(y軸；N=3)與DMSO對(duì)照(N=3)相比。圖13B表示在37° C處理2小時(shí)的細(xì)胞中的基因表達(dá)。用10 μ M的16，16- 二甲基PGE2處理的細(xì)胞(y軸；N=3)與DMSO對(duì)照(N=3)相比。圖14示出了使用Fluidigm基因表達(dá)平臺(tái)對(duì)用10 μ M的16，16-二甲基PGE2在37° C下孵育處理的細(xì)胞進(jìn)行的基因表達(dá)分析驗(yàn)證研究。圖14A示出了與媒介物處理的對(duì)照相比，用 ΙΟμΜ 的 16，16-二甲基 PGE2 在 37° C 處理 0，20，40，60，80，120，180 和 240 分鐘的⑶34+細(xì)胞中一組選擇的基因的基因表達(dá)。圖14Β示出了與媒介物處理的對(duì)照相比，用ΙΟμΜ 的 16，16- 二甲基 PGE2 在 37。C 處理 0，20，40，60，80，120，180 和 240 分鐘的 CD34.細(xì)胞中表3中列出的標(biāo)簽基因的平均基因表達(dá)。以下基因表現(xiàn)不佳且在確定圖14Β所示的平均基因表達(dá)中被排除:ARPC2，CXCL5, CXCL6, FGF9, GNAL,⑶LP1，LRIG2, PDE4D, PLAT(I)， 1^1'(2)，55了1 1，5￥了4和了10:3。以下管家基因用于標(biāo)準(zhǔn)化確定圖B中所示的平均基因表達(dá):ACTB, GAPDH, HPTRl和QARS。圖14C示出了與媒介物處理的對(duì)照相比，用10 μ M的16，16- 二甲基PGE2在37。C處理0，20，40，60，80，120，180和240分鐘的CD34.細(xì)胞中CXCR4的平均基因表達(dá)。圖14的所有基因表達(dá)譜是在處理細(xì)胞特定的時(shí)間并且在處理后不再孵育細(xì)胞后獲得。圖15示出了用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2足以驅(qū)動(dòng)完整的生物效應(yīng)的脈沖處理進(jìn)行處理的細(xì)胞或DMSO處理的細(xì)胞。用10 μ M的16，16- 二甲基PGE2的孵育⑶34+細(xì)胞所示的不同時(shí)間(0，20，40，80和120分鐘)，然后是在37° C無16，16-二甲基PGE2的恢復(fù)期，使得總孵育期為120分鐘。使用Fluidigm基因表達(dá)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖15Α和15Β示出了與媒介物處理的對(duì)照相比，用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO在37° C處理5，15，30，60和120分鐘的⑶34+細(xì)胞中表3中列出的標(biāo)簽基因的平均基因表達(dá)。以下基因表現(xiàn)不佳，且在確定圖15Β中所示的平均基因表達(dá)中被排除:?、铅?，CCNDI, CREB5,⑶LP1，MPPE1,PDE3B, PTGER2, RGS2和YPEL4。以下管家基因用于標(biāo)準(zhǔn)化確定圖15Β中所示的平均基因表達(dá):ACTB，ARPC2，GAPDG, HPRTl，LRIG2和QARS?；虮磉_(dá)譜是在120分鐘的孵育期后獲得。圖16使用Fluidigm基因表達(dá)平臺(tái)示出了 16，16-二甲基PGE2濃度或用DMSO處理對(duì)基因表達(dá)的影響。圖16A和16B示出了與媒介物處理的對(duì)照相比，用0，0.1，1，10，50和ΙΟΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO在37。C處理120分鐘的⑶34+細(xì)胞中表3中列出的標(biāo)簽基因的平均基因表達(dá)。以下基因表現(xiàn)不佳，且在確定圖16Β中所示的平均基因表達(dá)中被排除:ACDY7, CCNDI，CREB5, GULP I, FGFRl，F(xiàn)LJ27352, MPPEI，PDE4D, PTGER2, PDG3B 和YPEL4。以下管家基因用于標(biāo)準(zhǔn)化確定圖168中所示的平均基因表達(dá)40^^1 ^2，64 0!1，HPRTI，LRIG2 和 QARS。圖17示出了與DMSO處理的細(xì)胞相比，在37° C下用10 μ M的16，16-二甲基PGE2處理2小時(shí)的細(xì)胞的基因表達(dá)分析。圖17Α顯示了與DMSO處理的臍帶血細(xì)胞相比，在37° C下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理2小時(shí)的全臍帶血細(xì)胞的全基因組表達(dá)分析。圖17Β顯示了與DMSO處理的Lin(+)CD34+細(xì)胞相比，在37° C下用10 μ M的16，16-二甲基PGE2處理2小時(shí)的Lin+⑶34+細(xì)胞的全基因組表達(dá)分析。圖17C顯示了與DMSO處理的Lin(-)CD34+CD38+細(xì)胞相比，在37° C下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理2小時(shí)的Lin(-)⑶34+CD38+細(xì)胞的全基因組表達(dá)分析。圖17D顯示了與DMSO處理的Lin (-)⑶34+⑶38TD90+細(xì)胞相比，在37° C下用10 μ M的16，16-二甲基PGE2處理2小時(shí)的Lin(-)CD34+CD38TD90+細(xì)胞的全基因組表達(dá)分析。圖18示出了在不同的溫度下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理不同時(shí)間長(zhǎng)度的細(xì)胞中CXCR4表達(dá)。 圖18Α顯不了在該系列實(shí)驗(yàn)中比較的實(shí)驗(yàn)條件。圖18Β顯不了在4° C下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO處理I小時(shí)的細(xì)胞和在37。C下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO處理2小時(shí)的細(xì)胞，在處理后1、6和24小時(shí)時(shí)CXCR4細(xì)胞表面表達(dá)。圖18C顯示了在4° C下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2 *DMS0處理I小時(shí)的細(xì)胞和在37° C下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO處理2小時(shí)的細(xì)胞，在處理后1、6和24小時(shí)時(shí)在細(xì)胞表面表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的百分比。圖19示出了在指定的時(shí)間和溫度下用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2處理的⑶34+細(xì)胞的活力和增殖分析。然后使用體內(nèi)CFU-S測(cè)定分析處理的細(xì)胞。圖19Α顯示了 37° C孵育增加造血祖細(xì)胞的數(shù)目。圖19Β顯示了在4° C、25° C和37° C下用不同濃度的16，16-二甲基PGE2孵育120分鐘的人全臍帶血細(xì)胞的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)。圖19C顯示了在4° C和37° C下用不同濃度的16，16-二甲基PGE2孵育120分鐘的人⑶34+細(xì)胞的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)。圖19D顯示了與在4° C用DMSO或用dmPGE2處理的⑶34+細(xì)胞相比，在37° C下用dmPGE2孵育120分鐘的⑶34+細(xì)胞中增加CFU-C集落形成。圖20示出了體外趨化功能測(cè)定的實(shí)驗(yàn)流程圖。用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO對(duì)照處理CD34+細(xì)胞4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到遷移孔，在0-50ng/ml SDFla存在下測(cè)定4小時(shí)。圖21示出了體外趨化功能測(cè)定的代表性數(shù)據(jù)。用ΙΟμΜ的16，16-二甲基PGE2或DMSO對(duì)照處理CD34+細(xì)胞4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到遷移孔，在0-50ng/ml SDFla存在下測(cè)定4小時(shí)。圖22A 顯示了在 4° C、25° C 或 37° C 下用 10 μ M 的 16，16-二甲基 PGE2 處理120分鐘的⑶34+細(xì)胞(y-軸)對(duì)媒介物處理的細(xì)胞(X-軸)的全基因組表達(dá)分析。圖22B提供了來自圖22A所示的表達(dá)分析的細(xì)胞中標(biāo)簽基因亞組的平均倍數(shù)變化。圖23A示出了在37。C下用10 μ M的dmPGE2或毛喉素處理120分鐘的⑶34+細(xì)胞(y-軸)對(duì)媒介物處理的細(xì)胞(X-軸)的全基因組表達(dá)分析。圖23B(上圖)顯示了圖23A所示用dmPGE2或毛喉素處理的細(xì)胞中標(biāo)簽基因亞組的平均倍數(shù)變化。圖23B(下圖)顯示了通過FluidigmqPCR測(cè)定在37° C用ImM dbcAMP處理120分鐘或用dmPGE2處理120分鐘的⑶34+細(xì)胞中標(biāo)簽基因亞組的平均倍數(shù)變化。圖24示出了使用本發(fā)明的治療組合物在小鼠中進(jìn)行造血細(xì)胞移植的示例性策略。發(fā)明詳述A.導(dǎo)言本發(fā)明提供治療組合物和方法以改進(jìn)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞植入的功效，并解決了在再生細(xì)胞療法這一領(lǐng)域中醫(yī)療行業(yè)所面臨的多層面挑戰(zhàn)。本發(fā)明人分析了用改變?cè)煅杉?xì)胞和祖細(xì)胞的基因表達(dá)的試劑(包括刺激前列腺素通路和上調(diào)CXCR4的基因及細(xì)胞表面表達(dá)的試劑)處理的所述細(xì)胞群體的幾個(gè)生物參數(shù)，從而開發(fā)提高用于干細(xì)胞移植的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的功效的方法。細(xì)胞群體在植入后重建個(gè)體的造血系統(tǒng)中的有效性取決于諸如細(xì)胞群體歸巢并植入骨髓的能力， 自我更新的能力，和體內(nèi)增殖的能力等性質(zhì)。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞群體的方法，以改進(jìn)這樣的細(xì)胞特性，并在造血重建中提供所產(chǎn)生的治療改進(jìn)。具體而言，本發(fā)明提供了包含增強(qiáng)的人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的治療組合物，以及制備所述增強(qiáng)的治療組合物的方法和在干細(xì)胞移植中使用該增強(qiáng)的治療組合物的方法。本發(fā)明的治療組合物包含人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體，所述細(xì)胞群體已被離體改變，以在移植療法中使用所述細(xì)胞群體之前增強(qiáng)所述細(xì)胞群體的治療性質(zhì)。治療組合物經(jīng)改變的細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的歸巢并植入骨髓的能力，并且還具有改進(jìn)的細(xì)胞活力和自我更新能力。治療組合物的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的治療性質(zhì)包括細(xì)胞的植入和歸巢能力，該性質(zhì)由用改變細(xì)胞中被認(rèn)為與細(xì)胞歸巢和植入有關(guān)的基因(包括CXCR4)的表達(dá)的試劑離體處理所述細(xì)胞群體的方法所增加。因此，本發(fā)明的方法準(zhǔn)備了包含所述細(xì)胞的治療組合物，以實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞移植后的最佳有益治療效果。在本發(fā)明的方法中，在生理相關(guān)溫度下用所述試劑離體處理所述治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，使得與細(xì)胞的有益生物特性(如細(xì)胞群體的歸巢，植入和體內(nèi)擴(kuò)增)相關(guān)基因的表達(dá)增加。包含增強(qiáng)的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療組合物在下面描述的實(shí)施例中被證明在歸巢，植入，和增殖中具有優(yōu)勢(shì)。因此，所述治療組合物提供了改進(jìn)包括收獲的血細(xì)胞和(為清楚起見)臍帶血在內(nèi)的血細(xì)胞的植入潛力的方法，以及增加移植的造血干細(xì)胞的歸巢，活力和自我更新的方法。此外，本發(fā)明提供體內(nèi)擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法。在本發(fā)明中所述的治療組合物和方法可以允許在臍帶血移植中使用部分或單個(gè)臍帶血單位。目前的移植前操作造血干細(xì)胞的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)需要將溫度嚴(yán)格地控制在4°C，以最大化細(xì)胞活力和移植后的成功植入。本發(fā)明證明，在被認(rèn)為與降低細(xì)胞活力和減少試劑半衰期的條件(如在37° C下操作細(xì)胞兩小時(shí))下，刺激造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的前列腺素細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，意外地導(dǎo)致細(xì)胞歸巢至骨髓的能力增加，自我更新增加，和干細(xì)胞/祖細(xì)胞的植入潛力增加，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生不利影響。更具體地說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，需要將造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在生理相關(guān)溫度(如體溫)下長(zhǎng)時(shí)間暴露(至少一小時(shí))于發(fā)揮PGE2活性的處理試劑，以實(shí)現(xiàn)完整的生物效應(yīng)。值得注意的是，在生理相關(guān)溫度下短時(shí)間處理造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞導(dǎo)致cAMP產(chǎn)生增加，但意外地，不會(huì)導(dǎo)致被認(rèn)為與細(xì)胞歸巢和植入有關(guān)的基因的表達(dá)增加。需要在生理相關(guān)溫度下較長(zhǎng)的細(xì)胞處理時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的基因表達(dá)，并且本發(fā)明證明，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)所期望的增加細(xì)胞歸巢和植入的生物效應(yīng)是必要的。不希望受任何具體的理論限制，本文所述的方法導(dǎo)致增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在被給予個(gè)體后的增殖和植入潛力。前列腺素E2 (PGE2)通過作用于不同細(xì)胞類型上的多種不同的前列腺素受體，激活各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括但不限于，PI3激酶(PI3-K或PI3K)通路，從而發(fā)揮其功能。這些前列腺素受體代表被稱為G-蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)的細(xì)胞表面七跨膜受體的亞家族。有四種亞型的前列腺素E2受體=PGE2R1, PGE2R2, PGE2R3和PGE2R4。當(dāng)被適當(dāng)?shù)呐潴w或激動(dòng)劑(如前列腺素或其類似物，例如，PGE2R2或PGE2R4激動(dòng)劑)激活時(shí)，這些前列腺素受體會(huì)啟動(dòng)多種下游生物學(xué)功能。例如，對(duì)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激/激活，部分地與腺苷酸環(huán)化酶的G蛋白a -S (G a -S或G a -s)的激活和刺激相偶聯(lián)。腺苷酸環(huán)化酶的激活催化ATP向cAMP轉(zhuǎn)化。第二信使cAMP的濃度增加，會(huì)導(dǎo)致激活環(huán)核苷酸門控離子通道，由cAMP激活的諸如RAPGEF3的交換蛋白。GPCR與其最終的分子靶標(biāo)之間通過cAMP依賴通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性，可以通過包括GPCR，腺苷酰環(huán)化酶，和效應(yīng)蛋白的多蛋白復(fù)合物的形成而實(shí)現(xiàn)。
如上所述，環(huán)AMP激活蛋白激酶A (PKA，也稱為cAMP依賴性蛋白激酶)。PKA通常沒有活性，為四聚體全酶形式，由2個(gè)催化單元和2個(gè)調(diào)節(jié)單元(C2R2)組成，調(diào)節(jié)單元封閉催化單元的催化中心。環(huán)AMP結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)單元的特定位置，使調(diào)節(jié)亞基和催化亞基解離，從而激活催化單元，使得它們能夠磷酸化底物蛋白。不是所有蛋白磷酸酶都應(yīng)答cAMP，因?yàn)橛袔追N類型的蛋白激酶不是cAMP依賴性的，包括例如蛋白激酶C。PKA活性亞基可以催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物的特定絲氨酸或蘇氨酸殘基。磷酸化的蛋白激酶可以直接對(duì)細(xì)胞中的離子通道起作用，或可以激活或抑制其它酶。PKA還磷酸化結(jié)合DNA的啟動(dòng)子區(qū)域的特定蛋白，導(dǎo)致特定基因的表達(dá)增加。更下游的效應(yīng)依賴于PKA的各種作用，這可能根據(jù)細(xì)胞類型而不同。比如，激活的PKA可以磷酸化許多其它的蛋白質(zhì)，包括，例如，將糖原轉(zhuǎn)化成葡萄糖的蛋白質(zhì)，促進(jìn)心臟中肌肉收縮導(dǎo)致心率增加的蛋白，和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。因此，對(duì)PGE2R2和PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的刺激可能會(huì)導(dǎo)致增加轉(zhuǎn)錄因子激活，所述轉(zhuǎn)錄因子如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和CREB靶基因，例如，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)(見圖1)。給予具有增加的cAMP的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以維持造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞活力，增加歸巢，提高自我更新，并提供移植的細(xì)胞群體增加的體內(nèi)植入和增加的體內(nèi)增殖。對(duì)PGE2R2和PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激/激活也與糖原合成酶激酶_3 (GSK-3)的磷酸化增加和連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加相關(guān)(Hull etal.，2004; Regan, 2003)，這二者均指示W(wǎng)nt通路的激活。Wnt通路的PGE2刺激可以通過來自干細(xì)胞小生境(niche)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞本身內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)積極地增強(qiáng)造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞擴(kuò)增和自我更新(Northetal.，447(7147)Naturel007-ll (2007))。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中Wnt通路的激活也可以導(dǎo)致細(xì)胞群體體內(nèi)增殖的增加。PGE2R4刺激也已經(jīng)被證明會(huì)激活PI3K通路，并且對(duì)于實(shí)現(xiàn)所期望的增加干細(xì)胞歸巢、擴(kuò)增、存活和植 入的生物效應(yīng)也是是重要的。對(duì)PGE2R2的和PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如PI3K通路)的刺激/激活也可能增加對(duì)干細(xì)胞歸巢和植入重要的基因的表達(dá)，所述基因例如CXC趨化因子受體4 (CXCR4)，選擇素，整合素。在本發(fā)現(xiàn)之前，在最大化細(xì)胞活力和處理化合物穩(wěn)定性的條件下，可以用被測(cè)化合物完全飽和EP受體的認(rèn)識(shí)下，用化合物處理造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。根據(jù)造血干細(xì)胞移植的現(xiàn)行護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，與更高的溫度(例如25° C或37° C)和更長(zhǎng)的孵育期(例如2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)或更多小時(shí))相比，在4° C處理被認(rèn)為會(huì)提供改進(jìn)的經(jīng)處理細(xì)胞的細(xì)胞活力，并且預(yù)期增加被測(cè)化合物在該溫度下的半衰期。不希望被任何具體理論限制，本發(fā)明部分地考慮到通過在增加的溫度下用增加與歸巢和植入相關(guān)的基因的表達(dá)的試劑在延長(zhǎng)的孵育期處理造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，可以增加所述細(xì)胞的植入，細(xì)胞歸巢至骨髓的能力和細(xì)胞的自我更新，并保持細(xì)胞活力。相關(guān)試劑包括，例如前列腺素E2和具有dmPGE2活性的試劑(包括cAMP類似物和增強(qiáng)劑，和/或Ga-s激活劑)的改進(jìn)的組合。此外，本發(fā)明證明了給予在生理相關(guān)溫度(例如體溫或37° C)下用包括前列腺素E2和具有dmPGE2活性的試劑在內(nèi)的這類試劑在延長(zhǎng)的孵育期(即至少I小時(shí))處理的細(xì)胞，不僅導(dǎo)致增加的細(xì)胞植入，還導(dǎo)致造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體的體內(nèi)增殖。
因此，在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療組合物，所述人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑在約37° C的溫度下離體接觸。本發(fā)明還提供了制備用作用于造血重建的治療組合物的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法，其包括在最優(yōu)化造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的植入和增殖的條件下，使人造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞群體與能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑接觸，所述試劑例如刺激前列腺素通路的試劑。本文使用的冠詞“a”和“an”和“所述”指該冠詞的一個(gè)或多個(gè)(即至少一個(gè))語法對(duì)象。例如，“an element”指一個(gè)元件或多個(gè)元件。替代選擇(例如，“或/或者”)的使用應(yīng)被理解為替代選擇的一個(gè)、兩個(gè)或其任意組合。如本文所述的，術(shù)語“包括”和“包含”同義地使用。如本文所用，術(shù)語“約”或“大約”指與參考的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度相差多達(dá)15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度。在一實(shí)施方案中，術(shù)語“約”或“大約”指在一參考的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度上下±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、或 ±1% 的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重·量或長(zhǎng)度的范圍。在整個(gè)說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語“包含(comprise) ”、“包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”將被理解為意指包括陳述的步驟或元素,或者步驟或元素的組，但不排除任何其他的步驟或元素，或者步驟或元素的組。所用“由……組成”指包括且限于在詞組“由…組成”間列出的任何內(nèi)容。因此，詞組“由……組成”表明所列出的元素是必需的或強(qiáng)制的，并且不可以存在其他元素。所用“基本上由……組成”指包括在該詞組間列出的任何元素，并限于不妨礙或不促進(jìn)在所列元素的公開內(nèi)容中指明的活性或作用的其他元素。因此，詞組“基本上由……組成”表明所列元素是必需的或強(qiáng)制的，但其他元素是任選的，其他元素可以存在，也可以不存在，這取決于它們是否影響所列元素的活性或作用。整個(gè)本說明書中，在述及“一實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”時(shí)，是指與該實(shí)施方案有關(guān)的所描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或特性包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，在整個(gè)本說明書的多處中出現(xiàn)的措辭“在一實(shí)施方案中”或“在實(shí)施方案中”不必全部指同一實(shí)施方案。此外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，具體特征、結(jié)構(gòu)或特性可以以任何合適的方式組合。B.本發(fā)明的治療組合物本發(fā)明提供了包含懸浮于無菌的適合用于給予患者的治療可接受溶液中的人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的治療組合物。本發(fā)明的治療組合物包含人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的一種或多種試劑離體接觸，并且其中所述細(xì)胞通過基因表達(dá)標(biāo)簽表征，所述基因表達(dá)標(biāo)簽包括相對(duì)于非接觸的干細(xì)胞或祖細(xì)胞表達(dá)增加的CXCR4。造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以根據(jù)增加的基因和細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)水平而被表征。在本發(fā)明的治療組合物中，與非接觸的細(xì)胞中的CXCR4表達(dá)相比，造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的CXCR4的基因表達(dá)增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍或20倍。本發(fā)明的治療組合物還可以通過基因表達(dá)標(biāo)簽表征，其中與非接觸的細(xì)胞相比，選自以下的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。如本文所用，“非接觸的”細(xì)胞是未用除了對(duì)照試劑之外的試劑處理(例如培養(yǎng)、接觸或孵育)的細(xì)胞。與DMSO(對(duì)照試劑)接觸、或與其他媒介物(vehicle)接觸的細(xì)胞是非接觸的細(xì)胞。如本文所用的“標(biāo)簽基因”是指在表3中提供的標(biāo)簽基因集合中的任何基因。例如，標(biāo)簽基因包括透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，和Fos相關(guān)抗原2 (F0SL2)。為清晰起見，標(biāo)簽基因不包括管家基因。與非接觸的細(xì)胞相比，標(biāo)簽基因的表達(dá)可以增加2倍或更多倍，在具體實(shí)施方案中，增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍、15倍或20倍。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明的治療組合物的細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加。在具體實(shí)施方案中，與非接觸的細(xì)胞相比，至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍、15倍或20倍。在多個(gè)實(shí)施方案中，與非接觸的細(xì)胞相比，標(biāo)簽基因的表達(dá)可以增加至少6倍。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，CXCR4的基因表達(dá)增加至少約4倍，并且CREM的基因表達(dá)增加至少約10倍。構(gòu)成治療組合物的人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞也可以通過基因表達(dá)譜表征，其中所有標(biāo)簽基因的平均倍數(shù)變化為至少約2倍、4倍或6倍。在一些實(shí)施方案中，所有標(biāo)簽基因的平均倍數(shù)變化為至少約4。在一些實(shí)施方案中，所有標(biāo)簽基因的平均倍數(shù)變化為至少約6。在一些實(shí)施方案中，至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%或90%的標(biāo)簽基因的平均倍數(shù)變化為至少6倍。在一些實(shí)施方案中，至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%或90%的標(biāo)簽基因的平均倍數(shù)變化為至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在具體實(shí)施方案中，治療組合物可以通過基因表達(dá)譜表征，所述基因表達(dá)譜具有圖14(B)、圖15(B)或圖16(B)所示的所有標(biāo)簽基因的平均倍數(shù)變化。在用試劑處理構(gòu)成治療組合物的人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞之后，可以分析(即獲得)細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽；或者可以在處理后將細(xì)胞孵育一段時(shí)間，然后分析細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽。例如，可以用試劑離體處理細(xì)胞，洗滌細(xì)胞以除去試劑，并分析基因表達(dá)而無需進(jìn)一步孵育細(xì)胞。或者，在一些實(shí)施方案中，用試劑處理細(xì)胞，洗滌細(xì)胞以從細(xì)胞群體除去試劑，然后將細(xì)胞離體孵育一段時(shí)間，再分析細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，洗滌細(xì)胞以除去試劑，然后孵育I至6小時(shí)，再分析細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽。在一些實(shí)施方 案中，洗滌細(xì)胞，然后孵育至少約I小時(shí)，再分析細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，洗滌細(xì)胞，然后孵育約2小時(shí)，再分析細(xì)胞的基因表達(dá)標(biāo)簽。本文所用的“基因表達(dá)”是指生物樣品(例如本發(fā)明的治療組合物中的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞或者造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體)中的基因的相對(duì)表達(dá)水平和/或表達(dá)模式?？梢栽赾DNA、RNA、mRNA或其組合的水平上測(cè)量基因的表達(dá)?！盎虮磉_(dá)譜”或“基因表達(dá)標(biāo)簽”是指對(duì)同一樣品(即細(xì)胞群體)測(cè)量的多個(gè)不同基因的表達(dá)水平。本領(lǐng)域內(nèi)可用的用于檢測(cè)表征構(gòu)成本發(fā)明的治療組合物的細(xì)胞的基因表達(dá)的任何方法均包括在本文中。如本文所用，術(shù)語“檢測(cè)(……)表達(dá)”是指確定基因的RNA轉(zhuǎn)錄本或其表達(dá)產(chǎn)物的量或存在。用于檢測(cè)基因表達(dá)的方法，即基因表達(dá)繪圖，包括根據(jù)多核苷酸的雜交分析的方法，根據(jù)多核苷酸測(cè)序的方法，免疫組織化學(xué)方法和基于蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。這些方法通常檢測(cè)目的基因的表達(dá)產(chǎn)物(例如，mRNA)。在一些實(shí)施方案中，使用基于PCR的方法，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) (Weis et al.，TIG8:263-64，1992);和基于陣列的方法，例如微陣列(Schena et al.，Science270:467-70，1995)?！拔㈥嚵小笔侵冈诨迳嫌行蚺帕械目呻s交的陣列元件，例如多核苷酸探針。術(shù)語“探針”是指能夠與專門針對(duì)的靶生物分子選擇性結(jié)合的任何分子，所述生物分子例如內(nèi)源基因編碼的或與之對(duì)應(yīng)的核苷酸轉(zhuǎn)錄本或蛋白。探針可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員合成或來自于合適的生物制劑。探針可以被專門設(shè)計(jì)為被標(biāo)記的。可以用作探針的分子的實(shí)例包括，但不限于RNA、DNA、適體、蛋白、抗體和有機(jī)分子。RNA提取的常用方法是領(lǐng)域內(nèi)公知的，并公開于分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書中，包括 Ausubel 等人編輯的 Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))，John ffiley&Sons, New Yorkl987_1999。例如，在 Rupp and Locker (LabInvest.56:A67,1987)和 De Andres et al.(Biotechniquesl8:42-44，1995)中公開了從石蠟包被的組織提取RNA的方法。具體而言，可以使用來自商業(yè)制造商如Qiagen(Valencia, Calif.)的純化試劑盒、緩沖液系列和蛋白酶,根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行RNA分離。例如，可以使用Qiagen RNeasy微型柱從培養(yǎng)物中的細(xì)胞分離總RNA。其他可商購的RNA分離試劑盒包括MASTERPURE總DNA和RNA純化試劑盒(Epicentre, Madison, Wis.)和石臘包埋RNA分離試劑盒(Ambion, Austin, Tex.)。例如，可以使用RNA Stat-60 (Tel-Test, Friendswood, Tex.)從組織樣品分離總RNA。此外,可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法容易地處理大量組織樣品，所述技術(shù)例如Chomczynski的單步RNA分離方法(美國(guó)專利N0.4，843，155)。分離的R NA可以用在雜交或擴(kuò)增測(cè)定中，包括但不限于PCR分析和探針陣列。用于檢測(cè)RNA水平的一種方法涉及使分離的RNA與可以與由待檢測(cè)的基因編碼的mRNA雜交的核酸分子(探針)接觸。核酸探針可以是，例如全長(zhǎng)cDNA或其部分，例如長(zhǎng)度為至少7、
15、30、60、100、250或500個(gè)核苷酸并且在嚴(yán)格條件下足以與本發(fā)明的內(nèi)源基因特異性雜交的寡核苷酸，或任何衍生DNA或RNA。mRNA與探針的雜交表明探測(cè)的內(nèi)源基因被表達(dá)。在一實(shí)施方案中，mRNA被固定在固體表面上并與探針接觸，例如通過將分離的mRNA在瓊脂糖凝膠上電泳并將該mRNA從凝膠轉(zhuǎn)移到膜例如硝酸纖維素上。在其他實(shí)施方案中，探針被固定在固體表面上并且mRNA與探針接觸，例如在Agilent基因芯片陣列中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改變已知的mRNA檢測(cè)方法，用于檢測(cè)本發(fā)明的內(nèi)源基因的表達(dá)水平。確定樣品中的基因表達(dá)水平的其他方法涉及核酸擴(kuò)增的方法，例如通過 RT-PCR (美國(guó)專利 N0.4，683，202)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:189-93, 1991),自主序列復(fù)制(Guatelli et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874-78, 1990)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173-77，1989)，Q-β 復(fù)制酶(Lizardi et al.，Bio/Technology6:1197，1988)，滾環(huán)復(fù)制(美國(guó)專利N0.5，854，033)或任何其他核酸擴(kuò)增方法；然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子。如果核酸分子以非常低的數(shù)目存在，那么這些檢測(cè)方案特別有用于檢測(cè)這類分子。在本發(fā)明的具體方面，通過定量RT-PCR評(píng)估基因表達(dá)。多種不同的PCR或QPCR方案是本領(lǐng)域內(nèi)已知的并在下文列出，并且可以使用本申請(qǐng)描述的組合物直接應(yīng)用于或加以改變用于檢測(cè)和/或定量表3中列出的基因。通常，在PCR中，通過與至少一個(gè)寡核苷酸引物或一對(duì)寡核苷酸引物反應(yīng)擴(kuò)增靶多核苷酸序列。引物與靶核酸的互補(bǔ)區(qū)域雜交，并且DNA聚合酶延伸引物以擴(kuò)增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的條件下，一個(gè)大小的核酸片段占反應(yīng)產(chǎn)物(作為擴(kuò)增產(chǎn)物的靶多核苷酸序列)的支配地位。重復(fù)擴(kuò)增循環(huán)以增加單個(gè)靶多核苷酸序列的濃度?？梢栽谕ǔＳ糜赑CR的任何熱循環(huán)儀上進(jìn)行反應(yīng)。然而，優(yōu)選的是具有實(shí)時(shí)熒光測(cè)量能力的循環(huán)儀，例如SMARTCYCLER(&pheid，Sunnyvale, Calif.), ABI PRISM7700.(Applied BiosystemsjFoster City, Calif.), ROTOR-GENE(CorbettResearch, Sydney, Australia)，LIGHTCYCLER(Roche Diagnostics Corp, Indianapolis,Ind.),ICYCLER(Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)和 MX4000(Stratagene, LaJolla, Calif.)。在某些環(huán)境下定量PCR(QPCR)(也被稱為實(shí)時(shí)PCR)是優(yōu)選的，因?yàn)樗粌H提供定量測(cè)量，還縮短時(shí)間，減少污染。在某些實(shí)例中，全基因表達(dá)繪圖技術(shù)的可用性是受限的，因?yàn)樾枰迈r冷凍的組織和特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，這使得難以在臨床環(huán)境中常規(guī)地使用這類技術(shù)。如本文所用，“定量PCR(或“實(shí)時(shí)QPCR”)”是指在出現(xiàn)PCR擴(kuò)增時(shí)直接監(jiān)測(cè)其進(jìn)展，而不需要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物重復(fù)取樣。在定量PCR中，反應(yīng)產(chǎn)物可以在其產(chǎn)生時(shí)通過信號(hào)傳遞機(jī)制(例如熒光)被監(jiān)測(cè)，并在信號(hào)超過背景水平之后、但在反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)之前被追蹤。達(dá)到熒光的可檢測(cè)或“閾值”水平所需的循環(huán)數(shù)直接根據(jù)PCR過程開始時(shí)可擴(kuò)增靶的濃度而變化，使得信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)定能夠?qū)崟r(shí)地提供樣品中靶核酸量的測(cè)定。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將微陣列用于表達(dá)繪圖。由于在不同實(shí)驗(yàn)之間的再現(xiàn)性，微陣列特別適合于本目的。DNA微陣列提供了用于同時(shí)測(cè)量大量基因的表達(dá)水平的一種方法。每個(gè)陣列由連接到 固體支持物的可再現(xiàn)的捕獲探針圖案組成。標(biāo)記的RNA或DNA與陣列上互補(bǔ)的探針雜交，然后通過激光掃描被檢測(cè)。陣列上每個(gè)探針的雜交強(qiáng)度被確定并被轉(zhuǎn)換成表示為相對(duì)基因表達(dá)水平的定量值。參見，例如美國(guó)專利號(hào)6，040, 138，5，800, 992和6，020，135，6，033，860，和6，344，316。高強(qiáng)度寡核苷酸陣列在確定樣品中大量RNA的基因表達(dá)譜中是特別有用的。可以通過商購設(shè)備根據(jù)制造商的說明進(jìn)行微陣列分析,例如通過使用Affymetrix基因芯片技術(shù)，Illumina微珠陣列技術(shù)或Agilent噴墨打印微陣列技術(shù)?！皹?biāo)準(zhǔn)化”可用于除去樣品之間的差異。對(duì)于微陣列數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化處理意在通過平衡兩種標(biāo)記染料的熒光強(qiáng)度而除去系統(tǒng)性誤差。染料偏好可以來自多種來源，包括染料標(biāo)記效率的差異，熱和光敏感性以及用于掃描兩個(gè)通道的掃描儀設(shè)置。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化因子的一些常用的方法包括:(i)使用陣列上所有基因的全局標(biāo)準(zhǔn)化，例如通過多陣列對(duì)數(shù)健壯算法(log scale robust mult1-array analysis, RMA) ； (ii)使用恒定表達(dá)的管家 / 恒定基因的管家基因標(biāo)準(zhǔn)化；和(iii)使用在雜交期間添加的已知量的外源對(duì)照基因的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化(Quackenbush (2002) Nat.Genet.32 (Suppl.), 496-501)。在一實(shí)施方案中，本文公開的基因的表達(dá)可以通過對(duì)照管家基因或通過多陣列對(duì)數(shù)健壯算法(RMA)標(biāo)準(zhǔn)化。在多個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了用于移植例如骨髓移植的包含細(xì)胞群體的治療組合物。如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞群體”是指包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的異源或同源細(xì)胞群體。包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體可以是骨髓細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞或動(dòng)員的外周血細(xì)胞，或從任何合適的來源獲得的細(xì)胞群體，所述來源例如骨髓，動(dòng)員的外周血和臍帶血等。術(shù)語“細(xì)胞集合”也指細(xì)胞群體，在某些實(shí)施方案中，其與“細(xì)胞群體”同義。然而，細(xì)胞集合不必指任何特定的細(xì)胞群體。造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，無論獲自臍帶血、骨髓、外周血或其他來源，均可以在任何合適的、商購的或定制的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、處理或增殖，根據(jù)需要，可以添加或不添加血清(參見，例如，Hartshorn et al, Cell Technology for Cell Products,第221-224頁，R.Smith, Editor; Springer Netherlands, 2007,通過引用的方式將其整體并入本文)。例如，在某些實(shí)施方案中，無血清培養(yǎng)基可以利用白蛋白和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述蛋白已經(jīng)被證明對(duì)于CD34+細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和增殖是有用的。此外，可以包括細(xì)胞因子，諸如Flt-3配體、干細(xì)胞因子(SCF)和促血小板生成素等。HSC還可以生長(zhǎng)于諸如生物反應(yīng)器的容器中(參見，例如，Liu et al., Journal of Biotechnologyl24:592_601, 2006,通過引用的方式將其整體并入本文)。用于離體增殖HSC的合適的培養(yǎng)基還可以包含HSC支持細(xì)胞，諸如基質(zhì)細(xì)胞(例如，淋巴網(wǎng)狀基質(zhì)細(xì)胞)，所述支持細(xì)胞可以源自，例如，淋巴組織的解聚物，并且已經(jīng)被證實(shí)支持HSC以及它們的子代的體外、離體、和體內(nèi)的維持、生長(zhǎng)和分化。在具體實(shí)施方案中，細(xì)胞群體在被給予個(gè)體之前不被離體或體外增殖。在具體實(shí)施方案中，獲得了未被增殖的細(xì)胞群體，該細(xì)胞群體根據(jù)本文提供的方案離體處理，可以洗滌該細(xì)胞群體以除去處理試劑，并且將其給予患者而不對(duì)所述細(xì)胞群體進(jìn)行離體增殖。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞獲自捐獻(xiàn)者，包括臍帶血，并且在細(xì)胞處理之前或之后，或在將治療組合物給予患者之前的任何時(shí)間不被增殖。在一實(shí)施方案中，未被增殖的細(xì)胞群體被處理，并在群體中的細(xì)胞發(fā)生任何明顯的離體細(xì)胞分裂之前，或在任何明顯的離體細(xì)胞分裂所需時(shí)間之前被給予患者。在其他實(shí)施方案中，未被增殖的細(xì)胞群體被處理，并在群體中的細(xì)胞發(fā)生任何明顯的離體有絲分裂之前，或在任何明顯的離體有絲分裂所需時(shí)間之前被給予患者。在一些實(shí)施方案中，未被增殖的細(xì)胞群體被處理，并在群體中細(xì)胞加倍的時(shí)間之前被給予患者。在一些實(shí)施方案中，未被增殖的細(xì)胞群體被處理，并在處理細(xì)胞的6、12或24小時(shí)之內(nèi)被給予患者。在其他實(shí)施方案中，未被增殖的細(xì)胞群體被處理，并在處理細(xì)胞的2小時(shí)之內(nèi)被給予患者。在多個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞群體在用試劑離體處理之前或在被給予患者之前的任何時(shí)間不被培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群體被培養(yǎng)少于約24小時(shí)。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞群體被培養(yǎng)少于約12小時(shí)、10小時(shí)、8小時(shí)、4小時(shí)或2小時(shí)。在多個(gè)實(shí)施方案中，用本文他處所述的試劑處理并隨后被給予個(gè)體的細(xì)胞群體是異源細(xì)胞群體，包括全骨髓、臍帶血、動(dòng)員的外周血、造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞以及造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的子代，包括粒細(xì)胞(例如，早幼粒細(xì)胞，髓細(xì)胞，晚幼粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞)，紅細(xì)胞(例如，網(wǎng)織紅細(xì)胞，紅細(xì)胞等)，凝血細(xì)胞(例如，原巨核細(xì)胞，血小板產(chǎn)生的巨核細(xì)胞，血小 板)，和單核細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)。
在一實(shí)施方案中，治療組合物包含為約100%的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，治療組合物中的細(xì)胞群體是少于約0.1%,0.5%，1%，2%，5%，10%, 15%，20%，25%或30%的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體是少于約0.1%，
0.5%，1%，2%，5%，10%, 15%，20%, 25%或30%的CD34+細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體為約0.1%至約1%，約1%至約3%，約3%至約5%，約10%-約15%，約15%_20%，約20%_25%，約 25%-30%，約 30%-35%，約 35%_40%，約 40%_45%，約 45%_50%，約 60%_70%，約 70%-約 80%,約80%-90%，約90%-95%或約95%至約100%的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體為約0.1%至約1%，約1%至約3%，約3%至約5%，約10%-約15%，約15%_20%，約 20%-25%，約 25%-30%，約 30%_35%，約 35%_40%，約 40%_45%，約 45%_50%，約 60%_70%，約70%-80%，約 80%-90%，約 90%-95% 或約 95% 至約 100% 的 CD34+ 細(xì)胞。本發(fā)明的治療組合物中的細(xì)胞可以是自體(autologous)/自體(autogeneic)(“自體(self)”)的或非自體的(non-autologous)( “非自體(non-self) ”,例如，同種異體的，同系基因的或異種的)。如本文所用“自體”，是指來自同一個(gè)體的細(xì)胞。如本文所用“異體”，是指同一物種的與相比較的細(xì)胞在基因上不同的細(xì)胞。如本文所用“同系基因”，是指不同個(gè)體的與相比較的細(xì)胞在基因上相同的細(xì)胞。如本文所用“異種”，是指與相比較的細(xì)胞不同物種的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞是異體的?！案杉?xì)胞”是指這樣的細(xì)胞:該細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其能夠(I)長(zhǎng)期自我更新，或能夠產(chǎn)生原始細(xì)胞的至少一個(gè)相同的拷貝，(2)在單細(xì)胞水平上分化成多種，并在某些情況下，僅一種特化的細(xì)胞類型，以及(3)在體內(nèi)功能性再生組織。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能被細(xì)分為全能性(totipotent)、多能性(pluripotent)、專能性(multipotent)和寡能性/單能性(oligo/unipotent)?！白婕?xì)胞”也具有自我更新和分化成更多成熟細(xì)胞的能力，但定向于某個(gè)譜系(例如，造血祖細(xì)胞定向于血液譜系；髓樣祖細(xì)胞定向于骨髓譜系；淋巴樣祖細(xì)胞定向于淋巴譜系)，而干細(xì)胞不必有這樣的限制。“自我更新”是指細(xì)胞具有產(chǎn)生沒有改變的子細(xì)胞并因此補(bǔ)充和維持其群體數(shù)目、以及產(chǎn)生特化的細(xì)胞類型的獨(dú)特能力(潛能)。自我更新可以通過兩種方式實(shí)現(xiàn)。非對(duì)稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生一個(gè)與親本細(xì)胞相同的子細(xì)胞和一個(gè)不同于親代細(xì)胞并 且是更加定向的祖細(xì)胞或分化的細(xì)胞的子代細(xì)胞。對(duì)稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個(gè)相同的子細(xì)胞。細(xì)胞的“增殖”或“擴(kuò)增”是指對(duì)稱地分裂細(xì)胞。造血干細(xì)胞(HSC)產(chǎn)生能在生物體的整個(gè)生命期間形成成熟血細(xì)胞庫的定向造血祖細(xì)胞(committed hematopoietic progenitor cell，HPC)。術(shù)語“造血干細(xì)胞”或“HSC”是指產(chǎn)生生物體的所有血細(xì)胞類型的專能干細(xì)胞，所述血細(xì)胞類型包括骨髓譜系(例如，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，紅細(xì)胞，巨核細(xì)胞/血小板，樹突細(xì)胞)，和淋巴譜系(例如，T-細(xì)胞，B-細(xì)胞，NK-細(xì)胞)，以及本領(lǐng)域中已知的其他譜系(參見Fei，R.等人的美國(guó)專利號(hào)5，635，387;McGlaVe等人的美國(guó)專利號(hào)5, 460, 964; Simmons, P.等人的美國(guó)專利號(hào)5，677, 136; Tsukamoto等人的美國(guó)專利號(hào)5，750，397; Schwartz等人的美國(guó)專利號(hào)5，759，793;DiGuisto等人的美國(guó)專利號(hào)5，681，599;Tsukamoto等人的美國(guó)專利號(hào)5，716，827)。當(dāng)被移植進(jìn)致死輻射的動(dòng)物或人體中時(shí)，造血干細(xì)胞可以再建類紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和淋巴樣造血細(xì)胞庫。HSC可以根據(jù)某些表型或基因型標(biāo)志物來鑒定。例如，可以通過以下來鑒定HSC:其小體積、缺乏譜系(Iin)標(biāo)志物、諸如羅丹明123(羅丹明.，也稱為rho1。)或Hoechst33342活體染料的淺染(邊緣細(xì)胞群(side population))、以及多種抗原性標(biāo)志物在其表面的存在，其中許多屬于分化抗原簇系列(例如，CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45和c_kit，干細(xì)胞因子的受體)。HSC大都是通常對(duì)于檢測(cè)譜系定向(lineage commitment)的標(biāo)志物是陰性的,并因此經(jīng)常被稱為L(zhǎng)in(-)細(xì)胞。大多數(shù)的人 HSC 可以被表征為 CD34+，CD59+，Thyl/CD90+，CD38W' C_kit/CD117+ 和 Lin (-)。然而，不是所有干細(xì)胞都被這些組合所涵蓋，因?yàn)槟承〩SC是CD347-/CD38_。一些研究也表明，最早期的干細(xì)胞可能在細(xì)胞表面缺乏c-kit。對(duì)于人HSC，CD133可以代表早期標(biāo)志物，因?yàn)镃D34+和CD34_HSC都顯示為CD133+。本領(lǐng)域已知CD34+和Lin (-)細(xì)胞也包括造血祖細(xì)胞。用于本發(fā)明的方法的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的合適的來源包括，但不限于，從包含造血來源細(xì)胞的生物體分離或獲得的細(xì)胞?！胺蛛x的”是指從其原始環(huán)境取出的物質(zhì)。例如，如果細(xì)胞與在其天然狀態(tài)通常伴隨它的一些或所有組分分開時(shí)，則它是分離的。例如，本文所用的“分離的細(xì)胞群體”、“分離的細(xì)胞源”或“分離的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞”等是指一種或多種細(xì)胞與其天然細(xì)胞環(huán)境和與同組織或器官的其他組分的關(guān)聯(lián)的體外或離體分開，即其與體內(nèi)物質(zhì)沒有顯著關(guān)聯(lián)?？梢匀コ糜诒景l(fā)明的方法的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的成熟造血細(xì)胞，例如T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，類紅細(xì)胞，和其來自骨髓抽吸物，臍帶血，或動(dòng)員的外周血(動(dòng)員的白細(xì)胞清除產(chǎn)品)的定向前體。成熟的譜系定向細(xì)胞通過免疫去除，例如通過用結(jié)合一組所謂的“譜系”抗原的抗體標(biāo)記固體基質(zhì)，所述抗原為CD2，CD3，CDllb,CD14，CD15，CD16，CD19，CD56，CD123和CD235a?？梢赃M(jìn)行隨后的步驟以進(jìn)一步純化細(xì)胞群體，其中用結(jié)合CD34+抗原的抗體標(biāo)記的基質(zhì)被用于分離原始造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。用于從多種細(xì)胞來源純化造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的試劑盒是商業(yè)可獲得的，并且在具體實(shí)施方案中，這些試劑盒適合與本發(fā)明的方法一起使用。示例性純化造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的市售試劑盒包括，但不限于，系別(Lin)去除試劑盒(Miltenyi Biotec);⑶34+富集試劑盒(Miltenyi Biotec);RosettaSep(Stem Cell Technologies)。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明的治療組合物的細(xì)胞群體包含少于約30%，25%，20%，15%，10%，或5%的間充質(zhì)干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含不超過約10%的間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是可以容易地分化成包括成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的譜系的多潛能干細(xì)胞(Pittenger, et al.，Science, Vol.284，pg.143(1999);Haynesworth, et al., Bone,Vol.13,pg.69(1992);Prockop, Science, Vol.276, pg.71(1997))。在其他實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明的治療組合物的細(xì)胞群體包含少于約30%，25%，20%，15%，10%或5%的內(nèi)皮祖細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含少于約10%的內(nèi)皮祖細(xì)胞。如本文所用，“內(nèi)皮祖細(xì)胞”是指具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛能的多潛能或單能細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含不超過約10%的間充質(zhì)干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞。從捐獻(xiàn)者獲得的或其他方法提供的細(xì)胞群體可以基本上沒有間充質(zhì)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞，并且在具體實(shí)施方案中，包含少于約10%的間充質(zhì)干細(xì)胞和少于約10%的內(nèi)皮祖細(xì)胞。或者，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，例如使用免疫磁選技術(shù)，熒光激活的細(xì)胞分選或其組合，去除所述細(xì)胞群體中的間充質(zhì)干細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞。去除方法還可以包括使用對(duì)本文所述的至少一種細(xì)胞表面標(biāo)志物特異的至少一種抗體。在一些實(shí)施方案中，去除所述細(xì)胞群體中的內(nèi)皮祖細(xì)胞，包括CD14細(xì)胞表面標(biāo)志物陽性和⑶45陰性(⑶14+/⑶45_)細(xì)胞和/或VWF (血管假性血友病因子，Von WillebrandFactor)陽性(VWF+)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，去除所述細(xì)胞群體中的⑶73和/或⑶140B細(xì)胞表面標(biāo)志物陽性細(xì)胞。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34陽性細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的選自以下的細(xì)胞表面標(biāo)志物陽性的細(xì)胞:CD73，CD140B，CD14和VWF。在具體實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明的治療組合物的細(xì)胞群體包含CD34+細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的CD14+/CD45-細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含CD34+細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的VWF+細(xì)胞。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含⑶34+細(xì)胞并且包含少于約30%，25%，20%, 15%，10%或5%的⑶140B+細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體包含⑶34+造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞并且包含少于約 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 或 5% 的 CD14+/CD45-細(xì)胞，VffF+ 細(xì)胞，CD73.細(xì)胞和 CD140B+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體為細(xì)胞表面標(biāo)志物⑶34陽性并且為選自以下的至少一種細(xì)胞表面標(biāo)志物陰性:⑶14，VffF,⑶73和⑶140B。在其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群體為細(xì)胞表面標(biāo)志物⑶34陽性并且為細(xì)胞表面標(biāo)志物⑶14，VffF,⑶73和⑶140B陰性。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以從成人的未分級(jí)分離或分級(jí)分離的骨髓獲得或分離，包括股骨，髖骨，肋骨，胸骨和其他骨骼。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以利用針和注射器從髖骨取出直接獲得或分離，或者從血液中獲得，通常是在用誘導(dǎo)細(xì)胞從骨髓區(qū)室釋放的或動(dòng)員的諸如G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)的細(xì)胞因子預(yù)處理后從血液中獲得。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的其他來源包括臍帶血、胎盤血和動(dòng)員的外周血。對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)康模焊闻K、胎兒脾臟、腎髓(kidney marrow)和動(dòng)物的AGM(主動(dòng)脈一性腺一中腎)也是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的有用來源。在具體實(shí)施方案中，從造血來源(例如骨髓細(xì)胞、臍帶血或動(dòng)員的外周血細(xì)胞)收獲造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞?！笆斋@”造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞被定義為從基質(zhì)取出或分離細(xì)胞。這可以通過使用多種方法實(shí)現(xiàn)，如酶法，非酶法，離心法，電法，或基于大小的方法，或優(yōu)選的是，使用培養(yǎng)基(例如，其中孵育細(xì)胞的培養(yǎng)基)沖洗細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，收獲用于移植的足夠量的細(xì)胞可能需要?jiǎng)訂T捐獻(xiàn)者的干細(xì)胞和祖細(xì)胞?！霸煅杉?xì)胞動(dòng)員”是指在干細(xì)胞移植之前，為了白細(xì)胞清除目的，從骨髓釋放干細(xì)胞進(jìn)入外周血液循環(huán)。造血生長(zhǎng)因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或化療劑經(jīng)常被用來激發(fā)動(dòng)員。存在商業(yè)干細(xì)胞動(dòng)員藥物并可與G-CSF —起使用，以動(dòng)員足夠量的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞用于向個(gè)體移植。例如，可以給予捐獻(xiàn)者G-CSF和MozobiI (Genzyme公司)，從而收獲足夠數(shù)量的用于移植的造血細(xì)胞。通過增加從捐獻(xiàn)者收獲的干細(xì)胞的數(shù)目，可用于移植回個(gè)體的干細(xì)胞的數(shù)目，個(gè)體的結(jié)果可以顯著改善， 從而有可能減少植入時(shí)間，并因此導(dǎo)致個(gè)體具有不足的中性粒細(xì)胞和血小板的時(shí)間減少，從而防止感染，出血或其他并發(fā)癥。動(dòng)員造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的其它方法是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的。在具體實(shí)施方案中，從臍帶血得到造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)收獲臍帶血(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)7，147，626和7，131，958，通過引用將該方法并入本文)。在一實(shí)施方案中，在本發(fā)明的治療組合物和方法中使用的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以獲自專能干細(xì)胞來源，例如，誘導(dǎo)的專能干細(xì)胞(iPSC)和胚胎干細(xì)胞(ESC)。如本文所用，術(shù)語“誘導(dǎo)的專能干細(xì)胞”或“iPSC”是指已被重編程為專能狀態(tài)的非專能細(xì)胞。一旦個(gè)體的細(xì)胞已被重編程到專能狀態(tài)，則該細(xì)胞可以被編程為所需的細(xì)胞類型，如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“重編程”是指增加細(xì)胞至較低分化狀態(tài)的潛能的方法。如本文所用，術(shù)語“編程”是指降低細(xì)胞至較高分化狀態(tài)的潛能或者使細(xì)胞分化至較高分化狀態(tài)的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將治療組合物給予病人或需要治療的個(gè)體。治療組合物中包含的和給予患者的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量將隨細(xì)胞來源，個(gè)體的疾病狀態(tài)，年齡、性別和重量，以及造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在個(gè)體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力而變化。在一實(shí)施方案中，給予個(gè)體的治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(例如，CD34+, Lin(-)細(xì)胞)的量是部分或單個(gè)臍帶血中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量,或者至少為
0.1XlO5個(gè)細(xì)胞，至少為0.5X IO5個(gè)細(xì)胞，至少為IXlO5個(gè)細(xì)胞，至少為5X105個(gè)細(xì)胞，至少為10 X IO5個(gè)細(xì)胞，至少為0.5 X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為0.75 X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為I X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為1.25 X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為1.5 X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為1.75 X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為2X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為2.5X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為3X106個(gè)細(xì)胞，至少4X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為5X IO6個(gè)細(xì)胞，至少為IOX IO6個(gè)細(xì)胞 ，至少15X106個(gè)細(xì)胞，至少為20X 106個(gè)細(xì)胞，至少為25X 106個(gè)細(xì)胞，或至少為30X 106個(gè)細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(例如，⑶34+，Lin (-)細(xì)胞)的量是部分或單個(gè)臍帶血中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量,或者為約0.1X IO5個(gè)細(xì)胞至約IOXlO5個(gè)細(xì)胞，約0.5 X IO6個(gè)細(xì)胞至約5 X IO6個(gè)細(xì)胞；約IXlO6個(gè)細(xì)胞至約3 X IO6個(gè)細(xì)胞，約1.5 X IO6個(gè)細(xì)胞至約2.5 X IO6個(gè)細(xì)胞，或約2 X IO6約至2.5 X IO6個(gè)細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量是部分或單個(gè)臍帶血中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量，或者為約IX IO6個(gè)細(xì)胞至約3X IO6個(gè)細(xì)胞；約
1.0 X IO6個(gè)細(xì)胞至約5 X IO6個(gè)細(xì)胞；約1.0 X IO6個(gè)細(xì)胞至約10 X IO6個(gè)細(xì)胞，約10 X IO6個(gè)細(xì)胞至約20 X IO6個(gè)細(xì)胞，約IOX IO6個(gè)細(xì)胞至約30 X IO6個(gè)細(xì)胞，或約20 X IO6個(gè)細(xì)胞至約30 X IO6個(gè)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量是部分或單個(gè)臍帶血中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量，或者為約I X IO6個(gè)細(xì)胞至約30 X IO6個(gè)細(xì)胞；約
1.0 X IO6個(gè)細(xì)胞至約20 X IO6個(gè)細(xì)胞；約1.0 X IO6個(gè)細(xì)胞至約10 X IO6個(gè)細(xì)胞，約2.0XlO6個(gè)細(xì)胞至約30 X IO6個(gè)細(xì)胞，約2.0X IO6個(gè)細(xì)胞至約20 X IO6個(gè)細(xì)胞，或約2.0X IO6個(gè)細(xì)胞至約IOXlO6個(gè)細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量為約I X IO6個(gè)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，約2 X IO6個(gè)細(xì)胞，約5 X IO6個(gè)細(xì)胞，約7 X IO6個(gè)細(xì)胞，約10 X IO6個(gè)細(xì)胞，約15 X IO6個(gè)細(xì)胞，約17 X IO6個(gè)細(xì)胞，約20 X IO6個(gè)細(xì)胞，約25 X IO6個(gè)細(xì)胞，或約30 X IO6個(gè)細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，給予個(gè)體的治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量是部分或單個(gè)臍帶血中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量，或者至少為0.1 X IO5個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為
0.5 X IO5個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為I X IO5個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為5 X IO5個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為IOX IO5個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為0.5X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為0.75X 106個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為I X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為1.25 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為
1.5 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為1.75 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為2 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為2.5 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為3 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為4 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為5 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少為10 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重，至少有15 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為20 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,至少為25 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重,或至少為30 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg體重。
·
不希望受任何具體的理論限制，本發(fā)明部分地預(yù)期，本方法的優(yōu)點(diǎn)之一是較少的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞可用于移植，因?yàn)榕c對(duì)照處理的細(xì)胞和用試劑例如在4° C處理的細(xì)胞相比，本發(fā)明的治療組合物中增強(qiáng)的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞具有增加的植入潛力，改進(jìn)的歸巢，和增加體內(nèi)增殖能力。C.本發(fā)明的方法本發(fā)明人分析了用改變細(xì)胞基因表達(dá)的試劑(包括刺激前列腺素通路和上調(diào)CXCR4的基因及細(xì)胞表面表達(dá)的試劑)處理的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體的幾個(gè)生物參數(shù)，從而提高用于干細(xì)胞移植的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的功效。細(xì)胞群體在植入后重建個(gè)體的造血系統(tǒng)的有效性取決于諸如細(xì)胞群體歸巢并植入骨髓的能力，自我更新的能力，和體內(nèi)增殖的能力等性質(zhì)。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞群體的方法，以改進(jìn)這樣的細(xì)胞特性，并在造血重建中提供所產(chǎn)生的治療改進(jìn)?！爸踩霛摿Α笔侵讣?xì)胞植入的能力。在具體實(shí)施方案中，諸如⑶34+，Lin(_)細(xì)胞的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的植入潛力可以通過測(cè)定以下來確定，例如，pge2r2/r4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，細(xì)胞中與歸巢或植入相關(guān)的基因的表達(dá)，細(xì)胞活力和細(xì)胞自我更新的能力。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，其他合適的測(cè)定也可以指示造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增加的植入潛力。如本文所用，術(shù)語“植入”是指細(xì)胞整合到某個(gè)位置(例如某個(gè)組織)，并隨時(shí)間推移堅(jiān)守在該具體位置的能力，例如，造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞整合到骨髓中并堅(jiān)守在骨髓中的能力?！皻w巢”是指造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞集中(即移動(dòng))至某個(gè)具體區(qū)域或組織的能力，如移植的干細(xì)胞集中至骨髓。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療組合物，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞與能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的一種或多種試劑接觸過，所述試劑包括刺激前列腺素通路，例如PGE2R2/R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑。處理的細(xì)胞的治療組合物提供了優(yōu)于之前在干細(xì)胞移植中使用的細(xì)胞的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如細(xì)胞群體體內(nèi)歸巢、植入和增殖的增加。如本文所用，“試劑”是指能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑。這類試劑包括，例如但不限于PGE2或具有dmPGE2活性的試劑(包括但不限于本文他處所述的PGE2類似物，cAMP類似物或激活劑和/或G a -S激活劑)。在具體實(shí)施方案中，包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體可以與1、2、3、4、5或更多種試劑以任意組合同時(shí)或依次接觸。
在足以增加植入和/或植入潛力和/或增殖的條件下，與能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑，例如PGE2或具有dmPGE2活性的試劑，接觸過的人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以以多種不同方式表征，例如通過:由生物化學(xué)測(cè)定所確定的增加的細(xì)胞內(nèi)cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，例如CREB磷酸化；由諸如微陣列的基因表達(dá)測(cè)定所確定的指示參與PGE2R2/R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基因(如CREM)和增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞歸巢和植入的基因(如CXCR4)上調(diào)的基因表達(dá)標(biāo)簽；由諸如7-氨基放線菌素D(7-AAD)染色的細(xì)胞活力測(cè)定所確定的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞活力沒有可測(cè)量的下降；和/或由諸如離體集落形成單位(CFU-C)測(cè)定所確定的增加的造血干細(xì)胞自我更新能力。
在一實(shí)施方案中，在足以增加植入和/或植入潛力和/或增殖的條件下，與能夠增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑(例如PGE2或具有dmPGE2活性的試劑)接觸過的人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以通過檢查接觸的(處理的)細(xì)胞與用媒介物處理的細(xì)胞或用試劑在4° C處理的細(xì)胞相比的基因表達(dá)標(biāo)簽而鑒定。
在具體實(shí)施方案中，與用媒介物處理的細(xì)胞或用試劑在4° C處理的細(xì)胞相比，具有增加的植入和/或植入潛力和/或增加的體內(nèi)增殖的處理的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞具有表達(dá)增加的1、2、3、4、5種或所有的以下基因:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4(DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，F(xiàn)os相關(guān)抗原2 (F0SL2)，或CXC趨化因子受體4 (CXCR4)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，與非處理的細(xì)胞中的CXCR4表達(dá)水平相比，治療組合物中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的CXCR4上調(diào)至少4倍。
與從臨床前研究得到的觀察結(jié)果相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與刺激前列腺素通路的試劑接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞增加了所述細(xì)胞在本文所述的具體條件下的增殖和植入潛力。這些 條件優(yōu)化了用刺激前列腺素通路的試劑處理的期望生物應(yīng)答，包括干細(xì)胞歸巢、存活、擴(kuò)增和植入。
因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為降低造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞活力和降低dmPGE2半衰期的條件意外地導(dǎo)致造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞表現(xiàn)出增加的植入和/或體內(nèi)增殖潛力，因?yàn)樗鼈儽Ａ艏?xì)胞活力，增加向骨髓的歸巢和植入(例如，增加的CXCR4表達(dá))和增加的細(xì)胞自我更新能力。
因此，本發(fā)明部分地考慮到進(jìn)行骨髓、外周血和臍帶血移植的新方法，這通過在預(yù)期對(duì)增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞植入或造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞體內(nèi)增殖不利的條件下，用本文所述的上調(diào)細(xì)胞中的CXCR4表達(dá)的試劑(包括刺激PGE2R2/R4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑)處理造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體。
如本文所用，術(shù)語“足以……的條件”或“在足以……的條件下”是指用增加細(xì)胞中的CXCR4基因表達(dá)的試劑處理移植材料來源的孵育條件，所述移植材料來源例如骨髓細(xì)胞，外周血細(xì)胞，或臍帶血細(xì)胞，和/或其他包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體，和/或富集的或選擇的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體。在一實(shí)施方案中，該條件足以增加給予個(gè)體的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的植入。在一實(shí)施方案中，該條件足以增加給予個(gè)體的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖。在另一實(shí)施方案中，該條件足以增加給予個(gè)體的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的植入和增殖。孵育條件包括，但不限于細(xì)胞的來源、試劑濃度、孵育細(xì)胞和試劑的持續(xù)時(shí)間，以及孵育的溫度。在具體實(shí)施方案中，所述試劑為PGE2或具有dmPGE2活性的試劑。在一實(shí)施方案中，所述試劑為16，16-二甲基PGE2。
在多個(gè)實(shí)施方案中，足以增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞植入和/或增殖的條件包括，在生理相關(guān)溫度下孵育，例如約39° C的溫度范圍(約室溫至約體溫)，包括但不限于約22。 C，23。 C，24。 C，25。 C，26。 C，27。 C，28。 C，29。 C，30。 C，31。 C，32。 C，33。 C,34。C，35。C，36。C，37。C，38。C 和 39。C 的溫度；以約 IOnM 至約 120 μ M 終濃度的16，16- 二甲基PGE2,包括但不限于約ΙΟΟηΜ，約500nM，約I μ M，約10 μ Μ,約20 μ Μ,約30 μ Μ,約 40 μ Μ,約 50 μ Μ,約 60 μ Μ,約 70 μ Μ,約 80 μ Μ,約 90 μ Μ,約 100 μ Μ，約 110 μ Μ，或約120 μ Μ，或任何其他中間濃度的16，16-二甲基PGE2 (例如，0.1 μ Μ，I μ Μ，5 μ Μ，10 μ Μ，20 μ Μ, 50 μ Μ, 100 μ Μ)；以及孵育約60分鐘至約4小時(shí)，包括但不限于孵育時(shí)間持續(xù)約60分鐘，約70分鐘，約80分鐘，約90分鐘，約100分鐘，約110分鐘，約2小時(shí)，約2.5小時(shí)，約3小時(shí)，約3.5小時(shí)，或約4小時(shí)，或任何其他中間的孵育持續(xù)時(shí)間(例如，111分鐘，112分鐘，113分鐘，114分鐘，115分鐘，116分鐘，117分鐘，118分鐘，119分鐘)。
如本文所用“約”或“大約”指與參考的濃度、溫度、持續(xù)時(shí)間、量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度相差多達(dá)30%，25%, 20%, 25%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%，4%，3%，2%或I %的濃度、溫度、持續(xù)時(shí)間、量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語“約”是指以特定的量為中心加或減10%的量的范圍，例如約37° C的溫度是指33° C至41° C的溫度范圍。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語“約”是指以特定的量為中心加或減5%的量的范圍。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語約是指以特定的量為中心加或減1%的量的范圍。
在具體實(shí)施方案中，足以增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞植入和/或體內(nèi)增殖的條件包括在約35° C至約39° C的溫度范圍孵育；以約10 μ M至約25 μ M終濃度的16，16-二甲基PGE2 ;和孵育約I小時(shí)至約4小時(shí)，約2小時(shí)至約3小時(shí)，約2小時(shí)至約4小時(shí)，或約3小時(shí)至約4小時(shí)。
在另一實(shí)施方案中，足以增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞植入和/或體內(nèi)增殖的條件包括在約37° C的溫度(約體溫)孵育；以約10 μ M或更高終濃度的16，16- 二甲基PGE2 ；以及孵育約2小時(shí)。
在另一實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的人臍帶血、骨髓細(xì)胞或動(dòng)員的外周血，或純化的Lin (-) ⑶34+造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體在37° C的溫度與10 μ M終濃度的16，16-dmPGE2(dmPGE2)接觸120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，增加了造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞植入個(gè)體的骨髓中的潛力。接觸過的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞活力的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的下降，而表現(xiàn)出與造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞歸巢和植入以及自我更新能力相關(guān)的基因表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。
在另一實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的人臍帶血、骨髓細(xì)胞或動(dòng)員的外周血，或純化的Lin(-)⑶34+造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體在37° C的溫度與10 μ M終濃度的16，16-dmPGE2 (dmPGE2)接觸120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，增加了給予個(gè)體的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的體內(nèi)增殖。
在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了獲得和制備用于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞移植的細(xì)胞群體的方法，包括:在足以增加細(xì)胞的植入潛力和/或植入的條件下，使細(xì)胞群體與增加細(xì)胞中的CXCR4基因表達(dá)的一種或多種試劑接觸，所述試劑包括刺激PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了獲得和制備用于增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在個(gè)體中的量的細(xì)胞群體的方法，包括:在足以增加細(xì)胞群體體內(nèi)增殖的條件下，使細(xì)胞群體與增加細(xì)胞中的CXCR4基因表達(dá)的一種或多種試劑接觸，所述試劑包括刺激PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑。
在多個(gè)其他實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在個(gè)體中植入的方法，包括:使包含表達(dá)⑶34但缺乏Lin表達(dá)的造血細(xì)胞(例如，Lin (-)⑶34+細(xì)胞)的細(xì)胞群體與一種或多種試劑接觸，所述試劑選自:前列腺素E2(PGE2)或具有dmPGE2活性的試劑；并將所述細(xì)胞群體給予個(gè)體。所述細(xì)胞在本文他處所述的足以增加接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在該個(gè)體中的植入的條件下與所述試劑接觸。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了在個(gè)體中體內(nèi)增殖造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體的方法，包括:使包含表達(dá)⑶34但缺乏Lin表達(dá)的造血細(xì)胞(例如，Lin (-)⑶34+細(xì)胞)的細(xì)胞群體與一種或多種試劑接觸，所述試劑選自:前列腺素E2(PGE2)或具有dmPGE2活性的試劑；并將所述細(xì)胞群體給予個(gè)體。所述細(xì)胞在本文他處所述的足以在個(gè)體中增殖接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的條件下與所述試劑接觸。
本發(fā)明部分地考慮到增加干細(xì)胞在有需要的個(gè)體(例如，人)中植入的方法，包括:使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體(例如，骨髓細(xì)胞，外周血細(xì)胞和/或臍帶血細(xì)胞)與PGE2或其類似物(例如16，16- 二甲基PGE2(ClmPGE2)或具有dmPGE2活性的試齊IJ)接觸；并將所述細(xì)胞給予所述個(gè)體。在一實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞源與諸如dmPGE2的PGE2類似物接觸。在多個(gè)實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞源與具有dmPGE2活性的試劑接觸，所述試劑例如dmPGE2，cAMP類似物或增強(qiáng)齊U，或Ga-S激活劑。
在某一實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞源與諸如ClmPGE2的PGE2類似物和具有dmPGE2活性的試劑接觸，所述具有dmPGE2活性的試劑例如cAMP類似物或增強(qiáng)劑，或G a -S激活劑。在另一實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞源與一種或多種PGE2類似物、一種或多種cAMP類似物或增強(qiáng)劑，和/或一種或多種G a -S激活劑接觸。
在多個(gè)其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療有需要的個(gè)體的方法，包括:鑒定有需要的個(gè)體，并將包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體給予所述個(gè)體，從而治療所述有需要的個(gè)體，所述造 血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞在足以增加接觸過的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述個(gè)體中的植入或體內(nèi)增殖的條件下，與選自以下的一種或多種試劑接觸:前列腺素E2 (PGE2)，具有dmPGE2活性的試劑，例如cAMP類似物或增強(qiáng)劑和G a -s激活劑。
“增強(qiáng)”或“促進(jìn)”或“增加”或“激活”，一般是指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，PGE2或具有dmPGE2活性的試劑在細(xì)胞中產(chǎn)生或?qū)е赂蟮纳響?yīng)答(即下游的效應(yīng))的能力，例如，增加的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的植入/植入潛力和增加的干細(xì)胞體內(nèi)增殖。可測(cè)量的生理應(yīng)答可以包括造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞植入、活力、歸巢、自我更新和/或增殖以及根據(jù)本領(lǐng)域的理解和本文的描述顯而易見的其他生理應(yīng)答的增加。在一實(shí)施方案中，所述增加可以是通過PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而增加信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所致的基因表達(dá)增加，包括但不限于，CREB磷酸化增加，CREM表達(dá)增加和CXCR4增加。造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞植入、活力、歸巢、自我更新和/或體內(nèi)增殖的增加也可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定，例如基因表達(dá)，CFU-C測(cè)定，CFU-S測(cè)定，CAFC測(cè)定以及細(xì)胞表面蛋白表達(dá)等?！霸黾拥摹被颉霸鰪?qiáng)的”量通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”量，并可以包括為由媒介物(缺乏試劑)或?qū)φ战M合物所產(chǎn)生應(yīng)答的1.1, 1.2，1.5，2，3，4，5，6，7，8，9，10, 15，20, 30倍或更多倍(例如，500倍，1000倍)(包括兩者之間和大于I的所有整數(shù)和小數(shù)點(diǎn)，例如1.5，1.6，1.7，1.8等)的增加。例如，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體在約37° C與dmPGE2接觸。與在約4° C接觸的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞具有增加的植入潛力和增殖。
“減少”或“減低”，或“減輕”或“降低”或“減弱”通常是指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，PGE2或具有dmPGE2活性的試劑在細(xì)胞中產(chǎn)生或?qū)е赂〉纳響?yīng)答(即下游的效應(yīng))的能力，例如減少細(xì)胞凋亡。在一實(shí)施方案中，減少可以是通常與細(xì)胞活力降低相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的減少或基因表達(dá)的降低?！皽p少的”或“降低的”量通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”量，并可以包括為由媒介物(缺乏試劑)或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的應(yīng)答的1.1, 1.2, 1.5,2, 3,4, 5,6, 7,8,9, 10，15，20，30 倍或更多倍(例如，500 倍，1000 倍)(包括兩者之間和大于I的所有整數(shù)和小數(shù)點(diǎn)，例如1.5，1.6，1.7，1.8等)的降低。例如，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體在約37° C與ClmPGE2接觸。與在約4° C接觸dmPGE2的細(xì)胞相比，接觸的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞活力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。
“維持”或“保留”，或“保持”或“沒有改變”或“沒有顯著改變”或“沒有顯著降低”通常是指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答(參照應(yīng)答)相比，PGE2或具有dmPGE2活性的試劑在細(xì)胞中產(chǎn)生或?qū)е孪喈?dāng)?shù)纳響?yīng)答(即下游的效應(yīng))的能力。相當(dāng)?shù)膽?yīng)答是與參照應(yīng)答沒有顯著不同或可測(cè)量的不同的應(yīng)答(參見圖13A)。在一實(shí)施方案中，使包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與刺激PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑在約37° C接觸約2小時(shí)，所述試劑 例如具有dmPGE2活性的試劑，例如dmPGE2，cAMP類似物或增強(qiáng)劑，和Ga-S激活劑。與在4° C接觸的細(xì)胞相比，處理的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞活力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。換而言之，與在約4° C接觸的細(xì)胞相比，本文所述的方法維持了造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的活力，沒有顯著降低該活力，沒有導(dǎo)致該活力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低，沒有引起該活力的損失和/或沒有顯著改變?cè)摶盍Α?br> 在具體實(shí)施方案中，用諸如dmPGE2的試劑處理細(xì)胞一段時(shí)間。在相關(guān)實(shí)施方案中，處理后在細(xì)胞培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞使得它們基本上沒有所述試劑。例如，在一實(shí)施方案中，使包含人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體在約37° C下與16，16-二甲基PGE2接觸120分鐘的一段時(shí)間，所述細(xì)胞群體例如骨髓細(xì)胞，動(dòng)員的外周血細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞。在孵育后，但在輸注或隨后的處理或存儲(chǔ)之前，用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，所述培養(yǎng)基例如低分子量葡聚糖和5%人血清白蛋白培養(yǎng)基(LMD/5%HSA)或Stem Span培養(yǎng)基(Stem Cells TechnologyInc.)。
在多個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供體外或離體處理方法，包括使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與維持干細(xì)胞/祖細(xì)胞活力并增加植入、歸巢、自我更新和體內(nèi)增殖的PGE2或具有dmPGE2活性的試劑接觸。
術(shù)語“離體(ex vivo) ” 一般指發(fā)生在生物體外的活動(dòng)，諸如在生物體外的人工環(huán)境中的活體組織之中或之上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)或測(cè)量，優(yōu)選對(duì)天然條件的改變最小。在具體實(shí)施方案中，“離體”方法涉及從生物體獲取活體細(xì)胞或組織，并將其在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備中培養(yǎng)，通常在無菌條件下，一般培養(yǎng)幾小時(shí)或最長(zhǎng)達(dá)約24小時(shí)，但也包括最長(zhǎng)達(dá)48或72小時(shí)，這取決于環(huán)境。在某些實(shí)施方案中，這種組織或細(xì)胞可以被收集和冷凍，并在以后解凍用于離體處理。利用活體細(xì)胞或組織的持續(xù)超過幾天的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或方案通常被視為是“體外(invitro) ”的，盡管在某些實(shí)施方案中，該術(shù)語能夠與離體互換使用。
術(shù)語“離體給藥”、“離體處理”或“離體治療用途”一般指這樣的醫(yī)療操作，其中一種或多種器官、細(xì)胞或組織從活的或最近死亡的個(gè)體獲得，任選將其純化/富集，暴露于處理或操作(例如，離體給藥步驟，其包括用本發(fā)明的組合物或試劑孵育細(xì)胞以增強(qiáng)所需細(xì)胞諸如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖)。經(jīng)離體處理的細(xì)胞可以被給予相同的或不同的活個(gè)體。
這類離體醫(yī)療應(yīng)用還可以包括任選的體內(nèi)處理或操作步驟，例如將本發(fā)明的接觸過的細(xì)胞I次或多次給予活個(gè)體。按照本領(lǐng)域已知和本文他處所述的技術(shù)，這些實(shí)施方案包括局部和全身給藥。給予個(gè)體的細(xì)胞的量取決于該個(gè)體的特征，諸如一般健康狀況、年齡、性別、體重和藥物的耐受，以及對(duì)藥物和/或細(xì)胞移植物反應(yīng)的程度、嚴(yán)重性和類型。
術(shù)語“體內(nèi)(in vivo) ”通常是指在生物體內(nèi)部發(fā)生的活動(dòng)，例如細(xì)胞植入、細(xì)胞歸巢、細(xì)胞自我更新和細(xì)胞增殖。在一實(shí)施方案中，術(shù)語“體內(nèi)增殖”是指細(xì)胞群體在體內(nèi)增加數(shù)目的能力。在具體實(shí)施方案中，體內(nèi)增殖包括干細(xì)胞的自我更新和/或擴(kuò)增。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了制備用于諸如骨髓移植的移植的細(xì)胞群體的方法,所述細(xì)胞群體例如骨髓細(xì)胞，動(dòng)員的外周血細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞，所述方法包括:在足以增加所述接觸過的細(xì)胞被給予個(gè)體時(shí)植入和/或體內(nèi)增殖的溫度和時(shí)間下，使所述細(xì)胞與dmPGE2或具有dmPG E2活性的試劑離體接觸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療需要造血重建或造血系統(tǒng)重建的個(gè)體的方法，包括:鑒定需要造血重建的個(gè)體，并給予所述個(gè)體一個(gè)量的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，從而治療所述需要造血重建的個(gè)體，其中所述造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞已在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在所述個(gè)體中植入的條件下，與諸如dmPGE2的能夠增加CXCR4基因表達(dá)的試劑接觸過。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療需要造血重建、造血系統(tǒng)重建、增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞數(shù)目和/或體內(nèi)增殖造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的個(gè)體的方法，包括:鑒定需要造血重建的個(gè)體，并給予所述個(gè)體一個(gè)量的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，從而治療所述需要造血重建的個(gè)體，其中所述造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞已在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在所述個(gè)體中體內(nèi)增殖的條件下，與諸如dmPGE2的能夠增加CXCR4基因表達(dá)的試劑接觸過。
本文所用的“個(gè)體”包括表現(xiàn)這樣的癥狀的任何動(dòng)物，所述癥狀可以被本發(fā)明的試劑或組合物或裝置治療，或可以被已經(jīng)用本發(fā)明的試劑或組合物離體處理的HSC或臍帶血治療。“需要造血重建、造血系統(tǒng)重建、增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞數(shù)目和/或造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的個(gè)體”包括但不限于:患有或已被診斷有不同類型的本文他處所述的白血病、貧血、淋巴瘤、骨髓瘤、免疫缺陷癥和實(shí)體瘤的個(gè)體。“個(gè)體”還包括干細(xì)胞移植或骨髓移植(例如在惡性疾病的治療過程期間或作為基因治療的組成部分)的備選者。個(gè)體還可以包括捐獻(xiàn)用于異體移植的干細(xì)胞或骨髓的個(gè)體或動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體可能已經(jīng)經(jīng)歷照射治療或化療，例如在各種癌癥治療期間。合適的個(gè)體(例如，患者)包括實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(諸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、和家養(yǎng)動(dòng)物或?qū)櫸?諸如貓或狗)。包括非人靈長(zhǎng)類，并優(yōu)選包括人類患者。典型的個(gè)體包括表現(xiàn)出異常水平(比“正常”或“健康”個(gè)體低或高的水平)的一種或多種生理活動(dòng)的動(dòng)物，所述生理活動(dòng)可以被試劑或干細(xì)胞或骨髓移植調(diào)節(jié)。
用于本文所述方法的給予細(xì)胞群體的合適的方法包括非腸道給藥，包括但不限于血管內(nèi)給藥，如靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)給藥。用于給予本發(fā)明的細(xì)胞的其他示例性方法包括肌內(nèi)，鞘內(nèi)，囊內(nèi)，眼窩內(nèi)，心臟內(nèi)，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，經(jīng)氣管，皮下，表皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，囊下，蛛網(wǎng)膜下，椎管內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。
向個(gè)體給予的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的“量”是指給予“有效的量”以實(shí)現(xiàn)所需治療或預(yù)防結(jié)果，包括但不限于對(duì)個(gè)體的治療。因此，對(duì)于本文目的，“治療有效量”的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的考慮因素確定，并且可以隨著諸如以下的因素而改變:個(gè)體的疾病狀態(tài)，年齡、性別和重量，以及造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在個(gè)體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力。術(shù)語“治療有效量”包括有效“治療”個(gè)體(例如患者)的量。治療有效量還是其中造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的任何有毒或有害效果被治療有益效果超過的量。
“預(yù)防有效量”是指有效地實(shí)現(xiàn)所需預(yù)防結(jié)果的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量。由于預(yù)防劑量在發(fā)病之前或疾病的早期階段在個(gè)體中使用，因此預(yù)防有效量通常少于治療有效量，但并非必然如此。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療需要造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞移植的個(gè)體的方法，包括:選擇需要造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞移植的個(gè)體，并將細(xì)胞群體給予個(gè)體，與非接觸的細(xì)胞相比，所述細(xì)胞群體已在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中植入和/或體內(nèi)增殖的溫度和時(shí)間下，與dmPGE2或具有dmPGE2活性的試劑離體接觸過。在具體實(shí)施方案中，所述個(gè)體需要造血重建。
如本文所用的，術(shù)語“治療(treatment) ”、“治療(treating) ”等是指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理效果，包括但不限于，實(shí)現(xiàn)疾病癥狀的改善或消除。效果可以是預(yù)防性的，表現(xiàn)為完全地或部分地預(yù)防疾病或其癥狀；和/或效果可以是治療性的，表現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)癥狀的改善或消除，或提供對(duì)疾病和/或歸因于疾病的不利影響的部分或完全治愈。如本文所用，“治療”包括對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人的疾病的任何治療，包括:(a)阻止可能傾向于患有疾病但還未被診斷患有該疾病的個(gè)體發(fā)??；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；(c)緩解疾病，例如，導(dǎo)致疾病的消退，例如，以完全或部分消除疾病的癥狀；及(d)使個(gè)體恢復(fù)至疾病前狀態(tài)，例如，重建造血系統(tǒng)。
如本文所用的“治療”，包括對(duì)疾病的癥狀或病理或病理狀態(tài)的任何所需效果，并且可包括在被治療的疾病或疾病狀況的一個(gè)或多個(gè)可測(cè)量標(biāo)記的甚至最小的減少?！爸委煛辈⒉槐厝槐硎炯膊』蚣膊顟B(tài)或其相關(guān)癥狀的徹底根除或治愈。在本發(fā)明的具體方法中，治療提供了細(xì)胞群體在個(gè)體中改善的植入，在個(gè)體中改善的造血重建或在個(gè)體中改善的存活。
需要這種類型治療的個(gè)體包括遭受(例如患有)非惡性血液病癥的個(gè)體,所述非惡性血液病癥特別是免疫缺陷(例如SCID，范可尼貧血，重度再生障礙性貧血，或先天性血紅蛋白病，或代謝蓄積疾病，如胡爾勒病，亨特氏病，甘露糖苷貯積癥等)或癌癥，特別是血液惡性腫瘤，如急性白血病，慢性白血病(髓系或淋巴系)，淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)，多發(fā)性骨髓瘤，骨髓增生異常綜合征，或非血液癌癥如乳腺癌，結(jié)腸癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤或腎細(xì)胞癌。
本發(fā)明的方法可以用于治療其中需要增加骨髓中造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的量或需要向骨髓動(dòng)員造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的任何疾病或病癥。例如，本發(fā)明的方法可用于治療需要骨髓移植或造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植的患者，如接受化療和/或放射療法的癌癥患者。本發(fā)明的方法對(duì)于治療接受癌癥化療或放射治療的患者是特別有用的，包括患有骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，和實(shí)體瘤(乳房癌，卵巢癌，腦癌，前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，皮膚癌，肝癌，或胰腺癌)的患者。本發(fā)明的方法也可用于治療患有再生障礙性貧血、免疫失調(diào)(嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷綜合征或狼瘡)，骨髓增生異常，地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病或維斯科特-奧爾德里奇綜合征的患者。通過本發(fā)明的方法治療的病癥可以是，另一種主要治療的不希望的副作用或并發(fā)癥的結(jié)果，所述另一種主要治療如放療，化療，或用骨髓抑制藥物如齊多夫定(zidovadine),氯霉素或更昔洛韋(gangciclovir)治療。這些病癥包括中性白細(xì)胞減少癥，貧血，血小板減少和免疫功能失調(diào)。此外，本發(fā)明的方法可用于治療由無意暴露于毒劑或輻射引起的骨髓損傷。
待治療的病癥也可以是造成骨髓干細(xì)胞或祖細(xì)胞損壞的感染(例如，病毒感染，細(xì)菌感染或真菌感染)的結(jié)果。
除了上述疾病狀態(tài)，可以受益于使用本發(fā)明的方法治療的其他疾病狀況包括但不限于，淋巴細(xì)胞減少癥，淋巴溢，淋巴瘀滯，紅細(xì)胞減少癥，紅細(xì)胞變性病癥，成紅細(xì)胞減少癥，幼白成紅細(xì)胞增多癥；紅細(xì)胞破碎，地中海貧血，骨髓纖維化，血小板減少癥，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，免疫(自身免疫性)血小板減少性紫癜(ITP)，HIV誘導(dǎo)的ITP，脊髓發(fā)育不良；血小板性疾病，血小板增多癥，先天性中性白細(xì)胞減少癥(如科斯特曼(Kostmann’s)綜合征和舒-戴二氏(Schwachman-Diamond)綜合征)，腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥,兒童和成人的循環(huán)中性粒細(xì)胞減少癥，感染后中性粒細(xì)胞減少癥，脊髓發(fā)育不良綜合征，與化療和放療相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥，慢性肉芽腫病，黏多糖癥，戴-布二氏(Diamond Blackfan)貧血，鐮狀細(xì)胞病或重型β地中海貧血。
在具體實(shí) 施方案，需要移植的患者是已經(jīng)捐獻(xiàn)骨髓的骨髓捐獻(xiàn)者，還未捐獻(xiàn)骨髓的骨髓捐獻(xiàn)者，骨髓捐獻(xiàn)者移植接受者，具有環(huán)境壓力下的造血祖細(xì)胞，患有貧血，與正常個(gè)體相比具有降低水平的免疫細(xì)胞功能，或具有免疫系統(tǒng)缺乏。
在某些實(shí)施方案中，需要移植的患者患有骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性髓細(xì)胞性白血病，慢性骨髓性白血病，慢性粒細(xì)胞白血病，急性成淋巴細(xì)胞白血病，急性非成淋巴細(xì)胞白血病，或白血病前期。
D.本發(fā)明的方法中使用的試劑
在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體的治療組合物，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的一種或多種試劑接觸過，所述試劑如刺激PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑。
使用cGMP規(guī)范，可用于制備本發(fā)明的治療組合物的試劑可以配制在有機(jī)溶劑如乙酸甲酯中，用于接觸本發(fā)明的細(xì)胞，并可以在不含內(nèi)毒素的容器中供給。如本文所述，本發(fā)明涉及的試劑適用于離體給予至哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述溶劑通常是本文所述的合適的有機(jī)溶劑(例如DMSO、DMF、DME等，包括其組合或混合物)。一種或多種溶劑可以按一定比例組合。例如，兩種溶劑的混合物可以按9.5:0.5,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5等比例組合，包括所有整數(shù)和小數(shù)點(diǎn)。
術(shù)語“有機(jī)溶劑”或“合適的有機(jī)溶劑” 一般涉及溶解固體，液體，或氣體溶質(zhì)從而得到溶液的含碳液體或氣體。“合適的”有機(jī)溶劑是適合離體給予哺乳動(dòng)物細(xì)胞或與其一起孵育的有機(jī)溶劑，并且也可能適合體內(nèi)給予個(gè)體，例如在選擇的濃度孵育或給藥一段時(shí)間的離體條件(例如，細(xì)胞培養(yǎng))下或體內(nèi)具有最小的毒性或其他抑制作用。合適的有機(jī)溶劑還應(yīng)該對(duì)貯存穩(wěn)定性和處理本文所述的試劑是合適的。合適的有機(jī)溶劑的例子包括，但不限于二甲基亞砜(DMSO)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲氧基乙烷(DME)，和二甲基乙酰胺，包括它們的混合物或組合。在某些實(shí)施方案中，組合物或有機(jī)溶劑“基本上不含”乙酸甲酯，這意味著在所述組合物或溶劑中不應(yīng)該有多于痕量的乙酸甲酯，并優(yōu)選檢測(cè)不到的量(例如，通過高壓液相色譜法(HPLC)，氣相色譜(GC)等測(cè)量)。
如本文所用，術(shù)語“不含內(nèi)毒素”是指容器和/或組合物包含至多痕量(即，對(duì)個(gè)體不具有不利的生理效應(yīng)的量)的內(nèi)毒素，優(yōu)選檢不出量的內(nèi)毒素?！盎旧喜缓瑑?nèi)毒素”是指比FDA允許的生物制劑的內(nèi)毒素(總內(nèi)毒素為每天5EU/kg體重，對(duì)于平均70kg的人為350EU/總劑量的細(xì)胞)更少的內(nèi)毒素/劑細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，術(shù)語“不含內(nèi)毒素”是指容器和/或組合物至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%不含內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是與某些細(xì)菌(通常是革蘭氏陰性菌)相關(guān)的毒素，但是內(nèi)毒素也可能存在于革蘭氏陽性細(xì)菌如單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogene)中。最普遍的內(nèi)毒素是存在于各種革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，并且其代表這些細(xì)菌引起疾病的能力的核心致病特征。少量?jī)?nèi)毒素在人體中可以產(chǎn)生發(fā)熱，降低血壓以及激活發(fā)炎和凝血等不利生理效應(yīng)。因此，通常希望從藥品容器中除去大部分或全部痕量?jī)?nèi)毒素，因?yàn)榧词股倭恳部赡茉谌梭w造成不良影響?？梢允褂迷诒绢I(lǐng)域中已知的方法從容器除去內(nèi)毒素，例如，容器可以在HEPA過濾的洗滌設(shè)備中用不含內(nèi)毒素的水清洗，在250° C去除熱原，并在100/10級(jí)潔凈室(例如，100級(jí)潔凈室，在每立方英尺的空氣中包含不超過100個(gè)大于半微米的顆粒)中的HEPA過濾工作站中清潔包裝。
如本文所用，術(shù)語“優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP) ”是指食品，醫(yī)藥產(chǎn)品和醫(yī)療設(shè)備的生產(chǎn)控制和管理以及質(zhì)量控制檢驗(yàn)。GMP不必然依賴于采樣，而是依賴于藥品和醫(yī)療器械制造涉及的工藝，活動(dòng)和操作的每一個(gè)環(huán)節(jié)的文件記載。如果文件記載表明制造和測(cè)試產(chǎn)品的方式(這使得有可追溯性，并在將來出現(xiàn)問題的情況下，可以從市場(chǎng)召回)是不正確和不妥當(dāng)?shù)模敲丛摦a(chǎn)品不符合所要求的規(guī)格，并被認(rèn)為是被污染的(即，在美國(guó)是摻假的)。此夕卜，GMP通常要求所有的生產(chǎn)和檢測(cè)設(shè)備已經(jīng)被認(rèn)定為適合使用，并且在藥品生產(chǎn)過程中使用的所有操作方法和程序(如制造，清潔和分析測(cè)試)已經(jīng)根據(jù)預(yù)先確定的規(guī)格驗(yàn)證，以證明它們能夠履行其聲稱的功能。在美國(guó)，措辭“現(xiàn)行的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范”出現(xiàn)在1938年的《食品、藥品和化妝品法》501 (B)中(21USC§351)。
可以用于制備本發(fā)明的治療組合物的試劑是能夠增強(qiáng)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體的歸巢和植入潛力的試劑。這些試劑 包括增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑，包括刺激PGE2R2和/或PGE2R4細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的試劑。有用的試劑包括，但不限于PGE2和具有dmPGE2活性的試劑，例如PGE2類似物，cAMP的類似物或增強(qiáng)劑，和Ga-S激活劑。在某些實(shí)施方案中，PGE2R4特異的類似物是特別感興趣的，并且在一些實(shí)施方案中，試劑優(yōu)先結(jié)合并激活PGE2E4受體。
如本文所用，術(shù)語“前列腺素E2”或“PGE2”包括但不限于，任何天然存在的或化學(xué)合成的PGE2分子，以及它們的“類似物”。如本文所用，術(shù)語“類似物”涉及這樣的化學(xué)分子，其結(jié)構(gòu)和功能與另一化學(xué)物質(zhì)例如PGE2類似，通常在結(jié)構(gòu)上有單一的元素或基團(tuán)的不同，但也可以通過修飾多于一個(gè)基團(tuán)(例如，2，3，或4個(gè)基團(tuán))而不同，前提是其保留與親本化學(xué)品相同的功能。這樣的修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的，并包括，例如，另外的或取代的化學(xué)部分，如酸的酯或酰胺，保護(hù)基團(tuán)，如對(duì)于醇或硫醇為芐基，對(duì)于胺為叔丁氧羰基。還包括的是對(duì)烷基側(cè)鏈的修飾，如烷基取代(例如，甲基，二甲基，乙基等)，對(duì)側(cè)鏈的飽和或不飽和水平的修飾，和添加修飾基團(tuán)，如取代的苯基和苯氧基。類似物也包括偶聯(lián)物，如生物素或抗生物素蛋白部分，酶如辣根過氧化物酶等，并且包括放射性標(biāo)記部分，生物發(fā)光部分，化學(xué)發(fā)光部分或熒光部分。此外，部分可以被添加至本文所述的試劑，以改變它們的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如增加體內(nèi)或離體半衰期，或增加他們的細(xì)胞滲透性能等其他所需性質(zhì)。還包括的是前藥，已知它們?cè)鰪?qiáng)藥物的許多所需品質(zhì)(例如，溶解度，生物利用度，制造等)(參見，例如，W0/2006/047476的示例性的EP激動(dòng)劑前藥，將對(duì)這類激動(dòng)劑的披露通過引用并入本文)。
PGE2 “類似物”和具有dmPGE2活性的試劑的示例性例子包括，但不限于，16，16- 二甲基PGE2(ClmPGE2)，16，16- 二甲基PGE2對(duì)(對(duì)乙酰胺苯甲酰胺)苯基酯，11-脫氧-16，16- 二甲基PGE2,9-脫氧-9-亞甲基-16，16- 二甲基PGE2,9-脫氧-9-亞甲基PGE2,9-酮氟前列醇，5-反式PGE2,17-苯基-ω-拉坦(trinor) PGE2, PGE2絲氨醇酰胺，PGE2甲基酉旨，16-苯基 tetranor PGE2,15 (S)-15-甲基 PGE2,15 (R)-15-甲基 PGE2,8-異-15-酮 PGE2,8-異PGE2異丙酯，20-輕基PGE2,11-脫氧PGEI,諾氯如列素，硫如列酮，布他如列素，15-酮PGE2,和19 (R) 羥基PGE2。還包括與PGE2具有類似結(jié)構(gòu)的用鹵素在9-位上取代的PG類似物或衍生物(參見，例如，W02001/12596，其全部?jī)?nèi)容通過弓I用并入本文)，以及2-脫羧-2-磷酸亞基前列腺素衍生物，如在美國(guó)專利公開第2006/0247214號(hào)中描述的那些，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文)。
PGEl類似物，包括但不限于前列地爾(alprostadil)，也可以被用來激活PGE2R2 (EP2)和PGE2R4 (EP4)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，并考慮作為可用于本發(fā)明方法的試劑。
對(duì)PGE2R2 (EP2)和PGE2R4 (EP4)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的刺激/激活被認(rèn)為是增加細(xì)胞植入，維持細(xì)胞活力及增加細(xì)胞的歸巢和增殖的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的生理反應(yīng)基礎(chǔ)。因此，在一實(shí)施方案中，結(jié)合并刺激PGE2R2和PGE2R4受體的“非PGE2基配體”(即，PGE2R2/PGE2R4激動(dòng)劑)被考慮用于本發(fā)明的方法中。
非PGE2基EP2受體激動(dòng)劑的示例性的實(shí)例包括W02007/071456中所公開的CAY10399, 0N0_8815Ly, 0N0-AE1-259, CP-533, 536 和咔唑和芴。
非PGE2基EP4激動(dòng)劑的示例性實(shí)例包括W0/2000/038663 ;美國(guó)專利號(hào)6747037 ;和美國(guó)專利號(hào) 6610719 中公開的 0N0-4819，APS-999Na，AH23848，0N0-AEl-329，和其他非 PGE2基EP4激動(dòng)劑。
選擇用于PGE2EP4受體的試劑優(yōu)先結(jié)合PGE2EP4受體。這類試劑對(duì)EP4受體比對(duì)任何其他三個(gè)EP受體(即EP1, EP2和EP3)有更高的親和力。選擇性結(jié)合PGE EP4受體的試劑，包括但不限于選自以下的試劑:5-[ (1E，3R) -4，4- 二氟-3-羥基-4-苯基-1- 丁烯-1-基]-1-[6- (2H-四唑基-5R-基)己基]-2-吡咯烷酮，2-[3-[ (IR, 2S, 3R) -3-羥基-2-[(E，3S)-3-羥基-5-[2-(甲氧基甲基)苯基]戊-1-烯基]-5-氧代環(huán)戊基磺?；酋；鵠乙酸，4-[2-[(IR，2R, 3R)-3-羥基_2_[(E，3S)-3-羥基_4-[3_(甲氧基甲基)苯基]-1-烯基]-5-氧代環(huán)戊基]乙基磺?；鵠丁酸甲酯，16-(3-甲氧基甲基)苯基-P-tetranor-5-thiaPGE ;5_{3_[ (2S)-2-{(3R)-3-羥基 _4-[3_(三氟甲基)苯基]丁基} -5-氧代吡咯烷-1-基]丙基]噻吩-2-羧酸酯；[4’ - [3- 丁基-5-氧代-1- (2-三氟甲基苯基)-1,5-二氫-[1，2，4]三唑-4-基甲基]-聯(lián)苯基-2-磺酸(3-甲基-噻吩_2_羰基)-酰胺];和((Z) -7- {(IR, 4S, 5R) -5- [ (E) -5- (3-氯-苯并[b]噻吩-2-基)-3-羥基-戊-1-烯基]-4-羥基-3，3- 二甲基-2-氧代-環(huán)戊基}-庚-5-烯酸)，以及任何這些試劑的藥學(xué)上可接受的鹽。
“環(huán)AMP(cAMP)增強(qiáng)劑”是指這樣的分子:與沒有試劑或?qū)φ辗肿?組合物相比，其在細(xì)胞中產(chǎn)生或?qū)е赂罅康腸AMP,或在細(xì)胞中產(chǎn)生或?qū)е赂罅康腸AMP活性,或產(chǎn)生或?qū)е耤AMP相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的任何其他相關(guān)組分，或產(chǎn)生或?qū)е耤AMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的可測(cè)量的下游生理應(yīng)答或效應(yīng)。在具體實(shí)施方案中，具有dmPGE2活性的試劑是cAMP類似物或增強(qiáng)劑。
本發(fā)明的cAMP增強(qiáng)劑通常會(huì)增加或維持cAMP的細(xì)胞內(nèi)水平和/或活性。最普遍的是，環(huán)腺苷單磷酸(cAMP，環(huán)AMP或3’-5’-環(huán)腺苷單磷酸)在許多生物過程中作為重要的第二信使。第二信使系統(tǒng)涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，可擴(kuò)散的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在某些激活信號(hào)下迅速產(chǎn)生/分泌，該分子然后可以激活細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白以發(fā)揮細(xì)胞應(yīng)答。比如，除了其他應(yīng)答外，cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還會(huì)傳遞前列腺素的效應(yīng)，該效應(yīng)原本不能穿越過細(xì)胞膜。cAMP還調(diào)節(jié)Ca2+通過離子通道。
可測(cè)量的下游效應(yīng)可以包括更強(qiáng)的干細(xì)胞活力，增殖或擴(kuò)增，自我更新和植入，以及根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)的理解和本文的描述而顯而易見的其他效應(yīng)。cAMP增強(qiáng)劑可包括“激動(dòng)劑”和“拮抗劑”，激動(dòng)劑通常結(jié)合細(xì)胞的受體或其他分子，并觸發(fā)該細(xì)胞的應(yīng)答，拮抗劑通常對(duì)抗和阻止/抑制某個(gè)作用，如通過阻止cAMP的降解(例如阻止磷酸二酯酶)。也考慮cAMP類似物。
cAMP活性也可 以通過多種機(jī)制被負(fù)調(diào)控。比如，Ga-s亞基慢慢催化GTP水解為GDP7GDP反過來又使Gs蛋白失活，從而切斷cAMP通路。也可通過直接抑制腺苷酸環(huán)化酶或通過使由PKA磷酸化的蛋白去磷酸化，而使cAMP通路在下游失活。可以由腺苷酸環(huán)化酶的抑制性G(Gi)蛋白偶聯(lián)受體的激動(dòng)劑抑制腺苷酸環(huán)化酶，并由此抑制cAMP產(chǎn)生。cAMP被磷酸二酯酶催化分解成AMP，磷酸二酯酶也作為cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑。
抑制cAMP通路的分子的示例性實(shí)例包括，例如cAMP磷酸二酯酶，其將cAMP去磷酸化為AMP，從而降低cAMP水平A蛋白，其抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而降低cAMP水平；和百日咳毒素，其降低cAMP水平。
本發(fā)明的cAMP增強(qiáng)劑通常能夠在cAMP通路的任何階段激活該通路，或者可以防止cAMP的負(fù)調(diào)節(jié)(例如，降解)，并包括化學(xué)品，多肽，抗體，和其他具有這樣作用效果的分子。激活cAMP通路的示例性的分子或試劑可包括，例如，霍亂毒素，其增加cAMP的水平；毛喉素(forskolin)，其為激活腺苷酸環(huán)化酶的雙萜天然產(chǎn)物；以及咖啡因和茶堿，其抑制cAMP磷酸二酯酶，導(dǎo)致隨后激活cAMP通路的G蛋白被激活。
cAMP增強(qiáng)劑的示例性的實(shí)例包括，但不限于佛波酯，毛喉素，sclareline，8-溴-cAMP,霍亂毒素(CTx),氨茶堿,2，4-二硝基苯酹(DNP),去甲腎上腺素，腎上腺素,異丙腎上腺素，異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)，咖啡因，茶堿(二甲基黃嘌呤)，多巴胺，咯利普蘭，伊洛前列素，前列腺素E1,前列腺素E2,垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)，和血管活性腸多肽(VIP)，以及現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他cAMP增強(qiáng)劑。如上面所列舉的，cAMP增強(qiáng)劑的實(shí)例還包括cAMP和 cAMP 的類似物，例如 sp-5, 6-DC1-BIMPS(BIMPS)和二丁酰cAMP(dbcAMP)等。
cAMP參與培養(yǎng)物中造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或存活(參見，例如，Negrotto etal., Experimental Hematology34:1420-1428, 2006,其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文)。例如,觀察到 兩種不同的cAMP類似物，如二丁酰-cAMP和BMPS，通過抑制由一氧化氮(NO)或血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而促進(jìn)人臍帶來源的⑶34+細(xì)胞的存活。PKA和PI3K通路的參已通過他們各自的特異性抑制劑RP-cAMP和渥曼青霉素或LY294002逆轉(zhuǎn)BMPS的抗凋亡作用的能力而被證實(shí)。雖然血小板生成素(TPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，或干細(xì)胞因子(SCF)并不會(huì)增加cAMP的水平，但是這些生長(zhǎng)因子所施加的抗凋亡活性被對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制所阻斷并與BMPS協(xié)同作用。因此，環(huán)AMP類似物抑制暴露于NO或血清剝奪的細(xì)胞中降低的集落形成，表明cAMP似乎不僅是控制CD34+存活的關(guān)鍵途徑，還是TPO，G-CSF和SCF-介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的介質(zhì)。
同樣地，cAMP的激活，如通過骨髓細(xì)胞移植后不久注射異丙腎上腺素(刺激腺苷酸環(huán)化酶)或二丁酰環(huán)腺苷_3’，5’ -單磷酸，會(huì)幾乎立即通過誘導(dǎo)DNA合成觸發(fā)移植的干細(xì)胞進(jìn)入 S 期(參見，例如，Necas et al., Cell Proliferation, 9:223-230，2008，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文)。
“G a -s激活劑或激活試劑”或“G_蛋白a _s激活劑或激活試劑”包括能夠激活刺激性G蛋白(“G a -s”)或G a -S變體的α亞基的任何分子。G a -s激活劑的示例性實(shí)例包括PGE2及其激動(dòng)劑和衍生物，和霍亂毒素。在具體實(shí)施方案中，具有dmPGE2活性的試劑是G a -S激活劑。
因此，包含PGE2和具有dmPGE2活性的試劑(例如，dmPGE類似物，cAMP類似物或增強(qiáng)劑，和/或Ga -S激活劑)的本發(fā)明的組合物，可以用于保持或維持細(xì)胞活力，并增加造血干細(xì)胞的植入，歸巢，自我更新和/或體內(nèi)增殖。
因此，在具體實(shí)施方案中，通過使造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞離體或體外接觸沒有限制的任意具體組合形式的PGE2及其類似物(例如，dmPGE2)和具有dmPGE2活性的試劑，增加了該細(xì)胞的植入/植入潛力和/或體內(nèi)增殖。
在具體實(shí)施方案中，用一種或多種試劑處理(例如，接觸)細(xì)胞群體，每種試劑的最終濃度為約I μΜ至約100 μ Μ。在某些實(shí)施方案中，用一種或多種藥劑處理細(xì)胞群體，每種藥劑的最終濃度為約I X KT14M至約I X 10 約I X KT13M至約I X I(T4M,約I X KT12M至約 I X 1(Γ5Μ，約 I X 1(ΓηΜ 至約 I X 1(Γ4Μ，約 I X KT11M 至約 I X 1(Γ5Μ，約 I X 1(Γ10Μ 至約I X 1(Γ4Μ，約 I X 1(Γ10Μ 至約 I X 1(Γ5Μ，約 I X KT9M 至約 I X 1(Γ4Μ，約 I X KT9M 至約 I X I(T5M,約I X KT8M到約I X 1(Γ4Μ，約I X KT7M至約I X I(T4M,約I X KT6M至約I X I(T4M,或任何中間范圍的最終濃度。
在另一具體實(shí)施方案中，用一種或多種試劑處理細(xì)胞群體，每種試劑的最終濃度為約 I X I(T14M,約 I X I(T13M,約 I X I(T12M,約 I X 1(Γ10Μ，約 I X I(T9M,約 I X I(T8M,約 I X KT7M至約I X IO-6M,約I X IO-5M,約I X 1(Γ4Μ，約I X 10 或任何中間的最終濃度。在包括一種或多種試劑的治療中，激動(dòng)劑可以彼此為不同的濃度，或?yàn)橄嗤臐舛取?br> 在具體實(shí)施方案中，細(xì)胞群體被處理(例如，與一種或多種試劑接觸)1，2，3，4，5，6，7，8，9或10或更多次。細(xì)胞群體可以與一種或多種試劑在同一容器內(nèi)間歇地，不連貫地或依次地接觸(例如，使細(xì)胞群體與一種藥物接觸一段時(shí)間，更換培養(yǎng)基和/或洗滌細(xì)胞群體，然后用相同或不同的藥劑組合將此循環(huán)重復(fù)相同的預(yù)定時(shí)間段或不同的預(yù)定時(shí)間段)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用終濃度約10μ M的PGE2R2或PGE2R4激動(dòng)劑(例如，16，16- 二甲基PGE2)在約37。C處理細(xì)胞群體2小時(shí)。
示例性的處理時(shí)長(zhǎng)一般包括約I小時(shí)，約2小時(shí)，或約3小時(shí)的處理時(shí)間。
在具體實(shí)施方案中，可以將在本發(fā)明中有用的試劑從第一容器轉(zhuǎn)移至第二容器，其中所述第二容器是具有特氟龍(teflon)蓋的2mL小瓶，該小瓶不含內(nèi)毒素并適用于試劑的存儲(chǔ)或離體給藥，其中所述試劑是在基本上不含乙酸甲酯的二甲亞砜(DMSO)中提供的約IOmM存儲(chǔ)濃度的16，16-二甲基PGE2，并且其中在該小瓶中有空氣覆蓋。優(yōu)選地，整個(gè)組合物，包括容器和溶劑在內(nèi)，均是無菌和不含內(nèi)毒素的。
在某些實(shí)施方案中，所述第二或另一容器可以裝有包括造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞，外周血細(xì)·胞，或臍帶血細(xì)胞。因此，這些和其它實(shí)施方案可能涉及將所述組合物從第一或初始容器轉(zhuǎn)移至第二容器，所述第二容器適用于離體處理?xiàng)l件并裝有在合適的培養(yǎng)基中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞?；蛘?，可以將人細(xì)胞群體轉(zhuǎn)移到已經(jīng)包含所述組合物并已經(jīng)適合離體處理或孵育條件的第一或第二容器中，如PE袋或管。
E.本發(fā)明的給藥就緒組合物
本發(fā)明的治療組合物是無菌的，并且適合和準(zhǔn)備好向病人給藥(即沒有任何進(jìn)一步處理的情況下可以給予)。在一些實(shí)施方案中，治療組合物準(zhǔn)備好輸注到患者體內(nèi)。如本文所用，術(shù)語“給藥就緒”，“準(zhǔn)備好給藥”或“準(zhǔn)備好輸注”是指本發(fā)明的基于細(xì)胞的組合物在移植或給予個(gè)體之前不需要任何進(jìn)一步的處理或操作。
適合向患者給藥的無菌的治療學(xué)上可接受的組合物可以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑(例如，藥學(xué)上可接受的介質(zhì)，例如，細(xì)胞培養(yǎng)基)，或其他藥學(xué)上可接受的成分。藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑部分地取決于被給予的具體組合物，以及用于給予治療組合物的具體方法。因此，存在本發(fā)明的治療組合物的各種各樣的合適的制劑(例如,參見Remington’s PhaRmaceutical Sciences (雷明頓制藥科學(xué))，第 17 版，1985))。
在具體的實(shí)施方案中，包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的治療性細(xì)胞組合物包含藥學(xué)上可接受的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的包含基于細(xì)胞的組合物的治療組合物可通過腸內(nèi)或非腸道給藥方法另行給藥，或與其它合適的化合物聯(lián)合給藥，以實(shí)現(xiàn)所需的治療目標(biāo)。
藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑必須有足夠高的純度和足夠低的毒性，以使其適合給予被治療的人類個(gè)體。它還應(yīng)該維持或增加治療組合物的穩(wěn)定性。當(dāng)與本發(fā)明的治療組合物的其它組分組合時(shí)，藥學(xué)上可接受的載體可以是液體或固體，并根據(jù)考慮的計(jì)劃給藥方式選擇，以提供所希望的體積，稠度等。例如，藥學(xué)上可接受的載體可以是，但不限于，結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)，填充劑(例如，乳糖和其它糖，微晶纖維素，果膠，明膠，鈣硫酸酯，乙基纖維素，聚丙烯酸酯，磷酸氫鈣等)，潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石，二氧化硅，膠體二氧化硅，硬脂酸，硬脂酸金屬鹽，氫化植物油，玉米淀粉，聚乙二醇，苯甲酸鈉，醋酸鈉等)，崩解劑(例如，淀粉，淀粉羧乙酸鈉等)，或潤(rùn)濕劑(例如，月桂基硫酸鈉等)。本發(fā)明的組合物的其它合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于，水，鹽溶液，醇，聚乙二醇，明膠，直鏈淀粉，硬脂酸鎂，滑石，硅酸，粘性石蠟，羥甲基纖維素，聚乙烯基吡咯烷酮等。
這樣的載體溶液也可以含有緩沖液，稀釋劑和其它合適的添加劑。本文所用的術(shù)語“緩沖液”指的是其化學(xué)組成會(huì)中和酸或堿而沒有顯著PH值變化的溶液或液體。本發(fā)明所考慮到的緩沖液的實(shí)例包括但不限于，杜爾貝科氏磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，林格氏溶液，5%葡萄糖水(D5W)，正常/生理鹽水(0.9%NaCl)。
這些藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑可以以足以將治療組合物的pH值維持在約3至約10之間的量存在。因此，緩沖劑可以是高達(dá)基于總組合物約5%的重量比。電解質(zhì)，例如但不限于，氯化鈉和氯化鉀，也可以包含在治療組合物中。
在一方面中，治療組合物的pH值范圍是約4至約10?；蛘?，治療組合物的pH值范圍是約5至約9，約6至約9，或約6.5至約8。在另一實(shí)施方案中，治療組合物包含具有在一個(gè)所述PH值范圍中的pH值的緩沖液。在另一實(shí)施方案中，治療組合物的pH值為約7。或者，治療組合物的PH范圍是約6.8至約7.4。在又一實(shí)施方案中，治療組合物的pH值為約 7.4。
本發(fā)明的無菌組合物，可以是無毒的藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中的無菌溶液或懸浮液。本文所用的術(shù)語“懸浮”可指在其中細(xì)胞不附著到固體支持物的非粘附狀態(tài)。例如，保持懸浮的細(xì)胞可被攪拌并不粘附到支持物，如培養(yǎng)皿。
懸浮液是其中細(xì)小的物質(zhì)與另一物質(zhì)結(jié)合的分散系(混合物)，同時(shí)細(xì)小的物質(zhì)是如此細(xì)小并被充分混合，因此它不會(huì)快速沉降?？梢允褂妹浇槲?，如液體介質(zhì)(包括溶液)來制備懸浮液。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物是懸浮液，其中造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分散在可接受的液體 介質(zhì)或溶液例如鹽水或無血清培養(yǎng)基中，并沒有附著到固體支持物。在日常生活中，最常見的懸浮液是液態(tài)水中的固體懸浮液。在可接受的稀釋劑中，例如，媒介物及溶劑，可以采用的是水，林格氏溶液，等滲氯化鈉(鹽水)溶液及無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，采用高滲溶液來制備懸浮液。此外，無菌的固定油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。對(duì)于非腸道應(yīng)用，特別合適的媒介物包括溶液，優(yōu)選油性或水性溶液，以及懸浮液，乳液或植入物。水性懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。在一些實(shí)施方案中，輸注溶液對(duì)個(gè)體組織是等滲的。在一些實(shí)施方案中，輸注溶液對(duì)個(gè)體組織是高滲的。
構(gòu)成本發(fā)明的給藥就緒的治療組合物的藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑和其它組分，來自使治療組合物可用于臨床治療方案的美國(guó)藥品級(jí)試劑。通常情況下，在使用之前，將這些成品試劑(包括任何介質(zhì)，溶液，或其他藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑)通過本領(lǐng)域中常用的方式滅菌，如過濾滅菌，并測(cè)試各種不希望的污染物，如支原體，內(nèi)毒素，或病毒的污染。在一實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體基本上不含人或動(dòng)物來源的天然蛋白質(zhì)，并且適合存儲(chǔ)治療組合物的包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體。擬將治療組合物給予病人，因而該治療組合物基本上不含如牛血清白蛋白，馬血清和胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基組分。
本發(fā)明還部分地考慮到，本發(fā)明的具體組合物和/或培養(yǎng)物中的藥學(xué)上可接受的細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用。這樣的組合物適合向人類個(gè)體給藥。一般來說，支持本發(fā)明的所需重編程和/或編程的細(xì)胞的維持，生長(zhǎng)和/或健康的任何介質(zhì)均適合用作藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的細(xì)胞培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
治療組合物可以包含適于保存構(gòu)成該組合物的細(xì)胞群體的無血清培養(yǎng)基。與含血清培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括:組成簡(jiǎn)單且成分更清楚，污染物數(shù)量減少，傳染原的潛在來源被消除，并且成本更低。在多個(gè)實(shí)施方案中，無血清培養(yǎng)基是無動(dòng)物成分的，并任選地不含蛋白質(zhì)。任選地，培養(yǎng)基可以包含生物藥學(xué)上可接受的重組蛋白質(zhì)?！盁o動(dòng)物成分的”培養(yǎng)基是指其中組分來自非動(dòng)物來源的培養(yǎng)基。在無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中，用重組蛋白取代天然動(dòng)物蛋白，并且營(yíng)養(yǎng)素獲自合成，植物或微生物來源。相比之下，無蛋白培養(yǎng)基被定義為基本上不含蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中采用的無血清培養(yǎng)基是適合用于人類治療程序和產(chǎn)品的制劑。一種無血清培養(yǎng)基是QBSF-60 (Quality Biological, Inc.)，如美國(guó)專利號(hào)5945337中描述的。QBSF-60用美國(guó)藥品級(jí)組分優(yōu)化，并由以下組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)基MDM加2mM的L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，人注射級(jí)血清白蛋白(4mg/mL) (AlphaTherapeutic Corporation),部分鐵飽和人轉(zhuǎn)鐵蛋白(300 μ g/mL (Sigma ChemicalCorporation or Bayer Corporation)和重組人膜島素鈉(0.48U/mL) (Sigma)。本領(lǐng)域中已知的其他無血清培養(yǎng)基包括但不限于:Life Technologies公司編號(hào)StemPRo_34的無血清培養(yǎng)基；Capmany, et al., Short-term, serum-free, static culture of cordblood-derived CD34+cells: effects of FLT3-L and MIP-1 a on in vitro expansionof hematopoieticprogenitor cells, Haematologica84:675-682(1999) ;Daley, J P,etal., Ex vivo expansion of human hematopoietic progenitor cells in serum-freeStemProTM-34Medium, Focus 18 (3): 62-67; Life Technologies 有關(guān) AIM V 無血清培養(yǎng)基的目錄信息;BioWhittaker有關(guān)X-VIV010無血清培養(yǎng)基的目錄信息;5，397，706，標(biāo)題為 Serum-free basal and culture medium for hematopoietic and leukemiacells;沒有細(xì)胞擴(kuò)增；Kurtzberg et al., 18:153-4 (2000) ; Kurtzberg et al., ExpHemato126(4):288-98(A pril1998)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，上面的培養(yǎng)基實(shí)例是示例性的，而不以任何方式限制適合于在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基的制劑，并有很多在本領(lǐng)域中公知的和可用的這類培養(yǎng)基。
在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物包含人血清白蛋白(HSA)(如5%HSA)和低分子量(LMW)葡聚糖的無菌溶液。
所述治療組合物基本上沒有支原體，內(nèi)毒素和微生物污染。在具體的實(shí)施方案中，治療組合物包含少于約10，5，4，3，2，I，0.1,0.05 μ g/mL的牛血清白蛋白。
對(duì)于內(nèi)毒素，“基本上不含”是指比FDA允許的生物制劑的內(nèi)毒素(總內(nèi)毒素為每天5EU/kg體重，對(duì)于平均70kg的人為350EU/總劑量的細(xì)胞)更少的內(nèi)毒素/劑細(xì)胞。
對(duì)于支原體和微生物污染，本文所用的“基本上沒有”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普遍接受的測(cè)試的陰性讀值。例如，通過將治療組合物樣品在肉湯培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，并在37° C下在第1，3，7，和14天與合適的陽性和陰性對(duì)照涂布在瓊脂平板上來確定支原體污染。在100倍顯微鏡下將樣品的外觀與陽性和陰性對(duì)照的外觀進(jìn)行比較。此外，將指示細(xì)胞培養(yǎng)物的接種物孵育3和5天，并使用結(jié)合DNA的熒光染料，通過熒光顯微鏡在600倍下檢查支原體的存在。如果瓊脂和/或肉湯培養(yǎng)基方法和指示細(xì)胞培養(yǎng)方法均未顯示支原體污染的證據(jù)，則樣品被認(rèn)為是令人滿意的。
本發(fā)明的治療組合物是HLA分型的，并且可以匹配或部分匹配移植的特定患者。HLA類型是指被稱為人白細(xì)胞抗原的獨(dú)特蛋白質(zhì)集。這些蛋白存在于每個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞上，并允許免疫系統(tǒng)識(shí)別“自我的”和“外來的”。給予被識(shí)別為外來的細(xì)胞或組織可能導(dǎo)致相容性問題，如免疫排斥反應(yīng)或移植物抗宿主病(GVHD)。因此，HLA類型和匹配在器官和組織移植中特別重要。
有六種主要的HLA(HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR，HLA-DP,和 HLA-DQ)。在人群中，每種HLA抗原有多種亞型，并且由于我們的基因組的二倍體性質(zhì)，對(duì)每種HLA，每個(gè)個(gè)體可以有兩個(gè)不同亞型。因此，完全匹配將匹配12/12個(gè)亞型。從預(yù)期接受者的同一個(gè)體或同卵雙生個(gè)體捐獻(xiàn)的細(xì)胞或組織將有完美的HLA類型，被稱為同系基因的或自體的。還可以理解，包括但不限于民族背景和種族的某些因素與某些HLA類型相關(guān)。
存在許多主要和次要HLA亞型，并且應(yīng)當(dāng)理解，合適的匹配可以包括一小組主要HLA,所有主要HLA，一些或所有的主要和次要HLA或本領(lǐng)域公知的緩解免疫排斥或GVDH的任何組合之間的匹配。還應(yīng)當(dāng)理解，什么構(gòu)成良好的HLA類型匹配的具體指導(dǎo)方針取決于很多因素。因此， 必須由本領(lǐng)域的技術(shù)人員做出判斷以評(píng)估給定的細(xì)胞或組織樣品移植到給定的個(gè)體中的適用性。
可以使用所謂的低分辨率方法(例如，通過血清分型)或使用基于抗體的方法來確定HLA類型。血清分型是基于HLA類型的抗體識(shí)別。血清分型可以區(qū)分28種不同的HLA-A基因，59種HLA-B基因和21種HLA-C基因。血清分型方法的完美匹配是所謂的6/6個(gè)匹配，指存在于每個(gè)個(gè)體中的每種HLA(A，BjPC)的兩個(gè)等位基因。在某些情況下，5/6個(gè)匹配或更少的匹配可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定認(rèn)為是良好匹配。
確定HLA類型的其他低或中分辨率方法檢查個(gè)體的HLA亞型，但不依賴于確定個(gè)體的HLA等位基因的實(shí)際序列。通常情況下，捐獻(xiàn)者與接受樣品的個(gè)體有關(guān)，在這種情況下僅血清分型或與其他的低或中分辨率方法組合，可能足以確定樣品是否適合移植。在其他情況下，5/6個(gè)匹配或更低的匹配容易找到，但完美的匹配不容易找到。在這種情況下，可能有利的是，使用低匹配的細(xì)胞或組織，而不是花費(fèi)時(shí)間和努力尋找更好的HLA類型匹配。
高分辨率方法涉及檢查HLA基因或基因的表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì)或RNA)的具體序列。高分辨率方法可以區(qū)分成千上萬種不同的亞型。
在最低限度，對(duì)治療組合物的HLA分型在例如低分辨率/分割抗原水平對(duì)6種HLA基因座HLA-A，-B,和-DR進(jìn)行。
基于DNA的檢測(cè)方法可用于HLA-DR分型。基于DNA的檢測(cè)可用于HLA-A和-B。對(duì)患者，家庭分型及確認(rèn)潛在的無關(guān)系的捐獻(xiàn)者的HLA類型的移植核心指導(dǎo)方針包括:主要利用基于DNA的檢測(cè)方法對(duì)HLA-A，B,和-DR基因座進(jìn)行分型，對(duì)于DRBl，以等位基因水平分辨率進(jìn)行，對(duì)于HLA-A和-B，以低分辨率/分割抗原水平進(jìn)行。對(duì)患者和選定的捐獻(xiàn)者的分型可以使用同一系列的試劑，方法和解釋標(biāo)準(zhǔn)，利用新鮮組織樣品進(jìn)行，以確保HLA的一致性。遵守HLA檢測(cè)的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制。
在多個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞群體包含單體分型的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。在一些的實(shí)施方案中，構(gòu)成治療組合物的細(xì)胞群體是基于HLA-A，HLA-B7HLA-C和HLA-DRBl進(jìn)行HLA分型的。在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞群體是基于由HLA-DRB3/4/5，HLA-DQBl和DPBl組成的組進(jìn)行HLA分型的。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)成治療組合物的細(xì)胞群體與特定的人患者匹配。在一些實(shí)施方案中，HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體具有4/6個(gè)HLA匹配。HLA匹配可以基于等位基因或抗原或其組合。在一些實(shí)施方案中，HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體部分錯(cuò)配，所述個(gè)體是例如給予治療組合物的個(gè)體。
本發(fā)明的治療組合物能夠從FDA( BP,FDA批準(zhǔn))及其他國(guó)家和監(jiān)管地區(qū)的其他衛(wèi)生當(dāng)局獲得生產(chǎn)許可，以及表征關(guān)于產(chǎn)品適應(yīng)癥，產(chǎn)品功效，安全性和純度的信息的產(chǎn)品標(biāo)簽。FDA許可可能是基于細(xì)胞劑量和HLA錯(cuò)配。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)本發(fā)明的治療組合物進(jìn)行處理、冷凍保存，滅菌并作出標(biāo)記，例如，RH和ABO分型，HLA分型和A，B和DR-β-1基因座，以及處理后計(jì)數(shù)，⑶34+計(jì)數(shù)，CFU-GM計(jì)數(shù)，傳染病篩查，家族病史以及家屬同意捐獻(xiàn)的證據(jù)。待用于移植的治療組合物將包含最少4/6個(gè)抗原或3/6個(gè)等位基因匹配的細(xì)胞和本文所述的細(xì)胞劑量。
F.智能生物容器
在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到細(xì)胞例如造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞移植療法，所述方法包括:在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中植入和/或體內(nèi)增殖的條件下，使細(xì)胞群體與一種或者多種藥劑在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中接觸，并將所述接觸過的細(xì)胞給予所述個(gè)體。
本發(fā)明部分地進(jìn)一步考慮到，增加干細(xì)胞在個(gè)體中(例如，人)植入的方法，包括:在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中的植入的條件下，在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中，使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體(例如，骨髓細(xì)胞，外周血細(xì)胞和/或臍帶血細(xì)胞)與增加造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞中的CXCR4表達(dá)的試劑接觸，所述試劑如PGE2, dmPGE2,或具有dmPGE2活 性的試劑。
本發(fā)明部分地進(jìn)一步考慮到，增加個(gè)體中(例如，人)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞數(shù)目的方法，包括:在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中體內(nèi)增殖的條件下，在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中，使包含造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體(例如，骨髓細(xì)胞，外周血細(xì)胞和/或臍帶血細(xì)胞)與增加造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞中的CXCR4表達(dá)的試劑接觸，所述試劑如PGE2或其類似物，例如16，16- 二甲基PGE2 (dmPGE2)，或具有dmPGE2活性的試劑。
在多個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了在足以維持干細(xì)胞/祖細(xì)胞活力和增加植入、歸巢和體內(nèi)增殖的條件下，在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中，使造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞與PGE2或其類似物接觸的方法，所述試劑例如16，16- 二甲基PGE2(ClmPGE2)或具有dmPGE2活性的試劑。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地提供了制備用于諸如骨髓移植的移植的細(xì)胞群體的方法，所述細(xì)胞群體例如骨髓細(xì)胞，動(dòng)員的外周血細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞，所述方法包括:在與非接觸的細(xì)胞相比，在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中植入和/或體內(nèi)增殖的條件下，在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中，使該細(xì)胞與dmPGE2或具有dmPGE2活性的試劑接觸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在個(gè)體中植入的方法，包括:給予所述個(gè)體細(xì)胞來源或群體，與非接觸的細(xì)胞相比，所述細(xì)胞來源或群體已在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中植入的條件下，在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中，與dmPGE2或具有dmPGE2活性的試劑接觸過。
在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療需要造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞移植的個(gè)體的方法，包括:選擇所述需要造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞移植的個(gè)體，并給予所述個(gè)體細(xì)胞群體，與非接觸的細(xì)胞相比，所述細(xì)胞群體已在足以增加接觸過的細(xì)胞在個(gè)體中的植入和/或體內(nèi)增殖的條件下，在本文所述的不含內(nèi)毒素的容器中，與dmPGE2或具有dmPGE2活性的試劑接觸過。
如本文所用，術(shù)語“容器” 一般涉及能夠?yàn)榱艘韵履康亩皇褂玫娜魏挝锲?離體地或體外地培養(yǎng)，處理，操作，保存，分析，孵育，給予，以及以其他方式建立、支持、收獲包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體及其副產(chǎn)物，或者本文所列舉和考慮的各種各樣的目的。
容器的示例性實(shí)施方案包括但不限于:袋(例如，靜脈內(nèi)注射(IV)袋；細(xì)胞培養(yǎng)袋，例如，VueLife , KryoSure , KryoVue , PermaLife , Lifecell .X-FoId ,S1-Culture , VectraCell )，生物反應(yīng)器，細(xì)胞或組織培養(yǎng)裝置，口袋，膠囊，培養(yǎng)小瓶，裝置，細(xì)胞工廠，容器，培養(yǎng)管(例如，微量離心管，EPPENDORF TUBES ’ FALCON 圓錐形管等)，培養(yǎng)皿(例如，Petri培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)瓶，滾瓶，多孔板(例如，2孔，4孔，6孔，12孔，24孔，48孔，96孔，以及384孔板)，微型孵育器，微載體，微板，顯微鏡載玻片和腔室玻片，以及植入設(shè)備(例如，膠原蛋白海綿)。容器可以被多次使用，或者可以是單次使用的容器。
優(yōu)選地，本發(fā)明的容器不含內(nèi)毒素，并根據(jù)本文他處討論的GMP規(guī)范制造。
在具體實(shí)施方案中，容器可以由具有一個(gè)或多個(gè)以下特點(diǎn)的材料制造:透氣性(材料具有合適的氧氣，二氧化碳和氮?dú)獾臍怏w傳輸率)，可以忽略不計(jì)的水損失率(材料實(shí)際上不透水)，化學(xué)和生物惰性的(材料不與容器內(nèi)容物發(fā)生反應(yīng))，以及在各種條件下保持柔軟性和強(qiáng)度(材料使得容器可以被微波處理，用紫外線照射處理，離心，或在廣泛范圍的溫度例如-100° C至+100° C下使用)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇具有所需的透氣性，生物反應(yīng)性和生物相容性，耐溫性，柔韌性，熱傳導(dǎo)性以及強(qiáng)度的適當(dāng)?shù)木酆衔锊牧稀?br> 適合用于制造本發(fā)明的容器的示例性材料包括但不限于:玻璃，陶瓷，金屬，熱固性和彈性體單體和聚合物 ，單體和聚合的熱塑性塑料。適合用于制造本發(fā)明的容器的示例性的熱塑性材料包括但不限于:縮醛類樹脂，聚甲醛樹脂(delrin)，碳氟化物，聚酯，聚酯彈性體，金屬茂，聚酰胺，尼龍，聚氯乙烯，聚丁二烯，有機(jī)硅樹脂，ABS ( “丙烯腈，丁二烯，苯乙烯”的首字母縮寫)，聚碳酸酯(在塑料工業(yè)中也簡(jiǎn)稱為“PC” )，聚丙烯，聚乙烯，聚苯乙烯，液晶聚合物，合金，以及它們的組合和混合物和復(fù)合體，以及強(qiáng)化合金及其它們的組合和混合物和復(fù)合體。
在具體實(shí)施方案中，容器可以由選自以下的一種或多種材料來制造:二乙基己基鄰苯二甲酸酯，聚氯乙烯，聚乙烯，聚丙烯和氟化乙烯-丙烯。
在多個(gè)示例性的實(shí)施方案中，可以將容器制造成具有這樣的橫截面壁厚度，所述橫截面壁厚度以所選擇的材料和預(yù)期的應(yīng)用為基礎(chǔ)，并且完全受其制約。示例性的橫截面壁厚度包括但不限于，約0.25mm至約2.0mm,約0.5mm至約1.5mm,及約0.75mm至約1.25mm的厚度。在具體實(shí)施方案中，容器的橫截面壁厚度為至少0.2mm,0.3mm,0.4mm,0.5mm,0.6mm, 0.7mm, 0.8mm, 0.9mm, 1.0mm, 1.1 mm, 1.2mm, 1.3mm, 1.4mm, 1.5mm, 1.6mm, 1.7mm,1.8mm, 1.9mm或2.0mm,或任何中間的厚度。
在具體示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的容器被設(shè)計(jì)為容納特定的體積。本發(fā)明的容器的示例性體積包括但不限于，約10mL，約25mL，約50mL，約75mL，約IOOmL,約150mL，約250mL,約 500mL，約 750mL，約 IOOOmL,約 1250mL，約 1500mL，約 1750mL，約 2000mL，或更大的體積，包括任何中間體積。例如，IOmL和25mL之間的中間體積,包括IlmL, 12mL, 13mL, 14mL,15mL, 16mL, 17mL, 18mL, 1 QmT,, 2OmL, 21mL, 22mL, 23mL 和 24mL。
在某些實(shí)施方案中，本文涉及的容器包括I，2，3，4或5個(gè)隔室。隔室可以是相同的尺寸或不同的尺寸，并且可以具有相同的或不同的孔隙度。在一實(shí)施方案中，相鄰的隔室的孔隙率使得小分子，營(yíng)養(yǎng)物，多肽和/或生長(zhǎng)因子可以在隔室之間自由地交換，但其中每個(gè)隔室的細(xì)胞被限制在各自的隔室中。
相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于制造材料的知識(shí)和容器的預(yù)定用途制造具有所需的厚度，體積和隔室數(shù)量的容器。
在具體實(shí)施方案中，可以由容納特定涂層，薄膜，或其它試劑(例如，PGE2或具有dmPGE2活性的試劑或其適當(dāng)?shù)慕M合)的材料來制造容器。
使用相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以將容器的內(nèi)表面設(shè)計(jì)為容納有具有不同疏水性，親水性或兩親分子的涂層。例如，常用的疏水性材料，例如，本文所公開的熱固性材料，彈性體，橡膠和熱塑性塑料，如聚苯乙烯，聚碳酸酯，ABS,以及其它聚合物材料，接受疏水性分子的結(jié)合(例如，具有一個(gè)或多個(gè)疏水性區(qū)域的蛋白質(zhì))。此外，具體的實(shí)驗(yàn)，工業(yè)，或臨床應(yīng)用可能需要，排除，或不關(guān)心不同類型分子的結(jié)合，所述分子例如，核酸，蛋白質(zhì)，碳水化合物等。同樣希望的是防止，最小化和/或最大化分子與基底的結(jié)合，這取決于具體應(yīng)用的目標(biāo)。
在具體示例性實(shí)施方案中，本文涉及的容器包括一個(gè)或多個(gè)輸入和/或輸出端口，用于引入，交換或除去化合物，細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基等。視情況而定，端口可提供無針接入或可以包括適當(dāng)?shù)尼樖浇尤朦c(diǎn)。每個(gè)端口都可以含有一個(gè)或多個(gè)適配器(例如魯爾適配器)，閥和/或過濾器。
本發(fā)明部分地考慮到包括任何合適的組合和構(gòu)造的一個(gè)或多個(gè)裝置的容器，所述裝置指示例如容器內(nèi)容物溫度，容器已經(jīng)處于任何指定溫度的時(shí)間及多種環(huán)境條件(例如，PH值，氧濃度，二氧化碳濃度，葡萄糖濃度)。本發(fā)明涉及卡，帶，磁盤，貼紙，標(biāo)簽，探測(cè)器，傳感器，和小型電子裝置等形式的裝置。涉及的設(shè)備可以被集成到容器的材料中，或可替換地，可以與容器分開制造，隨后永久或非永久地固定或附著在容器的外表面。
在一實(shí)施方案中，容器包括溫度指示裝置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述裝置要么分開作為單獨(dú)的裝置，要么結(jié)合為單個(gè)裝置。在其他的實(shí)施方案中，容器包括溫度指示裝置，經(jīng)過時(shí)間指示裝置和一個(gè)或多個(gè)指示環(huán)境條件的裝置。多個(gè)裝置可以作為單獨(dú)的裝置分開制造，或作為單個(gè)裝置制造。
如本文所用，術(shù)語“溫度指示裝置”是指感應(yīng)，測(cè)量，和/或指示容器和/或容器內(nèi)容物的溫度，并包括一個(gè)或多個(gè)“溫度指示器”的裝置。如本文所用，術(shù)語“溫度指示器”是指產(chǎn)生指示溫度的信號(hào)的指示器。溫度指示器可以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于實(shí)時(shí)溫度或暴露于具體溫度任何預(yù)定時(shí)長(zhǎng)的信號(hào)。在具體實(shí)施方案中，溫度指示器是雙向的。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)溫度指示器單向地指示容器和/或容器內(nèi)容物已達(dá)到預(yù)定的溫度，或已經(jīng)歷預(yù)定溫度達(dá)具體時(shí)長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，溫度指示裝置包括任何數(shù)量或組合的一個(gè)或多個(gè)雙向和單向溫度指示器。
溫度指示裝置可以被用戶激活，或通過暴露于預(yù)定溫度而被激活。如本文所用，術(shù)語“預(yù)定溫度”是指由用戶選擇來進(jìn)行監(jiān)測(cè)的溫度或溫度范圍。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)定溫度是指示預(yù)計(jì)使用容器所需溫度或溫度范圍的“目標(biāo)溫度”。在多個(gè)實(shí)施方案中，溫度指示裝置提供指示一個(gè)或多個(gè)預(yù)定溫度的溫度指示器，即容器和/或容器內(nèi)容物的溫度處于、高于或低于目標(biāo)溫度，或者高于、低于或在目標(biāo)溫度范圍內(nèi)。本發(fā)明涉及多個(gè)目標(biāo)溫度和溫度范圍，而沒有限制。
考慮在本發(fā)明的溫度指示器中使用多種類型的信號(hào)。例如，溫度指示器可以通過以下方式指示溫度:產(chǎn)生可視信號(hào)(例如，數(shù)字顯示，顏色變化，曲線圖)，聲音信號(hào)，紅外信號(hào)，無線電信號(hào)，模擬信號(hào)，數(shù)字信號(hào)，或其組合。例如，溫度指示裝置可以包括一個(gè)或多個(gè):指示溫度的液晶顯示器(LCD);指示溫度或指明物體低于或超過預(yù)定目標(biāo)溫度的聲音或語音合成器；通過聲波，超聲波或其他波指示溫度的模擬，紅外或無線電信號(hào)；和/或電子地指示溫度的數(shù)字信號(hào)。
產(chǎn)生溫度的可視指示的溫度指示器，可以產(chǎn)生包括顏色在內(nèi)的信號(hào)，所述顏色對(duì)應(yīng)于處于、高于或低于目標(biāo)溫度，或者高于、低于或在目標(biāo)溫度范圍內(nèi)的容器和/或容器內(nèi)容物溫度。本發(fā)明考慮到，任何顏色組合均可以與任何數(shù)量和組合的溫度指示器一起使用，而不受限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用任何數(shù)量的在某些溫度下反映某些顏色的化學(xué)品，并可以選擇這樣的化學(xué)物質(zhì)，以反映對(duì)應(yīng)于具體溫度的所希望的顏色。
在其他示例性的實(shí)施方案中，溫度指示裝置可以包括一種或多種的溫度刻度(temperature scale),每個(gè)溫度刻度都包括一個(gè)或多個(gè)指示預(yù)定溫度或溫度范圍的溫度指示器。某個(gè)溫度刻度內(nèi)的每個(gè)溫度指示器均可以產(chǎn)生信號(hào)(例如，可視信號(hào)，數(shù)字信號(hào))。
示例性的溫度刻度包括在5° C，10° C，15° C，20° C，25° C，30° C，35° C，40。 C，45。 C，50。 C，55。 C，60。 C，65。 C，70。 C，75。 C，80。 C，85。 C，90。 C，95。 C,100。 C,110° C,125° C,130° C,140° C,150° C,160° C,170° C,180° C,190° C 或200° C 或更高的范 圍內(nèi)增幅為 1° C，2° C，3° CA° C，5° C，6° C，7° C，8° C，9° C，10 C的溫度指不器。
示例性的溫度范圍，包括但不限于，約4° C至約65° C，約4° C至約50° C，約4° C至42° C，約4° C到37° C的溫度范圍，或任何中間的溫度范圍。
本發(fā)明考慮到，但不限于，溫度指示裝置可以包括一種或多種在任何溫度范圍內(nèi)的任何增幅的溫度刻度，每種刻度包括任意數(shù)量和組合的溫度指示器，以指示預(yù)定溫度或溫度范圍。
在一實(shí)施方案中，溫度指示裝置包括多個(gè)雙向溫度指示器和一個(gè)或者多個(gè)單向溫度指示器，每個(gè)所述雙向溫度指示器都與特定的溫度范圍相關(guān)聯(lián)，所述單向溫度指示器指示一個(gè)或多個(gè)預(yù)定溫度已經(jīng)達(dá)到或經(jīng)歷任何預(yù)定的時(shí)長(zhǎng)。雙向指示器單獨(dú)實(shí)時(shí)地提供溫度的可視指示。溫度的可視指示對(duì)應(yīng)于處于、高于或低于目標(biāo)溫度，或者高于、低于或在目標(biāo)溫度范圍內(nèi)的容器和/或容器內(nèi)容物溫度。一旦已經(jīng)達(dá)到預(yù)定溫度，單向指示器維持可視指示。
本發(fā)明還考慮到包括一個(gè)或多個(gè)溫度指示裝置和一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示裝置，或指示多種環(huán)境條件的裝置的容器。
如本文所用，術(shù)語“經(jīng)過時(shí)間指示裝置”是指包括一個(gè)或多個(gè)“經(jīng)過時(shí)間指示器”的裝置。如本文所用，術(shù)語“經(jīng)過時(shí)間指示器”是指測(cè)量、監(jiān)測(cè)和指示已經(jīng)經(jīng)過預(yù)定的時(shí)長(zhǎng)的指示器。每個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器可以單獨(dú)地被用戶激活，或通過暴露于具體的預(yù)定溫度或溫度范圍而被激活。
一旦被激活，經(jīng)過時(shí)間指示器指示自激活起的時(shí)間。在一實(shí)施方案中，給定的經(jīng)過時(shí)間指示器測(cè)量預(yù)定時(shí)長(zhǎng)，然后產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，指示已經(jīng)經(jīng)過預(yù)定時(shí)長(zhǎng)的時(shí)間。在多個(gè)示例性的實(shí)施方案中，經(jīng)過時(shí)間指示裝置包括1，2，3，4，5，或更多個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器，每個(gè)能夠單獨(dú)地被用戶單獨(dú)地激活，或通過暴露于相同的或不同的預(yù)定溫度或溫度范圍而被激活。
在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明部分地考慮到包括經(jīng)過時(shí)間指示器的容器，所述經(jīng)過時(shí)間指示器指示容器和/或內(nèi)容物已經(jīng)暴露于，經(jīng)歷或維持在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的溫度或溫度范圍。在相關(guān)的實(shí)施方案中，經(jīng)過時(shí)間指示器指示容器和/或內(nèi)容物已經(jīng)暴露于，經(jīng)歷或維持在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的溫度或溫度范圍的預(yù)定時(shí)長(zhǎng)。經(jīng)過時(shí)間指示器可以產(chǎn)生連續(xù)的信號(hào)，或在已經(jīng)過總預(yù)定時(shí)間的預(yù)定百分比的時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)信號(hào)，例如在待測(cè)定的總經(jīng)過時(shí)間的定期間隔產(chǎn)生信號(hào)。
在一實(shí)施方案中，經(jīng)過時(shí)間指示器在待測(cè)定的總經(jīng)過時(shí)間的定期間隔產(chǎn)生信號(hào)。例如，如果經(jīng)過時(shí)間指示器被設(shè)計(jì)來測(cè)量和指示I個(gè)小時(shí)的總經(jīng)過時(shí)間，則該指示器可以產(chǎn)生信號(hào)以指示已經(jīng)經(jīng)過15分鐘，30分鐘，45分鐘，和I個(gè)小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。示例性的定期間隔包括I分鐘的間隔，2分鐘的間隔，5分鐘的間隔，10分鐘的間隔，15分鐘的間隔，20分鐘的間隔，30分鐘的間隔，45分鐘的間隔，60分鐘的間隔，90分鐘的間隔，120分鐘的間隔或更長(zhǎng)的間隔。任何總的經(jīng)過時(shí)間段中的定期間隔的示例性數(shù)目包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10個(gè)或更多個(gè)間隔。
在另一實(shí)施方案中，經(jīng)過時(shí)間指示器產(chǎn)生連續(xù)信號(hào)，指示已經(jīng)經(jīng)過的時(shí)長(zhǎng)，或尚未經(jīng)過的時(shí)長(zhǎng)(即，剩余時(shí)間)。例如，被設(shè)計(jì)來測(cè)量和指示I個(gè)小時(shí)的總的經(jīng)過時(shí)間的經(jīng)過時(shí)間指示器可以是進(jìn)度條，餅圖，或時(shí)鐘的形式，其中信號(hào)在被激活后產(chǎn)生，并相對(duì)于已經(jīng)經(jīng)過的總經(jīng)過時(shí)間的分?jǐn)?shù)而線性增加。在一實(shí)施方案中，一旦已經(jīng)經(jīng)過總時(shí)間，則經(jīng)過時(shí)間指示器可以終止產(chǎn)生信號(hào)或產(chǎn)生不同的信號(hào)來指示已經(jīng)經(jīng)過總時(shí)間。
在具體示例性的實(shí)施方案中，經(jīng)過時(shí)間顯示裝置包括一個(gè)或多個(gè)任意組合的經(jīng)過時(shí)間指示器。每個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器可以由用戶單獨(dú)地激活或通過暴露于不同的預(yù)定溫度而被激活。此外，每個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器可以測(cè)量不同的預(yù)定時(shí)長(zhǎng)并產(chǎn)生信號(hào)。
僅僅是為了說明的目的，單個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示裝置可以包括:用戶激活的測(cè)量并指示I小時(shí)的經(jīng)過時(shí)間的經(jīng)過時(shí)間指示器；用戶激活的測(cè)量并指示2小時(shí)的經(jīng)過時(shí)間的經(jīng)過時(shí)間指示器；用戶激活的測(cè)量并指示10分鐘的經(jīng)過時(shí)間的經(jīng)過時(shí)間指示器；通過暴露于4° C的預(yù)定溫度而被激活的測(cè)量并指示自激活起I小時(shí)，2小時(shí)，或更長(zhǎng)時(shí)間的經(jīng)過時(shí)間的經(jīng)過時(shí)間指示器；和/或通過暴露于30° C至40° C范圍中的預(yù)定溫度(優(yōu)選地37° C)而被激活的經(jīng)過時(shí)間指示器，其測(cè)量并指示自激活起I小時(shí)，2小時(shí)，或更長(zhǎng)的經(jīng)過時(shí)間。
經(jīng)過時(shí)間指示器所產(chǎn)生的信號(hào)的示例性類型包括但不限于，可視信號(hào)，聲音信號(hào)，紅外信號(hào)，無線電信號(hào)，數(shù)字信號(hào)，模擬信號(hào)，和它們的組合。
本發(fā)明部分地還考慮到包括指示裝置的容器，所述指示裝置包括一個(gè)或多個(gè)測(cè)量，監(jiān)測(cè)和指示容器內(nèi)容物的例如pH值，二氧化碳濃度，氧濃度，摩爾滲透壓濃度或葡萄糖濃度的環(huán)境指示器。在一實(shí)施方案中，環(huán)境指示器連續(xù)監(jiān)測(cè)并產(chǎn)生指示環(huán)境條件的信號(hào)。在另一實(shí)施方案中，環(huán)境指示器在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的時(shí)間和/或在定期間隔監(jiān)測(cè)和產(chǎn)生信號(hào)。信號(hào)優(yōu)選地為可視信號(hào)，更優(yōu)選地為在LED，OLED或IXD上產(chǎn)生的字母數(shù)字信號(hào)。
在多個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境指示器包括測(cè)量，監(jiān)測(cè)和指示容器內(nèi)環(huán)境條件的數(shù)字傳感器。此外，可以考慮到，可以校正傳感器來測(cè)量任何范圍的環(huán)境條件，而不受限制。因此，每個(gè)環(huán)境條件的正常范圍可被預(yù)編程進(jìn)每個(gè)環(huán)境指示裝置。范圍可以包括一個(gè)或多個(gè)最小閾值，最佳條件或最大閾值。在具體實(shí)施方案中，當(dāng)被測(cè)量或監(jiān)測(cè)的環(huán)境條件超出最小或最大閾值時(shí)，環(huán)境指示器將產(chǎn)生聲音信號(hào)以指示環(huán)境條件不在可接受的范圍內(nèi)。
其他示例性的環(huán)境指示器包括但不限于，Ca++、鉀、鈉、鎂、錳、硫酸鹽、磷酸鹽和氯化物濃度。
本發(fā)明部分地考慮到包括指示裝置組合的容器，所述裝置指示例如，容器內(nèi)容物溫度，容器已經(jīng)在任何指定溫度的時(shí)間，和任選地一種或多種不同的實(shí)驗(yàn)條件(例如，PH值，氧濃度，葡萄糖濃度)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合裝置可以包括本文所述的單獨(dú)的裝置和指示器并具有其特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，環(huán)境指示裝置優(yōu)選地與容器的內(nèi)容物接觸。可以將涉及的裝置整合進(jìn)容器的材料中，在整合處，容器的通透性是這樣的，使得具體的環(huán)境感應(yīng)裝置與容器內(nèi)腔或容器內(nèi)容物接觸。在另一實(shí)施方案中，環(huán)境指示裝置可以與容器分開制造，并隨后永久地或非永久地固定或附著在容器的外表面。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述固定或附著的裝置穿過容器，使得具體環(huán)境感應(yīng)裝置與容器內(nèi)腔或容器內(nèi)容物接觸。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述固定或附著的裝置被應(yīng)用到裝置的可通透部分，使得具體環(huán)境感應(yīng)裝置與容器內(nèi)腔或容器內(nèi)容物接觸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置的組合，所述裝置要么分開作為單獨(dú)的裝置，要么作為單個(gè)的裝置。在其他實(shí)施方案中，容器包括溫度指示裝置，經(jīng)過時(shí)間指示裝置和一個(gè)或多個(gè)環(huán)境條件指示裝置的組合，所述裝置要么分開作為單獨(dú)的裝置，要么作為單個(gè)的裝置。
組合指示裝置可以與容器一體化制造，可以永久或非永久地附著到容器的外表面，可以層壓到容器 的外表面，或者可以被容器包到容器襯里中。裝置可以是小型電子設(shè)備，探測(cè)器，傳感器或它們的組合。
組合指示裝置可以是任何大小或形狀的。組合指示裝置的示例性形狀，包括，但不限于:卡，帶，磁盤，貼紙，標(biāo)簽，探測(cè)器，或它們的組合。例如，卡裝或帶狀的溫度指示裝置可以包括一個(gè)或多個(gè)溫度指示磁盤，反之亦然。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，各種類型的圖形設(shè)計(jì)可被用于可視化容器的經(jīng)過時(shí)間和溫度，包括但不限于，各種線，曲線，橢圓形，矩形或點(diǎn)。同樣，還可以使用顯示液體向前遷移進(jìn)展的標(biāo)記，包括，但并不限于各種不同大小的箭頭，曲線，線和點(diǎn)。例如，，信號(hào)可以作為進(jìn)度條上的進(jìn)度在連續(xù)窗口中，或在多個(gè)可視窗口針對(duì)具體溫度或溫度范圍在特定經(jīng)過時(shí)間間隔時(shí)被觀察。此外，每個(gè)實(shí)施方案可以被修改以包括許多附加標(biāo)記，以顯示容器的時(shí)間指示器或溫度的狀態(tài)。這類標(biāo)記包括顯示向總經(jīng)過時(shí)間相比溫度逐步推進(jìn)的圖形符號(hào)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置的組合。
如本文所用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文中另有明確指出。
整個(gè)說明書中，除非上下文另外要求，詞語“包含(comprise) ”、“包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”將被理解為意指包括陳述的步驟或元素或者步驟或元素的組，但不排除任何其他的步驟或元素或者步驟或元素的組。所用“由……組成”指包括且限于在詞組“由……組成”間列出的任何內(nèi)容。因此，詞組“由……組成”表明所列出的元素是必需的或強(qiáng)制的，并且不可以存在其他元素。所用“基本上由……組成”指包括在該詞組間列出的任何元素，并限于不妨礙或不促進(jìn)在所列元素的公開內(nèi)容中指明的活性或作用的其他元素。因此，詞組“基本上由……組成”表明所列元素是必需的或強(qiáng)制的，但其他元素是任選的，其他元素可以存在，也可以不存在，這取決于它們是否影響所列元素的活性或作用。
整個(gè)本說明書中，在述及“一實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”時(shí)，是指與該實(shí)施方案有關(guān)的所描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或特性包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，在整個(gè)本說明書的多處中出現(xiàn)的措辭“在一實(shí)施方案中”或“在實(shí)施方案中”不必全部指同一實(shí)施方案。此外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中， 具體特征、結(jié)構(gòu)或特性可以以任何合適的方式組合。實(shí)施例
對(duì)用刺激前列腺素通路的試劑處理的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的數(shù)個(gè)生物參數(shù)進(jìn)行了分析，從而開發(fā)增加細(xì)胞的植入潛力和增殖的臨床方法(參見圖2)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Ib期臨床試驗(yàn)的結(jié)果描述如下。
實(shí)施例
對(duì)用刺激前列腺素通路的試劑處理的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的數(shù)個(gè)生物參數(shù)進(jìn)行分析，從而開發(fā)臨床方法以增加細(xì)胞的植入潛力和擴(kuò)增(參見圖2)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Ib期臨床試驗(yàn)的結(jié)果描述如下。
實(shí)施例1
競(jìng)爭(zhēng)性cAMP測(cè)定
使用LANCE cAMP檢測(cè)試劑盒(PeRkin ElmeR inc.，Waltham, Ma)，根據(jù)制造商的說明書，對(duì)⑶34+細(xì)胞進(jìn)行cAMP測(cè)定。簡(jiǎn)要地說，將3000個(gè)⑶34+細(xì)胞(Stem CellTechnologies, Vancouver, Canada)等分在384-孔不透明白色板的各孔中的推薦的刺激緩沖液中。在所有條件下一式三份進(jìn)行測(cè)定。
將CD34+細(xì)胞放置在冰上，然后用DMSO或16，16-二甲基PGE2在4° C刺激。對(duì)于在其他的溫度，例如25° C或37° C進(jìn)行的測(cè)定，在室溫下將DMSO或16，16-二甲基PGE2添加到⑶34+細(xì)胞，然后將板與DMSO或16，16-dmPGE2在實(shí)驗(yàn)溫度(25° C或37° C)下孵育。
將⑶34+細(xì)胞孵育5，15，30，60或120分鐘的時(shí)間。孵育期之后，向刺激的細(xì)胞添加檢測(cè)緩沖液，細(xì)胞在檢測(cè)緩沖液中于室溫下再孵育I小時(shí)，不考慮刺激溫度。使用EllVisioil 2 I 04 Multilabel Reader (Perkin Elmer),按照制造商的說明書來分析測(cè)定板。
使用⑶34+細(xì)胞進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性cAMP測(cè)定，以確定時(shí)間(孵育15，30，60，或120分鐘)，溫度(在4° C，25° C，或37° C孵育)，和最終16，16-二甲基PGE2濃度(1μΜ，10μΜ，50 μ Μ，或100 μ Μ)對(duì)細(xì)胞中cAMP產(chǎn)量的影響。
結(jié)果表明，最大cAMP反應(yīng)發(fā)生在孵育約30-60分鐘；孵育溫度越高，導(dǎo)致cAMP活性越強(qiáng)；在10 μ M的濃度閾值之上，cAMP反應(yīng)為劑量相對(duì)不敏感的(參見圖3)。與DMSO對(duì)照相比，當(dāng)用16，16- 二甲基PGE2在短至5分鐘至長(zhǎng)達(dá)2個(gè)小時(shí)的持續(xù)時(shí)間，以測(cè)試的所有16，16-二甲基PGE2濃度(1，10，50和ΙΟΟμΜ)，在37° C和25° C孵育CD34+細(xì)胞時(shí)，觀察到cAMP活性在統(tǒng)計(jì)上顯著增加(p〈0.001)。與DMSO對(duì)照相比，當(dāng)用16，16- 二甲基PGE2在類似的時(shí)間條件和在測(cè)試的所有濃度(1，10，50和ΙΟΟμΜ)下，在4° C孵育⑶34+細(xì)胞時(shí)，沒有觀察到cAMP產(chǎn)量在統(tǒng)計(jì)上顯著增加(對(duì)于所有樣品，ρ>0.05)。
在更高的溫度孵育更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間(這種條件之前被認(rèn)為與CD34+細(xì)胞活力和16，16-二甲基PGE2半衰期的降低有關(guān))，顯示出更強(qiáng)的cAMP刺激，而不負(fù)面影響細(xì)胞活力。此外，如本文所述，用16，16-二甲基PGE2在4° C處理細(xì)胞更短的時(shí)間，導(dǎo)致cAMP產(chǎn)量增力口，但不導(dǎo)致被認(rèn)為在調(diào)節(jié)干細(xì)胞歸巢、存活、增殖和植入中是重要的基因的表達(dá)增加。這類基因的上調(diào)并由此實(shí)現(xiàn)最強(qiáng)的生物應(yīng)答，需要用16，16-二甲基PGE2在諸如37° C的生理相關(guān)溫度下處理細(xì)胞至少約I小時(shí)增加的持續(xù)時(shí)間。
實(shí)施例2
基因表達(dá)
全某閔纟目表汰陣列
從Stem Cell Technologies Inc.(Vancouver, BC, Canada)購買人胳帶血和來自人臍帶血的預(yù)分離的CD34+細(xì)胞。在含低分子量葡聚糖和5%人血清白蛋白的培養(yǎng)基(LMD/5%HSA)或 Stem Span 培養(yǎng)基(Stem Cells Technology Inc.)中鮮育細(xì)胞，用于用16，16-二甲基PGE2離體處理。使用Pico Pure RNA分離試劑盒(MolecularDevices, Sunnyvale, CA)從孵育的細(xì)胞分離總RNA。
根據(jù)制造商的說明書，使用MessageAmp II aRNA擴(kuò)增試劑盒(AppliedBiosystems/Ambion, Austin, TX)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序制備生物素化的擴(kuò)增的RNA(aRNA)并任選地第二輪擴(kuò)增；使用MessageAmp II增強(qiáng)型生物素試劑盒(Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)將 拷貝RNA轉(zhuǎn)錄成生物素標(biāo)記的aRNA。根據(jù)Applied Biosystems操作程序純化并破碎生物素標(biāo)記的aRNA。將20 μ g破碎的aRNA與人基因組U133Plus2.0基因芯片(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)于 45。C 雜交 16 小時(shí)。
洗漆基因芯片并在Affymetrix洗漆工作站450中染色，使用Affymetrix基因芯片掃描儀30007G掃描。使用Affymetrix表達(dá)控制臺(tái)軟件和默認(rèn)分析設(shè)置來分析圖像數(shù)據(jù)。通過多陣列對(duì)數(shù)健壯算法標(biāo)準(zhǔn)化基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，并在用于基因組學(xué)的 Spotfire3.1 (TibcoSpotfire, Palo Alto, CA)中可視化。在 MetaCore.(GeneGo, St.Joseph, Ml)上進(jìn)行通路分析。
使用基因芯片技術(shù)以確定時(shí)間(孵育5，15，20，30，40，60，80，100，120，180，或240分鐘)、溫度(在4° C，25° C，或37° C孵育)和最終16，16-二甲基PGE2濃度(0.1 μ M，1μΜ，10μΜ，50μΜ或ΙΟΟμΜ)對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響。
使用Fluidigm平臺(tái)的微流控gPCR
使用BioMark 動(dòng)態(tài)陣列微流控系統(tǒng)(Fluidigm Corporation, South SanFrancisco, CA, USA)對(duì)用16，16- 二甲基PGE2離體處理的CD34+細(xì)胞樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR轉(zhuǎn)錄本定量。使用 Pico Pure RNA 分離試劑盒(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)從處理的細(xì)胞中分離總RNA。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life TechnologiesCorporation, Carlsbad, CA, USA)從 50ng 分離的總 RNA 中逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ) DNA(cDNA)。
使用TaqMan預(yù)擴(kuò)增混合試劑盒(Life Technologies)操作程序,利用200nM的96個(gè)基因(包括6個(gè)參照對(duì)照基因)特異性引物對(duì)(參見表I)的混合物預(yù)擴(kuò)增特定靶基因(96)的cDNA。根據(jù)制造商的操作程序，在標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)條件下使用14個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，從cDNA進(jìn)行特異性祀擴(kuò)增(STA)。根據(jù)Fluidigm’ s EvaGreen操作程序,添加EvaGreen染料(Biotium，Inc.Hayward, CA, USA)以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，反應(yīng)混合物包含3.0 μ L基因表達(dá) Master Mix (Life Tech.), 0.3 μ L 上樣緩沖液(Fluidigm), 0.3 μ L20 倍 EvaGreen 染料(Biotium, Inc.)，1.5 μ L 稀釋的(1:5 無菌 nH20) STA cDNA 和 0.9 μ L 無菌 diH20，用于向96.96動(dòng)態(tài)陣列(Fluidigm)的樣品入口上樣。
從第5孔至第9孔重復(fù)運(yùn)行樣品。對(duì)于引物對(duì)，反應(yīng)混合物包含2.5 μ L基因特異行引物對(duì)(20 μ Μ)和2.5μ L測(cè)定上樣緩沖液(Fluidigm)，用于向96.96動(dòng)態(tài)陣列(Fluidigm)的樣品入口上樣。使用 NanoFlex IFCController HX(Fluidigm)上樣 96.96 動(dòng)態(tài)陣列，并使用BioMark實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Fluidigm)進(jìn)行實(shí)時(shí)反應(yīng)。
使用BioMark實(shí)時(shí)PCR分析軟件分析結(jié)果。從樣品重復(fù)計(jì)算平均Ct,使用6個(gè)參照基因(ACTB，GAPDH，HPRTI，QARS，ARPC2和LRIG2)的平均值對(duì)僅媒介物的樣品計(jì)算S-SCt(AACt)。將超過28的Ct或具有不合適的解鏈曲線特性的擴(kuò)增產(chǎn)物從計(jì)算中排除。結(jié)果以熱圖形式顯示在用于基因組的Spotfire3.1 (Tibco Spotfire, PaloAlto, CA, USA)中，或作為 Excel 圖表(Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)顯不。
表1: 引物對(duì)
權(quán)利要求
1.含有細(xì)胞群體的治療組合物，所述細(xì)胞群體包含至少約一百萬個(gè)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中: a)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已在約37°C的溫度下與增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑離體接觸； b)與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約2倍；并且 c)其中所述治療組合物包括準(zhǔn)備好給予患者的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療上可接受的無菌懸浮液。
2.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍。
3.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑選自:cAMP類似物或增強(qiáng)劑，Ga-s激活劑，和選擇性地結(jié)合PGE2EP4受體的化合物。
4.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述增加所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑為PGE2,或者PGE2類似物或衍生物。
5.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑為16，16-二甲基PGE2。
6.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸至少約I小時(shí)的時(shí)間。
7.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
8.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約2小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
9.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約2小時(shí)的時(shí)間。
10.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含基因表達(dá)標(biāo)簽，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍，其中所述標(biāo)簽基因選自:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4(DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。
11.如權(quán)利要求10所述的治療組合物，其中至少兩個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述兩個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少5，10，15或20倍。
12.如權(quán)利要求10所述的治療組合物，其中每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍。
13.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含少于約0.10%,0.50%，1.0%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20% 或 30% 的 CD34.細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含至少約0.01%并且不超過約50%的⑶34+細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體不被離體增殖。
16.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中在護(hù)理點(diǎn)產(chǎn)生所述治療化合物并將其給予患者而無需培養(yǎng)所述細(xì)胞群體。
17.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述治療組合物基本上不含所述試劑。
18.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含少于約30%，25%，20%，.15%，10%或5%的間充質(zhì)干細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含少于約30%，25%，20%，15%，10%或5%的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求1所述的治療組合物,其中所述細(xì)胞群體中至少約15%的細(xì)胞表達(dá)CXCR4蛋白。
21.如權(quán)利要求1所述的治療組合物 ，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
22.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體是HLA單體分型的。
23.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體是基于由HLA-A，HLA-B,HLA-CJP HLA-DRBl組成的組進(jìn)行HLA單體分型的。
24.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體匹配。
25.如權(quán)利要求1所述的治療組合物，其中所述HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體具有4/6個(gè)HLA匹配。
26.含有細(xì)胞群體的治療組合物，所述細(xì)胞群體包含至少約一百萬個(gè)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中: a)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已在約37°C的溫度下與16，16-dmPGE2離體接觸約2小時(shí)的時(shí)間； b)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含⑶34+細(xì)胞集合，其中與非接觸的⑶34+細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述⑶34+細(xì)胞集合中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍；并且 c)其中所述治療組合物包括準(zhǔn)備好給予患者的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療上可接受的無菌懸浮液。
27.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含基因表達(dá)標(biāo)簽，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍，其中所述標(biāo)簽基因選自:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。
28.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中至少兩個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述兩個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少5，10，15或20倍。
29.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍。
30.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含少于約0.10%,0.50%，.1.0%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20% 或 30% 的 CD34.細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含至少約0.01%并且不超過約50%的⑶34+細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體不被離體增殖。
33.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
34.如權(quán)利要求26所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體是HLA單體分型的。
35.含有單體分型的細(xì)胞群體的治療組合物，所述細(xì)胞群體包含至少約一百萬個(gè)人造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其中: a)所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已在約37°C的溫度下與增加細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑離體接觸； b)與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約2倍；并且 c)其中所述治療組合物包括準(zhǔn)備好給予患者的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的治療上可接受的無菌懸浮液。
36.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述單體分型的細(xì)胞群體是基于由HLA-A，HLA-B, HLA-C和HLA-DRBl組成的組進(jìn)行單體分型的。
37.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述單體分型的細(xì)胞群體是基于由HLA-DRB3/4/5, HLA-DQBl和DPBl組成的組進(jìn)行單體分型的。
38.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體匹配。
39.如權(quán)利要求37所述的治療組合物，其中所述HLA單體分型的細(xì)胞群體與特定的人類個(gè)體具有4/6個(gè)HLA匹配。
40.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)相比，所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá)增加至少約3倍。
41.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑選自:cAMP類似物或增強(qiáng)劑，Ga-s激活劑，和選擇性地結(jié)合PGE2EP4受體的化合物。
42.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述增加造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中CXCR4基因表達(dá)的試劑為16，16-二甲基PGE2。
43.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞已與所述試劑接觸約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
44.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞包含基因表達(dá)標(biāo)簽，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍，其中所述標(biāo)簽基因選自:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4(DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)和Fos相關(guān)抗原2(F0SL2)。
45.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中至少兩個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述兩個(gè)標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少5，10，15，或20倍。
46.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中每個(gè)所述標(biāo)簽基因的表達(dá)比非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的所述標(biāo)簽基因的表達(dá)增加至少約2倍。
47.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含少于約0.10%, 0.50%，1.0%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20% 或 30% 的 CD34.細(xì)胞。
48.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體包含至少約0.01%并且不超過約50%的⑶34+細(xì)胞。
49.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體不被離體增殖。
50.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中在護(hù)理點(diǎn)產(chǎn)生所述治療化合物并將其給予患者而無需培養(yǎng)所述細(xì)胞群體。
51.如權(quán)利要求35所述的治療組合物，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
52.制備治療組合物的方法，其包括:在足以改變?cè)煅杉?xì)胞或祖細(xì)胞的基因表達(dá)的條件下，使包含造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞群體在約37° C的溫度下與一種或多種試劑離體接觸，以得到包含基因表達(dá)標(biāo)簽的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述基因表達(dá)標(biāo)簽包括與非接觸的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞相比表達(dá)增加的一個(gè)或多個(gè)以下基因:透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白1(NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a I (COLlAl)，F(xiàn)os 相關(guān)抗原 2 (F0SL2)或 CXC 趨化因子 4 (CXCR4)。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述一種或多種試劑中的至少一種增加所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的PGE2R2或PGE2R4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述一種或多種試劑中的至少一種選自:cAMP增強(qiáng)劑，Ga-s激活劑，和選擇性地結(jié)合PGE2EP4受體的試劑。
56.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述一種或多種試劑包括PGE2或其類似物。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述PGE2類似物包括16，16-二甲基PGE2。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述足以改變?cè)煅杉?xì)胞或祖細(xì)胞的基因表達(dá)的條件包括使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞與所述一種或多種試劑接觸約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間，其中所述至少一種試劑包括增加所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的PGE2R2或PGE2R4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在約37°C的溫度下與增加所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的PGE2R2或PGE2R4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的濃度為約10 μ M的試劑接觸約2小時(shí)的時(shí)間。
60.如權(quán)利要求52所述的方法，其中在不含內(nèi)毒素的容器中制備所述治療組合物，所述容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述溫度指示裝置包括至少一個(gè)產(chǎn)生指示容器溫度的信號(hào)的溫度指示器，所述經(jīng)過時(shí)間指示裝置包括至少一個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器；并且其中所述容器適于細(xì)胞貯存，細(xì)胞處理，細(xì)胞洗滌和細(xì)胞輸注。
61.如權(quán)利要求52所述的方法，其中將所述治療組合物給予需要細(xì)胞治療的個(gè)體。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述個(gè)體患有急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，青少年髓單核細(xì)胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，重度再生障礙性貧血，范可尼貧血，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)，純紅細(xì)胞再生障礙，巨核細(xì)胞缺乏/先天性血小板減少癥，嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)，維斯科特-奧爾德里奇綜合征，重度β -地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病，赫爾勒綜合征，腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓發(fā)育不良，難治性貧血，慢性髓單核細(xì)胞白血病，病因不明的髓樣化生，家族性噬紅細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥，實(shí)體瘤，慢性肉芽腫病，黏多糖癥或戴-布二氏貧血。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述個(gè)體患有乳腺癌，卵巢癌，腦癌，前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，皮膚癌，肝癌，胰腺癌或肉瘤。
64.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述個(gè)體已接受骨髓清除性或非清髓性化療或放射治療。
65.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述個(gè)體是骨髓捐獻(xiàn)者。
66.增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在個(gè)體中植入的方法，包括: (a)在約37°C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體接觸:前列腺素E2(PGE2)和具有dmPGE2活性的試劑； (b)洗滌所述細(xì)胞群體，以基本上除去所述試劑；和 (c)將所述細(xì)胞群體給予個(gè)體； 其中與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在所述個(gè)體中的植入的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述試劑是PGE2或其類似物。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述PGE2類似物是16，16-二甲基PGE2。
70.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述足以增加植入的條件包括使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞接觸: (a)約10μ M或更高濃度的16，16- 二甲基PGE2 ;并 (b)持續(xù)約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
71.如權(quán)利要求66所述的方法，其中使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞與約10μ M濃度的16，16- 二甲基PGE2接觸；并持續(xù)約2小時(shí)的時(shí)間。
72.如權(quán)利要求66所述的方法，其中與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞包含增加一個(gè)或多個(gè)以下基因的基因表達(dá):透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白1(NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a -1 (COLlAl)，F(xiàn)os 相關(guān)抗原 2 (F0SL2)或 CXC 趨化因子受體 4 (CXCR4)。
73.如權(quán)利要求52或66所述的方法，其中使所述細(xì)胞群體在不含內(nèi)毒素的容器中與所述一種或多種試劑接觸，所述容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述溫度指示裝置包括至少一個(gè)產(chǎn)生指示容器溫度的信號(hào)的溫度指示器，所述經(jīng)過時(shí)間指示裝置包括至少一個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器；并且其中所述容器適于細(xì)胞貯存，細(xì)胞處理，細(xì)胞洗滌和細(xì)胞輸注。
74.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述細(xì)胞群體包括一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中給予所述個(gè)體一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。
76.如權(quán)利要求74所述的方法,其中給予所述個(gè)體一個(gè)臍帶血單位或部分臍帶血單位。
77.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述個(gè)體患有急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，青少年髓單核細(xì)胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，重度再生障礙性貧血，范可尼貧血，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)，純紅細(xì)胞再生障礙，巨核細(xì)胞缺乏/先天性血小板減少癥，嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)，維斯科特-奧爾德里奇綜合征，重度β-地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病，赫爾勒綜合征，腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓發(fā)育不良，難治性貧血，慢性髓單核細(xì)胞白血病，病因不明的髓樣化生，家族性噬紅細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥或?qū)嶓w瘤。
78.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述個(gè)體患有乳腺癌，卵巢癌，腦癌，前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，皮膚癌，肝癌，胰腺癌或肉瘤。
79.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述個(gè)體已接受骨髓清除性或非清髓性化療或放射治療。
80.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述個(gè)體是骨髓捐獻(xiàn)者。
81.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是所述個(gè)體自體的。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是從所述個(gè)體的外周血或骨髓動(dòng)員的。
83.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是所述個(gè)體異體的。
84.治療需要造 血系統(tǒng)重建的個(gè)體的方法，包括: (a)選擇需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體； (b)在約37°C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體接觸:前列腺素E2(PGE2)和具有dmPGE2活性的試劑； (c)洗滌所述細(xì)胞群體，以基本上除去所述試劑；和 (d)將所述細(xì)胞群體給予所述個(gè)體； 其中與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在所述個(gè)體中的植入的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸，從而治療所述需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
86.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述試劑是PGE2或其類似物。
87.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述PGE2類似物是16，16-二甲基PGE2。
88.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述足以增加植入的條件包括使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞接觸: (a)約10μ M或更高濃度的16，16- 二甲基PGE2 ;并 (b)持續(xù)約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞與濃度約ΙΟμΜ的16，16- 二甲基PGE2接觸；并持續(xù)約2小時(shí)的時(shí)間。
90.如權(quán)利要求84所述的方法，其中與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞包含增加一個(gè)或多個(gè)以下基因的基因表達(dá):透明質(zhì)酸合成酶I (HASl)，GTP-結(jié)合蛋白GEM(GEM)，雙特異性蛋白磷酸酶4 (DUSP4)，雙調(diào)蛋白(AREG)，核受體相關(guān)蛋白I (NR4A2)，腎素(REN)，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(CREM)，膠原蛋白I型a -1 (COLlAl)，F(xiàn)os相關(guān)抗原2 (F0SL2)，或CXC趨化因子受體4 (CXCR4);與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，增加的自我更新能力；以及與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，沒有顯著下降的細(xì)胞活力。
91.如權(quán)利要求84所述的方法，其中在不含內(nèi)毒素的容器中制備所述細(xì)胞群體，所述容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述溫度指示裝置包括至少一個(gè)產(chǎn)生指示容器溫度的信號(hào)的溫度指示器，所述經(jīng)過時(shí)間指示裝置包括至少一個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器；并且其中所述容器適于細(xì)胞貯存，細(xì)胞處理，細(xì)胞洗滌和細(xì)胞輸注。
92.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述細(xì)胞群體包括一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中給予所述個(gè)體部分臍帶血單位或一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。
94.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述個(gè)體患有急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，青少年髓單核細(xì)胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，重度再生障礙性貧血，范可尼貧血，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)，純紅細(xì)胞再生障礙，巨核細(xì)胞缺乏/先天性血小板減少癥，嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)，維斯科特-奧爾德里奇綜合征，重度β -地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病，赫爾勒綜合征，腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓發(fā)育不良，難治性貧血，慢性髓單核細(xì)胞白血病，病因不明的髓樣化生，家族性噬紅細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥或?qū)嶓w瘤。
95.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述個(gè)體患有乳腺癌，卵巢癌，腦癌，前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，皮膚癌，肝癌，胰腺癌或肉瘤。
96.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述個(gè)體已接受骨髓清除性或非清髓性化療或放射治療。
97.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述個(gè)體是骨髓捐獻(xiàn)者。
98.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是所述個(gè)體自體的。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是從所述個(gè)體的外周血或骨髓動(dòng)員的。
100.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是所述個(gè)體異體的。
101.制備用于增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的細(xì)胞群體的方法，包括:在約37° C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體接觸:前列腺素E2(PGE2)和具有dmPGE2活性的試劑；其中與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸。
102.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周血。
103.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述試劑是PGE2或其類似物。
104.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述PGE2類似物是16，16-二甲基PGE2。
105.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述試劑是cAMP增強(qiáng)劑。
106.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述足以增加所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的條件包括使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞接觸: (a)約10μ M或更高濃度的16，16- 二甲基PGE2 ;并 (b)持續(xù)約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
107.如權(quán)利要求106所述的方法，其中使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞與濃度約10μ M的16，16- 二甲基PGE2接觸；并持續(xù)約2小時(shí)的時(shí)間。
108.如權(quán)利要求106所述的方法，其中在不含內(nèi)毒素的容器中制備所述細(xì)胞群體，所述容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述溫度指示裝置包括至少一個(gè)產(chǎn)生指示容器溫度的信號(hào)的溫度指示器，所述經(jīng)過時(shí)間指示裝置包括至少一個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器；并且其中所述容器適于細(xì)胞貯存，細(xì)胞處理，細(xì)胞洗滌和細(xì)胞輸注。
109.如權(quán)利要求106所述的方法，其中將所述細(xì)胞群體給予需要細(xì)胞治療的個(gè)體。
110.增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在個(gè)體體內(nèi)增殖的方法，包括: (a)在約37°C的溫度下，使包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群體與選自以下的一種或多種試劑離體接觸:前列腺素E2(PGE2)和具有dmPGE2活性的試劑；和 (b)將所述細(xì)胞群體給予個(gè)體； 其中與非接觸的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞相比，在足以增加所述接觸過的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞在所述個(gè)體體內(nèi)增殖的條件下，使所述細(xì)胞群體與所述試劑接觸。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述細(xì)胞群體獲自骨髓，臍帶血或動(dòng)員的外周 血。
112.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述試劑是PGE2或其類似物。
113.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述PGE2類似物是16，16-二甲基PGE2。
114.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述試劑是cAMP增強(qiáng)劑。
115.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述足以增加所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞體內(nèi)增殖的條件包括使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞接觸: (a)約10μ M或更高濃度的16，16- 二甲基PGE2 ;并 (b)持續(xù)約I小時(shí)至約6小時(shí)的時(shí)間。
116.如權(quán)利要求115所述的方法，其中使所述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞與濃度約ΙΟμΜ的16，16- 二甲基PGE2接觸；并持續(xù)約2小時(shí)的時(shí)間。
117.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述細(xì)胞群體在不含內(nèi)毒素的容器中制備，所述容器包括溫度指示裝置和經(jīng)過時(shí)間指示裝置，所述溫度指示裝置包括至少一個(gè)產(chǎn)生指示容器溫度的信號(hào)的溫度指示器，所述經(jīng)過時(shí)間指示器包括至少一個(gè)經(jīng)過時(shí)間指示器；并且其中所述容器適于細(xì)胞貯存，細(xì)胞處理，細(xì)胞洗滌和細(xì)胞輸注。
118.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述細(xì)胞群體包括一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。
119.如權(quán)利要求118所述的方法，其中給予所述個(gè)體一個(gè)或多個(gè)臍帶血單位。
120.如權(quán)利要求118所述的方法,其中給予所述個(gè)體一個(gè)臍帶血單位或部分臍帶血單位。
121.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述個(gè)體患有急性髓性白血病(AML)，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，青少年髓單核細(xì)胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，重度再生障礙性貧血，范可尼貧血，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)，純紅細(xì)胞再生障礙，巨核細(xì)胞缺乏/先天性血小板減少癥，嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)，維斯科特-奧爾德里奇綜合征，重度β -地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病，赫爾勒綜合征，腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，脊髓發(fā)育不良，難治性貧血，慢性髓單核細(xì)胞白血病，病因不明的髓樣化生，家族性噬紅細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥或?qū)嶓w瘤。
122.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述個(gè)體患有乳腺癌，卵巢癌，腦癌，前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，皮膚癌，肝癌，胰腺癌或肉瘤。
123.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述患者已接受骨髓清除性或非清髓性化療或放射治療。
124.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述個(gè)體是骨髓捐獻(xiàn)者。
125.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是所述個(gè)體自體的。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其中所述細(xì)胞群體是從個(gè)體的外周血或骨髓動(dòng)員的。
127.如權(quán)利要求110所 述的方法，其中所述細(xì)胞群體是所述個(gè)體異體的。
全文摘要
本發(fā)明提供了改進(jìn)的用于細(xì)胞治療的方法。特別地，本發(fā)明提供具有改進(jìn)的植入和歸巢性質(zhì)的經(jīng)改變的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的治療組合物，以及制備所述治療組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了改善造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞移植的功效的方法，包括向需要造血系統(tǒng)重建的個(gè)體中植入所述治療組合物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK103167876SQ201180049420
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者丹尼爾·肖馬克, 普拉蒂克·穆爾塔尼, 卡羅琳·德斯邦特斯, 大衛(wèi)·L·羅賓斯, 保羅·格雷森, 約翰·門德雷恩 申請(qǐng)人:菲特治療公司