專(zhuān)利名稱(chēng)：用于遞送生物分子的包含陶瓷粒子的粒狀物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遞送生物分子的包含陶瓷粒子的粒狀物質(zhì)，以及制備其的方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含帶有官能團(tuán)的陶瓷基質(zhì)的粒子的粒狀物質(zhì)，其具有設(shè)置在所述粒子的孔隙內(nèi)的可釋放生物分子。
背景技術(shù)：
siRNA和基因療法的使用代表衛(wèi)生保健的一個(gè)潛在主要進(jìn)步。它顯示治療一系列當(dāng)前非可治愈疾病如囊性纖維化、一些癌癥以及免疫疾病如I型糖尿病、多發(fā)性硬化等的潛力。然而，對(duì)于保護(hù)siRNA在體內(nèi)免于酶降解直至遞送至作用部位以提供有效療法存在需要。目前，siRNA療法昂貴。對(duì)于這樣的昂貴療法的主要市場(chǎng)主要在更發(fā)達(dá)的國(guó)家。對(duì)于基因療法的全球市場(chǎng)估計(jì)為>US$5B。開(kāi)發(fā)siRNA療法至臨床使用的主要挑戰(zhàn)包括:.保護(hù)活性材料免于酶降解；.使活性材料能夠進(jìn)入靶細(xì)胞(良好滲透)；.活性材料從包封劑中釋放到細(xì)胞質(zhì)(內(nèi)含體逸出)；.確保擊倒基因 的能力(優(yōu)選具有在nM濃度的效力)；和 實(shí)現(xiàn)低毒性(大治療窗)。SiRNA為中間尺寸化(約14kDa，3nm直徑，IOnm長(zhǎng)度)、親水性、帶強(qiáng)負(fù)電的分子。它們是化學(xué)和生物不穩(wěn)定的，除非被修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性。為了實(shí)現(xiàn)臨床效果，siRNA必須能夠越過(guò)細(xì)胞膜并且存在于靶細(xì)胞群的胞質(zhì)中。在過(guò)去，病毒載體已被開(kāi)發(fā)以遞送RNA或DNA。然而，這些存在免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)并且很難進(jìn)行實(shí)踐。各種非病毒載體(例如脂質(zhì)復(fù)合物，陽(yáng)離子聚合物復(fù)合物，脂質(zhì)體，樹(shù)枝狀聚合物，聚合物納米粒子)也已被開(kāi)發(fā)。這些提供了一系列問(wèn)題，包括用siRNA實(shí)施的困難，siRNA和載體之間的相互作用，以及siRNA暴露于體內(nèi)降解。尤其是，設(shè)計(jì)各種系統(tǒng)用于將DNA或RNA吸附到納米粒子的表面上。然而，這些通常存在所吸附分子在遞送至作用位點(diǎn)之前經(jīng)受酶攻擊，由此降低治療的有效性的缺點(diǎn)。盡管上述討論主要涉及siRNA和DNA，但是所討論的問(wèn)題不限于siRNA和DNA。它們潛在地應(yīng)用于廣泛的期望進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)遞送的生物分子，包括例如肽、蛋白質(zhì)等。因此對(duì)于這些問(wèn)題的方案可以更廣泛地適用。本發(fā)明的應(yīng)用因此不應(yīng)認(rèn)為局限于siRNA。有利地，本發(fā)明基本上克服或至少改善上述缺點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)并且至少部分地滿(mǎn)足上述需要。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種粒狀物質(zhì)，包含:帶有官能團(tuán)的陶瓷基質(zhì)的粒子，上述官能團(tuán)能夠促進(jìn)所述粒子滲入細(xì)胞；和
設(shè)置在所述粒子孔隙內(nèi)的生物分子，所述生物分子通過(guò)溶解所述陶瓷基質(zhì)從所述粒子可釋放。如本文中使用的，提及生物分子被“設(shè)置在粒子的孔隙內(nèi)”用于在其范圍內(nèi)包括其中有效形成固體多孔粒子的陶瓷基質(zhì)具有分散在整個(gè)陶瓷基質(zhì)的孔隙中或設(shè)置在陶瓷基質(zhì)的孔隙中的生物分子的實(shí)施方式。這不用于包括其中生物分子附著或結(jié)合至粒子的外表面的情形。通常，除了可能在相對(duì)極端條件下之外，生物分子在沒(méi)有溶解陶瓷基質(zhì)下通過(guò)浸析基本上從所述粒子是不可釋放的。在該方面，如本文中使用的，提及生物分子“在沒(méi)有溶解陶瓷基質(zhì)下通過(guò)浸析基本上從所述粒子是不可釋放的”用來(lái)在其范圍內(nèi)包括在提出的儲(chǔ)存條件下浸析并使用粒狀物質(zhì)。優(yōu)選地，所述官能團(tuán)與生物分子相互作用以基本上防止浸析。優(yōu)選地，所述官能團(tuán)均勻地分布在整個(gè)粒子中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，帶有官能團(tuán)的陶瓷基質(zhì)包括官能化的二氧化硅基質(zhì)。然而，一系列金屬氧化物包括混合金屬氧化物可以是合適的，例如二氧化鈦、氧化鋁、氧化鋯、氧化鐵、二氧化鈰、氧化鋅等。所述官能團(tuán)也可以通過(guò)有機(jī)二氧化鈦或有機(jī)-氧化鋁提供，或者通過(guò)將與另一種金屬前體共縮聚以形成有機(jī)二氧化鈦二氧化硅或有機(jī)-鋁-二氧化硅的有機(jī)-硅烷提供。進(jìn)一步的實(shí)施方式從以下涉及粒子制備的討論將被理解。陶瓷基質(zhì)的官能團(tuán)可以包括有效促進(jìn)粒子滲入細(xì)胞的任何基團(tuán)。例如，這可以包括氨基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，官能團(tuán)包括氨基烷基烷基、伯烷氨基、仲烷氨基和叔烷氨基、烷基咪唑基、烷基酰胺基或烷基氨基酸基團(tuán)、進(jìn)一步的實(shí)施方式從以下涉及粒子制備的討論將被理解。本發(fā)明涉及一種包含生物分子的粒狀物質(zhì)。在此上下文中，術(shù)語(yǔ)“生物分子”可以指生物學(xué)起源或性質(zhì)并且具有生 物學(xué)活性的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)在其范圍內(nèi)包括包含一種或多種分子(包括不同分子的混合物)的物質(zhì)。它的分子量可以為約I至約IOOOkDa以上，或約I至約 100，I 至 50，I 至 20，I 至 10，5 至 1000，10 至 1000，100 至 1000，500 至 1000，5 至 100，5 至 50，5 至 20 或 10 至 20kDa，例如約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 lOOOkDa。在一些情況下，它的分子可以低于IkDa或大于lOOOkDa。它的直徑可以為約0.5_20nm，或約I至 20，2 至 20，5 至 20，10 至 20，0.5 至 10，0.5 至 5，0.5 至 2，0.5 至 1，I 至 10，2 至 10，I 至5，5 至 10 或 10 至 20nm，例如約 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15 或 20nm。生物分子可以根據(jù)討論的具體應(yīng)用進(jìn)行選擇。為了實(shí)現(xiàn)將生物分子保持在粒子之中和/或之上，它可以帶負(fù)電。這可以使得生物分子能夠結(jié)合至陶瓷基質(zhì)上的官能團(tuán)，例如結(jié)合至氨基官能陶瓷基質(zhì)的質(zhì)子化胺基團(tuán)。替代地或另外地，生物分子可以具有使其能夠結(jié)合至陶瓷基質(zhì)的官能團(tuán)的其他官能度。替代地或另外地，生物分子可以足夠大(即，具有足夠大的分子量或分子體積)以使其物理地被捕獲在粒子中。它可以足夠大使其不能通過(guò)粒子的孔隙。在某些實(shí)施方式中，生物分子可以是核酸如RNA，例如siRNA(小干擾RNA)、miRNA(微小RNA)或核酶、ASODN(反義核苷酸或反義RNA)、DNA分子、適體、蛋白質(zhì)包括多肽、肽、糖蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白(例如抗體和抗體片段)、碳水化合物、脂質(zhì)或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，生物分子是siRNA。生物分子可以指示用于預(yù)防性或治療性治療疾病、障礙或病癥。在一些實(shí)施方式中將表明處理劑結(jié)合至粒子的表面將是有利的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，聚乙二醇(PEG)鏈偶聯(lián)至粒子的表面。替代地或另外地，定位基團(tuán)(靶向基團(tuán)，targeting group)可以偶聯(lián)至粒子的表面以有利于在應(yīng)用中將粒子祀向祀標(biāo),例如腫瘤或特定器官或其他靶標(biāo)。在某些實(shí)施方式中，在其遠(yuǎn)端具有定位基團(tuán)的PEG鏈可以偶聯(lián)至粒子。在某些實(shí)施方式中，可以?xún)?yōu)選粒狀物質(zhì)的粒子的平均粒度為約0.1至約I微米。然然，它們的平均粒度可以為約0.1至10微米，或約0.1至5，0.1至2，0.1至1，0.1至0.5，
0.2 至 10，0.5 至 10，I 至 10，2 至 10，5 至 10，0.2 至 2，0.2 至 1，0.2 至 0.5，0.5 至 2 或 0.5至 I 微米，例如約 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、
6、7、8、9 或 10 微米。在一些實(shí)施方式中，可以?xún)?yōu)選所述平均粒度小于約0.1微米。例如，它可以為約20至 IOOnm (0.1 微米)，或約 20 至 50nm，或約 50 至 lOOnm，例如約 20、30、40、50、60、70、80 或90nmo注意的是，尺寸高于約1-2微米的粒子可能不適合細(xì)胞內(nèi)遞送。然而，認(rèn)為它們可以可用于在身體內(nèi)其他地方遞送更大的蛋白質(zhì)。在該方面，多達(dá)幾微米的粒子可以被內(nèi)化，尤其通過(guò)專(zhuān)化吞噬細(xì)胞。粒子可以基本上是單分散的或者可以存在一些聚集以形成粒度分布曲線(xiàn)中的第二峰。分布曲線(xiàn)可以為正態(tài)、高斯或一些其它分布。粒子可以具有寬粒度分布或中度或窄粒度分布。粒子可以為球形或大致球形，或可以為卵形或扁球形或多面體(具有例如8至約60邊)或可以為一些其它形狀 。它們的形狀可以是不規(guī)則的。粒子可以為中孔性的(即〈lOOnm孔徑)。它們可以為微孔性的(即〈1.7nm孔徑)。優(yōu)選地，粒子的平均孔徑為約I至約50nm。例如，平均孔徑可以為約I至20，I至10，5至50，10 至 50，20 至 50，5 至 20，5 至 10 或 10 至 20nm,例如約 I, 2，3，4，5，10，15，20，25，30，35,40, 45 或 50nm?？紫督Y(jié)構(gòu)可以包括互連孔隙，或者可以包括通過(guò)相對(duì)較小互連通道結(jié)合的孔穴。孔徑可以足夠小以便通過(guò)從孔隙擴(kuò)散而基本上防止生物分子釋放。替代地，如果孔徑使得生物分子可以逃逸，則生物分子可以通過(guò)吸引至孔隙表面上的官能團(tuán)而被保留。官能團(tuán)可以與促進(jìn)粒子滲入細(xì)胞的那些官能團(tuán)相同或不同。粒子的生物分子的裝載量為約I至約20%w/w，例如，約I至10，I至5，I至2，2至20，5 至 20，10 至 20，2 至 10，2 至 5 或 5 至 10%,例如約 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20%，盡管在一些情況下，它可以低于1%或可以大于20%。使用中，生物分子有利地通過(guò)在基本上不降解生物分子的條件下溶解粒子而可釋放。例如，它可以通過(guò)基本上不降解生物分子的生物介質(zhì)溶解粒子而可釋放。它可以替代地在適當(dāng)釋放液體中稀釋時(shí)可釋放。通常，生物分子在約0.5至約50小時(shí)時(shí)間內(nèi)可釋放(例如基本上完全可釋放)。例如，約 0.5 至 20，0.5 至 10，0.5 至 5，0.5 至 2，I 至 50，5 至 50，10 至 50，I 至 20，I 至 10，2至 10 或 5 至 10 小時(shí)，例如約 0.5，I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45 或 50小時(shí)。由于溶解速率可能依賴(lài)于粒子的大小，所以此速率可以如在后面描述中討論的通過(guò)調(diào)節(jié)粒子的大小而進(jìn)行調(diào)節(jié)。最有利地，當(dāng)粒子暴露于降解劑例如酶時(shí)，生物分子在其從粒子釋放之前被保護(hù)以免于降解，否則所述降解劑將能夠降解該生物分子。即，生物分子通過(guò)陶瓷基質(zhì)被保護(hù)免于降解。在一些實(shí)施方式中，考慮了聚合物或絡(luò)合劑可以與生物分子一起設(shè)置在粒子的孔隙中以促進(jìn)內(nèi)含體逃逸。通常該聚合物可以是聚乙烯胺、聚賴(lài)氨酸、或聚組氨酸或者提供質(zhì)子海綿效應(yīng)的任何物質(zhì)。微粒OlOOnm)的形成在一些實(shí)施方式中，可以有利地在微觀級(jí)上形成粒子。即，用于此描述的目的，粒子的平均粒度大于lOOnm。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于制備包含設(shè)置在孔隙中的生物分子的粒子的方法，所述方法包括:a)組合:包含疏水液體、第一陶瓷 前體和表面活性劑的疏水相；和包含親水液體、第二陶瓷前體和生物分子的親水相，以形成包含分散在疏水相中的親水相的液滴的乳液；以及b)當(dāng)粒子在所述液滴內(nèi)形成時(shí)攪拌該乳液；其中第一陶瓷前體包含能夠促進(jìn)粒子滲入細(xì)胞的官能團(tuán)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“攪拌”在其范圍內(nèi)包括任何形式的攪拌，包括但不必限于攪動(dòng)、振蕩、渦旋、聲處理、剪切等，以及這些的任意組合。在制備粒子中，通過(guò)組合疏水相和親水相而形成乳液。這可以是油包水(w/o)乳液，其中疏水相表示連續(xù)相而親水相表示分散或不連續(xù)相。疏水相可以是親油相或親脂相。疏水相可以通過(guò)組合表面活性劑和疏水液體并添加第一陶瓷前體以形成疏水相而制備，或者它可以通過(guò)組合所有三種組分而制備，或者它可以通過(guò)組合第一陶瓷前體和疏水液體或表面活性劑之一然后添加另一種而制備。這些步驟優(yōu)選在組合疏水相和親水相之前進(jìn)行。每個(gè)組合步驟可以包括攪拌已經(jīng)組合的組分。攪拌可以包括包括攪動(dòng)、振蕩、渦旋、聲處理或這些的組合。對(duì)于這些組分它足以形成溶液。因此疏水相可以表示第一陶瓷前體和表面活性劑在疏水液體中的溶液。疏水相包含3種組分:疏水液體-這可以例如是植物油、石蠟油、礦物油或一些其它合適疏水液體。它可以包括疏水組分的混合物，例如植物油的混合物或植物油和石蠟油的混合物。它通常是中度粘度，例如約0.5至約1500mPa.s,或約0.5至1000，0.5至500，0.5至250，0.5至100，0.5 至 50，0.5 至 20，0.5 至 10，0.5 至 5，0.5 至 1，I 至 1500，10 至 1500，100 至 1500，250至 1500，500 至 1500，1000 至 1500，10 至 1000，10 至 200，200 至 1000 或 200 至 500mPa.s’例如約 0.5，I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，150，20
O,250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400 或 1500mPa.s,呼和在一些情況下，大于1500mPa.S。疏水液體的粘度可以被使用以控制通過(guò)該方法制造的粒子的粒度。因此更粘稠的疏水液體通常將提供更粘性的疏水相，這通常又將提供更小的粒度。表面活性劑-這可以是用于支持油包水乳液的合適表面活性劑。它可以在疏水液體中可溶或與其混溶。它可以是非離子表面活性劑或者它可以是陰離子表面活性劑或者它可以是兩性離子表面活性劑。它的HLB可以為約8至約16，或約8至12，10至16或8至10，例如約8，9，10, 11，12，13，14，15或16。合適的表面活性劑包拈Span' 20 (ι賽月桂酸山梨醇酐酯)、Aerosol OT (雙(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉)、Span 20/Tween 80混合物和Span_ 20/Brij(g| 35混合物。使用混合表面活性劑通常提供非常細(xì)的乳液，但最終粒度通常不變。第一陶瓷前體-這個(gè)組分包括能夠促進(jìn)所得粒子滲入細(xì)胞的官能團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，第一陶瓷前體的官能團(tuán)能夠與生物分子化學(xué)地相互作用，例如靜電地相互作用。這個(gè)組分可以例如是氨基官能的。替代地，可以使用其他帶正電荷基團(tuán)或可以導(dǎo)致帶正電荷的基團(tuán)。它可以是每個(gè)分子具有至少一個(gè)胺基并且能夠轉(zhuǎn)化成氨基官能陶瓷基質(zhì)的化合物。在疏水液體中或者在該疏水液體中的表面活性劑的混合物(可選地溶液)中，它可以是可溶的。合適的陶瓷前體包括氨基官能硅烷，尤其是氨基官能烷氧基硅烷。這些硅烷的烷氧基可以例如是Cl至C6烷氧基(如果C3以上，其可以是支化的)，通常Cl至C4烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基或丁氧基。在一些情況下，可以使用其他可水解基團(tuán)，例如酰氧基、酮肟基、烯醇氧基等。氨基官能陶瓷前體每個(gè)分子可以具有多于一個(gè)的胺基，例如2，3，4或5個(gè)胺基/分子。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)二氨基-和三氨基-陶瓷前體通常產(chǎn)生在結(jié)合合適生物分子方面比相應(yīng)單氨基-陶瓷前體更有效的粒子。每個(gè)胺基可以獨(dú)立地是伯、仲或叔的。在優(yōu)選的前體中，氨基被連接基團(tuán)分隔開(kāi)，該連接基團(tuán)通常是短亞燒基鏈如亞乙基(-CH2CH2-)、亞丙基(-CH2CH2CH2-)或亞丁基(-CH2CH2CH2CH2-)鏈。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為亞丁基可以是特別有用的，因?yàn)檫@個(gè)基團(tuán)出現(xiàn)在天然多胺多核苷酸配體如腐胺(N-4-N)、亞精胺(N-3-N-4-N)和 精胺(N-3-N- 4-N-3-N)中。涉及亞戍基和亞己基的各種組合也可以是有用的，然而生源構(gòu)型極不相同的基團(tuán)可能潛在地是有毒的。尤其是，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，亞乙基間隔物提供的胺基團(tuán)之間的距離可接受地接近siRNA中的電荷間隔并且存在于可商購(gòu)產(chǎn)品中，使得這種間隔物示于在生物分子是siRNA時(shí)使用。因此，合適的前體包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基娃燒、3-[2_(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷及其任意兩種以上的混合物。可以用作第一陶瓷前體的其他化合物包括服丙基二燒氧基娃燒、異氛酸酷官能燒氧基娃燒、竣基官能燒氧基娃燒、疏基官能燒氧基娃燒(例如疏丙基二燒氧基娃燒)、陽(yáng)尚子妝或接枝到燒氧基娃燒的碳水化合物或脂質(zhì)等。也可以使用這些中的任意兩種以上的混合物，或任何其他合適第一陶瓷前體的混合物。在一些情況下，第一陶瓷前體可以是混合物。它可以是硅烷陶瓷前體的混合物。它可以另外包含一種或多種非-硅烷陶瓷前體，例如氧化鋯前體、氧化鋁前體或二氧化鈦前體。這些可以例如分別是烷醇鋯、烷醇鋁和烷醇鈦。通常表面活性劑對(duì)疏水液體的比率為約5至約25%w/v(即約5至約25g表面活性劑對(duì)IOOml疏水液體)或約5至20，5至15，10至25，15至25或10至20%，例如約5，10，15，20 或 25%。通常第一陶瓷前體對(duì)疏水液體的比率為約10至約IOOOppm(基于v/v)，或約10至500，10 至 200，10 至 100，10 至 50，20 至 1000，50 至 1000，100 至 1000，200 至 1000，500 至1000，20 至 500，50 至 500，50 至 200，200 至 500 或 50 至 200ppm,例如約 10，20，304，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900 或 lOOOppm。親水相可以是疏油相。它可以是含水相。親水相包含三種組分:親水液體-這可以是疏脂的。它通常是含水的，例如，它可以是水，包括純水，或水溶液。它還可以包含溶解鹽。第二陶瓷前體-這可以是水溶性硅酸鹽，特別是偏硅酸鹽。它可以是硅酸鹽本身(例如通過(guò)水解四烷基硅酸鹽如四甲基原硅酸鹽或四乙基原硅酸鹽)，或者可以是具有式RSi (OR’ )xOHySiz的物質(zhì)，其中x+y+z=3 (在本文中稱(chēng)為烷基硅酸鹽，例如通過(guò)水解烷基三烷氧基硅烷例如甲基三甲氧基硅烷或乙基三甲氧基硅烷產(chǎn)生)。在烷基硅酸鹽的情況下，烷基R應(yīng)足夠小或者足夠親水以使第二陶瓷前體是水溶性的。應(yīng)理解，這可以例如用小R基團(tuán)如甲基或乙基，或者具有親水或極性取代基如羥基、硝基、硫酸根等的較大R基團(tuán)實(shí)現(xiàn)。第二陶瓷前體可以例如是水玻璃。水玻璃是通常在水溶液中的具有經(jīng)驗(yàn)式約Na2SiO3的低聚或聚合硅酸鹽材料，具有變化的水合度。水玻璃的固含量可以為約I至約20%，或約I至10，I至5，I至2，2至20，5至20，10至20，2至10，2至5或5至10%，例如約
I,2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或 20%。這可以具有在水中的約 25至約30% 二氧化硅和約I至約20%氫氧化鈉。它可以在水中以約1:2至約1:10的因子稀釋?zhuān)蚣s 1:2 至 1:5，1:5 至 1:10 或 1:3 至 1:8，例如約 1: 2，1: 3，1: 4，1: 5，1: 6，1: 7，1: 8，1:9或 1:10。
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第二陶瓷前體也可以是烷醇鈦(例如乙醇化物，正丙醇化物或異丙醇化物，正丁醇化物、仲丁醇化物和叔丁醇化物)或醇化鋁或醇化鋯或改性金屬醇化物(例如用乙酰基丙酮或乙酸改性)。它還可以是混合金屬醇化物。它還可以另一種金屬鹽如鎂鹽、鋯鹽和鋁鹽以形成硅酸鎂、硅酸鋁等。它可以是預(yù)先水解的烷氧基硅。第二陶瓷前體可以包括陶瓷膠體，例如膠體二氧化硅。陶瓷膠體的粒徑可以低于50nm，或低于約40，30，20或10nm，或?yàn)榧s5至約50nm或?yàn)榧s5至20，5至10，10至50，20至50或10至20nm。它的粒徑(通常是平均粒徑但可選地是最大粒徑)可以為約
5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 或 50nm。在一些情況下，第二陶瓷前體可以包括以上選項(xiàng)的兩種以上的組合，例如它可以包括水硅酸鹽與膠體二氧化硅的混合物。生物分子-對(duì)于生物分子的各種選擇如上所述。如注意到的，這可以帶負(fù)荷或者可以為中性電荷。它可以帶足夠負(fù)電荷以被吸引至，可選地結(jié)合至粒子的官能團(tuán)(衍生自第一陶瓷前體)。它可以是或者它可以包括RNA，例如siRNA(小干擾RNA)、miRNA(微小RNA)、ASODN(反義核苷酸或反義RNA)、適體、DNA、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。另外，可以添加聚合物或絡(luò)合劑以使其與生物分子一起設(shè)置在粒子的孔隙內(nèi)以促進(jìn)內(nèi)含體逃逸。通常該聚合物可以是聚乙烯胺、聚賴(lài)氨酸或聚組氨酸或提供質(zhì)子海綿效應(yīng)的任何物質(zhì)。
親水相可以是酸性的。它的pH可以抵御第一陶瓷前體的pKa(如果該陶瓷前體是堿，例如氨基官能陶瓷前體，則其共軛酸的pKa)。親水相的pH可以低于約10.5，或低于約 10，9，8，7，6，5.5，5，4.5 或 4，或?yàn)榧s 3 至 10.5，5 至 10.5，7 至 10.5，9 至 10.5，7 至 10，9至4，7至4，9至7，5至7，3至6，或約3至5，3至4，4至6，4至5或3.5至4.5，例如約
3,3.5, 4, 4.5, 5，5.5 或 6。通常在制備親水相中，親水液體和第二陶瓷前體組合，可選地第二陶瓷前體溶解在親水液體中。所述方法可以隨后包括將PH調(diào)節(jié)至低于第一陶瓷前體的PKa的pH，例如低于約10.5的pH，或調(diào)節(jié)至酸性pH，例如至低于約7、或低于約5、或低于約4的pH，以及添加生物分子以形成親水相。例如，在第二陶瓷前體是水玻璃或膠體二氧化硅的情況下，這通常導(dǎo)致堿性溶液。因此所述方法大可以包括酸化這種溶液。酸化可以通過(guò)將溶液暴露于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂而方便實(shí)現(xiàn)，其中在所述暴露之前，樹(shù)脂處于其酸(質(zhì)子化)形式。暴露可以包括組合樹(shù)脂和溶液，可選地?cái)嚢杷没旌衔?，然后將?shù)脂與酸化溶液分離(例如通過(guò)過(guò)濾、傾析、離心等)，或者它可以包括使溶液通過(guò)樹(shù)脂的床。樹(shù)脂對(duì)第二陶瓷前體的比率可以為使得期望PH (如上所述)被實(shí)現(xiàn)。替代地，第二陶瓷前體可以通過(guò)加入酸化劑(例如酸)或加入合適緩沖液進(jìn)行酸化。通常生物分子在親水相和疏水相組合之前不久添加到酸化溶液中。它可以在它們組合之前立即添加。它可以在它們組合之前少于約2分鐘，或者在它們組合之前少于約I分鐘，或少于約50，40, 30, 20, 15或10秒添加。這減少了發(fā)生生物分子的不利化學(xué)反應(yīng)的可能性。生物分子可以以足夠量存在于親水相中以實(shí)現(xiàn)最終粒子中的期望裝載量。親水相中生物分子的典型濃度為約1至 約10mg/ml，或約I至5，5至10或2至8，例如約1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/ml。生物分子可以溶液形式的添加到組合的親水液體/第二陶瓷前體中。用于這種溶液的溶劑應(yīng)與親水液體混溶，并且通常與親水液體相同。生物分子可以添加到水溶液中。在形成乳液過(guò)程中，疏水相和親水相組合，可選地在攪拌下。攪拌可以包括攪動(dòng)、振蕩、潤(rùn)旋和聲處理中的一種或多種。制備乳液的一種有效方式是制備如上所述的疏水相并在制備中使其同時(shí)攪動(dòng)和聲處理以添加親水相。親水相然后通過(guò)組合生物分子與該組合的第二陶瓷前體和親水液體(例如酸化的水玻璃水溶液)制備，并且將所得親水相盡可能快速地添加到該聲處理、攪動(dòng)的疏水相，同時(shí)維持聲處理。聲處理可以在添加后持續(xù)短時(shí)間，例如約10至約120秒，或約10至60，10至30，20至120，60至120，20至60或20至40秒，例如約10，20, 30, 40, 50, 60, 90或120秒。聲處理通常在適當(dāng)時(shí)間后關(guān)閉以防止乳液過(guò)熱。這樣的過(guò)熱例如可能不利地影響生物分子。聲處理可以以約200至2000W，或約200至1000，200 至 500，500 至 2000，1000 至 2000，500 至 1000 或 600 至 800W,例如約 200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1200，1400，1600，1800 或 2000W 的功率進(jìn)行。疏水相對(duì)親水相的比率可以為約10至約50 (即約10:1至約50:1)，或約10 至 40，10 至 30，10 至 20，20 至 50，30 至 50，40 至 50，20 至 40 或 25 至 25，例如約10，15，20，25，30，35，40，45 或 50。第一陶瓷前體對(duì)第二陶瓷前體的摩爾比為約0.2至約20mol%，或約0.5至20，I至20，2 至 20，5 至 20，10 至 20，0.2 至 10，0.2 至 5，0.2 至 2，0.2 至 1，I 至 10，I 至 5 或 5 至10，例如約 0.5，I, 1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20mol%可以是足夠的。在第一陶瓷前體是或包括氨基官能硅烷的情況下，第一陶瓷前體對(duì)第二陶瓷前體的比率可以變化以改變粒子上的電荷。因此如果該量低(例如相對(duì)于第二陶瓷前體為約lmol%)，則粒子將大致為中性電荷，而如果該量更高(約10mol%)，則它們將帶正電荷。如果沒(méi)有添加(或極低量，例如低于約0.5mol%)氨基官能硅烷，則粒子可能帶負(fù)電荷。在如上所述制備的乳液中，親水相的液滴的平均直徑可以為約0.1至約10微米，或約 0.1 至 5，0.1 至 2，0.1 至 1，0.1 至 0.5，0.2 至 10，0.5 至 10，I 至 10，2 至 10，5 至 10，0.2至 2，0.2 至 1，0.2 至 0.5，0.5 至 2 或 0.5 至 I 微米，例如約 0.1, 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，I, 1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9 或 10 微米。該平均值可以是數(shù)均直徑或
重均直徑。液滴可以基本上是單分散的或者可以有一些聚集以形成分布曲線(xiàn)中的第二峰。液體可以具有寬粒度分布或中度或窄粒度分布。認(rèn)為粒子通過(guò)第一和第二陶瓷前體的相互作用形成在液滴內(nèi)部。前體縮合形成粒子通常非常快速(幾微秒至幾秒)。所述相互作用可以是反應(yīng)。它可以是縮合。它可以包括水解第一陶瓷前體。已經(jīng)觀察到，如果第一陶瓷前體是氨基官能的并且直接添加到親水相中，則發(fā)生快速凝膠化使得適當(dāng)尺寸化粒子的形成被阻止。 組合的親水相和疏水相可以攪動(dòng)或其他方式攪拌足夠時(shí)間以形成粒子。這可能至少部分地取決于反應(yīng)溫度。粒子形成可以在任何合適溫度下進(jìn)行，例如室溫，或約10至約35° C，或約 10 至 30，10 至 25，10 至 20，15 至 35，20 至 35，25 至 35，15 至 30，15 至 20 或 20至25。C，例如約15，20，25，30或35° C。它可以在低于生物分子變性溫度的溫度下進(jìn)行。粒子的形成可能花費(fèi)約10至約120分鐘，盡管如果期望，組合的相可以攪動(dòng)或其他方式攪拌比這更長(zhǎng)的時(shí)間。合適的時(shí)間為約10至100，10至60，10至30，20至120，30至120，60至 120，30 至 90 或 45 至 75 分鐘，例如約 10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115 或 120 分鐘。一旦粒子已形成，它們可以被表面官能化。這可以原位實(shí)現(xiàn)，即不用分開(kāi)或分離粒子。它可以包括在粒子形成之后向乳液中添加表面處理以表面處理粒子。表面官能化可以是PEG化(即向表面添加聚乙二醇鏈)。表面處理劑可以包括偶聯(lián)至結(jié)合基團(tuán)的聚乙二醇(PEG)鏈。PEG鏈的分子量可以為約I至約20kDa，或約I至10，I至5，I至2，2至20，5至20，10 至 20，2 至 10，2 至 5 或 5 至 IOkDa,例如約 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17, 18, 19或20kDa。結(jié)合基團(tuán)可以是二燒氧基娃燒，即表面處理劑可以是二燒氧基甲娃燒基PEG。合適的燒氧基包括甲氧基、乙氧基或丙氧基。其他可水解甲娃燒基也可以使用，例如三乙酰氧基、三肟基、三烯醇氧基、三酰胺基等。粒子的表面可以通過(guò)使表面與具有官能團(tuán)的PEG (或其他合適的分子)反應(yīng)而官能化，該官能團(tuán)與表面的OH反應(yīng)或整合到粒子內(nèi)部和表面處的氨基發(fā)生反應(yīng)。例如，羧基官能PEG表面處理劑可以用來(lái)與粒子上的表面胺基團(tuán)形成酰胺，或表面胺基團(tuán)可以被活化(例如通過(guò)形成琥珀酰亞胺基或異硫氰酸酯基)，然后與氨基官能PEG表面處理劑反應(yīng)。PEG基團(tuán)通常大(典型地>lKDa)使得它們不滲入球體內(nèi)部而主要接枝到粒子的表面。一系列功能性PEG可商購(gòu)獲得，其適用于這種接枝，例如異硫氰酸酯-改性PEG和羧基-改性PEG，其在與粒子表面上的胺反應(yīng)時(shí)將產(chǎn)生酰胺鍵。隨后的表面官能化，例如PEG化，以官能化粒子的表面，可以限于但足夠在堿性條件中。在堿性條件中，第一陶瓷前體(例如氨基硅烷如氨基乙基氨基丙基三乙氧基硅烷)在一些情況下可以直接添加到第二陶瓷前體(例如水玻璃或膠體二氧化硅)。在一些情況下，親水相的PH不低于第一陶瓷前體的pKa。在這樣的情況下，初始形成的粒子懸浮液(在堿性條件下形成)可以隨后被酸化。如果生物分子帶負(fù)電荷，這可以用于促進(jìn)生物分子附著至粒子。如果粒子隨后進(jìn)行表面處理，則酸化可以在隨后的表面處理之前或期間進(jìn)行以有利于PEG-硅烷附著。在粒子上不存在正電荷的情況下，生物分子的釋放可以是非?？焖俚?幾分鐘數(shù)量級(jí))，除非它足夠大而阻止其逃逸通過(guò)粒子的孔隙。在一些情況下，表面處理劑可以包含用于靶向患者中的靶標(biāo)的定位基團(tuán)。例如，表面處理劑可以包含具有在PEG遠(yuǎn)端處的定位基團(tuán)的三烷氧基甲硅烷基-PEG，即它可以具有結(jié)構(gòu)三烷氧基甲硅烷基-PEG-定位基團(tuán)。靶標(biāo)可以例如是腫瘤或特定器官或一些其它靶標(biāo)。定位基團(tuán)可以例如是抗體或抗體片段(例如Fab)。合適定位基團(tuán)的實(shí)例包括抗體、肽細(xì)胞因子、肽激素、基質(zhì)蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞粘附中涉及的蛋白質(zhì)、細(xì)胞識(shí)別中涉及的蛋白質(zhì)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性中涉及的蛋白質(zhì)、細(xì)胞募集中涉及的蛋白質(zhì)、細(xì)胞分化中涉及的蛋白質(zhì)、疾病識(shí)別中涉及的蛋白質(zhì)、生物活性碳水化合物如肝素和相關(guān)物質(zhì)，生物活性糖蛋白包括但不限于落入以上所列類(lèi)別中的那些，上述類(lèi)別的任何成員的配體、上述類(lèi)別的任何成員的片段、上述類(lèi)別的任何成員的類(lèi)似物、共享上述類(lèi)別的任何成員的親和性或功能的低分子量物質(zhì)，其他低分子量生物分子如激素、營(yíng)養(yǎng)物、藥物、毒素、神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌遞質(zhì)、自分泌和旁分泌遞質(zhì)、顏料、脂質(zhì)、油類(lèi)、離子配體、代謝物、分解代謝物等。表面處理劑可以直接添加至疏水相中的粒子的懸浮液中。反應(yīng)可以在大約環(huán)境溫度下進(jìn)行，例如通過(guò)攪動(dòng)適當(dāng)時(shí)間以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。合適時(shí)間為約8至約24小時(shí)，或約8至16，8至12，12至24，18至24或12至18小時(shí)，例如約8，12，16，20或24小時(shí)?？梢允褂米銐虻谋砻嫣幚韯┮詫?shí)現(xiàn)適當(dāng)水平的表面官能化，例如在使用中足以防止過(guò)多粒子聚集或足以提供粒子至靶標(biāo)的可接受的靶向。一旦粒子已形成，通常它們不被徹底干燥。這抑制粒子的聚集，如果發(fā)生聚集，則它將需要再懸浮，其在一些情況可能很難。通過(guò)粒子通過(guò)離心分離自溶液。合適的條件為約 10000 至約 500 00rpm,或約 10000 至 30000，30000 至 50000 或 20000 至 30000rpm,例如約10000，20000, 30000, 40000或50000rpm。合適的分離通常在約5至15分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn),盡管有時(shí)可以使用更長(zhǎng)時(shí)間的離心。所得粒子可以洗滌以除去雜質(zhì)。洗滌過(guò)程可以涉及將粒子再懸浮在溶劑中，使粒子至少部分地與溶劑分離(例如通過(guò)沉淀和/或通過(guò)離心)并將溶劑從粒子潷析。重要的是，溶劑是不使生物分子變性的溶劑。這可以是對(duì)所使用的特定生物分子是特異的。例如，乙醇不影響DNA或RNA的結(jié)構(gòu)，但可以使大多數(shù)大蛋白質(zhì)變性。用于洗滌的合適溶劑包括烴類(lèi)如己烷、環(huán)己烷、甲苯等，以及醇類(lèi)如乙醇或異丙醇。粒子可以用相同溶劑或不同溶劑洗滌多次(例如2，3，4或5或更多次)。所得粒子可以再懸浮在合適溶劑中并作為懸浮液儲(chǔ)存在該溶劑用于以后使用。如果粒子要遞送至患者，則這種溶劑可以是臨床可接受的溶劑。用于儲(chǔ)存的合適溶劑是遺傳。通常粒子的儲(chǔ)存溫度為約-210至約+10° C，或約-210至0，-90至0，-210至-100，-210至-65，-90 至-30，-30 至 0，-30 至-10，-20 至 +10，-10 至 +10，O 至 10 或 O 至 5° C，例如約-210，-200，-180，-160，-140，-120，-100，-90，-80，-70，-60，-50，-40，-30，-25，-20，-15，-10，-5，O, I, 2，3，4，5，6，7，8，9或10° C。它們可以?xún)?chǔ)存在約液氮溫度。它們可以?xún)?chǔ)存在干冰溫度。它們可以?xún)?chǔ)存在冷凍機(jī)或冰箱中。在上述段落中，提及乙醇，乙醇包括包含多達(dá)約30%水。因此乙醇可以是約70至約100%乙醇，剩余可以是水，或約80至100，90至100，70至90或80至90%，例如約70，80, 90或100%乙醇。異丙醇、正丙醇或正丁醇也可以代替乙醇，對(duì)水含量具有類(lèi)似限制。使用乙醇或丙醇的優(yōu)點(diǎn)是它對(duì)用于遞送至患者或?qū)τ谄渲袩o(wú)菌性是有益的其他應(yīng)用提供無(wú)菌環(huán)境。在一些情況下，可以使用甲醇。所述方法對(duì)于生物分子的包封效率(EE)優(yōu)選高，因?yàn)樯锓肿油ǔ０嘿F。所述EE將取決于所述方法的精確性，包括例如第一陶瓷前體的類(lèi)型和量、生物分子對(duì)所使用的陶瓷前體的比率等。通常所述方法將遞送大約約40%，或大于約50，60，70或80%的EE。所述EE 可以例如為約 40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90 或 95%。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，提供了一種用于制備包含生物分子的粒子的方法，所述方法包括:a)組合:包含疏水液體、氨基烷烷基官能三烷氧基硅烷和HLB胃約8至約16的表面活性劑的疏水相；和包含水、處于pH5的水玻璃和生物分子的親水相， 以形成包含分散在疏水相中的親水相的液滴的乳液；以及b)當(dāng)粒子從液滴形成時(shí)攪拌所述乳液。

在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，提供了一種用于制備包含生物分子的方法，所述方法包括:組合HLB為約8至約16的表面活性劑和疏水液體并添加氨基烷氨基官能三烷氧基娃燒以形成疏水相；組合水和水玻璃，將pH調(diào)節(jié)至低于約5并添加生物分子以形成親水相；組合所述疏水相和親水相以形成包含分散在所述疏水相中的親水相的液滴；當(dāng)粒子從液滴形成時(shí)攪拌所述乳液；以及在形成所述粒子后向所述乳液中添加表面處理劑以表面處理所述粒子。在這個(gè)實(shí)施方式中，添加生物分子的步驟可以在組合疏水相和親水相步驟之前馬上(例如少于I分鐘)進(jìn)行。生物分子可以是RNA或DNA或之前描述的其他生物分子。它可以是s i RNA。在上述實(shí)施方式的變形中，可以使用其他pH范圍代替低于約5。例如可以使用堿性條件如大于約8的pH。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為范圍為約5至約8的pH也是可用的。其他可能的變形包括使用膠體懸浮液如膠體二氧化硅代替水/水玻璃組合。這些變形可以適用于相對(duì)較大生物分子如蛋白質(zhì)的包封。鄉(xiāng)內(nèi)米粒子(<IOOnm)的形成在各種實(shí)施方式中，可以有利地在較小數(shù)量級(jí)，特別是尺寸小于IOOnm上形成粒子?？紤]了這可以在一些情況下提供更有效的生物分子遞送。因此，本發(fā)明還提供一種用于制備包含設(shè)置在其孔隙內(nèi)的生物分子的粒子的方法，所述方法包括:
a)組合:包含疏水液體和表面活性劑的疏水相；和包含親水液體和催化劑的親水相，以形成包含分散在疏水相中的親水相的液滴的乳液；b)向乳液中添加陶瓷前體并水解該陶瓷前體；c)將親水相的pH調(diào)節(jié)至適用于生物分子的范圍；d)向乳液中添加生物分子和官能化陶瓷前體；以及e)當(dāng)粒子在液滴內(nèi)部形成時(shí)攪拌乳液，其中所述官能化陶瓷前體包含能夠促進(jìn)粒子滲入細(xì)胞的官能團(tuán)。關(guān)于制備微粒的許多上述特征和實(shí)施方式可以同樣適用于本發(fā)明的這個(gè)方面。同樣，這些特征和實(shí)施方式通過(guò)引用具體地結(jié)合于此以避免不必要的重復(fù)。在該方面，依照本發(fā)明這個(gè)方面描述的官能化陶瓷前體對(duì)應(yīng)于上述第一陶瓷前體。依照本發(fā)明這個(gè)方面描述的陶瓷前體對(duì)應(yīng)于上述第二陶瓷前體。盡管并入上述特征實(shí)施方式，尤其是本發(fā)明的實(shí)施方式，官能化陶瓷前體的官能團(tuán)能夠與生物分子化學(xué)地相互作用例如靜電地相互作用。例如，官能化陶瓷前體可以是氨基官能陶瓷前體，如氨基官能烷氧基硅烷。在某些實(shí)施方式中，氨基官能陶瓷前體包含氨基烷基烷基。例如，氨基官能陶瓷前體可以包含3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2_(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基二甲氧基娃燒、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙 基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷、或這些中的任意兩種以上的混合物。表面活性劑的HLB同樣可以為約8至約16。已發(fā)現(xiàn)利用壬基酚聚氧乙烯醚可以實(shí)現(xiàn)良好結(jié)果。疏水相可以另外包含輔助表面活性劑，如醇，例如1-戊醇。在制備納米粒子的情況下，認(rèn)為粘度不是關(guān)鍵，因?yàn)樾纬晌⑷橐?與正常乳液相反)，其是熱力學(xué)穩(wěn)定的并且由極小IOnm)液滴構(gòu)成。在某些實(shí)施方式中，疏水液體包含烷烴(例如己烷(C6)至十二烷(C12))，環(huán)烷烴如環(huán)己烷，芳烴(例如甲苯，苯)和摻混物如煤油。親水相包含親水液體和催化劑。例如，親水液體可以包含水并且催化劑可以是酸。更通常地，用于水解烷氧基硅的典型催化劑可以是酸或堿，氟化物或其他金屬醇化物例如醇化鈦。生物分子是如上所述的。例如，它可以帶負(fù)電荷或足夠大以使其不能通過(guò)粒子的孔隙。生物分子可以包括RNA、反義核苷酸和反義引物、適體、DNA、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，生物分子包括siRNA。所述方法包括調(diào)節(jié)乳液的pH，例如通過(guò)在添加生物分子和官能化陶瓷前體之前添加堿如Na0H、K0H和NH4OH,以避免生物分子的變性。典型地水解在低pH (如2)下進(jìn)行以確保對(duì)于水解反應(yīng)的足夠動(dòng)力學(xué)同時(shí)抑制水解前體的縮合。在添加生物分子之前，優(yōu)選將PH升至更大中性條件(即pH>4)。同樣，可以添加聚合物或絡(luò)合劑以使其于生物分子一起設(shè)置在粒子孔隙內(nèi)，以有利于內(nèi)含體逃逸。典型地所述聚合物可以是聚乙烯胺、聚賴(lài)氨酸或聚組氨酸或提供質(zhì)子海綿效應(yīng)的任何物質(zhì)。與關(guān)于本發(fā)明的之前的方面一樣，所述方法可以另外包括:f)在形成離子后向乳液中添加表面處理劑以表面處理所述粒子。表面處理劑可以包含偶聯(lián)至結(jié)合基團(tuán)的聚乙二醇鏈，所述結(jié)合基團(tuán)能夠?qū)⒃摼垡叶兼溄Y(jié)合至粒子的表面。例如，表面處理劑可以是PEG-硅烷，如三烷氧基甲硅烷基-PEG。表面處理劑可以包含用于靶向患者中的靶標(biāo)的定位基團(tuán)。例如，表面處理劑可以包括包含在PEG距離三烷氧基硅烷基的遠(yuǎn)端處的定位基團(tuán)。本發(fā)明還提供在任意前述段落中描述的方法制備的粒子。如以上注意的，生物分子可以指定用于預(yù)防或治療性治療疾病、障礙或病癥。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含如本文所公開(kāi)的粒狀物質(zhì)以及藥用載體、稀釋劑或賦形劑。藥用載體、稀釋劑或賦形劑可以是可以在全身給藥中安全使用的固體或液體填料、溶劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。取決于具體的給藥途徑，可以使用本領(lǐng)域熟知的各種各樣載體。這些載體可以選自包括以下的組:糖類(lèi)、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽糖、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸鹽緩沖液、乳化劑、等張鹽水和鹽類(lèi)如礦物酸鹽包括鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽,有機(jī)酸如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽和無(wú)熱原水。描述藥用載體、稀釋劑和賦形劑的有用文獻(xiàn)是Remington’ s Pharmaceutical Sciences (MackPublishing C0.N.J.USA, 1991)，通過(guò)引用將其結(jié)合于此。劑型包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液、糖漿、糖錠、膠囊、栓劑、氣溶膠、透皮貼劑等。這些劑型也可以包 括特別設(shè)計(jì)用于此目的的注射或植入受控釋放裝置或者改變以另外地以此方式發(fā)揮作用的植入物的其他形式。任何安全的給藥途徑可以采用用于給藥本發(fā)明的粒狀物質(zhì)。例如可以采用經(jīng)口、直腸、胃腸外、舌下、含服、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、
經(jīng)皮等。在另一方面，提供了一種治療哺乳動(dòng)物的疾病、障礙或病癥的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥如本文中公開(kāi)的粒狀物質(zhì)或藥物組合物，由此治療所述疾病、障礙或病癥的步驟。在另一方面，提供了一種如本文公開(kāi)的粒狀物質(zhì)，其用于治療哺乳動(dòng)物的疾病、障礙或病癥。所述疾病、障礙或病癥可以是遺傳疾病、障礙或病癥(例如囊性纖維化或亨廷頓氏病)、退行性疾病、障礙或病癥(例如老年性黃斑退化癥)、癌癥(例如實(shí)體瘤、肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、癌、黑素瘤，包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌和前列腺癌，盡管不局限于此)，免疫系統(tǒng)的疾病、障礙或病癥，包括自身免疫疾病(例如I型糖尿病、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和炎性病癥(例如哮喘、炎性腸病、腎小球腎炎)，由病原體如病毒感染引起的疾病、病癥或障礙(例如丙肝、流感、呼吸道合胞體病毒感染、AIDS)，細(xì)菌(例如肺炎，細(xì)菌性腦膜炎，百日咳，肺結(jié)核，破傷風(fēng))，原生動(dòng)物(例如瘧疾)或真菌(例如念珠菌)，循環(huán)系統(tǒng)的疾病、障礙或病癥(例如動(dòng)脈粥樣硬化，再狹窄，高膽固醇血癥)，內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病、障礙或病癥(例如，II型糖尿病，骨質(zhì)疏松癥，胰腺炎)或神經(jīng)性疾病、障礙或病癥(例如阿爾茨海默病，帕金生病或癲癇)，盡管不局限于此。
哺乳動(dòng)物可以是人或非人哺乳動(dòng)物，包括表演動(dòng)物(例如賽馬)、家養(yǎng)寵物(例如狗，貓)和家畜(例如牛、馬，羊，豬)，盡管不局限于此。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。


本發(fā)明的實(shí)施方式將通過(guò)僅實(shí)施例的方式，參考附圖進(jìn)行描述。應(yīng)當(dāng)理解，以下討論不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明。附圖中:圖1是制備本發(fā)明的粒子的流程圖；圖2示出了通過(guò)本發(fā)明方法制備的含有siRNA的粒子的TEM ；圖3示出了粒子的粒度分布；圖4不出了本發(fā)明的粒子的其他TEM ;圖5示出了舉例說(shuō)明粒子電荷和PEG化對(duì)熒光SiDNA從粒子釋放的作用的曲線(xiàn)圖；圖6示出了舉例說(shuō)明對(duì)于粒子中的不同有效載荷的釋放動(dòng)力學(xué)的曲線(xiàn)圖；圖7示出了從根據(jù)本發(fā)明制備的粒子釋放的未包封siRNA (紅色跡線(xiàn))和siRNA的HPLC色譜圖；圖8示出了本發(fā)明的粒子的懸浮液的照片；圖9示出了舉例說(shuō)明對(duì)于具有負(fù)電荷、中性電荷和正電荷的粒子，粒子滲入細(xì)胞的顯微照片；圖10示出了舉例說(shuō)明負(fù)荷在具有負(fù)電荷、中性電荷和正電荷的粒子中的保持的顯微照片；圖11和12示出了舉例說(shuō)明負(fù)荷利用粒子進(jìn)入細(xì)胞的顯微照片-圖11示出了粒子而圖12示出了負(fù)荷；圖13示出了作為時(shí)間函數(shù)的SiDNA在HEPG2細(xì)胞中的分散；圖14示出了作為時(shí)間函數(shù)的siDNA在HeLa細(xì)胞中的分散；圖15示出了作為時(shí)間函數(shù)的siDNA在RAW264細(xì)胞中的分散；圖16示出了作為時(shí)間函數(shù)的siDNA在細(xì)胞中的分散；圖17示出了本發(fā)明的粒子對(duì)BJ成纖維細(xì)胞中的DPP4的活性的作用；圖18示出了用于包封寡核苷酸的原型方法的詳細(xì)流程圖；圖19示出了在納米級(jí)上制備本發(fā)明的粒子的流程圖；圖20示出了根據(jù)圖19所示方法制備的粒子的FEG-SEM圖像；圖21示出了用氟-DNA標(biāo)記的粒子的相和熒光圖像；和圖22示出了納米粒子滲入HeLa細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式描述了 siRNA的封裝和從改性二氧化硅粒子的受控釋放。該粒子由具有并入以有助于載荷保持和細(xì)胞滲入的一定比例的氨基硅烷的無(wú)定形二氧化硅(SiO2)組成。粒子對(duì)于生物相容性進(jìn)行表面改性(循環(huán)半衰期 4h)。所述粒子可以滲透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜并且將它們的載荷釋放到內(nèi)含體和細(xì)胞內(nèi)空間中。
圖1示出了粒子的合成，包括封裝siRNA ( —種代表性生物分子，其表示所得粒子的載荷)。因此參考圖1，通過(guò)組合30mL重石蠟油和4.5g SPAN-20 (=500mM)制成疏水連續(xù)相。這些通過(guò)攪拌(30分鐘)進(jìn)行組合。然后將氨基硅烷(DATMS或TATMS，不是APTES)以足量加入用于期望電荷:對(duì)于負(fù)性粒子，沒(méi)有添加，對(duì)于中性粒子，添加DATMSd.5uL=lmol%,作為硅)并且對(duì)于正性粒子，添加DATMS (15uL=10mol%,硅)。然后所得混合物攪拌至少另外的10分鐘但不超過(guò)60分鐘。然后通過(guò)組合4mL水玻璃和20mL水制備二氧化硅溶液。將足夠的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在攪拌下加入到所得混合物以使PH至4.0。然后將二氧化硅溶液從樹(shù)脂傾析到新容器中。將疏水相(如上所述制備)設(shè)置成同時(shí)進(jìn)行磁攪拌和聲處理(3/8”探針)，并且啟動(dòng)攪拌器。在用于組合疏水相和親水相的制備中，聲處理器斜線(xiàn)升至70%功率( 700W)。5mg載荷(250uL20mg/mL siRNA溶液)與1.25mL如上所述制備的二氧化娃溶液混合。在10秒聲處理之后，將二氧化硅/載荷混合物加入到聲處理器有效區(qū)。聲處理持續(xù)30秒然后停用聲處理器。移出乳液并引入至磁攪拌器并攪拌I小時(shí)。在此之后，將PEG5000-硅烷(IOmg)加入到混合物中并且所得粒子懸浮液攪拌過(guò)夜。通過(guò)離心(15000xg達(dá)10分鐘)從乳液收集粒子。然后將乳液用0.5體積環(huán)己燒稀釋以減小其粘度，并用環(huán)己烷(約40mL)洗滌兩次和用100%乙醇(約40mL)洗滌兩次。每個(gè)洗滌步驟涉及再懸浮和收集粒子以及傾析上清。將粒子最后再懸浮在5mL的100%乙醇中以在-20° C或4° C儲(chǔ)存。所述粒子可以在4° C儲(chǔ)存幾個(gè)月而無(wú)生物學(xué)活性的顯著損失。然而，更低的溫度儲(chǔ)存提供甚至更長(zhǎng)期的儲(chǔ)存。上述方法提供粒度范圍為IOO-1OOOnm的粒子，具有的質(zhì)量加權(quán)平均直徑(da5)為約300nm。這些顯示在圖2和4。圖3示出了粒子的粒度分布。在約I微米的肩部可能代表少量的聚集粒子。上述 方法已被用于下述的研究，然而，該方法的更改可以生產(chǎn)da5〈150nm的分散粒子。通過(guò)改變加入的氨基硅烷的量和/或類(lèi)型，制備的粒子具有不同電荷。DATMS(氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷:2個(gè)氮原子/分子)用作標(biāo)準(zhǔn)。APTES(氨基丙基三甲氧基硅烷:I個(gè)氮原子/分子)顯著更低效并且TATMS (氨基乙基氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷:三個(gè)氮原子/分子)顯示與DATMS類(lèi)似的結(jié)果。如上所述，氨基硅烷加入到疏水相然后通過(guò)親水轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至親水相。由于各相之間的分配，并入的氨基硅烷的量低于添加的量。發(fā)現(xiàn)將氨基硅烷直接加入到親水相(即與水玻璃組合)在酸性PH下不實(shí)用，因?yàn)檫@引起提前凝膠化。粒子的電荷在IOmM MOPS (3_N_嗎啉代丙烷磺酸緩沖液)中在pH7.0測(cè)量。粒子的 電勢(shì)為如下:天然的(負(fù)性的)(無(wú)氨基硅烷):ζ彡-30mV中性的(1%DATMS):-5mv< ζ <5mV正性(10%DATMS): ζ 彡 +IOmV盡管使用間接測(cè)量方法，但所測(cè)得的電荷在各批次之間完全可重復(fù)。百分比封裝效率(EE)通過(guò)比較siRNA的理論加載(從添加的量確定)與如通過(guò)所釋放的量測(cè)得的實(shí)際加載進(jìn)行確定。結(jié)果顯示如下:理論加載:5%
EE (從 lmg/mL 釋放)批次1:85%+/-5%EE (從 0.lmg/mL 釋放)批次1:80%+/-2%批次2:85%+/_10%實(shí)際加載4.2%理論加載:10%EE75%,加載 7.5%因此引入的RNA的量越高，封裝效率越低。圖5示出了熒光標(biāo)記siDNA從不同電荷和表面改性的二氧化硅粒子的釋放效果。如上所述，粒子電荷可以通過(guò)改變所使用的氨基硅烷的量控制。從帶正電荷粒子的釋放比從帶負(fù)電荷的粒子的釋放遠(yuǎn)遠(yuǎn)更慢，如同通過(guò)帶正電荷粒子和帶負(fù)電荷有效載荷之間的預(yù)期吸引所預(yù)測(cè)的。對(duì)于帶負(fù)電荷的粒子，粒子表面上的PEG的存在看起來(lái)加速有效載荷的釋放。有效載荷從粒子的釋放被認(rèn)為主要通過(guò)溶解粒子基質(zhì)。在含水介質(zhì)中的高濃度( >約lmg/mL粒子)下，載荷從粒 子的浸出受限于通過(guò)粒子溶解介導(dǎo)的浸出，即所述溶液可以在粒子基質(zhì)中達(dá)到飽和，由此限制有效載荷的釋放。這顯示在圖6中，其中發(fā)生活性(圓點(diǎn)值)和雜混(方形點(diǎn)值)siRNA分子的相對(duì)快速釋放，直至由二氧化硅基質(zhì)溶解度指示的極限。應(yīng)注意，這在圖5中不明顯，因?yàn)榱Ｗ拥臐舛炔煌Ｔ陲@著低于二氧化硅溶解限度(大約100 μ g/mL)的濃度下，或在其中釋放液體連續(xù)更新的情況下，在約12-24小時(shí)內(nèi)發(fā)射粒子的完全溶解。如上所述制備的粒子在96%乙醇中在253K下儲(chǔ)存36天。在儲(chǔ)存后，所述粒子完全溶解在無(wú)RNA酶水中。所得液體在HPLC上的洗脫顯示與緩沖溶液中的未包封siRNA非常相似的外形，表明封裝和釋放不顯著影響siRNA。圖7示出了未包封siRNA和從根據(jù)本發(fā)明制備的粒子釋放的siRNA的HPLC譜圖。兩種粒子和參照(未包封siRNA)用RNA酶A處理15分鐘，然后在含有RNA酶抑制劑的PBS中懸浮之前用PBS洗滌三次。從二氧化硅粒子釋放的材料顯示完整RNA。未包封siRNA的類(lèi)似消化導(dǎo)致完成破壞。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)粒子保護(hù)包封生物分子免于酶降解的能力。圖8示出了相對(duì)于PBS (左)或相對(duì)于在PBS中的50%鼠血清(右)以3mg/L懸浮的離子的照片。在過(guò)夜溫育后，沒(méi)有出現(xiàn)可見(jiàn)的聚集。粒子還以l、3、10mg/kg懸浮在1500ppm BSA中，然后溫育2小時(shí)。然后通過(guò)Mastersizer (Mie scattering)確定粒度,表明在尺寸分布上沒(méi)有時(shí)間或濃度介導(dǎo)的移位?？傊?%的載荷加載可常規(guī)地實(shí)現(xiàn)，并且8%的加載已得到證實(shí)。>80%的包封效率可常規(guī)地實(shí)現(xiàn)。生物分子在粒子中的保持看起來(lái)主要通過(guò)靜電力介導(dǎo)，在生理pH產(chǎn)生溶解首先的釋放特性(即釋放主要通過(guò)基質(zhì)溶解發(fā)生)。載荷保持特性已證實(shí)在969ffitOH中在-20° C儲(chǔ)存40天后未改變。攝入哺乳動(dòng)物細(xì)胞考察了粒子電荷對(duì)細(xì)胞滲入和載荷保持的影響，以及攝入細(xì)胞中和內(nèi)含體逃逸的時(shí)間過(guò)程。合成用RITC (若丹明異硫氰酸酯)共價(jià)標(biāo)記的且載有具有siRNA-類(lèi)型序列并且用FITC (熒光異硫氰酸酯)標(biāo)記的DNA的粒子。將細(xì)胞(NIH3T3，HeLa，HEPG2)培養(yǎng)至50%匯合并將如上所述的粒子(約SOyg/ml，相當(dāng)于IOOnM DNA)直接加入到培養(yǎng)基中。在40h后，將培養(yǎng)物用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌以除去粒子(其已滲入到細(xì)胞中)，然后通過(guò)表面熒光顯微鏡成像。圖9示出了監(jiān)測(cè)RITC標(biāo)記的結(jié)果:在每對(duì)圖像中，上圖是相位對(duì)比圖像而下圖是熒光圖像。圖9表明，隨著粒子上的正電荷增加，更多的粒子被細(xì)胞吸收。因此，粒子上的正電荷不僅有助于結(jié)合有效載荷而且有助于粒子攝入細(xì)胞中。圖10顯示，相比于中性或帶負(fù)電荷粒子，載荷更有效地保持在帶正電荷粒子中，因?yàn)樗鼈儽患?xì)胞吸收。此圖顯示通過(guò)電荷的siDNA保持。在每對(duì)圖像中，上圖像是相位對(duì)比圖像而下圖是siDNA突光圖像。圖11示出了粒子攝入到兩種不同細(xì)胞系中(即粒子分布)，并且圖12示出了相同樣品但具有突出顯示的標(biāo)記有效載荷(即載荷分布)的顯微照片。在這些圖二者的每對(duì)圖像中，上圖是相位對(duì)比圖像。在圖11中，在每對(duì)圖中，下圖是RITC熒光(紅色通道)圖像，并且在圖12中，在每對(duì)圖中，下圖是siDNA的熒光圖像(綠色通道)。通過(guò)比較這兩個(gè)圖，可以確定當(dāng)粒子滲入細(xì)胞中時(shí)siRNA保持在粒子中。細(xì)胞內(nèi)的綠色和紅色點(diǎn)的并置表示二氧化硅已滲入內(nèi)部(紅色通道點(diǎn)=二氧化硅粒子)同時(shí)保持器熒光DNA載荷(綠色通道點(diǎn)=DNA),由此證實(shí)DNA已成功地被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。圖13至15顯示將標(biāo)記siDNA借助于本發(fā)明的粒子引入到各種細(xì)胞系的時(shí)間過(guò)程(圖13:HEPG2;圖14:HeLa;圖15:RAff264) 0各個(gè)圖顯示在細(xì)胞中的每次后處理的熒光分布。在每種情況下，可以看到，在較短時(shí)間期下，siDNA主要位于小區(qū)域中，表示位于細(xì)胞中的粒子內(nèi)的定位。在較長(zhǎng)時(shí)間期下，siDNA擴(kuò)展到更大區(qū)域中，表示粒子通過(guò)溶解粒子基質(zhì)的釋放和通過(guò)細(xì)胞的分布。圖16示出了使用共焦顯微鏡的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)。在圖16中，每對(duì)的上圖示出了核染色(藍(lán)色通道)并且下圖示出了 siDNA熒光(綠色通道)。因此，將HeLa細(xì)胞以25%匯合鋪放到聚-賴(lài)氨酸涂覆的蓋片上。這些用載有FAM-DNA的RITC改性粒子處理24或48h。然后它們用PBS洗滌并用在PBS中的3.7%甲醛固定。然后它們用在等張鹽水中的1.2μ g/mLHoescht33342染色,安 裝到具有Gelmount和丙烯酸類(lèi)(acrylic)的載玻片上,并用共焦顯微鏡在IOOx放大率下成像。圖像為150x150 μ m, ζ-軸片段深度350nm。良好定義的大致圓形結(jié)構(gòu)代表核DNA。在24小時(shí)后，有大量小亮區(qū)域，代表位于粒子內(nèi)的有效載荷。少量的擴(kuò)散發(fā)光代表少量釋放的有效載荷。在48小時(shí)后，點(diǎn)光源很大程度地小時(shí)，代表粒子溶解。相反，每個(gè)細(xì)胞具有売區(qū)域的擴(kuò)散齒素，代表細(xì)胞內(nèi)的釋放有效載荷。基因敲除研究圖17示出了用來(lái)顯示敲除中存在的加載粒子的效力(即基因表達(dá)的抑制)。此實(shí)驗(yàn)著眼于人BJ成纖維細(xì)胞中的DPP4的有效性敲除。siRNA單獨(dú)是有效的，可能因?yàn)橥ㄟ^(guò)系統(tǒng)中存在的RNA酶失活導(dǎo)致。不出意料地，未加載的二氧化硅粒子也是無(wú)效的。測(cè)量標(biāo)記的 siRNA/Lipo 是指借助于Lipofectamine 轉(zhuǎn)染的 siRNA，Lipofectaniine 已知用來(lái)跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)染寡核苷酸。這種系統(tǒng)具有的缺點(diǎn)是，它有毒并且對(duì)于siRNA不提供來(lái)自酶攻擊的保護(hù)。測(cè)量標(biāo)記的siRNA/nano表示封裝在根據(jù)本發(fā)明的粒子中的siRNA。在其中存在siRNA的每種情況下，它以約200nM使用。結(jié)果表明，封裝的siRNA在此濃度下的敲除有效，并且事實(shí)上比具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipofectamine)的siRNA稍微更有效。體外結(jié)論
將生物分子封裝到根據(jù)本發(fā)明的粒子中可以保護(hù)該生物分子免于酶降解。.當(dāng)在正常培養(yǎng)條件下應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)，加載有生物分子的粒子能夠滲透胞質(zhì)膜并將其載荷遞送至細(xì)胞內(nèi)空間。.生物分子經(jīng)由本發(fā)明粒子遞送組織培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致這些細(xì)胞中的mRNA水平的劑量依賴(lài)性降低。.封裝在粒子中的siRNA的劑量足以導(dǎo)致mRNA水平>50%降低表明在體外無(wú)顯著毒性。另外的結(jié)果-粒子的合成通常合成方法通過(guò)圖18中的流程圖描述。在將含水前體添加到表面活性劑溶液中后粒子形成極快。然而，通常在乳液形成和粒子收集之間允許至少12小時(shí)。寡核苷酸的保持受載荷和粒子的氨基硅烷組分之間的靜電相互作用強(qiáng)烈影響。這形成取代的量和類(lèi)型，以及在決定封裝、保持和釋放特性方面的形成和釋放關(guān)鍵因素的pH。盡數(shù)此實(shí)施例中使用的表面活性劑是山梨糖醇酐單月桂酸酯(Span 20)。使用的表面活性劑濃度為約17質(zhì)量％。疏水相為重液體石蠟，這獲得所測(cè)試的那些中的最小粒子。通過(guò)磁攪拌和聲處理的組合，粒度減小至對(duì)于靜脈內(nèi)注射可接受的值。用來(lái)增強(qiáng)載荷保持的優(yōu)選氨基硅烷是DATMS (氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷)。用APTES (氨基丙基三乙氧基硅烷)和TATMS (氨基乙基氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷)的實(shí)驗(yàn)表明，它們?cè)诨虼蠡蛐〕潭壬弦簿哂写诵Ч?，并且可以用于精?xì)調(diào)節(jié)保持/釋放特性。預(yù)期載荷加載影響粒子(電勢(shì)，并且預(yù)期氨基硅烷改性影響最大加載。

對(duì)于水玻璃的最小穩(wěn)定性的pH為大約5.5，其表示對(duì)于RNA的最大穩(wěn)定性的pH。如果硅酸鹽溶液太接近中性，則所述前體在它可以用于粒子粒子合成之前自發(fā)地凝膠化。如果所述溶液太酸性，則將發(fā)生核苷酸載荷的顯著降解。在RNA載荷下，已證實(shí)如果有點(diǎn)難處理，則3.75-4.00的前體pH是合適的。DNA、LNA或其他修飾的寡核苷酸可以允許更大酸性(并因此更穩(wěn)定的)前體溶液。實(shí)施例-圖18將siRNA封裝入用DATMS、羅丹明和mPEG_5000改性的粒子:15g的Dowex50W用100mL5M HCl攪拌30分鐘以將該樹(shù)脂轉(zhuǎn)化為活性、質(zhì)子化形式。然后通過(guò)真空輔助過(guò)濾到燒結(jié)玻璃過(guò)濾漏斗中進(jìn)行回收，其中它用IOOmL milliQ水洗滌兩次以除去殘留HCl。9克Span 20稱(chēng)入到聚四氟乙烯燒杯中并加入60mL液體石蠟。所得混合物攪拌約30分鐘以完成Span 20在石蠟中的溶解。將在2-丙酮中的29 μ L DATMS液體和6 μ L10%羅丹明-APTES加入到攪拌的表面活性劑溶液中。4.0mL硅酸鈉溶液加入到28mL milliQ水中。留下8.0mL此溶液用于后續(xù)主要體積的滴定。使用pH探針連續(xù)地監(jiān)測(cè)溶液pH，添加活化的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂以將硅酸鹽混合物的PH降低至約3.5。將硅酸鹽溶液從樹(shù)脂傾析并再檢測(cè)pH。將2.5mL的此前體溶液轉(zhuǎn)移至5mL塑料試管。適當(dāng)體積的(〈0.5mL)的載荷RNA溶液轉(zhuǎn)移至1.5mL試管。將載荷RNA溶液移液到硅酸鹽前體中。將RNA/硅酸鹽混合物移液到表面活性劑溶液中并持續(xù)聲處理攪拌25秒。所得乳液快速攪拌15分鐘。然后將15mg mPEG-5000硅烷粉末加入到該乳液中并將所得混合物攪拌過(guò)夜。然后將混合物在>2000x g離心5分鐘以分離粒子。然后粒子用環(huán)己烷洗滌兩次以除去石蠟和表面活性劑，在每次洗滌后離心，然后用乙醇洗滌一次。通過(guò)離心收集粒子，上清傾析，并且將粒子再懸浮在IOmL乙醇中。
獲得的產(chǎn)物的典型重量為200mg。典型封裝效率為>80%。粒子在pH7.4的典型ζ為+20mV。當(dāng)相比于天然硅酸鹽粒子時(shí)，結(jié)合于粒子的蛋白質(zhì)的典型減少(PEG化密度的量度)為>90%。實(shí)施例-圖19A.用于生物分子封裝的粒子的微乳液合成將0.381g的NP9通過(guò)在玻璃瓶中攪拌(磁力)溶解在3mL的環(huán)己烷(0.2mol/L)中，并在持續(xù)攪拌下隨后加入0.065mL的1-戊醇作為輔助表面活性劑(0.2mol/L)。所得溶液構(gòu)成疏水相。加入0.013mL的0.0lM HNO3以充當(dāng)酸催化劑，構(gòu)成親水相，并該溶液攪拌20分鐘以進(jìn)行均化。這導(dǎo)致形成微乳液。加入0.018mL的四甲基原硅酸酯(TMOS)并將所得溶液攪拌66小時(shí)以水解TMOS并提供水解后的前體溶液。加入0.013mL的0.0lM NaOH并攪拌5分鐘以將pH調(diào)節(jié)至大于約4。通過(guò)在攪拌下加入0.0lOmL的水來(lái)模擬生物分子的加入。作為官能化陶瓷前體，加入0.003mL的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷并將該混合物攪拌6.5小時(shí)，在該時(shí)間內(nèi)溶液變得逐漸更渾濁。這提供納米粒子的懸浮液。加入5mg的mPEG-硅烷(MW=5000)并將該溶液保持?jǐn)嚢?5小時(shí)。然后將該溶液離心(13，000達(dá)I分鐘)以分離粒子，然后該粒子用2mL乙醇洗滌三次，并懸浮在2mL乙醇中。所述粒子通過(guò)FEG-SEM成像，其表明尺寸范圍為30 - lOOnm。參考圖20。B.用于生物分子封裝的粒子的微乳液合成將0.636g的NP9通過(guò)在玻璃瓶中攪拌(磁力)溶解在5mL的環(huán)己烷(0.2mol/L)中。在持續(xù)攪拌下加入0.109mL的1-戊醇作為輔助表面活性劑(0.2mol/L)。將1.14mL的環(huán)己烷/NP9/1-戊醇溶液移液到第二玻璃瓶(x2)中。將0.0llmL的0.0lM HNO3加入到上述子樣品中并將溶液攪拌40分鐘以進(jìn)行均化，
形成微乳液。將0.0125mL(0.08mMol)的四甲基原硅酸酯加入到子樣品中并將所得溶液攪拌
17.5小時(shí)以水解TMOS0將0.0llmL的0.0lM NaOH加入到該兩個(gè)樣品中，然后將它們攪拌5分鐘以將pH調(diào)節(jié)至大于約4。在攪拌下降0.006mL的氟-DNA溶液(FITC-標(biāo)記的DPP4 (21個(gè)堿基對(duì)))，在水中為0.5mg/mL在攪拌下加入到一個(gè)樣品中，并將0.006mL的水在攪拌下加入到第二樣品中。
將0.002mL(0.009mMol)的3_(2_氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷作為官能化陶瓷前體加入到每個(gè)樣品中并將混合物攪拌6小時(shí)。將0.8mg的mPEG-硅烷(MW=5000)加入到每個(gè)樣品中，然后將樣品保持?jǐn)嚢?8小時(shí)。將ImL的丙酮加入到每個(gè)樣品中并且溶液攪拌10分鐘。然后將溶液離心(13，000達(dá)I分鐘)以分離粒子，該粒子然后用2mL乙醇洗滌三次。將含氟-DNA的樣品(CS11-0028)懸浮在2mL乙醇中。僅適用水支制成的樣品(CSl 1-0029)在40° C干燥并稱(chēng)重為7.3mg。將幾滴用氟-DN A標(biāo)記的粒子在顯微鏡用載玻片上干燥并使用裝配有FITC過(guò)濾器熒光顯微鏡在40x放大率和4次二次曝光下進(jìn)行成像。參考圖21。圖22示出了培養(yǎng)的人肝細(xì)胞用AlexaFluor-633標(biāo)記的二氧化娃納米粒子的轉(zhuǎn)染。細(xì)胞在成像前處理24小時(shí)。其他實(shí)施例合成用FITC (異硫氰酸突光素)共價(jià)標(biāo)記并載有藻紅蛋白(Phycoerythrin)有效載荷的粒子。將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至50%匯合并且如上所述的粒子(約30 μ g/ml)直接加入到培養(yǎng)基中。在40h之后，培養(yǎng)物用PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌一次以除去沒(méi)有深入細(xì)胞中的粒子，然后通過(guò)表面熒光顯微鏡成像，從而監(jiān)測(cè)所遞送的藻紅蛋白的細(xì)胞內(nèi)釋放。除非上下文另有要求或具體地相反說(shuō)明，作為單數(shù)的整數(shù)、步驟和構(gòu)件在本文中陳述的整數(shù)、步驟或構(gòu)件明確地涵蓋所陳述整數(shù)、步驟或構(gòu)件的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式。在本說(shuō)明書(shū)通篇中，除非上下文另有要求，術(shù)語(yǔ)“包括”或變形“包含”或“含有”應(yīng)被理解為暗示包括所陳述的步驟或構(gòu)件或整數(shù)，或者步驟或構(gòu)件或整數(shù)的組，但不排除任何其他步驟或構(gòu)件或整數(shù)或步驟、構(gòu)件或整數(shù)的組。因此，在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“包括”以包含含義使用并應(yīng)理解為是指“主要包括但不必是單獨(dú)地”。應(yīng)理解，前面的描述通過(guò)本發(fā)明的舉例說(shuō)明性實(shí)施例給出并且其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的更改和變形被視為落入本文提出的發(fā)明的寬范圍和界限內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種粒狀物質(zhì),包含: 帶有官能團(tuán)的陶瓷基質(zhì)的粒子，所述官能團(tuán)能夠促進(jìn)所述粒子滲入細(xì)胞中；和設(shè)置在所述粒子的孔隙內(nèi)的生物分子，所述生物分子通過(guò)溶解所述陶瓷基質(zhì)從所述粒子是可釋放的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粒狀物質(zhì)，其中在沒(méi)有溶解所述陶瓷基質(zhì)下，所述生物分子通過(guò)浸出從所述粒子是基本上不可釋放的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粒狀物質(zhì)，其中所述官能團(tuán)與所述生物分子化學(xué)相互作用以基本上防止浸出。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中帶有官能團(tuán)的所述陶瓷基質(zhì)包括官能化的二氧化硅基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中所述陶瓷基質(zhì)的官能團(tuán)包括氨基烷基烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中所述生物分子包括RNA、反義核苷酸、反義引物、適體、DNA、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中聚乙二醇鏈偶聯(lián)于所述粒子的表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中定位基團(tuán)偶聯(lián)于所述粒子的表 面。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中所述粒子的平均粒度為約0.1至10微米，優(yōu)選為約0.1至I微米。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中所述粒子的平均粒度為約20至約lOOnm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中所述粒子的孔徑為約I至約50nmo
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中所述粒子的生物分子的加載為約I至約20%w/w。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，其中聚合物或絡(luò)合劑與所述生物分子一起設(shè)置在所述粒子的孔隙中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的粒狀物質(zhì)，其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚賴(lài)氨酸或聚組氨酸，或者提供質(zhì)子海綿效應(yīng)的物質(zhì)。
15.一種用于制備粒子的方法，所述粒子在其孔隙中設(shè)置有生物分子，所述方法包括: a)組合: 包含疏水液體、第一陶瓷前體和表面活性劑的疏水相；和 包含親水液體、第二陶瓷前體和所述生物分子的親水相， 以形成包含分散在所述疏水相中的所述親水相的液滴的乳液；和 b)隨著所述粒子在所述液滴內(nèi)形成時(shí)攪拌所述乳液； 其中所述第一陶瓷前體包含能夠促進(jìn)所述粒子滲入細(xì)胞中的官能團(tuán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，包括以下步驟:組合所述表面活性劑與所述疏水液體；和 添加所述第一陶瓷前體， 以形成所述疏水相，所述這些步驟在步驟a)之前進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述第一陶瓷前體的官能團(tuán)能夠與所述生物分子發(fā)生化學(xué)相互作用，例如發(fā)生靜電相互作用。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一陶瓷前體是氨基官能陶瓷前體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述氨基官能陶瓷前體是氨基官能烷氧基硅燒。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述氨基官能陶瓷前體包含氨基烷基烷基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述氨基官能陶瓷前體是3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基娃燒、3-[2_(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基二甲氧基娃燒、3_(2_氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷，或者這些中的任意兩種以上的混合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求15至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑的HLB為約8至約16。
23.根據(jù)權(quán)利要求15至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水液體的粘度為約0.5至約 15000mPa.S。
24.根據(jù)權(quán)利要求15至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水液體包括石蠟油、植物油或礦物油。
25.根據(jù)權(quán)利要求15至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一陶瓷前體是堿并且所述親水相的PH低于所述第一陶瓷前體的pKa。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，包括以下步驟: 組合所述親水液體和所述第二陶瓷前體； 將所述PH調(diào)節(jié)至低于所述第一陶瓷前體的PKa ;和 添加所述生物分子， 以形成所述親水相，所述這些步驟在步驟a)之前進(jìn)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中調(diào)節(jié)所述pH的步驟包括將所述第二陶瓷前體在所述親水液體中的溶液暴露于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，接著一旦所述溶液的pH已達(dá)到低于所述第一陶瓷前體的PKa的期望pH時(shí)將所述溶液與所述樹(shù)脂分離。
28.根據(jù)權(quán)利要求15至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述親水液體是水性的。
29.根據(jù)權(quán)利要求15至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二陶瓷前體包括水玻璃或膠體二氧化硅或者預(yù)先水解的烷氧基硅。
30.根據(jù)權(quán)利要求15至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物分子帶負(fù)電或足夠大以至它不能通過(guò)所述粒 子的孔隙。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物分子包括RNA、反義核苷酸、和反義引物、適體、DNA、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述生物分子包括siRNA。
33.根據(jù)權(quán)利要求15至32中任一項(xiàng)所述的方法，另外包括: c)在形成所述粒子后向所述乳液中添加表面處理劑以對(duì)所述粒子進(jìn)行表面處理。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述表面處理劑包括偶聯(lián)至結(jié)合基團(tuán)的聚乙二醇鏈，所述結(jié)合基團(tuán)能夠?qū)⑺鼍垡叶兼溄Y(jié)合至所述粒子的表面。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述表面處理劑是PEG-硅烷，如三烷氧基甲硅烷基-PEG。
36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面處理劑包含用于靶向患者中的靶標(biāo)的定位基團(tuán)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述表面處理劑包括包含在所述PEG距離所述三烷氧基硅烷基的遠(yuǎn)端處的定位基團(tuán)的三烷氧基甲硅烷基-PEG。
38.根據(jù)權(quán)利要求15至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加聚合物或絡(luò)合劑以使其與生物分子設(shè)置在所述粒子的孔隙內(nèi)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚賴(lài)氨酸、或聚組氨酸，或提供質(zhì)子海綿效應(yīng)的物質(zhì)。
40.一種用于制備包含設(shè)置在孔隙中的生物分子的粒子的方法，所述方法包括: a)組合: 包含疏水液體和表面活性劑的疏水相；和 包含親水液體和催化劑的親水相， 以形成包含分散在所述疏水相中的所述親水相的液滴的乳液； b)向所述乳液中添加陶瓷前體并水解所述陶瓷前體； c)將所述親水相的pH調(diào)節(jié)至適合所述生物分子的范圍； d)將所述生物分子和官能化的陶瓷前體添加到所述乳液中；和 e)在所述粒子在所述液滴內(nèi)形成時(shí)攪拌所述乳液， 其中所述官能化的陶瓷前體包含能夠促進(jìn)所述粒子滲入細(xì)胞中的官能團(tuán)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述官能化的陶瓷前體的所述官能團(tuán)能夠與所述生物分子發(fā)生化學(xué)相互作用，例如發(fā)生靜電相互作用。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述官能化的陶瓷前體是氨基官能陶瓷前體。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述氨基官能陶瓷前體是氨基官能烷氧基硅燒。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中所述氨基官能陶瓷前體包含氨基烷基烷基。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述氨基官能陶瓷前體是3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基娃燒、3-[2_(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基二甲氧基娃燒、3_(2_氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷，或者這些中的任意兩種以上的混合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求40至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑的HLB為約8至約16，如壬基酚聚氧乙烯醚。
47.根據(jù)權(quán)利要求40至46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水相另外包含輔助表面活性劑，如醇，例如1-戊醇。
48.根據(jù)權(quán)利要求40至47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疏水液體包含烷烴如己烷(C6)至十二烷(C12)，環(huán)烷烴如環(huán)己烷，芳烴如甲苯和苯，以及摻混物如煤油。
49.根據(jù)權(quán)利要求40至48中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述親水液體包含水冰清所述催化劑是酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求40至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物分子帶負(fù)電或者足夠大使得它不能通過(guò)所述粒子的孔隙。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述生物分子包括RNA、反義核苷酸、和反義引物、適體、DNA、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、烴或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述生物分子包括siRNA。
53.根據(jù)權(quán)利要 求40至52中任一項(xiàng)所述的方法，包括在添加所述生物分子和所述官能化的陶瓷前體之前，將所述乳液的pH調(diào)節(jié)至大于4，例如通過(guò)加入堿，如NaOH、KOH和NH4OH。
54.根據(jù)權(quán)利要求40至53中任一項(xiàng)所述的方法，另外包括: f)在形成所述粒子后向所述乳液中加入表面處理劑以對(duì)所述粒子進(jìn)行表面處理。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述表面處理劑包含偶聯(lián)至結(jié)合基團(tuán)的聚乙二醇鏈，所述結(jié)合基團(tuán)能夠?qū)⑺鼍垡叶兼溄Y(jié)合至所述粒子的表面。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述表面處理劑所述PEG-硅烷，如三烷氧基甲硅烷基-PEG。
57.根據(jù)權(quán)利要求54至56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面處理劑包含用于靶向患者中的靶標(biāo)的定位基團(tuán)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述表面處理劑包括包含所述PEG距離所述三烷氧基硅烷基的遠(yuǎn)端處的所述定位基團(tuán)。
59.根據(jù)權(quán)利要求40至58中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加聚合物或絡(luò)合劑以使其與所述生物分子一起設(shè)置在所述粒子的孔隙內(nèi)。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚賴(lài)氨酸或聚組氨酸，或者提供質(zhì)子海綿效應(yīng)的物質(zhì)。
61.通過(guò)權(quán)利要求15至60中任一項(xiàng)所述的方法制備的粒子。
62.—種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的粒狀物質(zhì)，或根據(jù)權(quán)利要求61的粒子，以及藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
63.一種治療哺乳動(dòng)物的疾病、障礙或病癥的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項(xiàng)所述的粒狀物質(zhì)，或根據(jù)權(quán)利要求61的粒子或根據(jù)權(quán)利要求56所述的藥物組合物，從而治療所述疾病、障礙或病癥。
64.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的粒狀物質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求61的離子，用于治療哺乳動(dòng)物的疾病、障礙或病癥。
全文摘要
一種粒狀物質(zhì)，其包含帶有官能團(tuán)的陶瓷基質(zhì)的粒子，所述官能團(tuán)能夠促進(jìn)所述粒子滲入到細(xì)胞中；以及設(shè)置在所述粒子的孔隙內(nèi)的生物分子，所述生物分子通過(guò)所述陶瓷基質(zhì)的溶出而可從所述粒子釋放。
文檔編號(hào)A61K31/70GK103209688SQ201180049680
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者克里斯托夫·吉思·亞歷山大·巴布, 金·蘇珊娜·芬尼, 塞繆爾·奈特利, 托賓·約翰斯頓·帕賽羅 申請(qǐng)人:澳大利亞核能科技組織