專利名稱：用于心臟修復的骨髓衍生cd271前體細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的實施方式針對用骨髓衍生間充質前體細胞治療心血管疾病的方法。
背景技術：
心力衰竭導致美國醫(yī)療系統(tǒng)直接和間接花費332億美元(1，2)且有此診斷的大部分患者有來自先前MI的疤痕化心肌。左室功能是患有心肌梗塞(MI)病人的存活和生活質量的最重要決定因素(1，3)。心肌在梗塞形成后的再生潛能很有限且目前醫(yī)學中的主要探索是基于細胞的組織再生。此探索有希望改變許多慢性疾病的治療。在慢性缺血性心肌病(影響超過400萬美國人的疾病)領域，基于細胞的成功治療會對患者發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生巨大影響，降低此疾病的社會負擔。為了推進此領域發(fā)展，過去五年中已進行大量嘗試以獲得成功的細胞治療，采用骨髓衍生細胞的策略已在早期臨床試驗中測試(4，5)。這些試驗已大大推進對細胞遞送方法的理解并建立安全特性；然而，理想的細胞源仍有待充分建立。

發(fā)明內(nèi)容
提供此發(fā)明內(nèi)容以介紹本發(fā)明的概述，來簡要說明本發(fā)明的特性和實質。提交時應理解這不用于解讀或限制權利要求書的范圍或意義。本發(fā)明的實施方式涉及含成人骨髓衍生的間充質干細胞前體的組合物。這些細胞體內(nèi)給予，例如給予心臟并使心肌再生。在優(yōu)選的實施方式中，預防或治療心血管疾病或紊亂的方法包括從對象的骨髓分離CD271+間充質干細胞前體(MSC);給予患者治療有效量的經(jīng)分離CD271+間充質干細胞(MSC)前體。在一個實施方式中，⑶271+MSC分離自有低親和性神經(jīng)生長受體的骨髓細胞(NGFR;CD271)。CD271+干細胞分離自含以下的供體(或來源):自體、同源、同種異體或異種。MSC前體細胞分化成包含以下的至少一種譜系:心肌、血管或內(nèi)皮譜系。在另一個實施方式中，分離的前體間充質干細胞離體培養(yǎng)并擴增然后給予患者。在一個實施方式中，擴增非貼壁干細胞并給予患者。在另一個實施方式中，所述前體間充質干細胞可選在一段時間內(nèi)以不同濃度給予患者。在一個實施方式中，所述前體間充質干細胞可選用心臟衍生基質細胞調(diào)整的培養(yǎng)基調(diào)理。在另一個實施方式中，可選給予患者一種或多種試劑，所述試劑包含至少一種:細胞因子、趨化因子、生長因子或分化因子。在優(yōu)選的實施方式中，成體干細胞包含具有CD271+表型的骨髓間充質干細胞(MSC)前體衍生細胞。
其他方面如下所述。附圖簡要說明

圖1顯示⑶271+細胞形態(tài)。準備細胞離心涂片并用瑞氏姬姆薩(Wright Giemsa)染色。圖2A-2C顯示由CD271+細胞(圖2A ;每個T75cm2瓶170，000個細胞);BMMNC (圖2B;每個T75cm2瓶1500萬個細胞)和C)CD271_細胞(圖2C ;每個T75cm2瓶1700萬個細胞)形成MSC。圖3顯示培養(yǎng)第10天的典型CFU-F集落。圖4顯示⑶271+細胞在特氟龍袋(Teflon bag)中7、14和21天的培養(yǎng)。圖5顯示非貼壁間充質干細胞(NA-MSC)的流式分析。同種型對照染色以綠線顯示且⑶105-FITC在陰影區(qū)內(nèi)。圖6A和6B顯示人骨髓⑶271+細胞的成骨和脂肪細胞分化。成骨和脂肪細胞分化如方法中所述來進行。成骨分化的存在通過第14天FAST BCIP/NBT染色的堿性磷酸酶(AP)表達來顯示(圖6A ；x/100)。分化成脂肪細胞通過第11天的油紅O染色來顯示(圖6B ；x/100)。顯示3個實驗的代表性示例。圖7顯示培養(yǎng)的⑶271+細胞中心臟標記的表達。圖8顯示治療組的超聲心動圖比較。

圖9A-9D顯示注射有⑶271+細胞的N0D/SCID小鼠的心臟切片的免疫組化。所述心臟切片用Alu序列染色并用心臟標記(a SA、肌鈣蛋白I (TnI)、連接蛋白43 (Cx) (40Χ))共染色。圖9Α:顯示邊界區(qū)切片，有陽性細胞包埋在血管壁中以及在宿主肌細胞間的。圖9Β:顯示朝向心臟基底的遠端區(qū)仍呈現(xiàn)所注射的人細胞。圖9C:顯示遠端區(qū)域中有alu陽性細胞的大血管。圖9D:顯示另一心臟的邊緣區(qū)，有許多陽性細胞。
具體實施例方式干細胞顯示有用于許多不同健康和醫(yī)學研究領域的潛能。一些最嚴重的醫(yī)療病癥如癌和先天缺陷由干細胞分化或維持過程中某些地方發(fā)生的問題引起。泛泛而言，有2種不同干細胞類型，即胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞在囊胚中發(fā)現(xiàn)且具有分化成所有特殊胚胎組織的能力。成體干細胞是在胚胎發(fā)育后體內(nèi)遍布發(fā)現(xiàn)的未分化細胞。成體干細胞能分裂并補償臨終細胞(dying cell)和再生受損組織。此外，成體干細胞可維持再生器官如血液、皮膚和腸組織的正常更替。成體干細胞有無限分裂和自我更新的能力且能產(chǎn)生其來源器官的所有細胞類型。干細胞能根據(jù)其分化成不同細胞類型的潛能分類為全能、多能(pluripotent)、多潛能(multipotent)或單能。全能干細胞由配子融合和受精卵最初幾次分裂生成。這些細胞能分化成胚胎和外胚層細胞類型。多能干細胞能分化成3個胚層的任意細胞。多潛能細胞僅可生成緊密相關家族的細胞。單能細胞僅可生成一種細胞類型，但有自我更新特性使其與非干細胞區(qū)分開。大部分成體干細胞是細胞系限制性多潛能干細胞，以其來源組織歸類。多能成體干細胞稀有且一般數(shù)量較少，但能在包括臍帶血在內(nèi)的一些組織中發(fā)現(xiàn)(Ratajczak Μ.Z.等，Leukemia21 (5): 860-867 (2007))。有數(shù)種不同成體干細胞類型，包括但不限于脂肪衍生干細胞(Zuk, P.A.等，Tissue Engineering : 211-216) (2001))、上皮干細胞、造血干細胞、乳腺干細胞(Shackleton, M.等，Breast Cancer R Ε.7:86-95 (2005))、間充質干細胞、內(nèi)皮干細胞、神經(jīng)干細胞(Alvarez-Bul lta, A.等，Brain Res.Bull.57:751-758(2002))、嗅干細胞(Murrel1W.等,Dev.Dyn.233:496-515 (2005))、睪丸干細胞、牙髓衍生干細胞和臍帶血造血祖細胞。成體干細胞分裂時，產(chǎn)生類似自身的另一細胞和比自身更分化的細胞。此不對稱細胞分裂過程產(chǎn)生一個相同的子細胞和一個具有高增殖能力的早期短暫擴充細胞(早期TA)。通過一系列細胞分裂，早期TA細胞產(chǎn)生后期TA細胞，然后是組織特異性祖細胞，并最終產(chǎn)生大量分化細胞來構成器官或組織(Ribacka, C.等.Ann.Med.印刷版之前的電子出版:1-10(2008))ο下面對本發(fā)明的數(shù)個方面參考說明性的示例應用加以描述。應理解，列出了許多特定細節(jié)、關系和方法以提供對發(fā)明的充分理解。然而，相關領域普通技術人員會容易地認識到本發(fā)明的實施可不需一種或多種特定細節(jié)或可與其他方法一同實施。本發(fā)明不局限于所述的行為或事件的順序，因為一些行為可以不同順序發(fā)生和/或與其他行為或事件同時發(fā)生。此外，并非全部所述行為或事件都是實施如本發(fā)明所述方法所必需?？蓪嵤┍景l(fā)明的實施方式而不需所示理論方面。此外，對于所示的理論方面，應理解申請人不試圖受所示 理論的約束。定義本文所用術語僅出于描述特定實施方式的目的且不意在限制本發(fā)明。除非上下文另有明確說明，本文所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”、“所述”也意在包括復數(shù)形式。此外，就術語“包括”、“含有”、“具有”、“含”、“有”或其變體在詳細描述和/或權利要求書中使用的程度而言，這些術語意在為包容性，與術語“包含”的方式類似。術語“約”或“大致”指在特定值的可接受誤差范圍內(nèi)，如本領域普通技術人員所測定，這部分取決于所述值如何測量或測定，即測量體系的限制。例如，“約”可指按本領域的實踐在I個標準差內(nèi)或大于I個標準差。或者，“約”可指相對給定值最多至20%，優(yōu)選最多至10%，更優(yōu)選最多至5%，更加優(yōu)選最多至1%的范圍?；蛘?，特別是涉及生物系統(tǒng)或方法時，所述術語可指在某一值的數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選5倍內(nèi)且更優(yōu)選2倍內(nèi)。在本申請和權利要求中描述特定值時，除非另有說明，應假定術語“約”意味著在特定值的可接受誤差范圍內(nèi)。本文所用的“干細胞”是本質上能在體內(nèi)或離體無限增殖且能分化成其他細胞類型的未分化細胞。這可以是組織中存在可分離自組織的某些分化細胞、定向細胞、未成熟細胞、祖細胞或成熟細胞類型，或是顯著分化的細胞類型，例如從共同前體細胞衍生的紅細胞和淋巴細胞，或甚至是與獲得所述干細胞的組織完全不同的組織中任何階段的細胞類型。例如，血液干細胞可變成腦細胞或肝細胞，神經(jīng)干細胞可變成血細胞，從而干細胞為多潛能，且在其環(huán)境有合適信號，就能分化成體內(nèi)的任何組織。舉例而言，“增殖”能通過已分離干細胞在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中通過至少50次，優(yōu)選100次且甚至多至200或更多次細胞分裂而增殖的能力來確定。干細胞可以是“全能”的，意味著其如同生殖細胞能產(chǎn)生生物體所有細胞。干細胞還可以是“多潛能”的，意味著其能產(chǎn)生許多不同細胞類型，但不能產(chǎn)生生物體所有的細胞。干細胞分化時，一般產(chǎn)生更成年細胞類型，后者可以是部分分化細胞如祖細胞、分化細胞或終末分化細胞。干細胞可以是高度活動性的。
“分離”干細胞指從組織樣品移出干細胞并分離出不是組織的干細胞的其他細胞的過程。經(jīng)分離干細胞一般沒有其他細胞類型的污染，即“同質性”或“純度”，且一般能增殖和分化產(chǎn)生分離出所述干細胞的組織的成熟細胞。經(jīng)分離干細胞能在小部分其他細胞類型出現(xiàn)下存在，所述細胞類型不干擾所述干細胞在分析或生成其他分化細胞類型中的應用。經(jīng)分離干細胞一般為至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 99.9%純。本發(fā)明所述的經(jīng)分離干細胞優(yōu)選至少98%或至少99%純。本文所用的“培養(yǎng)”指通過在支持細胞活力或增殖的環(huán)境和條件下孵育一段時間來增殖或培育細胞、細胞集合、組織或器官。培養(yǎng)可包括擴增和增殖本發(fā)明所述細胞、細胞集合、組織或器官的一個或多個步驟。“骨髓衍生祖細胞”(BMDC)或“骨髓衍生干細胞”指具有自我更新組成型活性機制的原始干細胞。此定義包括全能、多潛能和前體干細胞?！扒绑w細胞”可以是細胞分化途徑中能分化成更成熟細胞的任何細胞。如此，術語“前體細胞群”指能發(fā)育成更成熟細胞的一組細胞。前體細胞群可包含全能細胞、多潛能細胞和干細胞系受限制的細胞(即細胞能發(fā)育成不足所有造血譜系或發(fā)育成例如僅紅細胞系的細胞)。本文所用的術語“自體”指自某個體衍生任何材料后重弓I入同一個體。術語“異種細胞”指細胞衍生自某動物種，該動物種不同于移植或疫苗接種過程中成為受體動物宿主的動物種。術語“同種異體細胞”指細胞衍生自某動物種，該動物種與成為“受體宿主”的動物為相同動物種但在一個或多個基因座上有遺傳差異。術語“同源細胞”指細胞衍生自某動物種，該動物種與在移植或疫苗接種過程中成為該細胞系的受體宿主的動物為相同動物種且就大部分基因型和表型標記而言有相同遺傳組成。這通常適用于移植自同卵雙生的細胞或可適用于高度近交動物間移植的細胞。

本文所用的術語“安全和有效量”或“治療量”指在以本發(fā)明方式使用時足以產(chǎn)生所需治療反應而沒有過度副作用(如毒性、刺激、或過敏反應)的組分量，與合理的效益/風險比相稱。“治療有效量”指有效產(chǎn)生所需治療反應的本發(fā)明化合物量。具體的安全和有效量或治療有效量會隨多種因素而變化，例如，待治療的特定病癥、患者身體情況、所治療哺乳動物或動物類型、治療持續(xù)時間、同時治療(如果有)的性質、所采用的具體制劑和化合物或其衍生物的結構?！盎颊摺被颉皩ο蟆敝覆溉閯游锴野ㄈ撕瞳F醫(yī)學對象。本文所用的短語“診斷”指分類疾病或癥狀，確定疾病嚴重性，監(jiān)控疾病進展，預測疾病后果和/或復原前景。術語“檢測”還可以可選地涵蓋上述任意一種。應注意到“獲自對象的生物樣品”還可以可選地包含未從對象物理移出的樣品，如下文更詳細所述?！爸委煛笔菫榱朔乐辜膊“l(fā)展或者改變疾病病理或癥狀而進行的干預。因此，“治療”指治療性處理和預防性或防止性措施。需要治療的那些包括已有疾病的以及要預防疾病的那些。本文所用的“減輕”或“治療”指，按常規(guī)統(tǒng)計學檢驗所測定，癥狀趨近正常值(例如在健康患者或個體中獲得的值)，如與正常值差異小于50%，優(yōu)選與標準化值差異小于約25%，更優(yōu)選與正常值差異小于10%，更加優(yōu)選與正常值差異不顯著，如用。如本文所定義，試劑或化合物、細胞等的“治療有效量”(即有效劑量)指足以產(chǎn)生治療上(如臨床)所需結果的量。所述組合物的給予可以從每天一次或多次到每周一次或多次給予；包括每兩天一次。技術人員應理解某些因素能影響有效治療對象所需的劑量和時間，這些因素包括但不限于疾病或紊亂的嚴重性、先前治療、對象的總體健康和/或年齡、和存在的其他疾病。此外，用治療有效量的本發(fā)明化合物治療對象可包括單次治療或一系列治療?！邦A防有效量”可指足以預防心臟疾病或紊亂如缺血復發(fā)、或這些在患者中發(fā)生的前體間充質干細胞量，所述患者包括但不限于易患心臟病的那些，例如遺傳上易患心臟病、中風等的那些。預防有效量還可指在疾病防止中提供預防益處的預防劑的量。術語“樣品”意在以其最廣義解釋。“樣品”指生物樣品，例如從個體或細胞培養(yǎng)成分分離的一種或多種細胞、組織或流體(包括但不限于血漿、血清、全血、腦脊液、淋巴、淚、尿、唾液、乳汁、膿汁、組織滲出液和分泌物)，以及獲自例如實驗室過程的樣品。生物樣品可包含分離自細胞的染色體(如中期染色體分散)，分離自細胞的細胞器或膜，全細胞或組織，核酸如溶液中或結合固體于支持物的基因組DNA如用于Southern分析、溶液中或結合固體支持物的RNA如用于Northern分析、溶液中或結合固體支持物的cDNA、溶液中或結合固體支持物的寡核苷酸、溶液中或結合固體支持物的多肽或肽，組織，組織印跡等。許多熟知的組織或流體收集方法能用于從對象收集生物樣品以測定對象中感興趣變體的DNA、RNA和/或多肽水平。示例包括但不限于細針活檢、針活檢、芯針活檢和手術活檢(如腦活檢)和灌洗。無論所采用的過程如何，一旦獲得活檢/樣品就能測定變體水平并因而能作出診斷。本文所用的“心臟疾病或紊亂”或“心血管疾病或紊亂”指任何類型的心臟疾病或紊亂，包括心肌癥、肥大型心肌病、擴張型心肌病、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、缺血性心臟病、心肌炎、病毒性感染、創(chuàng)傷、高血壓心臟病、瓣膜病、先天性心臟病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心律失常、導致心臟重塑的疾病、心力衰竭、缺血、心肌梗塞、移植、高血壓、再狹窄、心絞痛、風濕性心臟病或先天性心血管缺陷。心臟疾病或紊亂可能緣于任何原因，例如心臟組織損傷如收縮性損失(如可由射血分數(shù)減少所證明)。心臟損傷或紊亂表征為心臟功能不足，包括正常心臟功能的任何損傷或缺失或者異常心臟功能的存在。異常心臟功能可以是疾病、損傷和/或衰老的結果。本文所用的異常心臟功能包括心肌細胞、心肌細胞群、或心臟本身的形態(tài)和/或功能異常。形態(tài)和功能異常的非限制性示例包括心肌細胞的物理退化和/或死亡，心肌細胞的異常生長模式，心肌細胞間物理連接異常，心肌細胞的一種或多種物質生成不足或生成過度，心肌細胞不能生成其正常可產(chǎn)生的一種或多種物質，以異常模式或在異常時間傳遞電脈沖。更整體水平的異常包括動力障礙、射血分數(shù)減少、超聲波心動描記術觀察到的變化(如擴張)、EKG變化、運動耐量變化、毛細血管灌注減少和血管造影術觀察到的變化。許多疾病中發(fā)現(xiàn)異常心臟功能，所述疾病包括例如缺血性心臟病如心絞痛，心肌梗塞，慢性缺血性心臟病，高血壓心臟病,肺心病(肺原性心臟病)，心臟瓣膜病如風濕熱、二尖瓣脫垂、二尖瓣環(huán)鈣化，類癌性心臟病，感染性心內(nèi)膜炎，先天性心臟病，心肌病如心肌炎、擴張型心肌病、高血壓性心肌病，造成充血性心力衰竭的心臟紊亂，和心臟腫瘤如原發(fā)性肉瘤和繼發(fā)瘤。心臟損害還包括創(chuàng)傷，例如刀傷；生物性(如病毒；自身免疫病)或化學性(如化療、藥物)；手術；移植等?！靶募∪毖敝溉狈ρ趿鲃拥叫呐K，導致心肌缺血損傷。本文所用的短語心肌缺血損傷包括流到心肌的血流減少引起的損害。心肌缺血和心肌缺血損傷的病因的非限制性示例包括:主動脈舒張壓降低，心室內(nèi)壓和心肌收縮提高，冠狀動脈狹窄(如冠脈結扎、固定的冠狀動脈狹窄、急性斑塊變化(如破裂、出血)、冠動脈血栓形成、血管收縮)，主動脈瓣狹窄和反流，和右房壓增加。心肌缺血和心肌缺血損傷的不良作用的非限制性示例包括:肌細胞損傷(如心肌細胞損失、心肌細胞肥大、心肌細胞增生)，心絞痛(如穩(wěn)定型心絞痛、變異型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、心性猝死)，心肌梗塞,和充血性心力衰竭。由于心肌缺血引起的損害可以是急性或慢性，后果可包括瘢痕形成、心臟重塑、心臟肥厚、壁厚變薄、擴張和相關功能變化。急性或慢性心肌損傷和/或心肌缺血的存在和病因可用本領域熟知的多種方法和技術中任意一種來診斷，所述方法和技術包括例如非侵入性成像(如MR1、超聲波心動描記術)，血管造影術，測壓，分析心臟特異蛋白如心肌肌鈣蛋白和臨床癥狀。這些方法和技術以及其他合適技術可用于確定哪些對象是本文所述治療方法的合適候選。骨髓衍生CD271+細胞缺血性心肌病是 發(fā)達國家中心力衰竭的主要病因，一旦發(fā)生梗塞重塑很少有療法來改善心臟功能，缺乏能在心肌梗塞(MI)后確實逆轉心臟有害重塑的療法。將成體骨髓衍生祖細胞給予到心臟有希望能再生心肌。發(fā)明人在臨床前模型(還是首次的人類初步數(shù)據(jù))中證明經(jīng)手術和導管遞送系統(tǒng)遞送至心臟的骨髓(BM)衍生間充質干細胞(MSC)具有移植、支持逆轉重塑、改善心臟功能和減少瘢痕大小的能力。盡管MSC顯示有很大希望，這些細胞需要4-5周培養(yǎng)以獲得足夠量用于注射。MSC前體能根據(jù)低親和性神經(jīng)生長因子受體(NGFR;⑶271)的表達而分離自骨髓且⑶271+細胞是用于治療應用的易得細胞源。重要的是，骨髓衍生CD271+細胞能獲自骨髓穿刺并在4-5小時內(nèi)分離至充足量，提供用于立即應用的物流優(yōu)勢。此外，這些細胞在功效上顯著優(yōu)于培養(yǎng)的MSC。所述研究的目標是進行臨床前試驗在心肌梗塞的嚙齒類動物和豬模型中測試BM-CD271+細胞并將此工作轉化成冠狀動脈旁路手術后直接手術注射CD-271+細胞的臨床試驗。不希望受理論約束，中心假設是由手術注射遞送的BM-CD271+細胞會移植，改善心臟功能，和減少瘢痕大小。慢性缺血性心肌病的細胞治療提供對會導致心力衰竭的進一步組織損害的預防潛能。發(fā)明人證明人CD271+細胞確實是MSC前體且在小鼠心肌梗塞(MI)模型中具有修復缺血組織的潛能。⑶271+細胞比培養(yǎng)的MSC更有效且分化成心肌細胞的能力更強。重要的是，能在4-5小時內(nèi)從BM分離合適數(shù)目的CD271+細胞，為用自體骨髓衍生療法治療患者提供很大的物流進步。在優(yōu)選的實施方式中，骨髓衍生(BM)獲得前體間充質干CD271+細胞用于治療心力衰竭患者的缺血組織。在另一個優(yōu)選的實施方式中，預防或治療心血管疾病或紊亂的方法包括給予患者有效量的⑶271+干細胞。所述⑶271+細胞優(yōu)選分離自具有低親和性神經(jīng)生長因子的骨髓細胞(NGFR ;CD271)。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述CD271+干細胞為自體、同源、同種異體、異種或其組合。給予的干細胞繁殖并修復受損組織，例如心臟組織。這些細胞分化成不同細胞系，引起再生和修復受損組織。在另一個優(yōu)選的實施方式中，可選給予患者一種或多種試劑，所述試劑包含以下至少一種:細胞因子、趨化因子、生長因子或分化因子。—方面，本文提供治療有心臟疾病或損傷的患者的方法，所述方法包括將治療性細胞組合物給予有心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病或損傷的患者，并評價患者心臟功能的改善，其中所述細胞組合物包含本文所述的CD271+。在一個實施方式中，所述心臟疾病是心肌癥。在特定實施方式中，所述心肌癥是特發(fā)性或有已知病因的心肌癥。在其他實施方式中，所述心肌癥為缺血或非缺血性質。在另一個實施方式中，所述心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病包含一種或多種以下疾病:血管成形術、動脈瘤、絞痛(心絞痛)、主動脈狹窄、主動脈炎、心律失常、動脈硬化、動脈炎、非對稱性心室間隔肥厚(ASH)、動脈粥樣硬化、心房顫動和心房撲動、細菌性心內(nèi)膜炎、Barlow綜合征(二尖瓣脫垂)、心動過緩、柏格氏癥(血栓閉塞性脈管炎)、心臟肥大、心肌癥、心臟炎、頸動脈疾病、主動脈縮窄、先天性心臟病(先天性心臟缺陷)、充血性心力衰竭(心力衰竭)、冠狀動脈疾病、艾森曼格綜合征、栓塞、心內(nèi)膜炎、紅斑性肢痛癥、纖顫、肌纖維發(fā)育不良、心傳導阻滯、心雜音、高血壓、低血壓、嬰兒期特發(fā)性動脈鈣化、川崎病(黏膜皮膚淋巴結綜合征、黏膜皮膚淋巴結病、嬰兒型多動脈炎)、代謝綜合征、微血管性心絞痛、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、心肌炎、陣發(fā)性房性心動過速(PAT)、結節(jié)性動脈周圍炎(多動脈炎，結節(jié)性多動脈炎)、心包炎、周圍性血管疾病、嚴重肢體缺血、糖尿病血管病變、靜脈炎、肺動脈瓣狹窄(肺動脈狹窄)、雷諾氏病、腎動脈狹窄、腎血管性高血壓、風濕性心臟病、中隔缺陷、無癥狀心肌缺血、X綜合征、心動過速、多發(fā)性大動脈炎、法洛四聯(lián)癥、大血管轉位、三尖瓣閉鎖、動脈干、心臟瓣膜病、靜脈曲張性潰瘍、靜脈曲張、血管炎、室中隔缺損、預激(Wolff-Parkinson-White)綜合征、或心內(nèi)膜墊缺損。在其他實施方式中，心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病的包含一種或多種以下疾病:急性風濕熱，急性風濕性心包炎，急性風濕性心內(nèi)膜炎，急性風濕性心肌炎，慢性風濕性心臟病，二尖瓣病變，二尖瓣狹窄，風濕性二尖瓣閉鎖不全，主動脈瓣疾病，其他心內(nèi)膜構造疾病，缺血性心臟病(急性和亞急性),心絞痛,肺循環(huán)疾病(急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病)，脊柱后側凸性心臟病，心肌炎，心內(nèi)膜炎，心內(nèi)膜心肌纖維化，心內(nèi)膜纖維彈性組織增生，房室傳導阻滯，心臟節(jié)律不整，心肌變性，循環(huán)系統(tǒng)疾病包括腦血管疾病、大腦前動脈閉塞和狹窄、腦動脈阻塞、動脈疾病、小動脈和毛細血管(動脈粥樣硬化、動脈瘤)，或靜脈和淋巴管疾病。在一個實施方式中，治療包括用含⑶271+細胞的治療性細胞組合物治療心肌癥患者，所述細胞組合物含或不含另一細胞類型。在其他優(yōu)選的實施方式中，患者體驗來自所述治療的益處，例如得益于細胞支持其他細胞生長的能力，那些其他細胞包括心臟中存在的干細胞或祖細胞，得益于組織向內(nèi)生長或組織血管化，和得益于有益細胞因子、趨化因子、細胞因子等的存 在。對于患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個體，給予所述個體本文提供的CD271+細胞或治療組合物，該個體的改善能通過所述循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂癥狀的一個或多個可檢測改善來評價或證明。在另一個實施方式中，對于患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個體，給予所述個體本文提供的CD271+細胞或治療組合物，該個體的改善能通過一種或多種心臟功能標記的可檢測改善來評價或證明，所述可檢測改善例如與給予CD271+細胞前的個體相比顯示以下一種或多種功能的可檢測改善:胸心輸出量(CO)、心臟指數(shù)(Cl)、肺動脈楔壓(PAWP)、和心臟指數(shù)(Cl)、％縮短分數(shù)(%FS)、射血分數(shù)(EF)、左心室射血分數(shù)(LVEF);左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、收縮性(如dP/dt)、壓力-容積環(huán)、心臟作功的度量、房性或室性功能增強；泵效提高、泵效損失率降低、血液動力學功能損失減少；和心肌癥相關并發(fā)癥減少。
接受本文所提供治療組合物的個體的改善還能通過主觀指標如給藥后個體關于他或她健康狀況的自我評估來評價。在某些實施方式中，本文所提供的治療方法包括誘導治療性CD271+細胞向間充質細胞系分化，如趨向心肌生成、血管形成或血管生成表型，或分化成細胞如肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、心外膜細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞(如血管平滑肌細胞)。將CD271+細胞或含這種細胞的治療組合物給予需要的個體能通過例如移植，植入(如細胞本身或作為基質-細胞組合物部分的細胞)，注射(如直接到疾病或病癥位點，例如直接到有心肌梗塞個體的心臟內(nèi)缺血位點)，輸注，經(jīng)導管遞送，或本領域已知提供細胞治療的任何其他方法來完成。在一個實施方式中，將治療性細胞組合物提供給需要的個體，例如通過注射入個體中的一個或多個位點來提供。在一個特定實施方式中，所述治療性細胞組合物通過心內(nèi)注射來提供，例如到心臟缺血區(qū)域。在其他特定實施方式中，所述細胞注射到心臟表面上、相鄰區(qū)域內(nèi)、或甚至更遠端區(qū)域。在優(yōu)選的實施方式中，所述細胞回到患病或受損區(qū)域。能將CD271+細胞在該細胞為治療上有益的任何時間給予有冠狀或血管系統(tǒng)疾病或病癥的個體。在某些實施 方式中，例如，本發(fā)明的細胞或治療組合物在心肌梗塞1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或 24 小時內(nèi)，或者 1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或 30 天內(nèi)給予。優(yōu)選在心肌梗塞較短時間如1-3或1-7天內(nèi)給藥而非較長時間如心肌梗塞后3或7天后給藥。在其他實施方式中，本發(fā)明的細胞或治療組合物在所述疾病或病癥初始診斷
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或 24 小時內(nèi)，或者 1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天內(nèi)給予。本文還提供用于治療心肌梗塞的藥盒。所述藥盒提供治療性細胞組合物、施用器以及使用說明書，所述組合物能以藥學上可接受形式制備，例如通過與藥學上可接受的運載體混合來制備。理想地，所述藥盒能實地應用，例如在醫(yī)生診療室，或由急診護理提供者應用，來施用于診斷有心肌梗塞或類似心臟事件的患者。在本文所提供治療方法的一些方面，所述CD271+細胞與干細胞一起給予，所述干細胞非CD271+細胞、成肌細胞、肌細胞、成心肌細胞、心肌細胞，或成肌細胞、肌細胞、成心肌細胞、和/或心肌細胞的祖細胞。在一個特定實施方式中，本文所提供治療方法包括將CD271+細胞如含所述細胞的治療組合物給予有心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病的患者；并評價患者的心臟功能改善，其中所述治療性細胞組合物作為基質-細胞復合物給予。在某些實施方式中，所述基質是至少包含所述細胞的支架，優(yōu)選生物可吸收的支架。在一些實施方式中，⑶271+細胞群在刺激干或祖細胞沿心臟發(fā)生、血管生成(angiogenic)、血管形成(hemangiogenic)或血管發(fā)生(vasculogenic)途徑分化的一個或多個因子存在下孵育或給予患者。這種因子在本領域已知；確定分化的合適條件能用常規(guī)實驗完成。這種因子包括但不限于因子如生長因子、趨化因子、細胞因子、細胞產(chǎn)物、去甲基化劑和已知或此后確定能刺激(例如，刺激干細胞)沿著心臟發(fā)生、血管生成、血管形成或血管發(fā)生途徑或細胞系分化的其它刺激物。例如，CD271+細胞可通過在因子存在下培養(yǎng)細胞而沿著心臟發(fā)生、血管生成、血管形成或血管發(fā)生途徑或細胞系分化，所述因子含有至少一種去甲基化劑、BMP、FGF> Wnt因子蛋白，Hedgehog,和/或抗Wnt因子。包含去甲基化劑趨于能使細胞沿著間充質細胞系向成心肌途徑分化。能通過例如心肌球蛋白、骨骼肌肌球蛋白或GATA4中至少一種的表達；或通過獲得自發(fā)或另行誘導的心跳節(jié)律；或通過至少部分整合到患者心肌而不誘導心律失常的能力，來確定分化。能用于啟動這種分化的去甲基化劑包括但不限于:5_氮雜胞苷、5-氮雜-2’-脫氧胞苷、二甲亞砜、氯化白屈菜紅堿、視黃酸或其鹽、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、普魯卡因胺和普魯卡因。在本文的某些實施方式中，細胞成為心臟發(fā)生、血管生成、血管形成或血管發(fā)生細胞，或祖細胞。優(yōu)選細胞整合到受體心血管系統(tǒng)中，包括但不限于心肌、心臟的血管和其他結構、心血管或外周血管等。在某些其他實施方式中，所述CD271+細胞分化成的細胞獲得2種或更多成心肌細胞或其祖細胞的標記且能整合到受體心臟或血管系統(tǒng)中。在特定實施方式中，給予個體的所述細胞不引起心律失常、心臟缺損、血管缺損或者個體循環(huán)系統(tǒng)或健康狀況的其他異常的增加。在某些實施方式中，所述⑶271+細胞作用于促進患者心肌、血管、血液等中天然存在的干細胞本身分化成例如心肌細胞，或至少沿著心臟發(fā)生、血管生成、血管形成或血管發(fā)生細胞系分化。能將CD271+細胞和這類細胞的群體治療性或預防性提供給個體，例如有心臟或循環(huán)系統(tǒng)本身的或者影響心臟或循環(huán)系統(tǒng)的疾病、紊亂或病癥的個體。這種疾病、紊亂或病癥可包括動脈粥樣硬化、心肌癥或心臟損傷引起的充血性心力衰竭，所述損傷如缺血性損傷，例如由心肌梗塞或創(chuàng)傷(急性或慢性)造成。所述CD271+細胞可以治療組合物的形式給予個體，所述組合物包含所述細胞和另一治療劑，如胰島素樣生長因子(IGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，肝細胞生長因子(HGF)，IL-8，抗血栓形成劑(如肝素、肝素衍生物、尿激酶、和PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)；抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達莫、魚精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑、和/或血小板抑制劑)，抗凋亡劑(如ΕΡ0、ΕΡ0衍生物和類似物和其鹽、TPO、IGF-1, IGF-11、肝細胞生長因子(HGF)或半胱天冬酶抑制劑)，抗炎劑(如P38MAP激酶抑制劑、他汀類、IL-6和IL-1抑制劑、哌羅來斯、曲尼司特、英利昔單抗、西羅莫司、非留類抗炎化合物，例如乙酰水楊酸、布洛芬、替泊沙林、托美丁或舒洛芬)，免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)劑(如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢霉素、他克莫司、mTOR抑制劑如西羅莫司或依維莫司；抗增殖劑如硫唑嘌呤和霉酚酸酯；皮質類固醇如脫氫皮質醇或氫化可的松；抗體如抗IL_2Ra受體單克隆抗體、巴利昔單抗、達利珠單抗(daclizuma),抗T細胞多克隆抗體如抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、抗淋巴細胞球蛋白(ALG)，和抗T細胞單克隆抗體0KT3，和/或抗氧化劑(如普羅布考；維生素A、C和E，輔酶Q-10，谷胱甘肽，L半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，或抗氧化劑衍生物，上述的類似物或鹽)。在某些實施方式中，含有⑶271+細胞的治療組合物還包含一種或多種其他細胞類型，如成體細胞(例如成纖維細胞或內(nèi)皮層細胞)，或干細胞或祖細胞。這種治療劑和/或一種或多種其他細胞能單獨或與2種或更多這類化合物或試劑聯(lián)合給予有需要的個體。 在某些實施方式中，所述待治療個體是哺乳動物。在一個特定實施方式中，所述待治療個體是人。在特定實施方式中，所述個體是牲畜動物或家畜動物。在其他特定實施方式中，所述待治療個體是馬、綿羊、母?；蜷幣！⒇i、狗或貓。在另一優(yōu)選的實施方式中，與分離自心臟組織的對照細胞樣品相比，所述干細胞群體純度至少約80% ;優(yōu)選地，與分離自心臟組織的對照細胞樣品相比，所述干細胞群體純度約90% ;優(yōu)選地，與對照細胞樣品相比，所述干細胞群體純度約95%、96%、97%、98%、99%、99.9%。在另一優(yōu)選的實施方式中，所分離的CD271+干細胞群能用于最終用戶所需的任何試驗，例如表達非天然或外來分子、在細胞中可激活或不激活的天然分子。這種分子的示例能是生長因子、受體、配體、治療劑等。所述分子能由最終用戶選擇以根據(jù)最終用戶需要來由所分離的干細胞表達。所述分子包含例如多肽、肽、寡核苷酸、多核苷酸、有機或無機分子。在另一優(yōu)選的實施方式中，干細胞可以是胚胎干細胞、成體干細胞、臍帶血干細胞、體干細胞或癌癥干細胞。在優(yōu)選的實施方式中，所述干細胞是成體干細胞，優(yōu)選心臟干細胞。另外，本發(fā)明的干細胞可以是造血干細胞或間充質干細胞。本發(fā)明的干細胞可以是全能、多能、多潛能 或單能干細胞。本發(fā)明的干細胞可通過一種或多種干細胞標記物的出現(xiàn)來選擇，所述標記物包括但不限于:⑶133、⑶34、⑶38、⑶117/c-kit、0CT3/4、Nanog,RUNX2、S0X9、整合素、SPARC、骨鈣素、內(nèi)皮因子和STR0-1。本發(fā)明的干細胞可以是原代干細胞或可衍生自已建立的干細胞系、癌前干細胞系、癌細胞系或表現(xiàn)任何干細胞標記物的任意細胞系。原代干細胞可源自癌癥患者或健康患者。給予:CD271+干細胞群體的分離有益于許多類應用類型，例如移植到心臟或其他器官以治療心臟疾病或紊亂，如受損心肌。本文所用的“受損心肌”指已經(jīng)受缺血性條件的心肌細胞。這些缺血性條件可由心肌梗塞或其他心血管病或相關疾病引起。缺氧導致周圍區(qū)域中的細胞死亡，留下會最終結疤的梗塞。本文所用的“年齡相關性心肌癥”指隨著生物年齡增長發(fā)生的內(nèi)在機制所引起的心肌退化。在優(yōu)選的實施方式中，所述干細胞用于修復和/或再生有需要對象中的受損心肌或年齡相關性心肌癥的方法，通過將經(jīng)分離干細胞給予受損心肌區(qū)域來進行，所給予的干細胞分化成一種或多種肌細胞、內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞。所述已分化的細胞可增殖并形成多種心臟結構，包括冠狀動脈、小動脈、毛細血管和心肌，這些都是心臟中正常運行必需的結構?；謴凸δ芎徒Y構完整性的能力是本發(fā)明的另一方面。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述干細胞是成體心臟干細胞。在另一個實施方式中，從需要治療性處理某種心臟或血管病癥的對象收獲的心臟組織分離得成體心臟干細胞并移植回該對象中。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述分離的CD271+干細胞經(jīng)過離體培養(yǎng)并擴增，然后將所述干細胞給予患者。所述細胞可以是例如自體、同源、同種異體、異種，或其任何組合。如果需要連續(xù)給予,不必使用相同來源的干細胞。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及將治療有效劑量或用量的干細胞給予心臟。有效劑量是足以實現(xiàn)有益或所需的臨床結果的量。所述劑量的給藥可有一次或多次給予。準確測定哪種劑量應視為有效劑量可以基于對各患者獨特的因素，包括其尺碼、年齡、心肌損傷面積、自損傷起的時間量。本領域技術人員特別是醫(yī)師或心臟病專家能確定將構成有效劑量的干細胞數(shù)目，而不需過度實驗。在本發(fā)明的一些實施方式中，分離的干細胞在激活后給予對象。干細胞的激活可通過將已分離干細胞暴露于一個或多個細胞因子如肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)，或其變體來完成。HGF通過c-Met受體的激活正向影響干細胞遷移和歸巢(Kollet 等(2003) J.Clin.1nvest.112:160-169 ;Linke 等(2005)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA102:8966-8971 ；Rosu-MyIes 等(2005)J.Cell.Sc1.118:4343-4352 ；Urbanek 等(2005)Circ.Res.97:663-673)。類似地，IGF-1和其對應受體(IGF-1R)在心臟中誘導心臟細胞分裂，上調(diào)端粒酶活性，阻礙復制性衰老并保護功能活性心臟干細胞庫(Kajstura等(2001)Diabetes50:1414-1424 ;Torella 等(2004)Circ.Res.94:514-524 ；Davis 等(2006)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA103:8155-8160)。在一個優(yōu)選的實施方式中，分離的干細胞接觸肝細胞生長因子和/或胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)。適于激活已分離干細胞的細胞因子的一些其他非限制性示例包括激活素A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6、心營養(yǎng)素-1、成纖維細胞生長因子1、成纖維細胞生長因子4、Flt3配體、膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、肝素、胰島素樣生長因子-11、胰島素樣生長因子結合蛋白-3、胰島素樣生長因子結合蛋白-5、白介素-3、白介素-6、白介素_8、白血病抑制因子、中期因子、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子BB、黃體酮、腐胺、干細胞因子、基質細胞衍生因子-1、促血小板生成素、轉化生長因子-α、轉化生長因子-β 1、轉化生長因子-Ρ2、轉化生長因子-β 3、血管內(nèi)皮生長因子、Wntl、Wnt3a和 Wnt5a,描述于 Kanemura 等(2005) Cell Transplant.14:673-682 ； Kap I an 等(2005)Nature438:750-751 ;Xu 等(2005) Methods Mo 1.Med.121:189-202 ;Quinn 等(2005) MethodsMo1.Med.121:125-148 ;Almeida 等(2005)J Biol.Chem.280:41342-41351 ；Bamabe-Heider等(2005)Neuron48:253-265 ;Madlambayan 等(2005)Exp Hematol33:1229-1239 ；Kamanga-Sol 1 等(2005)Exp Cell Res3 11:1 67-1 76 ;Heese 等(2005)Neuro-oncol.7:476-484 ；He 等(2005)Am J.Physiol.289:H968_H972 ；Beattie 等(2005)Stem Cells23:489-495 ;Sekiya 等(2005)Cell Tissue Res320:269-276 ；ffeidt (2004)Stem Cells22:890-896 ;Encabo 等(2004) Stem Cells22:725-740 ;和 Buytaer1-Hoefen 等(2004) Stem Ce lls22:669-674，各通過引用全文納入本文。上述細胞因子的功能變體也可用于本發(fā)明。功能性細胞因子變體會保留結合并激活其對應受體的能力。變體可包括氨基酸取代、插入、缺失、選擇性剪接變體或天然蛋白的片段。例如，NKl和NK2是HGF的天然剪接變體，它們能結合c-MET受體。本發(fā)明考慮這些天然發(fā)生的剪接變體類型以及保留功能的經(jīng)工程改造細胞因子蛋白變體。在一些實施方式中，將干細胞給予有需要的對象伴有給予心臟一個或多個細胞因子來完成。所述細胞因子可選自下組:干細胞因子(SCF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集刺激因子(GM-CSF)、基質細胞衍生因子-1、青灰因子、血管內(nèi)皮生長因子、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)、白介素_3、或能刺激和/或調(diào)動干細胞的任何細胞因子。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述細胞因子選自HGF，IGF-1，HGF或IGF-1的功能變體，或其組合。所述細胞因子可與干細胞的CD271+群體同時遞送?；蛘撸毎蜃拥慕o予可在給予干細胞之前或之后的規(guī)定時間段。所述時間段可以是約15分鐘、約30分鐘、約I小時、約3小時、約6小時、約12小時、約24小時、約36小時、約I周、約2周、約I個月、或約6個月。所述細胞因子可通過一次或多次給予遞送至心臟。在一個實施方式中，細胞因子通過單次給予來遞送。在另一個實施方式中，將多次的相同劑量細胞因子給藥遞送至心臟。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式包括將多個劑量的細胞因子給予心臟，從而形成趨化梯度。從心房和/或心尖延伸到左心室中部區(qū)域的趨化梯度可通過給予遞增細胞因子濃度的多個劑量來建立?；蛘撸蓮母杉毎浦参稽c到左心室中部區(qū)域或心肌梗塞邊界區(qū)形成所述趨化梯度。在一個實施方式中，至少2種細胞因子用于形成趨化梯度。在另一個實施方式中，第一細胞因子濃度恒定，而第二細胞因子濃度可變，從而形成趨化梯度。

在一個優(yōu)選的實施方式中，通過多次給予IGF-1和HGF形成趨化梯度，其中IGF-1濃度保持恒定而HGF濃度可變。在一些實施方式中，HGF的可變濃度范圍為約0.1-約400ng/ml。在其他實施方式中，IGF-1濃度可為約0.1-約500ng/ml。分離的干細胞⑶271+群體和細胞因子可通過注射給予心臟。所述注射優(yōu)選為心肌內(nèi)。本領域技術人員應意識到這是遞送干細胞和/或細胞因子的優(yōu)選方法，因為心臟是功能性肌肉。通過此途徑注射確保注入的材料不由于心臟收縮運動而損失。在發(fā)明的另一方面，所述干細胞和/或細胞因子通過透心內(nèi)膜或透心外膜注射來給予。此優(yōu)選實施方式使細胞因子能穿透保護性外周膜，為心肌內(nèi)注射細胞因子的實施方式所必須。發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式包括使用基于導管的方法提供跨心內(nèi)膜注射。使用導管可排除必須打開胸腔的更侵入性遞送方法。本領域技術人員會理解更小侵入性過程允許最優(yōu)的恢復時間。導管方法涉及使用的技術如NOGA導管或類似系統(tǒng)。所述NOGA導管系統(tǒng)通過提供感興趣區(qū)域的電動機械作圖以及能用于提供靶定注射或用治療劑浸洗靶區(qū)域的可回縮針來促進導向給予。本發(fā)明的任何實施方式能通過使用所述系統(tǒng)遞送注射或提供治療劑來給予。本領域技術人員會認識到，能通過成像和導管遞送系統(tǒng)的整合來提供靶向治療的能力的替代系統(tǒng)也能用于本發(fā)明。關于NOGA和類似系統(tǒng)的應用的信息可參見例如 Sherman(2003)Basic Appl.Myol.13:11-14 ；Patel 等(2005)The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130:1631-38 ;和 Perrin 等(2003)Circulationl07:2294-2302;其內(nèi)容各通過引用全文納入本文。在另一個實施方式中，分離的心臟干細胞是通過冠狀動脈內(nèi)給予途徑來給予。本領域技術人員會認識到能用于本發(fā)明的其他有用的遞送或移植方法，包括Dawn等(2005) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA102, 3766-3771所述方法，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。本發(fā)明的方法可用于治療心血管病，包括但不限于動脈粥樣硬化、缺血、高血壓、再狹窄、心絞痛、風濕性心臟病、先天性心血管缺陷、年齡相關性心肌癥、動脈炎癥，以及其他動脈、小動脈和毛細血管疾病。具體地，本發(fā)明的方法提供受損心肌的修復和/或再生，所述受損心肌由上面所列疾病之一或由心肌細胞隨著年齡增長總體衰退而引起。本發(fā)明還涵蓋預防或治療對象心力衰竭的方法，所述方法包括將分離的成體心臟干細胞CD271+群給予對象心臟并給予血管緊張素II受體拮抗劑。在一個實施方式中，CD271+群成體心臟干細胞先如本文所述通過暴露于一種或多種細胞因子來激活然后給予。在另一個實施方式中，將一種或多種細胞因子給予心臟以形成引起所給予成體心臟干細胞遷移到心肌損傷區(qū)域的趨化梯度。在另一個實施方式中，所述一種或多種細胞因子是HGF、IGF-1，或其變體。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是促進體內(nèi)血壓和胞外體積調(diào)節(jié)的激素系統(tǒng)。腎灌注下降時，腎內(nèi)的細胞釋放酶腎素。腎素切割血管緊張素原成為血管緊張素I，血管緊張素原是由肝分泌的無活性前體肽。血管緊張素I隨后由血管緊張素轉化酶(ACE)轉變成血管緊張素II (Ang II)，ACE主要在肺中發(fā)現(xiàn)。Ang II通過ATl受體的激活產(chǎn)生許多效果，包括血管收縮以及醛固酮和加壓素的分泌。Ang II參與心臟中年齡依賴性氧化性損傷的積累(Fiordaliso 等(2001)Diabetes50:2363-2375 ；Kajstura等(2001)DiabeteS50:1414-1424)，且據(jù)報道誘導衰老和減少內(nèi)皮祖細胞的數(shù)目和功能(Kobayashi 等(2006)Hypertens.Res.29:449-455)。另外,Ang II 引發(fā)肌細胞凋亡(Leri等(1998) J.Clin.1nvest.101:1326-1342)且可引起心力衰竭發(fā)展(McMurray 等(2003)Lancet362:767-771)。事實上，已顯示ATl受體的抑制改善慢性心力衰竭患者的臨床結果且延長人壽命(McMurray 等(2003) Lancet362:767-771)。本發(fā)明提供方法，通過向對象的心臟聯(lián)合給予Ang II受體拮抗劑以及成體心臟干細胞，來預防對象心力衰竭和/或治療慢性心力衰竭。Ang II受體拮抗劑優(yōu)選是ATl受體的拮抗劑。本發(fā)明所涵蓋Ang II受體拮抗劑的一些非限制性示例包括纈沙坦、替米沙坦、洛沙坦、厄貝沙坦、奧 美沙坦、坎地沙坦和依普沙坦。另外，血管緊張素轉換酶(ACE)的抑制劑可補充或替代Ang II受體拮抗劑而給予。如上所述，ACE將血管緊張素I轉變成血管緊張素II。抑制該酶會引起Ang II水平下降并因而減輕Ang II對心臟干細胞的有害效果。可用于本發(fā)明方法的ACE抑制劑包括但不限于苯那普利、依那普利、賴諾普利、卡托普利、福辛普利、雷米普利、培哚普利、喹那普利、莫西普利和群多普利。Ang II受體拮抗劑或ACE抑制劑可在給予成體心臟干細胞后以多劑量給予對象。拮抗劑或抑制劑可持續(xù)設定時間段以常規(guī)方案獲取。例如，可在給予成體心臟干細胞后持續(xù)約I個月、約2個月、約3個月、約6個月、約12個月、或約24個月每日獲取一次所述抑制劑。可采用其他給藥方案。本領域技術人員，特別是醫(yī)師或心臟病專家，能就給予ACE抑制劑或Ang II受體拮抗劑確定合適劑量和方案。優(yōu)選地，一種或多種心力衰竭癥狀在給予心臟干細胞和Ang II受體拮抗劑和/或ACE抑制劑后有減輕或緩解。心力衰竭癥狀包括但不限于疲勞、虛弱、快速或不規(guī)則心跳、呼吸困難、持續(xù)性咳嗽或氣喘、腿腳水腫和腹部腫脹。本發(fā)明還包含制備組合物如藥物組合物的方法，所述組合物包括成體干細胞和/或至少一種細胞因子，例如用于本發(fā)明方法以治療心血管病、心力衰竭或其他心臟病癥。在一個實施方式中，所述藥物組合物包含分離的人心臟干細胞和藥學上可接受的載體。在一個優(yōu)選方面，所述方法和/或組合物(包括藥物組合物)包含有效量的成體心臟干細胞或者2種或更多細胞因子以及用于治療心臟和/或血管病癥的合適藥物試劑。在另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)注射遞送。這些給予(遞送)途徑包括但不限于皮下或胃腸外，包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)(如冠狀動脈內(nèi))、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、心肌內(nèi)、經(jīng)心內(nèi)膜、經(jīng)心外膜、鼻內(nèi)給予以及鞘內(nèi)和輸注技術。因此，所述藥物組合物優(yōu)選為適于注射的形式。胃腸外給予本發(fā)明治療劑時，其一般配制成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。適于注射的所述藥物制劑包括無菌水溶液或分散液和用于在無菌注射溶液或分散液中重建的無菌粉末。所述載體能是溶劑或分散介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)，其合適混合物，和植物油。能通過使用包被如卵磷脂，通過維持分散情況中的所需粒度，和通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。非水性載劑如棉籽油、芝麻油、橄欖油、大豆油、玉米油、葵花籽油或花生油和酯如肉豆蘧酸異丙酯也可用作復合組合物的溶劑系統(tǒng)。另外，可加入提高組合物穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的多種添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑。能通過多種抗細菌和抗真菌劑如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等確保防止微生物作用。許多情況中，需要包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。可通過使用延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠來產(chǎn)生延長吸收可注射藥物形式。然而，根據(jù)本發(fā)明，所用的任何載劑、稀釋劑或添加劑必須與所述化合物相容。無菌注射溶液能通過將溶于所需量合適溶劑的本發(fā)明實施所用化合物與不同量的其他成分按需合并來制得。本發(fā)明的藥物組合物，例如含有治療劑量的CD271+干細胞的組合物，能在含任何相容性載體的可注射制劑中給予對象，所述載體如多種載劑、佐劑、添加劑和稀釋劑；或本發(fā)明所用化合物能以緩釋皮下移植物或靶向遞送系統(tǒng)如單克隆抗體、離子電滲、聚合物基體、脂質體和微球形式胃腸外給予對象。本發(fā)明采用的藥物組合物能口服給予對象?？墒褂脗鹘y(tǒng)方法如以片劑、懸液、溶液、乳液、膠囊、粉末、糖漿等來給予所述化合物。優(yōu)選口腔或靜脈內(nèi)遞送所述化合物并保持生物活性的已知技術。在一個實施方式中，能初始給予本發(fā)明組合物，之后通過進一步給予來維持。例如，本發(fā)明組合物能以一種組合物類型給予，之后以不同或相同組合物類型給予。例如，本發(fā)明組合物能通過靜脈內(nèi)注射給予以使血液水平達到合適水平。然后通過口服劑型維持對象水平，盡管可根據(jù)對象情況使用其他給予形式。待給予的藥物組合物的量會根據(jù)治療對象而變化。在優(yōu)選的實施方式中，給予對象2X IO4-約IX IO5個成體心臟干細胞和可選的每天50-500 μ g/kg細胞因子或所述細胞因子變體。然而，準確確定哪些會視作有效劑量可基于對各患者獨特的因素，包括其尺碼、年齡、受損心肌面積和損傷后的時間量。本領域技術人員可容易確定本發(fā)明方法中待給予組合物中的化合物和可選添加劑、載劑和/或載體的劑量和含量。通常，任何 添加劑(除活性干細胞和/或細胞因子以外)的存在量為溶于磷酸鹽緩沖鹽水的0.001-50wt%溶液，且活性成分以微克到毫克級存在，如約0.0001-約5wt%,優(yōu)選約 0.0001-約 lwt%，最優(yōu)選約 0.0001-約 0.05wt% 或約 0.001-約 20wt%，優(yōu)選約0.01-約10wt%，且最優(yōu)選約0.05-約5wt%。當然，就給予動物或人的任何組合物而言，和就任何特定給予方法而言，優(yōu)選就此確定:毒性，如通過確定合適動物模型如嚙齒動物例如小鼠中的致死劑量(LD)和LD5tl來確定；和能引起合適反應的組合物劑量，其中組分的濃度和給予組合物的時間。根據(jù)技術人員、本公開和本文所引用文獻的知識，這種確定不需要過度實驗。能確定后續(xù)給予時間而不需過度實驗。含本發(fā)明治療劑的組合物示例包括用于孔口如口腔、鼻、肛門、陰道、經(jīng)口、胃內(nèi)、粘膜(例如經(jīng)舌、肺泡、齒銀、嗅或呼吸道粘膜)等的液體制品，給予如懸液、糖漿或酏劑；和用于胃腸外、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給予(例如可注射給予)的制品，如無菌懸液或乳液。這種組合物可混合適當載體、稀釋劑或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等。所述組合物還能凍干。根據(jù)給予途徑和所需制品，所述組合物可包含輔助物質如濕潤劑或乳化劑、PH緩沖劑、膠化或粘度增強添加劑、防腐齊U、增味劑、色素等。制備合適制品可參考通過引用納入本文的標準教材如“REMINGTON’ SPHARMACEUTICAL SCIENCE (《雷明頓藥物科學》)”，第17版，1985，而不需要過度實驗。
本發(fā)明藥物組合物易作為液體制品提供，如等滲水溶液、懸液、乳液或粘性組合物，其可緩沖至選定pH。顯然，合適載體和其他添加劑的選擇將取決于實際給予途徑和特定劑型性質，如液體劑型(例如所述組合物是否配制成溶液、懸液、凝膠或另一液體形式)或固體劑型(例如所述組合物是否配制成丸劑、片劑、膠囊、囊片、時間釋放形式或液體填充形式)。，溶液、懸液和凝膠通常在活性化合物以外包含大量水(優(yōu)選純化水)。還可存在少量其他成分如pH調(diào)節(jié)劑(如堿例如NaOH)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、膠凝劑(如甲基纖維素)、色素和/或調(diào)味劑。所述組合物可以是等張的，即其可具有與血液和淚液相同的滲透壓。本發(fā)明組合物的所需等滲性可用氯化鈉、或其他藥學上可接受試劑如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或者其他無機或有機溶質來實現(xiàn)。就含鈉離子的緩沖液而言特別優(yōu)選氯化鈉。所述組合物的粘度可用藥學上可接受的增稠劑來維持在選定水平。優(yōu)選甲基纖維素，因為其能容易且經(jīng)濟地獲得且易于操作。其他合適增稠劑包括例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波莫等。藥學上可接受的防腐劑能用于增加所述組合物的保存期。芐醇可能合適，盡管還可使用多種防腐劑，包括例如對羥苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇或苯扎氯銨。防腐劑的合適濃度基于總重量為0.02%-2%，盡管根據(jù)所選試劑可有明顯變化。本領域技術人員應認識到所述組合物的成分應選擇成相對于活性化合物在化學上為惰性。根據(jù)本公開和本文所引用的文獻，這對熟悉化學和藥學原理的技術人員不構成問題，或者可通過參考標準教材或通過簡單實驗(不涉及過度實驗)而容易地避免問題。組合物能以劑量給予，并通過熟悉醫(yī)學及獸醫(yī)學領域的技術人員熟知的技術來給予，考慮因素如特定對象的年齡、性別、重量和情況以及用于給藥的組合物形式(如固體相比液體)等。根據(jù)本公開、本文引用的文獻和本領域知識，技術人員能確定人或其他哺乳動物的劑量而不需過度實驗。初始給予和進一步劑量或順序給予的合適方案還可變化，可包括初始給予然后后續(xù)給予；盡管如此，可由技術人員根據(jù)本公開、本文引用的文獻和本領域知識來確定。本發(fā)明的 藥物組合物用于治療心力衰竭和心血管病，包括但不限于動脈粥樣硬化、缺血、高血壓、再狹窄、心絞痛、風濕性心臟病、先天性心血管缺陷和動脈炎癥，以及其他動脈、小動脈和毛細血管疾病或相關疾病。因此，本發(fā)明涉及給予本文所述成體干細胞用于治療或預防任何一種或多種這些病癥或者涉及心臟疾病或紊亂的其他病癥，其給予為單獨的或者如本文所討論聯(lián)合有一種或多種細胞因子或所述細胞因子的變體。給予的優(yōu)選途徑涉及最適于治療這些病癥的途徑，如經(jīng)注射，包括但不限于皮下或胃腸外注射，包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、心肌內(nèi)、經(jīng)心內(nèi)膜、經(jīng)心外膜、鼻內(nèi)給予以及鞘內(nèi)和輸注技術。盡管上面描述了本發(fā)明的多個實施方式，應理解它們僅以舉例方法呈現(xiàn)，而不用于限制。可根據(jù)本文的公開內(nèi)容對所公開實施方式進行許多改變而不偏離本發(fā)明精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍應不受任何上述實施方式限制。本文提及的所有文獻通過引用納入本文。本申請引用的所有發(fā)表物和專利文獻通過引用納入以用于所有目的，程度就好像各單獨發(fā)表物或專利文獻如此單獨表示。申請人在本文中引用不同參考文獻，并非是申請人承認任何特定參考文獻是其發(fā)明的“現(xiàn)有技術”。下列實施例中說明本發(fā)明組合物和方法的實施方式。
實施例下列非限制性實施例用于說明本發(fā)明的選定實施方式。應理解所示組分元素的比例和替代物的變化對本領域技術人員為顯而易見且在本發(fā)明實施方式的范圍內(nèi)。材料和方法非標準縮寫和首字母縮略詞:骨髓(BM);成纖維細胞菌集落形成單位(CFU-F);冠狀動脈旁路移植術(CABG);射血分數(shù)(EF);舒張末期容積(EDV);收縮末期容積(ESV);間充質干細胞(MSC);單核細胞(MNC);小鼠心臟基質細胞條件培養(yǎng)基(MsHrtStr CM);心肌梗塞(MI);非貼壁MSC(NA-MSC);重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF)。小鼠:將人細胞移植到接受左冠狀動脈結扎和誘導心肌梗塞(MI)的N0D/SCID小鼠中。僅研究雄性、2月齡的小鼠。分組如下:1)注射人MSC的10只小鼠；2)注射人BM-⑶271+細胞的10只小鼠。
左冠狀動脈結扎方法:小鼠用5%異氟烷誘發(fā)并續(xù)以依托咪酯20mg/kg 1.p來麻醉。進行氣管插管，然后將小鼠置于心臟監(jiān)視器上并機械通氣。左側胸部切口位點上的皮膚用聚維酮碘10%溶液以無菌方式預備和覆蓋(draped)。用加熱墊在過程中保持小鼠溫暖以防止熱損失。手術前將手術用的無菌非藥用眼膏應用于眼睛以防止角膜干燥。一旦達到充分鎮(zhèn)靜狀態(tài)，經(jīng)左側胸部切口開胸。使左冠狀動脈暴露并進行結扎以產(chǎn)生前壁梗死。閉塞10分鐘后，將紅細胞生成素(2-6yg/kg)經(jīng)頸內(nèi)靜脈導管輸入。胸部用O和3.0(用于肌肉)可吸收縫線逐層閉合，手術后給予丁丙諾啡(0.05-0.lmg/kg s.c.)以緩解疼痛。小鼠用繃帶包扎并飼養(yǎng)在標準無菌分離室內(nèi)，手術后小鼠在室中恢復3-4天。用丁丙諾啡0.05-0.lmg/kg s.c.ql2hX6劑量實現(xiàn)疼痛控制。密切監(jiān)控(每日4次)動物在手術后階段的疼痛和感染，觀察征兆如厭食、精神不振、攻擊性和呼吸困難。表現(xiàn)出麻痹、發(fā)生潰瘍、呼吸困難或活動力降低的動物從研究中移除并施以安樂死。經(jīng)歷除放置冠狀動脈結扎以外所有操作的假手術小鼠用作對照。假手術組中的圍手術期死亡率低(〈15%)，梗塞組稍高。剩余小鼠中，約75%在MI后存活至少2個月。小鼠通常在手術后研究4周。干細胞用30號針通過直接心肌內(nèi)注射來給予。梗塞當天，在打開胸腔以誘導MI時，所述細胞直接注射入心肌。遞送3次100 μ I注射。血液動力學測量方法:用微型電導微量測壓法進行完整心臟血液動力學分析。如下麻醉動物:異氟燒氣體續(xù)以依托咪酯12mg/kg 1.ρ.，聚氨酯600mg/kg 1.p.和嗎啡lmg/kg 1.p.。進行氣管插管，然后將小鼠置于心臟監(jiān)視器上并機械通氣。使左頸內(nèi)靜脈暴露并用30號針插管以給予藥物。將4電極壓力容積導管(SPR-839，米勒儀器有限公司(MillarInstruments Inc))插入右頸動脈并推進到左心室。在基線和灌注異丙腎上腺素(1-lOOng/分鐘)后測量壓力容積環(huán)。最后，通過經(jīng)胸部切口夾緊下腔靜脈減少預加載。通過觀察胸壁運動、心率、血壓、肌張力、和刺激知覺來監(jiān)控麻醉深度。實驗結束時，處死動物(在如上深度麻醉下)且收獲心臟用于后續(xù)分子生物學研究和免疫組化。慢性缺血性心肌病模型:使用哥廷根小型豬(25_30kg，雌性，10-12月齡)并接受缺血性心力衰竭的大型動物模型。為創(chuàng)建慢性缺血性心肌病的臨床前模型，給予小型豬氯胺酮以誘導麻醉，進行氣管插管，給予異氟烷以維持全身麻醉。連續(xù)監(jiān)控所述豬的非侵入性BP、心率、溫度、脈沖血氧測量和二氧化碳測量。在頸中部進行縱切開，使右頸總動脈和頸內(nèi)靜脈暴露。用血管袢獲得近端和遠端控制，然后將7Fr血管通路鞘置于右頸總動脈和右頸內(nèi)靜脈。在MI之前和之后獲得有IVC閉塞的壓力容積環(huán)。用JR4導管進行左和右的冠狀動脈造影。然后，小型豬通過第一對角支遠端冠狀動脈左前降支(LAD)的氣囊擴張經(jīng)受實驗性前壁梗死2.5小時。監(jiān)控豬的心律失常并在必要時啟動高級心臟救命術(AdvancedCardiac Life Support)。氣囊血管成形術完成時,用6-0prolene線修復頸動脈且頸內(nèi)靜脈結扎。3層關合頸部切口；筋膜、皮下組織和皮膚用3-Opolysorb再縫合。然后小型豬恢復，使疤痕能隨著心臟經(jīng)歷重塑而復原3個月，所述疤痕通常是約20%左心室的透壁性梗塞且位于前間壁。遞送人BM-MSC或BM-⑶271+細胞:MI后3個月，給予小型豬氯胺酮以誘導麻醉，仰臥置于手術臺，經(jīng)面罩給予異氟烷，進行氣管插管，繼續(xù)異氟烷以維持全身麻醉。如上所述獲得左頸總動脈和頸內(nèi)靜脈的血管通路以用壓力容積環(huán)進行血液動力學評價。用10號解剖刀在第5-6肋間隙形成左前側胸廓切口 ；軟組織用電凝止血法切開以控制出血；鑒定胸膜壁層；使用metzenbaum解剖剪將其打開以進入左胸膜腔，注意不損傷肺實質；使用肋骨牽開器來展開肋骨。鑒定心包且用metzenbaum解剖剪進行縱切，小心保持于膈神經(jīng)前方而不損傷心肌。使心臟暴露且用填充有0.5cc MSC或⑶271+細胞的針筒完成疤痕區(qū)和邊界區(qū)的10次注射。總注射體積為5cc。用紗布縫線控制任何出血區(qū)。胸廓切口用2-Opolysorb縫線3層閉合，通過置于切口側面的ISFr胸管水下抽吸。然后所述豬脫離呼吸機并恢復。第二天移出胸管。分組如下:I)MI后3個月注射2億個MSC(n=6) ;2)MI后3個月注射200萬個CD271+細胞(n=6)。心臟功能評價:所移植⑶271+細胞和MSC的效果用左心室壓力容積環(huán)和系列心臟MR來評價。在急性MI之前和之后、注射時、和處死時，用心導管插入術期間置于左心室中的Millar壓力容積傳感器導管評估左心室(LV)血液動力學。同步非侵入性心臟功能數(shù)據(jù)用Siemensl.5T MRI掃描儀來獲得。心臟MR作為綜合和高精度成像模式出現(xiàn)以評價總體功能、區(qū)域功能、疤痕大小和灌注參數(shù)。許多人將心臟MR視為成像心臟的一站式方案，因為用一個研究得以評估許多心臟參數(shù)。心臟MR操作方案包括電影法心電門控圖像，首過釓灌注成像，帶標記線的MR圖像，和延遲的超增強圖像。典型MR掃描獲得約1，200張需要大量后期處理分析的心臟 圖像。所有圖像保持在邁阿密大學WebPax系統(tǒng)上并且各研究下載至DellPrecision690工作站。2種FDA批準軟件程序Segment (Medviso AB和隆德大學，瑞典隆德)和Diagnosoft (北卡羅來納州的凱里)用于分析。電影法和延遲增強圖像用Segment軟件分析。帶標記線圖像和首過灌注圖像用Diagnosoft程序分析以分別獲得峰值歐拉圓周應變和心肌上升斜率和曲線下面積。處死和組織學:注射細胞后3個月，如上所述將各動物在深度麻醉下處死。心臟通過中央灌注40mEq氯化鉀而驟停，氯化鉀使心臟驟停于舒張期。收集豬心臟并保存于甲醛中。各心臟以短軸切片且梗塞、邊界區(qū)和遠端區(qū)的活檢用共聚焦顯微鏡分析移植和分化。另外，完成豬的全身剖檢以評價異位組織形成。小鼠:使用NOD-SCID小鼠，因為它們?yōu)槊庖呷毕菪颓沂侨烁杉毎暮线m受體。經(jīng)歷MI小鼠的心臟功能在手術后4周內(nèi)低于假手術小鼠。根據(jù)計算，各組需納入8只小鼠以獲得0.90的統(tǒng)計效力且α =0.05。然而，MI后野生型小鼠的死亡率在手術后頭6周中為約25%。因此，為了進行MI研究，每組使用至少10只小鼠。
豬:哥庭根小型豬用于臨床前研究，因為其冠狀動脈解剖類似人，且在約12-15月齡時有穩(wěn)定生長曲線，使其能在長期存活研究中被跟蹤而心臟混雜生長最小。計算顯示各組需納入6只豬以獲得0.90的統(tǒng)計效力且α =0.05。小鼠手術:在考慮預防疼痛和不適情況下進行小鼠手術。如上所示，在任何手術過程中使用合適試劑以提供麻醉和止痛。對于冠狀動脈結扎，小鼠的麻醉用5%異氟烷以誘導并續(xù)以依托咪酯20mg/kg 1.p。疼痛控制用丁丙諾啡0.05-0.lmg/kg s.c.ql2h實現(xiàn)。另夕卜，小鼠體溫用加熱毯或燈來維持。盡管一些小鼠由于不同手術過程發(fā)展出心臟肥厚和心力衰竭，對經(jīng)歷體重過度喪失、呼吸困難、發(fā)紺和無應答的小鼠進行評估，且在合適時提早安樂死。豬手術:在考慮預防疼痛和痛苦情況下進行所有涉及豬的過程。如上所討論，所有過程在全身麻醉下進行。手術后疼痛通過術后皮下注射丁丙諾啡0.05-0.lmg/kg控制且將芬太尼25mcg貼片置于豬背部72小時。如果豬在此研究進程中的任何時間出現(xiàn)痛苦，由獸醫(yī)和調(diào)查小組進行評估。許多痛苦病例是由于傷口或肺感染，其能用口服或肌肉內(nèi)抗生素控制。安樂死:這些方法符合2007年美國獸醫(yī)協(xié)會安樂死指南的建議。所有豬和小鼠就以下2種情況之一施以安樂死:1)表現(xiàn)出顯著手術后疼痛或痛苦，所述疼痛或痛苦不能由鎮(zhèn)痛藥、抗生素和其他措施緩解；2)完成生理學研究的指定時間量。小鼠用過量氯胺酮(150mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)及隨后的頸脫位法來施以安樂死。將豬置于前述深度麻醉下且心臟用40mEq氯化鉀驟停。實施例1:比較心肌梗塞小鼠模型(N0D/SCID)中的人BM-MSC和BM-⑶271+細胞。為對此進行測試，通過在N0D/SCID小鼠中開胸短暫結扎冠狀動脈左前降支(LAD)來使用心肌梗塞的已確立小鼠 模型。缺血后I小時，從LAD移除縫線結扎以允許充分再灌注。然后，小鼠以1:1方式隨機化到人BM-MSC或BM-271+細胞組。使用其他動物組建立合適的對照和比較。這些包括⑶34+和⑶133+骨髓衍生細胞，所述細胞包含造血干/祖細胞和內(nèi)皮前體細胞。再灌注后，隨之在直視疤痕區(qū)和邊界區(qū)情況下注射所述細胞，總注射體積為10yL。然后，對小鼠通過系列超聲波心動描記術跟蹤8周以評估細胞治療的功效。注射8周后，處死經(jīng)歷詳細血液動力學評估的小鼠并對收集的心臟進行免疫組化分析以確定所注射細胞的移植和分化。組織病理學:研究末期進行血液動力學測量后，小鼠心臟灌注以氯化鉀和固定劑以用于免疫組化研究。測量總尸體、心臟、肺和肝重量以及脛骨長度以檢測非梗塞心室組織肥大。心臟切片用蘇木精和伊紅染色以整體檢查。馬森染色為藍的橫切面中左心室周長部分提供梗塞大小的量度。通過免疫染色追蹤已分化干細胞。用alu染色在小鼠心臟內(nèi)檢測人細胞。就肌鈣蛋白1、α橫紋肌肌動蛋白、心肌細胞、結蛋白、α-心臟肌動蛋白、連接蛋白-43、GATA-4、Nkx-2.5和MEF2染色指示肌細胞。⑶31和波形蛋白染色用于鑒定內(nèi)皮細胞，而α -平滑肌肌動蛋白和SMA22用于鑒定平滑肌細胞。因此，能鑒定注射人⑶271或MSC產(chǎn)生的所有細胞和這些細胞再生出不同細胞系的潛能。關于心臟再生的充分描述還包括測量總肌細胞數(shù)目和大小。每個左心室的肌細胞數(shù)目用Bruel和Nyengaard方法通過核計數(shù)來估計。為了測量肌細胞截面面積，載玻片用突光素偶聯(lián)麥胚凝集素(英杰公司(Invitrogen))和Hoechst33258染色。聯(lián)用卡瓦列利和解剖器原理來計算肌細胞體積。或者，個體肌細胞能在急性分離后用形態(tài)測量軟件通過共聚焦顯微鏡測量。為了檢測與病理學重建相關的纖維化，切片用天狼猩紅(膠原)和固綠(細胞)染色。結果由馬森三色確認。為了檢測可能與進行中重建相關的任何凋亡肌細胞，石臘包埋切片用Apoptag Red原位凋亡檢測試劑盒(密理博(Millipore))基于間接TUNEL法染色。其他試驗包括用針對經(jīng)切割半胱天冬酶-3的特異性抗體進行免疫組化，通過蛋白質印跡檢測半胱天冬酶依賴性PKC δ切割，DNA階梯檢測。小鼠研究:將人BM-⑶271細胞在實驗性MI后注射到N0D/SCID小鼠心臟中可改善射血分數(shù)(EF)，縮短分數(shù)與安慰劑和間充質干細胞作比較。重要的是，CD271細胞高度有效改善EF和減緩心腔尺寸增加，有效程度高于數(shù)目大許多的培養(yǎng)MSC。CD271細胞注射還引起心肌收縮性相較安慰劑改善，如收縮末期壓力容積曲線斜率增加和向左平移所證明。在組織學上評價時，CD271細胞顯示高度移植和肌細胞分化證據(jù)，支持以下觀點:心臟復原是緣于受損心肌中的細胞移植。這些研究決定性地測試了以下假設:⑶271MSC前體能產(chǎn)生肌細胞和血管分化，修復受損心臟的程度高于培養(yǎng)的MSC。實施例2:在心肌梗塞的豬模型中比較人BM-MSC與BM-⑶271+細胞。使用慢性缺血性心肌病的大型動物模型且所述模型在本實驗室中已充分確立(7，8)，該模型用以測試 CD271細胞是否移植并分化成肌細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞。還用心臟MRI測試⑶271+細胞對心臟功能、疤痕大小和心肌灌注的效果。發(fā)明人在于不同品種豬中創(chuàng)建缺血性心肌病模型方面有充足經(jīng)驗(8，9)。對于本研究，10只成年哥庭根小型豬接受冠狀動脈左前降支的實驗性氣囊血管成形術持續(xù)2.5小時，引起涵蓋約20%左心室心肌的前間隔壁發(fā)生透壁性梗塞，然后在氣囊放氣后完全再灌注。動物隨后恢復，并隨著心臟經(jīng)歷廣泛重塑用系列心臟MR進行跟蹤。MI后3個月，小鼠以1:1方式隨機化到BM-MSC或ΒΜ-271+細胞組。然后，動物進行左側小切口開胸，在切口處將人骨髓衍生⑶271+細胞或MSC用22號針在直視情況下注入。任何出血區(qū)域進行縫線結扎。然后閉胸且動物用心臟MR來系列跟蹤。所有小型豬用口服環(huán)孢霉素A(CsA)免疫抑制以防止人細胞異種移植到豬心臟引起的免疫排斥(10，11)。⑶271+細胞的功效用系列心臟磁共振成象(MRI)來評估。此成像模式能詳細表型分析總體心臟功能，采用HARP分析區(qū)域心臟功能，使用延遲超增強成像分析疤痕大小，和通過首過釓灌注分析心肌灌注上升斜率及曲線下面積。注射后3個月，處死動物并收集心臟用于免疫組化分析以確定CD271+細胞的移植和分化。對各動物進行全身剖檢以評價異位組織形成。如(7-9)所述在這些動物研究中進行詳細的安全和功效評價?？傮w目標是建立包括免于瘤形成或異位組織形成的長期安全性，以及向日益增長的數(shù)據(jù)庫添加表明急性手術遞送細胞到衰竭心臟是安全的這一信息。此外，平行進行詳細的機械研究，采用成像、血液動力學評價和免疫組化以測試以下假設:CD271+細胞注射對在慢性缺血性心肌病中引起逆重塑高度有效，此效果的機制至少部分是緣于細胞移植和分化。自體間充質干細胞在慢性缺血性心肌病中產(chǎn)生逆重塑:本實驗室在心肌梗塞后有完全愈合疤痕的大型動物模型中進行的工作顯示，MSC給予能顯著改善左心室結構和功能性指標，指示有意義的修復。通過用成像技術探究此經(jīng)驗，在慢性缺血性心肌病的豬模型中追蹤到移植MSC引起的表型改善，并在形態(tài)測量上定量了這些變化。在豬中產(chǎn)生MI ;12周后，梗塞段變薄，留下透壁性疤痕。已從各動物中擴增自體MSC，并在此時將這些細胞或安慰劑遞送到梗塞和外周邊界區(qū)。另一個12周的隨訪階段中，心臟MRI揭示心肌內(nèi)注射MSC不僅使疤痕負擔(LV質量)降低21.8+3.9% (p〈0.05，相比安慰劑以及第12周相比第24周)，還顯著改善區(qū)域收縮性、總LV功能、射血分數(shù)和心肌血流。重要的是，所述治療產(chǎn)生逆重塑并降低梗塞疤痕的圓周范圍。此些效果證明缺血性心肌病中的高度有效修復。同種異體間充質干細胞在慢性缺血性心肌病中通過三系分化能力恢復心臟功能:測試以下假設:基于MSC的心臟修復是否經(jīng)由含長期移植的機制并通過分化成心肌及血管元件來使心臟再生。同種異體MSC產(chǎn)生自雄性豬供體中，在MI后12周通過經(jīng)心內(nèi)膜注射入雌性豬而給予性別錯配細胞。動物用系列MRI跟蹤，12周后收集心臟用于免疫組織學評價。雄性供體細胞的命運通過Y染色體(Yp°s)細胞與心臟、血管和內(nèi)皮細胞系的共定位來確定。MSC移植到梗塞和邊界區(qū)并分化成心肌細胞，如與GATA-4、Nkx2.5和α -橫紋肌肌動蛋白標記物共定位所確認。另外，Yp°s MSC顯示血管平滑肌和內(nèi)皮細胞分化，有助于大和小血管形成。移植細胞數(shù)目與發(fā)生的功能變化相關聯(lián)。在移植到慢性疤痕化心肌后證明長期MSC存活，移植，且分化成心肌、血管、和內(nèi)皮細胞系。這些細胞就心肌生成和血管生成而言的能力都可能有助于其修復慢性疤痕化心肌的能力。實施例3:對接受搭橋手術的MI患者的臨床試驗和接受搭橋手術患者的⑶271+細胞臨床試驗中測試⑶271+細胞。所進行的是I/II 期臨床試驗[稱為 “Prospective Randomized Study ofCD271+Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (接受心臟手術患者中⑶271+細胞治療的前瞻性隨機研究)”(PR0METHEUS-1I)]。這是雙盲、隨機化、安慰劑對照的試驗，在接受搭橋手術的15個患者中比較CD271+細胞與安慰劑。此試驗終點是安全性和功效。功效終點使用心臟磁共振成象(MRI)評價心肌梗塞大小、區(qū)域和總體左心室(LV)功能和心肌灌注。還收集患者骨髓和循環(huán)血液樣品的生物儲備(biorepository)以確定可預測成功響應治療的生物標記物。在邁阿密大學的細胞生產(chǎn)項目設施中分離用于此試驗的⑶271+細胞產(chǎn)品。用于此試驗的⑶271+細胞是骨髓衍生成體干細胞，所述干細胞是MSC前體。初步臨床試驗數(shù)據(jù):缺血性心力衰竭試驗中的經(jīng)心內(nèi)膜自體細胞(TAC-HFT):TAC-HFT是I/II期隨機、雙盲研究，經(jīng)食品和藥物管理局批準在2009年招募。此研究將招募60個有心肌梗塞繼發(fā)性慢性缺血性左心室功能不全(EF在20-50%之間)的患者。Helix灌注導管(加利福尼亞州圣何塞的BioCardia公司)用于在心導管插入中經(jīng)心內(nèi)膜注射來遞送:MSC、全骨髓或安慰劑。 TAC-HFT試驗設計成招募8個患者作為開放標簽導入期用以在60個患者的雙盲隨機期之前建立初步安全數(shù)據(jù)。這些前8個患者以非盲方式接受全骨髓(n=4)或骨髓衍生間充質干細胞(n=4)。所有8個患者耐受干細胞注射而沒有任何重大不良事件，使雙盲期能隨后招募患者。由于前8個患者都接受細胞注射，分析其心臟MR圖像。電影法圖像和延遲增強圖像用軟件Segment (Medviso AB和隆德大學,瑞典隆德)分析而帶標記線心臟圖像用HARP軟件(診斷軟件有限公司(Diagnosoft, Inc.))分析。來自這些患者的初步數(shù)據(jù)揭示干細胞注射后6個月，總體功能改善顯示舒張末期容積減少11.2±3.4%(p〈0.05)，收縮末期容量減少13.5±4.2%(p〈0.01)，射血分數(shù)平均增加4.9±6.7%。延遲增強圖像上，作為左心室質量百分數(shù)的疤痕尺寸平均減少13.3±7.2%(p=0.06)。帶標記線MR圖像顯示梗塞區(qū)域和邊界區(qū)收縮性的區(qū)域性改善，如歐拉圓周應變所證明。這些數(shù)據(jù)顯示MSC是安全的，改善心臟功能，支持逆重塑，并減小疤痕尺寸。這些數(shù)據(jù)設定了先例，因為沒有其他治療策略實現(xiàn)伴有心肌疤痕實際減輕的這種重塑程度。這些令人激動的發(fā)現(xiàn)高度支持加速此領域臨床研究的必要性。急性心肌梗塞后靜脈內(nèi)成體人間充質干細胞(PiOChymal)的隨機、雙盲、安慰劑對照、劑量遞增研究:1期53個患者研究的安全和功效數(shù)據(jù)近期發(fā)表于Journal of theAmerican College of Cardiology (18)且為同種異體MSC提供關鍵的安全數(shù)據(jù)。本試驗中，再灌注急性MI的患者隨機化到單次靜脈內(nèi)灌注安慰劑或人MSC組，所述MSC分離自從與受體在人白細胞抗原上不匹配的單個不相關供體所獲得的骨髓穿刺物。不良事件率在hMSC處理(每個患者5.3)和安慰劑處理(每個患者7.0)組中類似。動態(tài)ECG記錄顯示hMSC處理患者中的心室性心博過速發(fā)作次數(shù)目相較安慰劑減少。前壁心肌梗塞患者的超聲波心動描記術顯示hMSC處理患者中的射血分數(shù)改善。重要的是，此試驗為同種異體MSC在缺血性心臟病中的應用提供了關鍵的安全數(shù)據(jù)。來自發(fā)明人實驗室的其他臨床前安全和功效數(shù)據(jù)(7，8，15)在有急性和慢性MI的不同品種豬模型中獲得。經(jīng)導管注射MSC到梗塞組織減少心肌梗塞尺寸，改善總體和區(qū)域LV功能，使心臟能量學正?；⒒謴徒M織灌注(7，8，16)。從正常人BM分離⑶271+細胞:由有經(jīng)驗的血液學家/腫瘤學家從處于清醒鎮(zhèn)靜和局麻的患者的髂嵴獲得骨髓穿刺物。BM單核細胞用密度梯度離心分離，然后細胞用結合有⑶271抗體的微珠標記且在CliniMACS臨床裝置(德國科隆的美天旎生物技術公司)上分⑶271+細胞離。然后，洗滌細胞并制備用于灌注。此過程耗時約4-5小時。所有⑶271+細胞(1-5M)都用于患者注射。

此實驗室的先前工作證明分離⑶271+細胞的可行性。⑶271+細胞分離自正常供體骨髓細胞，使用抗CD271-APC和抗APC微珠間接標記細胞。起始BM MNC的中值細胞數(shù)目為1.4X IO8個有核細胞(范圍為2.9 X 107-3.3 X IO8, Ν=7)，產(chǎn)生選擇后中值4.2 X IO5個CD271.細胞(范圍為3.9Χ104-9.4Χ105)。這代表BM MNC產(chǎn)品中CD271+細胞的頻率為0.3%。分離的⑶271+細胞顯示有低質核比的原初形態(tài)。置于液體培養(yǎng)中時，⑶271+細胞在7天內(nèi)形成MSC，而全BM MNC形成更少的MSC。將從⑶271+細胞產(chǎn)生MSC與⑶27Γ細胞作比較，170，000個CD271+細胞在T162cm2瓶中培養(yǎng)7天后產(chǎn)生顯著MSC，而高100倍的CD27r細胞(T162cm2瓶中1.7xl07個細胞)在7天內(nèi)沒能產(chǎn)生顯著MSC。⑶271_細胞培養(yǎng)中有一些貼壁細胞，然而，這些細胞看來是內(nèi)皮細胞而非MSC。就CFU-F來富集⑶271+細胞，1/222的CD271.細胞形成CFU-F，而BM MNC為1/12，500。CD271陰性部分也包含極少CFU-F,低于 1/100,000 細胞。細胞遞送:冠狀動脈搭橋手術完成時，自體BM-⑶271+細胞或安慰劑由心臟外科醫(yī)師在直視下經(jīng)心外膜注射到疤痕區(qū)和邊界區(qū)。任何出血區(qū)用紗布縫線控制。心臟MR1:本組在利用前沿的非侵入性成像技術確定心臟結構和功能上有充分經(jīng)驗(17，19，20)。心臟MR用于評價細胞治療功效。心肌功能、組織灌注和非侵入性測定梗塞大小分別通過諧波相位(HARP)組織標記、釓吸收動力學和延遲對比增強MRI方案來確定?；颊哐雠P在磁臺上且所有圖像在以呼氣結束的12-15次心跳的屏氣過程中獲得，該過程平均10-15秒，屏氣之間有充分休息時段(10-15秒)。成像方案首先包括矢狀、軸向和傾斜定位(oblique scout)圖像以定位心臟。各MRI段估計持續(xù)45_60分鐘。為了確定心肌功能，如上所述進行組織標記操作。所用方案是基于ECG觸發(fā)的快速梯度回波脈沖序列，其產(chǎn)生6_標記的心肌隔離。此方法產(chǎn)生能用于干預后不同時間點跨對象比較的基于區(qū)域的定量移動和應變參數(shù)，從而提供評價系列和定量LV功能的快速和可重復方法。此后，患者接受靜脈團注0.2mmol/kg釓-DTPA。用反轉恢復準備的門控快速梯度回波序列從8_10個LV短軸橫截面(確保完整心臟覆蓋)獲得高分辨延遲增強圖像。結果顯示，用此方法獲得的超增強區(qū)域在死后用氯化三苯四唑(TTC)染色測量的梗塞尺寸10%內(nèi)，因而凸顯此方法為確定梗塞尺寸的極精確方法(19)。
實施例4:骨髓⑶271+MSC前體細胞的心臟潛能方法分離CD271+細胞:在合適的知情同意書和IRB批準下從澳賽爾斯有限責任公司(AllCells LLC)(加利福尼亞州埃默里維爾)獲得骨髓穿刺物(25_50ml)。骨髓(BM)細胞用PBS+1%FCS1:1稀釋并在ficol上分層以分離低密度單核細胞部分(MNC)。然后，MNC用CD271微珠(德國科隆的美天旎生物技術公司(Miltenyi Biotech))標記且CD271+細胞用Miltenyi MACS細胞分選裝置(VarioMACS)根據(jù)生產(chǎn)商推薦過程分離。計數(shù)CD271+細胞并準備細胞離心涂片供形態(tài)分析。分離和擴增間充質干細胞(MSC):BM MNC如上所述分離且所述細胞在T162cm2培養(yǎng)瓶中以100-300萬MNC/ml a MEM培養(yǎng)，所述a MEM含有20%FBS與1%谷氨酰胺青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)基每3-4天更換，棄去非貼壁細胞。MSC在瓶表面生長為貼壁細胞，培養(yǎng)物在融合時用胰蛋白酶處理進行傳代。MSC在4或5次傳代時收獲并在液氮中冷凍。注射前解凍并洗滌細胞。CFU-F試驗:BM MNC、⑶271+和⑶27Γ細胞的成克隆潛能用成纖維細胞菌集落生成單位(CFU-F)試驗評價。細胞接種于35mm培養(yǎng)皿的2ml間充質干細胞刺激培養(yǎng)基與補充物(加拿大溫哥華的干細胞技術公司(Stem Cell technologies)中。細胞以每板10，000個細胞到多至每板100萬個細胞范圍的不同細胞密度接種。培養(yǎng)物在5%C02中37° C孵育10天，然后用吉姆沙染色劑染色并用解剖顯微鏡評分。通常CFU-F集落直徑為1-Smm且能肉眼目測評分。誘導和評價脂肪細胞及成骨分化潛能:CD271+細胞在特氟龍采樣袋中于非貼壁條件下培養(yǎng)，收獲細胞并接種于6孔細胞培養(yǎng)皿(丹麥羅斯基勒的能肯公司(Nunc))以用于分化試驗。通過將這些細胞在NH AdipoDiff培養(yǎng)基(美國加利福尼亞州奧本的美天旎生物技術有限公司(Miltenyi Biotec Inc.))中以5xl04個細胞/ml濃度培養(yǎng)2周來誘導脂肪細胞分化。然后，細胞用于脂滴染色，使用油紅O染色(密蘇里州圣路易斯的西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))。通過將這些細胞在NH OsteoDiff培養(yǎng)基(美天旎生物技術有限公司)中以3xl04個細胞/ml濃度培養(yǎng)3周來誘導成骨分化。然后，細胞用SIGMA FASTBCIP/NBT緩沖底物片(西格瑪公司(Sigma))染色以檢測其堿性磷酸酶(AP)表達，AP是參與骨基質礦物化的酶。此階段中在a-MEM內(nèi)培養(yǎng)的細胞用作對照。動物模型、心肌梗塞和細胞移植。所有在活體動物上進行的實驗都根據(jù)邁阿密大學動物護理和使用計劃批準的方案來進行。通過氣管插管(1-2%)用異氟烷吸入麻醉動物，而麻醉水平用體溫和心率控制。丁丙諾啡(0.3mg/kg，SQ注射)在手術前和后使用(Q6小時)以管理疼痛。使用左前胸切口，使8-10周齡的NOD/SCID雌性小鼠(NOD/SCID ;緬因州巴爾港的杰克遜實驗室(Jackson Laboratory))心臟暴露且將LAD動脈用7_0prolene線永久結扎。通過結扎遠端的視覺消隱和心電圖(ECG) ST段抬高確認梗塞。第一后續(xù)ECG在手術后48小時用作研究招募標準，因此所有動物有等同大小的MI。建立4個實驗組，動物組成如下:接受磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)注射作為對照；接受⑶271+細胞(1.2X105個細胞)、以2個不同劑量1.2XlO5(低劑量)或IX IO6個細胞(高劑量)接受人BM MSC0梗塞或，各動物立即用30號針在梗塞區(qū)邊界和中心接受3次PBS或細胞注射(10 μ I/注射)。手術死亡率是11.5%且細胞注射后頭48小時中死亡率是5%(圍手術期時間的總死亡率是16.5%)。移植后8周，處死動物并準備心臟用于免疫組織學分析。超聲波心動描記術:由Vevo770成像系統(tǒng)(加拿大多倫多的視覺聲音公司(VisualSonic Inc.))監(jiān)控手術前(為基線)，梗塞和細胞注射后48小時、1、2、4和8周的心臟功能。在異氟烷吸入(1-2%)麻醉下記錄圖像，心率高于400bpm且體溫為(37±10C)。用2維圖像計算心臟結構和解剖學的超聲參數(shù)，包括舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)和射血分數(shù)(EF)。壓力容積環(huán)分析:細胞注射和使用右頸動脈方法后8周，Millar電導測壓導管(SPR839)(得克薩斯州的米勒儀器公司(Millar Instruments)推進到左心室。所述過程中，稀釋的6.25%白蛋白溶液以5 μ I/分鐘流速灌注到頸靜脈且用1-2%異氟烷吸入通過氣管插管實現(xiàn)麻醉。用MPVS Ultra系統(tǒng)(得克薩斯州的米勒儀器公司)獲得在基線和下腔靜脈(IVC)閉塞后的壓力容積數(shù)據(jù)。體積校準用比色皿法和高滲鹽水輸注完成。組織制備和組織病理學:PV環(huán)記錄結束后，收集心臟并用氯化鈉20 μ M溶液和福爾馬林10%以Iml/分鐘通過主動脈插管來灌注10分鐘從而固定舒張心臟。對心臟進行切片且組織學切口用馬森三色(TM)和Η&Ε染色或用于免疫組化。使用人特異 性DNA探針(人Alu探針，加利福尼亞州的生物基因公司(BioGenex))和熒光原位雜交(FISH)方法追蹤小鼠組織中注射的人細胞(抗熒光素-HRP偶聯(lián)物，馬薩諸塞州波士頓的珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))。來自人類胎兒心臟和PBS注射小鼠的樣品分別用作陽性和陰性對照。Alu染色載玻片用Zeiss熒光激光掃描儀掃描且圖像用Mirax viewer軟件以20X放大分析。單獨取圖像并用CS3Adobe Photoshop合并,在同一切割的2個不同區(qū)域計數(shù)陽性細胞。免疫組化:樣品用心臟特異性抗體α橫紋肌肌動蛋白(a -SA)(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)、肌鈣蛋白I(TnI)(馬薩諸塞州劍橋的阿柏堪穆公司(Abcam))和連接蛋白43 (Cx43)(加利福尼亞州圣克魯茲)染色。層粘連蛋白(阿柏堪穆公司)染色用于描繪細胞。染色樣品首先通過免疫熒光顯微鏡研究，然后用共聚焦顯微鏡ZeissLSM710制備圖像。統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism軟件分析且值表示為平均值土均值的標準差(SEM)。帶重復測量使用方差分析(有邦弗朗尼(Bonferoni)事后檢驗的雙向ANOVA以分析回波數(shù)據(jù)和單向ANOVA以比較終末血流動力學數(shù)據(jù)與Newman-Keuls多重比較事后檢驗。結果
從正常人BM中分離⑶271+細胞:⑶271+細胞從正常供體BM細胞中分離，用抗⑶271-APC和抗APC微珠間接標記細胞。起始BM MNC的中值細胞數(shù)為1.4xl08個有核細胞(范圍為2.9χ107-3.3χ108，Ν=7)，選擇后得到4.2χ105個CD271.細胞的中值(范圍為
3.9χ104-9.4χ105)。這代表BM MNC產(chǎn)品中CD271.細胞的頻率為0.3%。所分離CD271.細胞顯示有低質核比的原初形態(tài)(圖1)。置于液體培養(yǎng)時，⑶271+細胞在7天內(nèi)形成MSC (圖2Α)，而完整BM MNC形成較少MSC(圖2Β)。對從CD271+細胞與CD271_細胞產(chǎn)生MSC作比較，170，000個0)271+細胞在T162cm2瓶中培養(yǎng)7天后產(chǎn)生顯著MSC，而高100倍的CD271_細胞(T162cm2瓶中1.7xl07個細胞)在7天內(nèi)沒能產(chǎn)生顯著MSC(圖2C)。如圖2C所示，⑶271_細胞培養(yǎng)中有一些貼壁細胞，然而，這些看來是內(nèi)皮細胞而非MSC。就CFU-F 富集 CD271+細胞(圖 3)，1/250 的 CD271+細胞形成 CFU-F 相較 1/12，500的BM MNC。⑶271陰性部分也包含極少CFU-F，低于1/100，000細胞。
非貼壁條件下體外培養(yǎng)CD271+細胞:CD271+細胞在特氟龍采樣袋中于非貼壁條件下生長1-3個月，早期生長階段示于圖4。這些培養(yǎng)的培養(yǎng)基由a-MEM+20%FCS與20ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF)組成。第I周中，可觀察到細胞簇，特氟龍采樣袋上形成的一些細胞形態(tài)類似塑料貼壁性MSC。按摩所述袋以使貼壁細胞脫落并每周改變培養(yǎng)基。細胞簇繼續(xù)增殖并形成圖4所示的球，到第21天發(fā)展出大球。這些細胞在培養(yǎng)4周后通過流式細胞術分析，圖5顯示大部分表達典型MSC標記物⑶105。還評價非貼壁條件下生長的CD271+細胞的脂肪細胞和成骨分化潛能。從培養(yǎng)袋中收獲細胞并接種于6孔細胞培養(yǎng)皿(丹麥羅斯基勒的能肯公司)以用于分化試驗。如圖6所示，培養(yǎng)的CD271+細胞分化成脂肪細胞和成骨細胞。細胞還在典型MSC培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，即在有a MEM+20%FCS的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。圖4所示的球附于所述瓶的塑料表面且通常MSC從球生長并在1-2周后形成融合培養(yǎng)物。這些結果證明非貼壁條件下培養(yǎng)的⑶271+細胞形成細胞球，所述細胞是⑶105+，具有脂肪細胞和成骨細胞潛能并形成與MSC特性一致的塑料貼壁MSC樣細胞。使用心臟組織衍生小鼠基質細胞(MsHtStr CM))調(diào)理的培養(yǎng)基，評價非貼壁條件下培養(yǎng)2周的⑶271+細胞的心臟潛能。非貼壁MSC(NA-MSC)表達α橫紋肌肌動蛋白、Nkx2.5和連接蛋白-43、GAT-4和N-鈣粘素(圖7)。這些結果顯示CD271+細胞具有分化成心臟細胞以及脂肪細胞和成骨細胞的潛能并證明CD271+細胞相較作為塑料貼壁性細胞產(chǎn)生的MSC具有更高分化潛能。由于⑶271是神經(jīng)受體，提出這些細胞可能還具有神經(jīng)分化潛能且目前正著手實驗以評價此問題。BM-⑶271+細胞的體內(nèi)潛能:為評價BM-⑶271+細胞的體內(nèi)心臟潛能，將新鮮分離的人⑶271+細胞注射到N0D/SCID小鼠的梗塞心臟。MI損傷產(chǎn)生時間依賴性心室擴張和功能障礙(圖8)。所有組中梗塞的初始影響相等。舒張末期的心室容積(EDV)的比較(圖8)顯示CD271+細胞處理小鼠(112.8± 13.6 μ I)與對照比較(128.1 ±15.7 μ I)時顯示顯著逆轉重塑(P=0.02)。⑶271處理組還確實顯著優(yōu)于等劑量MSC處理的動物(低劑量；145.5 ±14.9 μ I) (p=0.0001)，但與高劑量 MSC 處理動物(116.5 ± 14.5 μ I)類似。在 MSC 處理動物中表現(xiàn)出劑量響應，低劑量MSC處理動物相較高劑量之間有顯著差異(ρ=0.0001)。收縮末期容積(ESV)產(chǎn)生相同趨勢-⑶271處理動物的ESV(81.5±12.4μ I)顯著低于對照動物(119.7 ±17.8 μ 1，ρ〈0.0001)和低劑量 MSC 處理動物(117.1 ±13.4 μ 1，ρ〈0.0001)，但不顯著低于高劑量MSC處理動物(91.2±12.6μ I)。⑶271處理動物在8周結束時顯示的射血分數(shù)(EF) (32.3±3.7%)高于對照處理動物(17.6±4.1%, ρ〈0.0001)和低劑量MSC處理動物(19.7 ±3.1%, ρ=0.0005)，但不高于高劑量MSC處理動物(24.7 ±2.9%)。壓力容積環(huán)分析:在注射后8周進行處理和對照心臟的血液動力學評價。通過經(jīng)頸動脈方法使用電導測壓。計算主動脈彈性(Ea)且⑶271處理小鼠的Ea (3.0±0.2mmHg/μ L)低于對照動物(4.7±0.2mmHg/ μ L, p〈0.05)，但與低或高劑量MSC處理小鼠(分別為
4.3±0.6和3.5±0.4mmHg/ μ L)無顯著差異。恒定等容舒張(Tau_ffeiss)顯不CD271心臟的舒張?zhí)匦?12.3±0.8msec)高于對照(15.2 土 L Omsec, ρ〈0.05)。免疫組化:在注射后8周，將來自⑶271+細胞MSC和安慰劑所處理動物心臟的組織切片用人特異性Alu探針染色。如圖9A-9D所示，注射有⑶271+細胞的動物顯示心臟遠端和邊界區(qū)都出現(xiàn)人細胞。檢測到大量人細胞包埋在血管壁中或在宿主細胞間。另外，一些心肌細胞就Alu而言為陽性且Alu陽性細胞表達肌鈣蛋白1(圖9Β)和α平滑肌動蛋白(圖9D)。這證明⑶271+細胞的一些心臟分化潛能。還在注射高劑量MSC的動物心臟中檢測到人細胞且這些細胞也是包埋于血管壁中或在宿主心肌細胞間。注射高劑量MSC的動物心臟中沒有檢測到Alu染色心肌細胞或Alu陽性細胞內(nèi)心臟標記物表達。討論CD271+細胞以低頻率存在于BM細胞中，約占BM MNC群的0.3%。使用MiltenyiMACS選擇試劑和裝置，分離出純度高于90%的高純化⑶271+細胞群，從25cc BM穿刺物平均回收4.2xl05個細胞。⑶271+細胞形態(tài)顯示由低質核比構成的均一性母細胞的原初表型。數(shù)據(jù)確認⑶271+群中富集MSC形成細胞，⑶271+細胞中CFU-F的水平是BM MNC的60倍。另外，⑶271陰性群中CFU-F的頻率為1/100，000個細胞，相較BM MNC中的1/12，500大幅降低且比⑶271+群低500倍 。通過粘附塑料瓶從⑶271+細胞產(chǎn)生的MSC表現(xiàn)的體外特性與BM MNC所產(chǎn)生的MSC相同，所述MSC表達⑶105+且能體外形成脂肪細胞和成骨細胞。先前研究證明MSC潛能屬于⑶271+⑶45_細胞群。此外，表型分析證明⑶271+細胞就包括⑶105和⑶90在內(nèi)的典型MSC標記物為陰性，然而，培養(yǎng)后，所述細胞表達經(jīng)典MSC標記物⑶105、⑶90和⑶73。進一步⑶271表達會抑制MSC分化成成骨、成脂、成軟骨和肌原性細胞系。本文的數(shù)據(jù)與文獻一致并支持以下假設:CD271+細胞是作為MSC前體的干細胞群且CD271+細胞分化成塑料貼壁性MSC引起定向為成脂、成軟骨和成骨細胞系。體外進行其它實驗以評價非貼壁培養(yǎng)條件下產(chǎn)生MSC的方法。鑒于本實驗室聚焦于心臟修復，假設作為塑料貼壁性細胞產(chǎn)生的MSC可能就心臟再生而言非最優(yōu)。BM中，MSC有骨表面來用作貼壁細胞生長的基材，然而，心臟組織中不存在等效基材。因此，就非貼壁培養(yǎng)條件下擴增MSC (NA-MSC)開發(fā)培養(yǎng)條件。CD271+細胞在特氟龍采樣袋中培養(yǎng)，所述袋使細胞貼壁最小且定期按摩該袋使細胞維持于懸浮液。如結果部分所示，MSC在袋中增殖，所述袋形成有MSC特性的細胞球，置于標準塑料瓶時形成經(jīng)典貼壁MSC樣細胞并表達⑶105。NA-MSC在合適培養(yǎng)條件下還分化成脂肪細胞和軟骨細胞?，F(xiàn)正在評價NA-MSC的成骨能力。另外，本文顯示⑶271+細胞在鼠心臟衍生基質細胞調(diào)理的培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)時能誘導表達心臟特異性基因。人類胎兒心臟組織衍生基質細胞調(diào)理的培養(yǎng)基也刺激心臟基因表達。這些數(shù)據(jù)證明CD271+細胞相較塑料粘附產(chǎn)生的MSC可具有更高分化能力，后者在相同條件下培養(yǎng)時不能表達心臟基因。人CD271+細胞的體內(nèi)潛能在誘導心肌梗塞后的免疫受損N0D/SCID小鼠中作評價。為了比較，注射用標準粘附塑料瓶分離和擴增的人MSC且對照動物組接受安慰劑注射。注射120，000個CD271+細胞導致心臟功能比注射有等同數(shù)目MSC的小鼠和對照動物有改善，其射血分數(shù)增加。注射有更高劑量MSC的動物獲得等同結果。這些數(shù)據(jù)證明CD271+細胞的潛能高于等同細胞劑量的MSC。另外，在注射有CD271+細胞的動物中檢測到人細胞內(nèi)的心臟標記物表達，但注射MSC的動物沒有檢測到，這與顯示⑶271+細胞而非MSC的心臟潛能的體外數(shù)據(jù)一致。許多組評價了數(shù)個骨髓衍生群的潛能，包括單核細胞、⑶34+細胞、⑶133+細胞和MSC。本研究中，BM衍生MSC的潛能在大型動物臨床前研究中作評價且顯示MSC能移植并毗鄰慢性梗塞疤痕且刺激顯著心肌恢復，包括梗塞大小明顯減小、逆轉受損心臟重塑、和心肌收縮性及組織灌注增加。這些臨床前研究產(chǎn)生邁阿密大學進行中的MSC臨床試驗。這些研究之一在有心肌梗塞繼發(fā)性慢性缺血性左心室功能不全的患者中進行，所述患者接受冠狀動脈搭橋術(CABG)的心臟手術。此試驗的招募受限于患者接受搭橋手術的緊急性和僅少量患者能等待產(chǎn)生自體MSC所需的5-6周。這些BM衍生⑶271+細胞代表這些患者的理想自體細胞源。CD271+細胞能在4-5小時內(nèi)分離自BM穿刺物，提供易得細胞群用于治療需要緊急手術的CABG患者。這些研究提供證據(jù)顯示BM衍生⑶271+細胞提供用于心臟修復研究的獨特細胞群。與通過塑料粘附分離的MSC相比，CD271+細胞有更高的體外心臟分化潛能且MI后治療小鼠引起心臟功能更大改善。CD271+細胞能用磁性細胞選擇迅速分離，因此可能是需要搭橋手術患者的潛在細胞源。盡管本發(fā)明就一種或多種實施加以說明和描述，本領域技術人員閱讀并理解本說明書和附圖后會了解其等效改變和修改。另外，本發(fā)明具體特征可能就數(shù)種實施中僅一種來加以公開，可以就任何或特定的應用，按需要或有利地將該特征可與其他實施的一個或多個其他特征組合。本公開的摘要 能使讀者迅速確定技術公開的性質。提交時應理解其不用于解釋或限制所列權利要求的范圍或含義。參考文獻列表(I)Lloyd-Jones D, Adams R, Carnethon M, De SG, Ferguson TB, Flegal K, FordEj Furie K，Go A，Greenlund K，Haase N，Hailpern S，Ho Mj Howard V, Kissela B，KittnerS，Lackland D，Lisabeth L，Marelli A，McDermott M，Meigs Jj Mozaffarian D，NicholG，O’Donnell C，Roger V，Rosamond Wj Sacco R，Sorlie P，Stafford R，Steinberger J，ThomTj Wasserthiel-Smoller Sj Wong Nj Wylie-Rosett J，Hong Y.Heart disease and strokestatistics—2009update:a report from the American Heart Association StatisticsCommittee and Stroke Statistics Subcommittee (《心臟病和中風統(tǒng)計一2009 年更新:美國心臟協(xié)會統(tǒng)計委員會中風統(tǒng)計小組委員會》).(: ιχιι Β οη2009:119(3):480-486.PMID:19171871(2) Fang J，Mensah GA, Croft JBj Keenan NL.Heart failure-relatedhospitalization in the U.S.，1979to2004(《1979-2004 年美國心衰相關住院情況分析》).J Am Coll Cardiol2008;52(6):428-434.PMID:18672162
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1.一種預防或治療心血管疾病或紊亂的方法，所述方法包括: 從對象骨髓分離CD271+間充質干細胞前體(MSC)； 給予患者治療有效量的經(jīng)分離CD271+間充質干細胞(MSC)前體；和 預防或治療心血管疾病或紊亂。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD271+MSC分離自有低親和性神經(jīng)生長受體的骨髓細胞(NGFR ;CD271)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD271+干細胞分離自包含以下的供體:自體、同源、同種異體或異種。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述MSC前體細胞分化成包含以下的至少一種譜系:心肌、血管或內(nèi)皮譜系。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述MSC前體細胞分化成包含以下的譜系:心肌、血管或內(nèi)皮譜系。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述心肌細胞通過包含以下的標記物鑒定:GATA-4、Nkx2.5或α -橫紋肌肌動蛋白。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述血管細胞通過包含以下的標記物鑒定:α -平滑肌肌動蛋白或SMA22。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)皮細胞通過包含以下的標記物鑒定:⑶31或波形蛋白。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，可選將一種或多種試劑給予患者，所述試劑包含至少一種:細胞因子、趨化因子、生長因子或分化因子。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病或紊亂包含:心力衰竭、動脈粥樣硬化、缺血、心肌梗塞、移植、高血壓、再狹窄、心絞痛、風濕性心臟病、或先天性心血管缺陷。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述前體間充質干細胞可選以不同濃度在一段時間內(nèi)給予患者。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述前體間充質干細胞體內(nèi)移植到心臟的梗塞和邊界區(qū)。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述前體間充質干細胞可選用心臟衍生基質細胞調(diào)整的培養(yǎng)基調(diào)理。
14.如權利要求1所述 的方法，其特征在于，所述前體間充質干細胞可選離體培養(yǎng)且將非貼壁前體間充質干細胞(NA-MSC)分離、擴增并給予患者。
全文摘要
分離CD271+干細胞群的方法對預防或治療心血管疾病和修復心臟組織很重要。所述方法可應用于來自不同來源的干細胞且能用于治療或預防疾病或者修復生物體其他地方的組織。
文檔編號A61K35/12GK103221058SQ201180051933
公開日2013年7月24日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權日2010年8月27日
發(fā)明者J·M·黑爾, I·K·麥克尼斯 申請人:邁阿密大學