專利名稱：探測(cè)活性氧的修飾的氫菁染料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于探測(cè)活性氧(reactive oxygen species, R0S)的探針,特別是涉及還原的菁染料探針(cyanine dye probes),以及這樣的探針在體外或體內(nèi)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氧化應(yīng)激源于活性氧(ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞清除這樣的自由基的能力之間的不平衡。氧化應(yīng)激可有許多不同的通路引起，內(nèi)在或外在的，或者由線粒體呼吸或者由膜-結(jié)合的NADPH氧化酶介導(dǎo)。ROS在多種疾病，包括，但不限于炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、衰老和年齡相關(guān)性退行性紊亂的進(jìn)程中起重要作用?？商綔y(cè)血清樣品、活組織外植體、細(xì)胞培養(yǎng)物中和體內(nèi)的ROS的探針具有醫(yī)學(xué)診斷和診斷以ROS產(chǎn)生增加為特征的疾病的研究工具的潛在用途(1-6)。成像術(shù)使與在小細(xì)胞中的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡相關(guān)的不同參數(shù)的多重分析、定位和定量成為可能。因此， 通過(guò)常規(guī)熒光顯微鏡術(shù)、熒光分光術(shù)、流式細(xì)胞儀和/或高容量成像法的ROS的探測(cè)相對(duì)于其他技術(shù)可能具有優(yōu)勢(shì)。超氧化物和羥基，諸如二氫乙啶(dihydroethydium) (DHE)的熒光傳感器已經(jīng)被用作ROS探針。然而，由于其自發(fā)性自動(dòng)-氧化、快速光漂白、高度毒性和與ROS的多種反應(yīng)產(chǎn)物，DHE已經(jīng)限制應(yīng)用(7-8)。更有甚者，DHE的較低的發(fā)射波長(zhǎng)使得其在體內(nèi)的應(yīng)用成為問(wèn)題。二氫羅丹明(Dihydrorhodamine) (DHR),已經(jīng)被研究用于ROS的探測(cè)的另一種還原性染料(9),遭受高氧化率，由此限制其應(yīng)用。迄今為止，所開(kāi)發(fā)的作為基于Cy3/Cy5/Cy7 (10-11)的ROS的探針的菁染料，不同程度地遭受溶解度問(wèn)題和/或自動(dòng)-氧化作用?；撬狨?基染料也已經(jīng)被研究用作ROS探針(12-13)。這些探針，典型地需要費(fèi)時(shí)并且昂貴的多步合成程序，經(jīng)歷快速水解，由此限制其應(yīng)用。因此，存在對(duì)探測(cè)ROS的探針的需求，使在體外或體內(nèi)使用經(jīng)得起檢驗(yàn)，而不遭受在先技術(shù)ROS探針的局限，特別是，它們傾向經(jīng)歷由氧和/或光催化的自發(fā)性自動(dòng)-氧化，同時(shí)伴隨高水平的背景熒光的產(chǎn)生(14-15)。發(fā)明簡(jiǎn)述
本文描述的是通過(guò)常規(guī)熒光顯微鏡術(shù)、熒光分光術(shù)、流式細(xì)胞儀和/或高容量成像法探測(cè)活性氧(ROS)的化合物、組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明化合物是新的還原性染料，包括 Cy-基氫菁染料(hydrocyanine dyes)和 Cy-基氣菁染料(deuterocyanine dyes),所述染料是在體外或體內(nèi)探測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和檢測(cè)氧化應(yīng)激的探針。這些探針在與其他活細(xì)胞染料，諸如，例如綠色熒光蛋白(GFP)的多重應(yīng)用中是有用的，使得它們用于檢測(cè)細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的多種生物標(biāo)記和可被用于評(píng)價(jià)由各自不同的試劑，包括，但不限于脂多糖、甲萘醌、血管緊張素I1、奈法唑酮(nefazodone)、伊屋諾霉素(ionomycin)和谷氨酸鹽在多種或細(xì)胞模型中所產(chǎn)生的ROS。本文公開(kāi)的還原性染料，一般具膜通透性并因此可在細(xì)胞中聚集，與相應(yīng)的氧化性染料相比，表現(xiàn)出少量或無(wú)熒光性。當(dāng)與本文公開(kāi)的還原性染料細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，即ROS的探測(cè)時(shí)，還原性染料由此被氧化，得到在暴露足量波長(zhǎng)的光下具實(shí)質(zhì)性熒光強(qiáng)度的染料。本文公開(kāi)的還原性染料與例如，線粒體膜電位、質(zhì)膜滲透性和/或胱天蛋白酶(caspase)激活的探針組合時(shí)，也可被用于區(qū)分肝毒性化合物與無(wú)毒性化合物。本文也描述了制備用于本發(fā)明公開(kāi)的組合物、方法和試劑盒中的新的還原性染料，即ROS探針的方法。—個(gè)實(shí)施方案提供具有結(jié)構(gòu)式(I)的、新的還原性染料化合物(即ROS探針):..../ / \ \
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式(I)的還原性染料化合物:
2.依據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中的化合物具有結(jié)構(gòu)式(III):
3.依據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中的化合物具有結(jié)構(gòu)式(IV):
4.依據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中的化合物具有結(jié)構(gòu)式(V):
5.依據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中的化合物具有結(jié)構(gòu)式(VI):
6.依據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中R3、R4、R13和R14獨(dú)立地為C1-C22烷基。
7.依據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中R2和R12獨(dú)立地為甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基、丙氧基擬基燒基、乙稀氧基擬基燒基、稀丙氧基擬基燒基、甲氧基擬基鏈稀基、乙氧基擬基鏈烯基或丙氧基羰基鏈烯基。
8.一種選自以下的還原性染料化合物: 1- (4-乙氧基-4-氧代丁基)-2，3，3-三甲基-1吲哚爾溴化物； 1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-((W，W, AE) -5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)_3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)戊-1, 3- 二烯基-3，3- 二甲基-W-吲哚働溴化物； 1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)_3，3- 二甲基-2- ({IE, ,E, 5E) -5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)戊-1，3- 二烯基)吲哚啉； 1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2-氘-3，3-二甲基-2-((1^，3萬(wàn)，5萬(wàn))-5-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)_3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)戊-1，3- 二烯基)吲哚啉； 1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-2- ({IE, W、-3-(1-4-乙氧基-4-氧代丁基)_3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)丙-1-烯基)_3，3- 二甲基-W-吲哚鐵溴化物； 1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)_3，3- 二甲基-2- ({XE, W) -3-(1-(4-乙氧基-4-氧代丁基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)丙-1-烯基)吲哚啉； 1-(3-羧基丙基)_2，3，3-三甲基-M-吲哚-1-爾溴化物；1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2，3，3-三甲基-M-吲哚-1-鐵溴化物； 1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-2-((1^ 3幻-3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)丙-1-烯-1-基)_3，3- 二甲基-M-吲哚-1-霞溴化物； 4- ((β) -2- ((β) -3-(1-(4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基)-3，3- 二甲基吲哚啉_2_基)烯丙叉)-3，3-二甲基吲哚啉-1-基)丁酸烯丙酯； {E)-1-(4-乙氧基-4-氧代丁 -2-烯-1-基)-2，3，3-三甲基-W-吲哚-1-儀溴化物；1-((.E) -4-乙氧基-4-氧代丁 -2-烯-1-基)-2-({IE, ,E) -3-(1-((β) ~4~ 乙氧基-4-氧代丁 -2-烯-1-基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)丙-1-烯-1-基)_3，3- 二甲基-W-吲哚-1-雜溴化物; (.Ε) -4- ((B) -2- ({E) -3-(1-({E) -4-乙氧基-4-氧代丁 -2-烯-1-基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-基)烯丙叉)-3，3- 二甲基吲哚啉-1-基)丁 -2-烯酸乙酯； 1-({E) -4-乙氧基-4-氧代丁 -2-烯-1-基)-2- ({IE, W, 5￡) -5-(1-((￡) ~4~ 乙氧基-4-氧代丁 -2-烯-1-基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)戊-1，3- 二烯-1-基)-3，3- 二甲基-3/F吲哚-1-爾溴化物；{E) -4- ({E) -2- ({2E, AE) -5-(1-({E) ~4~ 乙氧基-4-氧代丁 _2_ 烯-1-基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-基)戊-2，4-二烯-1-亞基)-3，3-二甲基吲哚啉-1-基)丁-2-烯酸乙酯；1-(11-乙氧基-11-氧代i^一烷基)_2，3，3-三甲基-M-吲哚-1-鋪溴化物； 1-(11-乙氧基-11-氧代十一燒基)~2~ ((IE, >E) -3-(1-(11-乙氧基-1 1-氧代十一燒基)-3，3- 二甲基吲哚啉-2-亞基)丙-1-烯-1-基)-3，3- 二甲基-W-吲哚-1-雜；和 I1-(2-((1^,3^)-3-(3,3- 二甲基-1-(11-氧代十三烷基)吲哚啉_2_亞基)丙-1-烯-1-基)-3，3- 二甲基吲哚啉-1-基)十一酸乙酯。
9.一種探測(cè)氧自由基(ROS)的組合物，該組合物包括: a)一個(gè)或多個(gè)還原性染料；和 b)載體， 其中所述還原性染料是依據(jù)權(quán)利要求1的化合物并且以當(dāng)與ROS反應(yīng)時(shí)有效探測(cè)ROS的存在的量存在。
10.依據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中的組合物適于體外應(yīng)用。
11.依據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中的組合物適于體內(nèi)應(yīng)用。
12.—種探測(cè)樣品中的活性氧(ROS)的方法，該方法包括以下步驟: a)使樣品與有效量的一個(gè)或多個(gè)依據(jù)權(quán)利要求1的還原性染料化合物接觸；和 b)測(cè)定還原性染料化合物是否已經(jīng)被氧化。
13.—種探測(cè)樣品中活性氧(ROS)的方法，該方法包括以下步驟: a)使樣品與有效量的依據(jù)權(quán)利要求9的組合物接觸；和 b)測(cè)定還原性染料化合物是否已經(jīng)被氧化。
14.依據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的樣品包括細(xì)胞、組織、生物液或其組合。
15.依據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)熒光分光術(shù)探測(cè)還原性染料化合物的氧化。
16.依據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)熒光顯微鏡探測(cè)還原性染料化合物的氧化。
17.依據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中通過(guò)共焦激光掃描熒光顯微鏡探測(cè)還原性染料化合物的氧化。
18.依據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中通過(guò)全內(nèi)反射熒光顯微鏡探測(cè)還原性染料化合物的氧化。
19.依據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中活性氧(ROS)的探測(cè)被用于診斷選自以下的疾病或紊亂:頸動(dòng)脈損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、癌癥、以炎癥為特征的疾病和紊亂、輻射誘發(fā)的晚期正常組織的損傷；由于化療引起的組織損傷、缺血或移植后再灌注；糖尿病，諸如I型糖尿病(TID)、神經(jīng)退行性疾病，諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)和亨廷頓氏舞蹈病；腦血管疾病、囊性纖維化、慢性腎病、心血管疾病、先兆子癇、眼科疾病，及其組合。
20.一種探測(cè)樣品中活性氧(ROS)的試劑盒，該試劑盒包括: a)一個(gè)或多個(gè)依據(jù)權(quán)利要求1的還原性染料化合物；和 b)一 個(gè)或多個(gè)容器。
21.一種探測(cè)樣品中活性氧(ROS)的試劑盒，該試劑盒包括: a)依據(jù)權(quán)利要求9的組合物；和b) 一個(gè)或多個(gè)容器。
22.依據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中的試劑盒還包括進(jìn)行探測(cè)一個(gè)或多個(gè)活性氧(ROS)的測(cè)定的說(shuō)明書(shū)。
23.依據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，其中的測(cè)定在體內(nèi)或體外進(jìn)行。
24.一項(xiàng)制備結(jié)構(gòu)式(I)還原性染料化合物的方法，
25.依據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中X是CR3R4,Z是CR13R14, R24是H和η是I或2。
26.依據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中R3、R4、R13和R14獨(dú)立地為C1-C22烷基。
27.依據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中R2和R12獨(dú)立地為甲氧基羰基烷基、乙氧基羰基烷基或丙氧基擬基燒基。
28.依據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中R2和R12各自為乙氧基羰基烷基。
29.—種結(jié)構(gòu)式(I)的還原性染料化合物:
30.依據(jù)權(quán)利要求29的化合物，其中該化合物具有結(jié)構(gòu)式(VI):
31.依據(jù)權(quán)利要求30的化合物，其中R3、R4、R13和R14獨(dú)立地為C1-C22烷基。
32.依據(jù)權(quán)利要求31的化合物，其中R2和R12獨(dú)立地為C1-C22烷基。
33.依據(jù)權(quán)利要求32的化合物，其中的還原性染料化合物是1-(4-(氯代甲基)芐基)-4-((I萬(wàn)，3Z, 5萬(wàn))-1-(1, 3，3-三甲基吲哚啉-2-基)_5_(1，3，3-三甲基吲哚啉-2-亞基)戊_1, 3- 二烯-3-基)批唳-1-鋪氯化物。
全文摘要
本發(fā)明描述的是通過(guò)常規(guī)熒光顯微鏡術(shù)、熒光分光術(shù)、流式細(xì)胞儀和/或高容量成像法探測(cè)活性氧(ROS)的化合物、組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明公開(kāi)的化合物是新的還原性染料，包括Cy-基氫菁染料和Cy-基氘菁染料，所述染料是體外和/或體內(nèi)探測(cè)ROS和檢測(cè)氧化應(yīng)激的探針。本發(fā)明也描述制備用于公開(kāi)的組合物、方法和試劑盒中的新的還原性染料，即ROS探針的方法。
文檔編號(hào)A61K8/41GK103209737SQ201180052780
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者姜熙喆, K.吉, B.曼達(dá)維利, L-Q.贏, B.布蘭肖 申請(qǐng)人:生命科技公司