專利名稱：肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有ACE-抑制特性的肽、其變異體、包含其的組合物及其用途，特別是醫(yī)學(xué)用途例如治療高血壓的用途。
背景技術(shù)：
高血壓是中風(fēng)、心臟病發(fā)作、心力衰竭和動脈瘤的風(fēng)險因素之一，并且是慢性腎衰竭的主要原因。即使中等水平的動脈血壓升高都會導(dǎo)致預(yù)期壽命縮短。高血壓可通過靶向于血管緊張素1-轉(zhuǎn)化酶(ACE)而被治療。ACE是一種參與到身體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的酶。它是一種外肽酶，可以將十肽的血管緊張素I催化轉(zhuǎn)化成八肽的血管緊張素II。血管緊張素II引起血管收縮，導(dǎo)致血壓升高。它也刺激醛固酮從腎上腺皮質(zhì)處釋放。醛固酮促進(jìn)了腎臟中末梢腎單位的鈉潴留，這也導(dǎo)致了血壓的上升。ACE抑制劑被用于在患有高血壓或糖尿病的人中控制血壓、治療心力衰竭、預(yù)防中風(fēng)以及預(yù)防腎損傷等。它們同樣可以提高心臟病發(fā)作后的生存率。常用的ACE抑制劑包括貝那普利(洛汀新)、卡托普利(開搏通)、依那普利(Vasotec)、福辛普利(蒙諾)、賴諾普利(Prinivil,捷賜瑞)、莫西普利(Univasc)、培哚普利(Aceon)、喹那普利(Accupril)、雷米普利(Altace)和群多普利(Mavik)。這些藥物通常具有不希望的副作用和/或它們的藥效不足，因此對于其他ACE抑制劑仍有需要。許多不同的肽均被發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制活性(Vercruysse等，September2005, Journal of Agricultural and Food Chemistry A-J),并且對其他具有 ACE 抑制活性的肽仍有需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)鑒定出一種肽具有特別良好的ACE抑制活性。所述肽具有序列FSY,其中F表不苯丙氨酸，也可以表不為Phe, S表不絲氨酸,也可以表不為Ser,以及Y表示酪氨酸，也可以表示為Tyr。因此，本發(fā)明的一個方面提供了一種肽，包括SEQ IDNO:1 (FSY)或由 SEQ ID NO:1 (FSY)組成。本發(fā)明的發(fā)明人也對上述肽的一種具有序列FTY的變異體進(jìn)行了測定，所述變異體也具有特別良好的ACE抑制活性。T表示蘇氨酸，也可以表示為Thr。因此，本發(fā)明在另方面提供了一種肽，包括SEQ ID NO: 2 (FTY)或由SEQ ID NO: 2 (FTY)組成。在本說明書中“FSY/FTY”用于表示肽可以具有序列FSY或FTY。所述肽可以包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40 或 50 個氨基酸，以及優(yōu)選不多于 50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5 或 4 個氨基酸，例如 3-25、3-15、3-10、3-8、3-7、3-6、3-5 或 3-4 個氨基酸，優(yōu)選由 4、5、6、7、8、9、10、
12、14、16、18 或20個氨基酸組成，最優(yōu)選由3個氨基酸組成?！坝啥鄠€氨基酸組成”指的是所含有的氨基酸的個數(shù)不超過所列舉的數(shù)字，但這一表達(dá)并不排除所述肽包括其他非肽部分的可能性。例如，如下文中所討論的，所述肽可以被磷酸化或可包括C-末端帽。因此，所述肽具有核心氨基酸序列FSY或FTY。在本說明書中使用的術(shù)語“核心氨基酸序列”指的是一段氨基酸序列，所述氨基酸序列可以起始于肽的N-末端，可以是肽的內(nèi)部序列，可以在肽的C-末端終止，或者可以起始于肽的N-末端并終止于肽的C-末端。核心序列的N-和/或C-末端側(cè)的氨基酸被稱之為“側(cè)翼”氨基酸。所述FSY/FTY肽可以是重組體，即其可以從宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中的異源性基因中表達(dá)并從中純化出來。它可以從非重組體源獲得，例如從天然生成該種肽的動物或植物樣品中分離出來。它可以通過酶學(xué)或化學(xué)分解(例如水解)包含F(xiàn)SY/FTY序列的蛋白質(zhì)而獲得。肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如固相合成，可被用于合成該種肽，F(xiàn)moc或Boc固相合成是優(yōu)選的。本發(fā)明因此還提供了一種生產(chǎn)分離的FSY/FTY肽的方法。所述方法可以包括上述的任何方法。優(yōu)選地，所述方法包括將蛋白質(zhì)的組合物水解生成水解產(chǎn)物并且將FSY/FTY肽從水解產(chǎn)物中分離的步驟。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)包含F(xiàn)SY/FTY肽的組合物的方法，所述方法包括水解含F(xiàn)SY/FTY基序的蛋白質(zhì)以生成包含F(xiàn)SY/FTY肽的組合物。除非另外聲明，在本說明書中提及的任何生產(chǎn)方法均可以在純蛋白質(zhì)或在蛋白質(zhì)的混合物上進(jìn)行。蛋白質(zhì)的混合物可以例如為包括蝦(優(yōu)選北極甜蝦(Pandalusborealis))的頭、尾和/或殼的奸處理廢物。可選地，所述肽可以包括FSY/FTY氨基酸序列的1、2或3個保守替換，優(yōu)選不多于I個保守替換。Ser為極性中性氨基酸，因此用Cys、Met、Thr、Asn或Gln替換Ser表示保守替換。Phe和Tyr為芳香族氨基酸，因此它們每個均可獨立地被Phe、Trp或Tyr替換。因此，也包括具有選自FTY、YSY、Y SF、FCY、FMY、FNY等等的核心序列的肽?？蛇x地，所述肽可以在核心和/或側(cè)翼序列中包括非基因編碼的氨基酸，雖然優(yōu)選地所述核心序列不包括任何非基因編碼的氨基酸?！胺腔蚓幋a的氨基酸”指的是側(cè)鏈與20個基因編碼的氨基酸不相同的氨基酸。因此，在本說明書中使用的該術(shù)語指的是該側(cè)鏈，且在本說明書中并不用于區(qū)分L和D氨基酸。非基因氨基酸的例子包括3-碘-L-酪氨酸、疊氮基丙氨酸、疊氮基高丙氨酸和正亮氨酸。眾所周知，肽的穩(wěn)定性可以通過所謂的封端，即N-和C-末端氨基酸的化學(xué)修飾而得以改善。典型的封端包括C-末端的酰胺化和N-末端的乙?；蛎摪被?。因此，在一些實施方案中，本說明書中公開的肽具有經(jīng)修飾的C-末端和/或經(jīng)修飾的N-末端，優(yōu)選為酰胺化的C-末端和/或乙?；幕蛎摪被腘-末端。L-構(gòu)型為優(yōu)選的，因此優(yōu)選地，所述肽的所有的氨基酸均為L-構(gòu)型，但所述肽可以包括一個或多個D-構(gòu)型的氨基酸?？蛇x地，多于一半或所有的氨基酸為D-構(gòu)型。可選地，所述核心序列僅包括L-氨基酸，而側(cè)翼序列包括一個或多個D-氨基酸，或反之亦然?？蛇x地，所述核心和/或側(cè)翼序列的一個或多個氨基酸可以被糖基化?？蛇x地，所述核心和/或側(cè)翼序列的一個或多個氨基酸可以被磷酸化。組成所述肽的氨基酸代表性地將通過肽鍵，優(yōu)選α -肽鍵連接。這些是一種酰胺鍵。然而，一個或多個氨基酸可以通過非肽鍵連接。優(yōu)選地，所述肽為直鏈，但其可選地為環(huán)形或支鏈。
在本說明書中為方便而使用的術(shù)語“FSY/FTY肽”指的是上文中限定的肽，即由序列FSY/FTY組成或包括序列FSY/FTY的肽，其可選地包括在本說明書中談?wù)摰降囊环N或多種修飾。FSY肽具有ACE抑制活性。如在實施例1中示出的，發(fā)明人提供的FSY肽對于ACE抑制方面的IC5tl大約為4μ M (多次測量的平均值)。采用Dragnes等的方法進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)測量顯示，對于ACE抑制方面的IC5tl大約為2.2 μ M。Vermeirssen的方法測量的對于ACE抑制方面的IC5tl大約為7.7μΜ。FTY肽也具有ACE抑制活性。如在實施例2中示出的，發(fā)明人提供的FTY肽對于ACE抑制方面的IC5tl大約為59 μ M (采用Dragnes等的方法)。Vermeirssen的方法測量的對于ACE抑制方面的IC5tl大約為274 μ M0因此，對于ACE抑制方面，所述肽的IC5tl優(yōu)選少于400、300、200、190、180、170、100、80、60、40、30 或 20μΜ，最優(yōu)選少于 18、16、14、12、10、8、7、6、5、4、3 或 2 μ Μ，例如大約 4 μ Μ，優(yōu)選大約3、2、1.7或I μ Μ。例如，所述肽的IC5tl可以為大約1-20、1-10、1-6、1-4或1_2 μ Μ。ACE-抑制具有如下文所討論的多種治療應(yīng)用。在本說明書中包括的所有治療應(yīng)用中，F(xiàn)SY/FTY均抑制ACE活性。FSY/FTY肽因此可被用于治療以ACE活性異常為特征的任何狀況。“異常的” ACE活性指的是ACE活性太高，即高于健康受試者中的ACE活性。這些狀況的例子為高血壓前期和高血壓。或者認(rèn)為，F(xiàn)SY/FTY肽可被用于治療任何能夠受益于ACE抑制的患者，例如患有高血壓前期或高血壓，或者處在發(fā)展出高血壓前期或高血壓風(fēng)險下的患者。應(yīng)該理解，在本說明書中公開的治療應(yīng)用中，F(xiàn)SY/FTY肽以ACE-抑制有效量使用。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含F(xiàn)SY/FTY肽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種FSY/FTY肽用于治療，優(yōu)選用于降低血壓和/或預(yù)防或減少高血壓前期或高血壓的發(fā)展或`演進(jìn)。本發(fā)明還提供了一種用于抑制ACE活性的方法，包括向有需要的患者施用ACE抑制有效量的在本說明書中公開的FSY/FTY肽。本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防高血壓前期或高血壓的發(fā)展或演進(jìn)的方法，包括向有需要的患者施用藥學(xué)有效量的在本說明書中公開的FSY/FTY肽?？梢圆捎靡阎姆椒?，例如基于由Cushman和Cheung(1971)的方法，通過測量ACE(Sigma A6778)和底物HHL(Sigma H1635)之間的酶促反應(yīng)的終產(chǎn)物馬尿酸(HA)而對 ACE 抑制活性進(jìn)行檢測(CUSHMAN, D.ff.&CHEUNG, H.S.(1971).Concentrations ofAngiotensin-Converting Enzyme in Tissues of Rat.Biochimica Et BiophysicaActa250(I)，261-265和 Dragnes 等.J Food Composition and Analysis2009;22:714-17) Vermeirssen 等(2002), J.Biochem Biophys.Methods51 (2002),第 75-87 頁中公開了一種不同的合適的檢測方法，所述內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合至本說明書。簡要地說，這是一種光譜光度測量方法，其中采用底物呋喃丙烯?；?Phe-Gly-Gly和兔肺丙酮提取物作為ACE源對ACE抑制情況進(jìn)行測量?？梢詼y量IC5(I。IC50被定義為將活性抑制50%的濃度。在體內(nèi)抑制ACE通常會有抗高血壓的效果，因此FSY肽的體內(nèi)作用可通過使用自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)進(jìn)行檢測。SHR是一種被廣泛認(rèn)可的用于高血壓的動物模型，合適的品系被商業(yè)繁殖。SHR在年輕時血壓正常，但隨著它們變老，它們會發(fā)展出自發(fā)且持久的高血壓，特別是收縮壓超過150mmHg。可以在這些大鼠中檢測FSY/FTY肽抑制高血壓的能力。這種抑制可以是完全的，即防止了任何高血壓的發(fā)展，或者是部分的，即，使得經(jīng)FSY/FTY肽處理過的大鼠與未經(jīng)處理的大鼠相比高血壓不那么嚴(yán)重。FSY/FTY肽的體內(nèi)抗高血壓效果也可在其他動物，例如使用患有高血壓的受驗物中進(jìn)行檢測，或者通過測試FSY/FTY肽對抵消一種或多種血壓升高試劑的高血壓作用的能力來進(jìn)行檢測。血壓通常以“毫米汞柱”(mmHg)度量，并以收縮壓和舒張壓的形式表示。收縮壓是動脈的峰值壓力，其發(fā)生在心動周期的近末端，此時心室正在收縮。舒張壓是動脈的最小壓力，其發(fā)生在心動周期的近開始期，此時心室中充滿血液。對于靜止、健康的成人來說，正常的測量值的例子為90-120mmHg收縮壓以及60-80mmHg舒張壓，例如IlOmmHg收縮壓和70mmHg 舒張壓(寫作 110/70mmHg)。對于人類，“高血壓”通常被定義為基本上每次測量時均為140/90mmHg或更高的血壓。即，其“持續(xù)”為140/90mmHg或更高。然而，“高血壓”也包括高的收縮壓結(jié)合正常的舒張壓，或高的舒張壓結(jié)合正常的收縮壓。因此，本說明書中使用的“高血壓”或“高血壓癥”指的是收縮壓為HOmmHg或更高和/或舒張壓為90mmHg或更高。因此患有高血壓癥的患者可以具有的收縮壓至少為140、145、150、155、160、165或170mmHg和/或舒張壓至少為90、95、100、105、110、115 或 120mmHg。血壓在120/80和139/89之間的在本說明書中被稱為“高血壓前期”,這表示人類受試者發(fā)生高血壓的風(fēng)險增加。其他動物的正常或高血壓的值在本領(lǐng)域中是已知的。FSY/FTY肽或含有FSY/FTY肽的組合物可被用于治療或預(yù)防高血壓前期或高血壓。因此，其對于治療或預(yù)防·選自如下的紊亂可能是特別有用的:冠狀動脈病(CAD)或冠心病(CHD)，如心絞痛、高血壓癥、動脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗死、腦梗死和血管成形術(shù)后再狹窄、心律失常、快速心律失常、充血性心力衰竭(CHF)、主動脈瓣反流；血脂異常；異常脂蛋白血癥；與糖尿病有關(guān)的血管疾病，如糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、微白蛋白病(microalbumia)和糖尿病視網(wǎng)膜病；腎臟病，特別是急性和慢性腎衰竭。如上所述，在所有這些治療應(yīng)用中，F(xiàn)SY/FTY肽被用于抑制ACE活性。FSY/FTY肽在施用至少1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或28天，優(yōu)選在大約7天后優(yōu)選能夠降低收縮壓和/或舒張壓至少大約1、2、3或4mmHg,更優(yōu)選至少大約5、6、7或8mmHg,優(yōu)選至少大約 9、10、11、12、13、14 或 15mmHg,例如大約 1-20、2-15、3_10 或 5-1OmmHgo在一些實施方案中，F(xiàn)SY/FTY肽抑制了收縮壓和/或舒張壓使其不再增加。這種抑制可以是完全的，使得收縮壓和/或舒張壓保持穩(wěn)定，或者可以是部分的，減慢了收縮壓和/或舒張壓的任何增加。這種抑制可例如通過將在施用FSY/FTY肽之前的一段時期中收縮壓和/或舒張壓的任何變化與在施用FSY/FTY肽期間內(nèi)的變化進(jìn)行比較而評定。也可通過將接受FSY/FTY肽的受試者與接受安慰劑或未接受治療的對照受試者的收縮壓和/或舒張壓的任何變化進(jìn)行比較而評定。任何哺乳動物都可應(yīng)用，例如人類和任何家畜、家養(yǎng)或?qū)嶒瀯游?。具體實例包括小鼠、大鼠、豬、貓、狗、綿羊、兔、母牛和猴。然而，優(yōu)選的，哺乳動物為人。本說明書使用的術(shù)語“治療”或“處理”包括預(yù)防性治療，其可以防止疾病的發(fā)生，以及對已經(jīng)發(fā)生的紊亂的治療處理。術(shù)語“治療”和“處理”包括與疾病斗爭或治療疾病，但同樣包括控制、減少或緩和疾病或一種到多種與此有關(guān)的癥狀。在本說明書中使用的“有效量”可以指根據(jù)治療特性的治療有效量或預(yù)防有效量。治療有效量可被認(rèn)為是(以合適的劑量和給藥方案)實現(xiàn)所希望的治療結(jié)果所必需的量。預(yù)防有效量可被認(rèn)為是(以合適的劑量和給藥方案)實現(xiàn)所希望的預(yù)防疾病的結(jié)果所必需的量?？梢愿鶕?jù)患者的體重、年齡和性別以及疾病的嚴(yán)重程度而變化所述量。有利地，以ACE抑制有效量使用FSY/FTY肽，其優(yōu)選對在本說明書中列出的任何狀況的預(yù)防和/或治療處理是有效的。在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含F(xiàn)SY/FTY肽和可選地其他成分的營養(yǎng)制品組合物。本說明書中使用的術(shù)語“營養(yǎng)制品”表示除營養(yǎng)作用外還可提供保健作用的產(chǎn)品。本發(fā)明的營養(yǎng)制品具有ACE抑制活性。因此，所述營養(yǎng)制品可以優(yōu)選地降低血壓和/或預(yù)防或減少高血壓的發(fā)展或演進(jìn)?？蛇x地或另外地，它可以刺激免疫反應(yīng)和/或刺激生長，特別是在作為動物飼料施用到動物時。所述營養(yǎng)制品組合物可被配制成補充劑，例如其可以為固體制劑如膠囊、片劑或粉末，或者為液體制劑，例如溶液或懸浮液。它也可通過結(jié)合或加入一種或多種其他可食用的物質(zhì)而被配制成人的食物，或是非人的動物的飼料。所述可食用的物質(zhì)可以是液體或固體?？杀慌渲瞥砂景l(fā)明的肽或營養(yǎng)制品組合物的食品包括但不局限于速溶粉末產(chǎn)品、壓成塊的加工食品例如糖塊或蛋白質(zhì)棒、肉和人造肉制品、魚和人造魚制品、早餐谷物、植物油脂食物、蛋黃醬、乳制品、大豆乳制品、意式面食、面條、焙烤食品例如面包、點心、蛋糕和餅干、即食餐點、嬰兒配方奶粉和嬰兒食品。乳制品的合適的例子包括黃油、乳酪、冰淇淋、酸乳酪、鮮奶油、酸奶油和白軟干酪。肉制品的例子包括但不局限于經(jīng) 加工的肉例如動物肝醬、火腿、罐頭肉、香腸和全肌肉。人造肉可以是在結(jié)構(gòu)上類似于肉類的組織化的植物、真菌或乳制品蛋白，例如闊恩或豆腐?？杀慌渲茷榘ū景l(fā)明的肽或營養(yǎng)制品組合物的蛋白強化的液體飲料的非限制性例子包括碳酸強化的軟飲料、啤酒、果汁、水果調(diào)味飲料、蔬菜飲料、運動飲料、豆奶飲料、米粥飲料、嬰兒配方奶粉、牛奶、經(jīng)調(diào)味的牛奶飲料、山羊奶、液態(tài)酸奶、酪乳或其組合。可被配制為包括本發(fā)明的肽或營養(yǎng)制品組合物的飼料可以是任何動物飼料，包括寵物食品。飼料可以是干燥或潮濕的形式。除FSY/FTY肽之外，食物、飼料或營養(yǎng)制品組合物的典型組分可以包括粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、碳水化合物、多糖、淀粉、粗纖維、灰燼、礦物質(zhì)、微量元素、維生素、脂肪酸、蛋白質(zhì)、肽(除FSY/FTY肽外)、氨基酸、草藥、脂質(zhì)、抗氧化劑、類葫蘿卜素、生育酚、生育三烯酚類、植物甾醇、多酚、生物類黃酮和/或飲食纖維。因此，這些是可被用于制備營養(yǎng)制品組合物的合適的可食用物質(zhì)的所有例子。動物飼料，以及大多數(shù)食物，通常會包括一種或多種選自如下的組分:含碳水化合物的物質(zhì)、含蛋白質(zhì)的物質(zhì)以及含脂質(zhì)的物質(zhì)，因此本發(fā)明的飼料可以包括一種或多種這些組分，優(yōu)選地包括所有這些組分的組合。合適的含淀粉飼料/食物組分可以例如源自谷物，例如選自玉米、大豆、小麥、高梁、大麥、燕麥及其混合物。合適的含淀粉物質(zhì)的例子包括但不局限于玉米粉、碾碎的玉米、大豆粉、小麥面粉、碾碎的燕麥粉、次粉、豆柏、玉米渣及其混合物?？梢允褂煤值鞍踪|(zhì)的物質(zhì)，例如魚粉、干燥乳清粉、豆柏及其混合物。其他合適的含蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括但不局限于大豆蛋白濃縮物、大豆粉、血粉、血漿蛋白、脫脂乳粉、乳清蛋白濃縮物、油菜籽柏、玉米面筋粉、小麥面筋粉、酵母、葵子餅粉及其混合物。合適的含脂肪物質(zhì)包括但不局限于豬油、牛脂、豆油、卵磷脂、椰子油、乳清-脂肪混合物及其混合物。本發(fā)明的FSY/FTY肽也可被配制成用于微生物的培養(yǎng)基或添加物。本發(fā)明的營養(yǎng)制品組合物可以包括足以給受試者施用合適(即有效)劑量的FSY/FTY肽的量的FSY/FTY肽，合適的劑量在上文中藥物組合物部分已經(jīng)談及過。本發(fā)明的營養(yǎng)制品組合物可以作為食物或?qū)θ魏蝿游?包括陸生和水生動物)的飼料而提供。所述動物可以為哺乳動物、魚、鳥、脊椎動物或無脊椎動物，例如海鮮、家畜、寵物和人。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備包含F(xiàn)SY/FTY肽的營養(yǎng)制品組合物的方法。所述方法可以包括將FSY/FTY肽與可食用的物質(zhì)結(jié)合。合適的可食用的物質(zhì)在上文中談及過。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備由FSY/FTY肽強化的食物、飲料或飼料的方法。所述方法可以包括將FSY/FTY肽與可食用的物質(zhì)結(jié)合或?qū)SY/FTY肽加入到食物、飲料或飼料中。合適的食物、飲料和飼料在上文中談及過。

在另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼在本說明書中公開的FSY/FTY肽的核酸分子。本發(fā)明還提供了這種核酸分子的補體(complement)。優(yōu)選地，所述核酸分子包括可操作地連接至編碼在本說明書中公開的肽的序列上的啟動子序列和/或轉(zhuǎn)錄起始位點和/或可操作地連接至編碼在本說明書中公開的肽的序列上的轉(zhuǎn)錄或翻譯終止序列。本發(fā)明的核酸分子包括至少9個核苷酸以及優(yōu)選地不多于800個核苷酸，更優(yōu)選不多于 500、400、300、200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20 或 15 個核苷酸。核酸分子優(yōu)選為分離的分子。它可以為單鏈分子，或為包含編碼FSY/FTY肽及其補體的核酸鏈的雙鏈分子。轉(zhuǎn)錄的起始密碼子通?？偸潜环g成甲硫氨酸(Met，Μ),因此核酸通常會編碼從甲硫氨酸開始的肽。因此，它可以編碼由序列MFSY或MFTY組成的肽，而包含這些序列或由這些序列組成的肽是本發(fā)明的其它方面。優(yōu)選地，起始的甲硫氨酸屬于可分解的信號序列的一部分，使得肽可以分解以釋放由序列FSY或FTY組成的肽。另一個方面涉及包含在本說明書中限定的核酸分子的載體。所述載體也可包括通常會在載體上發(fā)現(xiàn)的其他元件，例如復(fù)制起點，可選擇的標(biāo)記物例如抗生素耐性標(biāo)記物，和/或多克隆位點。所述載體可進(jìn)一步為表達(dá)載體，并且可以包括其他元件，例如用于核酸分子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制或調(diào)控元件。這些控制元件，例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、增強子、終止子等等均是本領(lǐng)域公知的且被充分描述過的。載體可以例如為質(zhì)粒或病毒，優(yōu)選其選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。所述核酸可被用于替換在本說明書中公開的任何方面的FSY/FTY肽或與其共同使用。因此在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含在本說明書中限定的核酸分子和/或在本說明書中限定的載體以及藥理學(xué)(或藥學(xué))上可接受的賦形劑的藥物組合物。所述核酸的用途，特別是醫(yī)學(xué)用途是本發(fā)明的其它方面。在另一方面，本發(fā)明提供了一種含有如上所述的核酸分子和/或載體的重組宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞，優(yōu)選地是細(xì)菌和酵母細(xì)胞，例如大腸桿菌。肽是一種由通常通過酰胺鍵，也稱為肽鍵連接至少兩個氨基酸所形成的分子。因此，肽包括至少2個氨基酸或由至少2個氨基酸組成。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由三個氨基酸組成的肽稱為三肽等等。由2-20個氨基酸組成的肽可被稱為寡肽，而具有不到大約50個氨基酸的肽通常被稱為多肽。術(shù)語“蛋白質(zhì)”通常被用于指的是大的多肽或多肽的復(fù)合物。應(yīng)該理解，在本說明書中對FSY/FTY “肽”的任何提及均指的是以肽的形式存在的分子并且不包括含所列出的序列的蛋白質(zhì)?！耙噪牡男问酱嬖凇敝傅氖撬龇肿泳哂须?，即2-50個氨基酸的大小，并且不是更大的實體如蛋白質(zhì)的一個完整部分。因此，所述肽可被稱之為“游離”或“分離”的形式。因此，含F(xiàn)SY/FTY肽的組合物是一種其中FSY/FTY肽以肽的形式存在的組合物。本發(fā)明的FSY/FTY肽和核酸分子通常為“分離”或“純化”的分子使得它們區(qū)別于任何可能存在于活體例如動物、植物、真菌或原核生物或源自有機體的樣品內(nèi)原位處的這些組分。然而，這些序列可以與在有機體中發(fā)現(xiàn)的序列相對應(yīng)或大體上同源。因此，對于本說明書中所使用的關(guān)于核酸分子或序列和肽，術(shù)語“分離的”或“純化的”指的是從天然環(huán)境中分離或純化得到或基本上擺脫了它們的天然環(huán)境的這類分子，如，從有機體中分離的或純化的，或者指的是通過一個技術(shù)過程制備的一類分子，也就是，包括重組和合成而制備的分子。因此，當(dāng)用于核酸分子時，這些術(shù)語可以指代大體上不含有與其天然地聯(lián)系在一起的物質(zhì)的核酸，這類物質(zhì)如其他核酸/基因或多肽。這些術(shù)語也可指代一類核酸，當(dāng)通過重組DNA技術(shù)制備時，該類核酸大體上不含有細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過化學(xué)合成時，該類核酸大體上不含有化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。分離的或純化的核酸也可以大體上不含有天然位于所述核酸所起源的核酸的側(cè)翼的`序列(也就是，位于該起源核酸5’和3’端的序列)，或者不含有通過例如基因工程方法制作的位于所述核酸的側(cè)翼的序列(如，標(biāo)簽序列或其他沒有治療作用的序列)。因此，在用于與肽相關(guān)時，術(shù)語“分離的”或“純化的”通常指的是基本上不含有來自獲得所述肽的來源的細(xì)胞物質(zhì)或其他蛋白的肽。在有些實施方案中，特別是在對人類或動物施用所述肽的實施方案中，這些分離的或純化的肽基本上不含有培養(yǎng)基(此時通過重組技術(shù)制備所述肽)，或者化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)(此時通過化學(xué)合成制備所述肽)。這些分離的或純化的肽也可以不含如上面關(guān)于分離的核酸分子所述的側(cè)翼序列。術(shù)語“游離肽”可被用于方便地表示不構(gòu)成蛋白質(zhì)的一部分的肽。本發(fā)明的藥物組合物可以按照本領(lǐng)域已知并且在文獻(xiàn)中進(jìn)行過充分描述的任何常規(guī)方法進(jìn)行配制。因此，可以將FSY/FTY肽，可選地與其他活性物質(zhì)一起(活性物質(zhì)的例子如下所述)加入到適合于組合物的具體用途的一種或多種常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑中，從而生成適合于或能夠使得適合于施用的常規(guī)制劑。它們可被制備成液體、半固體或固體，例如液體溶液、分散液、懸浮液、片劑、丸劑、粉劑、囊劑、膠囊劑、酏劑、乳劑、糖漿等等。它可以以例如胃液耐受的制劑和/或以持續(xù)作用的形式提供。它可以是適于口服、腸胃外、表皮、直腸、生殖器、皮下、經(jīng)尿道、透皮、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉和/或靜脈給藥和/或通過吸入施用的形式。優(yōu)選的形式取決于所計劃的施用方式及治療應(yīng)用。在一個代表性的實施方案中，所述藥物組合物是一種適于脂質(zhì)體給藥的方式，因此優(yōu)選地提供了包含藥物組合物的脂質(zhì)體。當(dāng)使用脂質(zhì)體時，可以不必要包括其他賦形劑，因此也提供了包含在本說明書中限定的FSY/FTY肽、核酸分子和/或在本說明書中限定的載體的脂質(zhì)體。優(yōu)選的施用方式為口服。任何生理上相容的載體、賦形劑、稀釋劑、緩沖液或穩(wěn)定劑均可被用在本發(fā)明的組合物中。合適的載體、賦形劑、稀釋劑、緩沖液和穩(wěn)定劑的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等中的一種或多種，以及它們的組合。在有些情況下，等滲試劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉可被包括在內(nèi)。所述組合物可另外包括潤滑劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、增香劑等等。本發(fā)明的組合物可被配制成以使得在通過利用本領(lǐng)域公知的方法施用到受試者后有效成分被迅速、持續(xù)或延遲的釋放。可選地可以使用腸溶衣。除FSY/FTY肽外，所述組合物可進(jìn)一步包括一種或多種其他的有效成分，例如對治療(前)高血壓有用的其他試劑，其例子包括ACE抑制劑、血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)藥物、β阻斷劑、利尿劑、鈣通道阻斷劑、α-阻斷劑以及末梢血管擴張劑。優(yōu)選地，其他有效成分為其他的ACE-抑制劑，優(yōu)選為肽。因此，本發(fā)明提供了一種包括FSY/FTY肽聯(lián)合一種或多種其他ACE-抑制肽的藥物或營養(yǎng)制品組合物。其他ACE-抑制肽可以例如包括選自如下的序列或由選自如下的序列組成:LF、FL、LY、LVK、NPK、NVY、KLP、LYK、LNA、LVAK、LVAH、LLTK、ALPH、LLLK、LNPK 和 VLAH。優(yōu)選地，含有選自該列表的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13種肽。如上文中所給出的，所述FSY/FTY肽包括核心序列，但其也可以含有一種或多種側(cè)翼序列和/或包括修飾。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括至少兩種不同的FSY/FTY肽或由至少兩種不同的FSY/FTY肽組成的組合物。如上文所談及的，也可以含有一種或多種其他ACE-抑制肽。這些FSY/FTY肽的核心序列、側(cè)翼序列和/或在修飾上可能彼此不同。因此，在本說明書中公開的任何方面的實施方案中，可以含有兩種或更多種不同的FSY/FTY肽。含有FSY肽聯(lián)合FTY肽的組合物是特別優(yōu)選的。可以很容易地測定合適的每日劑量，但例如大約1-5，如大約3mg每天可能是合適的。通常的每日劑量可取決于受試者的體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，合適的劑量可通過施用單劑量單位每天，或者通過施用兩種或多種更低劑量單位每天而實現(xiàn)。本發(fā)明的藥物組合物會因此包括合適量的FSY/FTY肽每固體劑量單位，例如大約3mg每片，或?qū)?yīng)劑量的液體制劑。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備包含F(xiàn)SY/FTY肽的藥物組合物的方法。所述方法可以包括將FSY/FTY肽與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑結(jié)合以生成適合于或能夠使得適合于施用的藥物組合物。合適的載體、稀釋劑和賦形劑在上文中談及過。在另一方 面，本發(fā)明提供了一種抑制ACE活性的體外方法，所述方法包括使用FSY/FTY肽。具體地，所述FSY/FTY肽可被用于調(diào)節(jié)細(xì)胞裂解液、細(xì)胞或組織樣品中的ACE的活性。這可為ACE和ACE-抑制的作用提供其他的視角。
表I示出了多種不同的肽的ACE抑制活性的比較分析結(jié)果。本發(fā)明現(xiàn)在會在下列非限制性的實施例中進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
具體實施例方式實施例1通過酶活性分析對FSY肽進(jìn)行分析，其中ACE從底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)生成馬尿酸(HA)。HA的濃度由定量HPLC分析測定，下降的濃度與抑制效果相關(guān)?；谟蒀ushman和Cheung(1971)報道的方法，通過測量ACE(Sigma A6778)和底物HHL(SigmaH1635)之間的酶促反應(yīng)的終產(chǎn)物馬尿酸(HA)而對ACE抑制活性進(jìn)行測定，基本上如在Dragnes 等，J Food Composition and Analysis2009; 22:714-17 中的描述。將 100 μ I 的含有2mM HHL的IOOmM的硼酸鈉緩沖液(pH8.3)在37°C下與25 μ I抑制劑(FSY肽稀釋于硼酸鈉緩沖液中)預(yù)孵育30分鐘。然后通過加入50 μ I ACE(IOmU)而開始該試驗。通過加入215 μ I的IM HCl而終止該酶促反應(yīng)。定量HPLC分析在島津(日本島津公司)上進(jìn)行,使用對稱-盾(Symmetry-Shield)反相C-18智能高速柱。在環(huán)境溫度下洗脫ΗΑ，使用的流動相由0.05%的水性三氟乙酸和HPLC-級乙腈組成。使用了 2分鐘線性梯度，在0.5分鐘等度洗脫后以5%乙腈開始并以90%乙腈結(jié)束。流速維持在2ml/min，在228nm處測量UV吸收情況。抑制50%的ACE活性所需要的ACE抑制劑的濃度被定義為IC5(I。所測定的FSY肽的IC5tl平均大約4 μ M，其中有些測量的IC5tl低至1.7 μ Μ，通常的測量大約為2.2 μ Μ。當(dāng)使用Vermeirssen等(如上)的方法測量IC5tl時,測得的值大約為7.7 μ Μ。實施例2使用實施例1中描述的 方法檢測具有序列FTY的FSY肽的變異體的ACE抑制活性。采用Dragnes等(如上)的方法所測得的FTY肽的IC5tl大約為59 μ Μ,采用Vermeirssen等(如上)的方法所測得的IC5tl大約為274 μ M0實施例3IC5tl值的測定取決于精確的試驗條件，這使得難以將在各個單獨的試驗中所測得的IC5tl值進(jìn)行有意義的比較。因此進(jìn)行比較分析，以將FSY肽的ACE抑制活性與已知的ACE抑制肽的ACE抑制活性進(jìn)行比較。采用在實施例1中描述的Dragnes等的方法對ACE抑制活性進(jìn)行分析。結(jié)果在表I中示出。表I
權(quán)利要求
1.一種3-20個氨基酸的用于治療或預(yù)防以ACE活性異常為特征的狀況的肽，所述肽具有ACE抑制活性，并且由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療或預(yù)防的肽，其特征在于，所述肽由序列FSY或FTY組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療或預(yù)防的肽，其特征在于，所述肽長度為4-9個氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的用于根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的治療或預(yù)防的肽，其特征在于，所述狀況為高血壓前期或高血壓。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的用于根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的治療或預(yù)防的肽，其特征在于，所述肽被用于抑制ACE活性以治療選自如下的狀況:冠心病心絞痛、動脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗死、腦梗死、血管成形術(shù)后再狹窄、心律失常、快速心律失常、充血性心力衰竭(CHF)、主動脈瓣反流、血脂異常、異常脂蛋白血癥、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、微白蛋白病和糖尿病視網(wǎng)膜病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的用于根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的治療或預(yù)防的肽，其特征在于，所述肽包括選自如下的一種或多種修飾: (i)N-末端帽； (ii)C-末端帽； (iii)磷酸化；(iv)糖基化； (V)D-構(gòu)型的一種或多種氨基酸；和 (vi) 一種或多種非基因編碼的氨基酸。
7.一種由序列FSY或FTY組成的分離的肽。
8.一種包括根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
9.一種藥物組合物，包括: (i)3-20個氨基酸的具有ACE抑制活性并由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY的肽；以及 ( )其他抗高血壓藥劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述其他抗高血壓藥劑為具有ACE抑制活性并且包括序列FSY或FTY或由序列FSY或FTY組成的其他肽。
11.一種包括根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽以及賦形劑或載體的營養(yǎng)制品組合物。
12.—種營養(yǎng)制品組合物，包括具有ACE抑制活性并且由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY的3-20個氨基酸的肽，以及一種或多種選自如下的營養(yǎng)制品組分:脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)、纖維、灰燼、礦物質(zhì)和維生素。
13.一種食物或飼料，包括具有ACE抑制活性并且由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY的3-20個氨基酸的肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的食物或飼料，其特征在于，所述食物或飼料選自速溶粉末產(chǎn)品、壓成塊的加工食品、肉和人造肉制品、魚和人造魚制品、早餐谷物、植物油脂食物、蛋黃醬、乳制品、大豆乳制品、意式面食、面條、焙烤食品、即食餐點、嬰兒配方奶粉、嬰兒食物、寵物食品、家畜飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。
15.一種制造根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的食物或飼料產(chǎn)品的方法，包括將具有ACE抑制活性并且由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY的3_20個氨基酸的肽與可食用的物質(zhì)結(jié)合。
16.具有ACE抑制活性并且由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY的3_20個氨基酸的肽在抑制ACE活性的體外方法中的用途。
17.一種編碼具有ACE抑制活性并且由序列FSY或FTY組成或包括序列FSY或FTY的3-20個氨基酸的肽的核酸分子。
18.—種載體，包括根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸分子。
19.一種宿主細(xì)胞，包括根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求18所述的載體。 ·
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肽，包括SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1組成，以及其變異體，特別是包括序列FTY或由序列FTY組成的變異體，編碼所述肽的核酸以及包含所述肽和/或核酸的藥物和營養(yǎng)制品組合物。本發(fā)明還提供了這種肽在治療和ACE抑制的體外方法中的用途。
文檔編號A61P9/12GK103249741SQ201180059041
公開日2013年8月14日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者J·拉沃 申請人:瑪里艾利斯股份公司