含非復(fù)制性益生菌微生物的可勺性酸奶制備物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可勺性酸奶組合物領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供了包含非復(fù)制性益生菌微生物的可勺性酸奶組合物。這些非復(fù)制性益生菌微生物可以是例如，經(jīng)熱處理的具有生物活性的益生菌微生物。本發(fā)明還涉及通過這些非復(fù)制性益生菌微生物提供健康益處。
【專利說明】含非復(fù)制性益生菌微生物的可勺性酸奶制備物
[0001]本發(fā)明涉及可勺性酸奶組合物(spoonable yogurt composition)領(lǐng)域。特別地， 本發(fā)明提供了包含非復(fù)制性益生菌微生物的可勺性酸奶組合物。這些非復(fù)制性益生菌微生 物可以是例如經(jīng)熱處理的具有生物活性的益生菌微生物。本發(fā)明還涉及由這些非復(fù)制性益 生菌微生物提供的健康益處。
[0002]同時(shí)，益生菌的健康益處在本領(lǐng)域是公認(rèn)的，例如由Blum等人在Curr Issues Intest Microbiol.2003Sep;4(2): 53-60中總結(jié)。通常，在共生制劑中益生菌與益生元一起 施用，所述共生制劑甚至具有增加的健康益處。
[0003]已知益生菌能與人類腸細(xì)胞粘著，并能排斥人類腸細(xì)胞上的病原菌。為了具有這 種活性，在產(chǎn)品中的益生菌被消耗之前，所述益生菌必須保持生活力。這是工業(yè)中的挑戰(zhàn)， 并使得將益生菌加入到食品中是重要的。
[0004]特別地，對(duì)于在生產(chǎn)期間經(jīng)加熱的產(chǎn)品和/或在消費(fèi)之前可能具有較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí) 間的產(chǎn)品，如貨架穩(wěn)定的產(chǎn)品，通常認(rèn)為，在消費(fèi)之前，確保產(chǎn)品中的益生菌保持生活力，此 外確保所述益生菌在到達(dá)腸道時(shí)也是存活的是困難的。
[0005]將期望得到這樣的可勺性酸奶組合物，甚至能在較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間后，在用于益生 菌的臨界條件下，所述可勺性酸奶組合物仍能遞送益生菌的益處，并且制備簡(jiǎn)單。通過使用 天然成分來(lái)實(shí)現(xiàn)該目的將是優(yōu)選的，所述天然成分對(duì)于施用者是安全的(沒有副作用)，并 且使用當(dāng)今工業(yè)技術(shù)水平可以容易地將所述天然成分摻入到可勺性酸奶組合物中。
[0006]還期望的是提供包含具有改進(jìn)的免疫增強(qiáng)作用的益生菌的組合物。
[0007]還期望的是提供包含具有改進(jìn)的抗炎效應(yīng)的益生菌的組合物。
[0008]本發(fā)明人已經(jīng)處理了該需求。因此，本發(fā)明的目的是提高技術(shù)發(fā)展水平，并提供可 以滿足上述需求的可勺性酸奶組合物。
[0009]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題，他們可以實(shí)現(xiàn)該目的。從屬權(quán)利 要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的思想。
[0010]因此，本發(fā)明人提供了包含非復(fù)制性益生菌微生物的可勺性酸奶組合物。
[0011]可勺性酸奶可以是凝固型酸奶或攪拌型酸奶。攪拌型酸奶例如以淡味的、不加糖 的、加糖的或者調(diào)味的制備物形式存在。根據(jù)本發(fā)明可勺性酸奶可以是低脂的或無(wú)脂的或 者含奶油的。所述可勺性酸奶可以包含水果制備物。凝固型酸奶還可以以水果位于底物的 凝固形式存在。
[0012]將非復(fù)制性益生菌微生物加入到產(chǎn)品中的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，與存活的益生菌不同，如 果存在于產(chǎn)品中，所述非復(fù)制性益生菌微生物不會(huì)影響纖維的質(zhì)地，使得組合物的口感不 會(huì)隨著時(shí)間而改變。
[0013]此外，本發(fā)明人能夠顯示，非復(fù)制性益生菌可以提供益生菌的健康益處，甚至可以 具有改進(jìn)的益處。
[0014]因此，保持益生菌在最終產(chǎn)品中存活，并且確保它們活著到達(dá)腸中的復(fù)雜方法似 乎是不必要的。此外，在可勺性酸奶組合物中使用非復(fù)制性益生菌還允許在一種制備物中 具有益生菌和益生元，而在制備和儲(chǔ)存產(chǎn)品期間不存在不希望的過早破壞纖維的風(fēng)險(xiǎn)。[0015]本發(fā)明的可勺性酸奶組合物中非復(fù)制性微生物的量可以相當(dāng)于每份約 106-1012cfu。
[0016]顯而易見，非復(fù)制性微生物不會(huì)形成菌落；因此，將該術(shù)語(yǔ)理解為從104-1012cfu/g 的復(fù)制性細(xì)菌獲得的非復(fù)制性微生物的量。這包括滅活的、無(wú)生活力的或死的或以碎片如 DNA或細(xì)胞壁或胞質(zhì)化合物存在的微生物。換句話說，組合物包含的微生物的數(shù)量用該數(shù) 量的微生物的菌落形成能力(cfu)表述，就好像全部微生物是存活的，而不考慮事實(shí)上它 們是非復(fù)制的如滅活的或者死的、碎片化的或者這些狀態(tài)的任一個(gè)或者全部的混合?？缮?性酸奶由標(biāo)準(zhǔn)化的全脂乳、部分脫脂乳、濃縮脫脂乳、奶油和無(wú)脂奶粉的混合物制成。備選 地，可以通過在真空鍋中去除約15%-約20%的水來(lái)部分地濃縮乳。優(yōu)選的是補(bǔ)充具有無(wú)脂 奶粉的非脂乳固體(MSNF)。酸奶中的乳脂水平是從無(wú)脂酸奶少于約0.5%至正常酸奶最低
3.2%的范圍。MSNF優(yōu)選地為至少8.25%。
[0017]為了修飾酸奶的某些性質(zhì)，可以加入多種成分。為了使酸奶更甜，可以加入大約7% 的蔗糖(糖)。為了降低酸奶的熱量，可以使用人造甜味劑如阿斯巴甜或糖精?？梢约尤肽?油以提供更光滑細(xì)膩的質(zhì)地?？梢酝ㄟ^包含穩(wěn)定劑如食物淀粉、明膠、豆角膠、瓜爾豆膠和 果膠，來(lái)改善酸奶的濃稠度和貯存穩(wěn)定性?？缮仔运崮探M合物可以例如包含約0.3-0.5重 量％的果膠。
[0018]可勺性酸奶組合物可以在寒冷條件下儲(chǔ)存。寒冷條件通常具有2V -15°C，優(yōu)選地 40C _8°C的范圍內(nèi)的溫度。
[0019]可勺性酸奶組合物還可以在環(huán)境條件下儲(chǔ)存。環(huán)境條件通常具有16°C-25°C，優(yōu) 選地8°C _23°C的范圍內(nèi)的溫度。在環(huán)境條件下保持益生菌存活延長(zhǎng)的時(shí)間尤其具有挑戰(zhàn) 性。因此，特別是對(duì)于待儲(chǔ)存在環(huán)境溫度下的可勺性酸奶組合物，添加非復(fù)制性益生菌微生 物是賦予產(chǎn)品另外的健康益處的可能方式。
[0020]可勺性酸奶組合物還可以包含益生元。
[0021]“益生元”指的是促進(jìn)益生菌在腸中生長(zhǎng)的食物物質(zhì)。益生元在胃中和/或腸的 上段不被分解并且在攝食它們的人的胃腸道中不被吸收，但是它們被胃腸道微生物區(qū)系和 / 或益生菌發(fā)酵。例如 Glenn R.Gibson 和 Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota:1ntroducing the Concept of Prebiotics, J.Nutr.1995125:1401-1412 中定義了益生元。
[0022]根據(jù)本發(fā)明可以使用的益生元沒有特別地限制并且包括促進(jìn)益生菌在腸中生長(zhǎng) 的所有食物物質(zhì)。優(yōu)選地，它們可以選自包含果糖、半乳糖、甘露糖的寡糖；膳食纖維，特別 是可溶性纖維、大豆纖維；菊粉或者它們的混合物。優(yōu)選的益生元是低聚果糖(FOS)、低聚 半乳糖(IOS)、低聚異麥芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳 酮糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)低聚糖(PAO)、低聚麥芽糖(MOS)、樹膠和/或其水解產(chǎn) 物、果膠和/或其水解產(chǎn)物。
[0023]益生元的一般實(shí)例是低聚果糖和菊粉。
[0024]在根據(jù)本發(fā)明的可勺性酸奶組合物中的益生元數(shù)量取決于其促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的 能力。
[0025]可勺性酸奶組合物可以包含的益生菌的量例如相應(yīng)于每克至少IO3Cfu益生元，優(yōu) 選地IO4至107cfu/g益生元的量。[0026]本發(fā)明人驚奇的看到，例如在免疫增強(qiáng)效應(yīng)方面和/或在抗炎效應(yīng)方面，非復(fù)制 性益生菌微生物比復(fù)制性益生菌微生物更有效。
[0027]該現(xiàn)象是令人驚奇的，因?yàn)橐嫔ǔ１欢x為“當(dāng)以足夠的量施用時(shí)賦予 宿主健康益處的活的微生物”(FA0/WH0指南)。大量出版的文獻(xiàn)涉及活的益生菌。另 夕卜，一些研究調(diào)查了非復(fù)制性細(xì)菌傳遞的健康益處并且大部分益生菌表明例如通過 熱處理引起的益生菌的滅活導(dǎo)致它們據(jù)說的健康益處的喪失(Rachmilewitz, D.， 等人，2004，Gastroenterologyl26:520-528;Castagliuolo,等人，2005，F(xiàn)EMS Immunol.Med.Microbiol.43: 197-204 ; Gi 11，H.S.和 K.J.Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr.86:285-289;Kaila, M.，等人，1995, Arch.Dis.Child72:51-53.)。一些研究表明滅 活的益生菌可保留一些健康效應(yīng)(Rachmilewitz, D.,等人，2004, Gastroenterologyl26:5 20-528;Gill, H.S.和K.J.Rutherfurd, 2001，Br.J.Nutr.86:285-289)，但是顯然，在本領(lǐng)域 認(rèn)為活的益生菌更有效。
[0028]“非復(fù)制性”益生菌微生物包括已經(jīng)受到熱處理的益生菌。這包括滅活的、死的、無(wú) 生活力的和/或以碎片如DNA、代謝物、胞質(zhì)化合物和/或細(xì)胞壁物質(zhì)存在的微生物。
[0029]“非復(fù)制性”指的是通過經(jīng)典的平板接種方法可以檢測(cè)的無(wú)生活力的細(xì)胞和/或 菌落形成單位。在微生物書中概述了這些經(jīng)典的平板接種方法:James Monroe Jay, Martin J.Loessner，David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, Springer Science, New York, N.Y.790p。通常地,存活細(xì)胞的缺失可以按照以下顯示:用不同濃度細(xì) 菌制備物(“非復(fù)制”的樣品)接種并且在適合的條件(有氧和/或厭氧空氣中持續(xù)至少24 小時(shí))下培育后，在瓊脂平板上沒有可見的菌落或者在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中沒有增加的濁度。
[0030]為本發(fā)明的目的將益生菌定義為“對(duì)宿主的健康或者安康有有益作用的微生物細(xì) 胞制劑或者微生物細(xì)胞組分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:how should they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0031]本發(fā)明的組合物包含足夠至少部分產(chǎn)生健康益處的量的益生菌微生物和/或非 復(fù)制性益生菌微生物。將足夠?qū)崿F(xiàn)該目的的量定義為“治療有效劑量”。用于該目的的有效 量將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多因素如消費(fèi)者的體重和一般健康狀況以及食品基 質(zhì)的影響。
[0032]在預(yù)防應(yīng)用中，根據(jù)本發(fā)明的組合物以一定量施用給易感染病癥或者處在該病癥 的風(fēng)險(xiǎn)中的消費(fèi)者，所述量足夠至少部分地降低患上這種病癥的風(fēng)險(xiǎn)。這種量被定義為“預(yù) 防有效劑量”。再次，該精確量取決于很多因素如消費(fèi)者的健康狀況和體重以及食品基質(zhì)的影響。
[0033]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量。
[0034]一般本發(fā)明的組合物含有治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量的非復(fù)制性益生菌 微生物。
[0035]通常，治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量在每日劑量約0.005mg -1OOOmg非復(fù)制 性益生菌微生物范圍內(nèi)。
[0036]優(yōu)選地，非復(fù)制性益生菌微生物以相當(dāng)于IO4至109cfu/g干組合物的量，更優(yōu)選地 以相當(dāng)于IO5至109cfu/g干組合物的量存在。
[0037]益生菌可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法成為非復(fù)制性的。[0038]使益生菌菌株成為非復(fù)制性益生菌的如今可得到的技術(shù)通常是熱處理、Y -照射、 紫外線或者使用化學(xué)試劑(福爾馬林、多聚甲醛)。
[0039]就數(shù)值的量而言，例如，經(jīng)“短時(shí)間高溫”處理的非復(fù)制性微生物可以以相當(dāng)于IO4 至IO12當(dāng)量cfu/g的干組合物的量存在于組合物中。
[0040]優(yōu)選地使用在食品工業(yè)中在工業(yè)環(huán)境下相對(duì)容易應(yīng)用的技術(shù)來(lái)使益生菌成為非 復(fù)制性益生菌。
[0041]例如，可以使益生菌成為非復(fù)制的，并可以將其作為非復(fù)制性益生菌加入到可勺 性酸奶組合物中。
[0042]今天市場(chǎng)上包含益生菌的大部分產(chǎn)品在它們的生產(chǎn)中是經(jīng)熱處理的。因此，方便 的是能對(duì)益生菌與生產(chǎn)的產(chǎn)品一起進(jìn)行熱處理或者至少以相似的方式處理，同時(shí)益生菌保 留或者改進(jìn)它們的有益性質(zhì)或者甚至獲得對(duì)于消費(fèi)者新的有益性質(zhì)。
[0043]因此，還可以將益生菌以存活的形式加入到可勺性酸奶組合物中，并且在可勺性 酸奶的正常生產(chǎn)方法中，在熱處理步驟期間可以使所述益生菌成為非復(fù)制的。
[0044]然而，在文獻(xiàn)中通過熱處理失活益生菌微生物通常與益生菌活性的至少部分損失 相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明人現(xiàn)在驚奇的發(fā)現(xiàn)，例如通過熱處理使益生菌微生物成為非復(fù)制性益生菌 不會(huì)導(dǎo)致益生菌健康益處的損失，而是相反-可以增強(qiáng)現(xiàn)存的健康益處并且甚至產(chǎn)生新的 健康益處。
[0045]因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是可勺性酸奶組合物，其中所述非復(fù)制性益生菌微 生物通過熱處理成為非復(fù)制性的益生菌。
[0046]這種熱處理可以在至少71.5° C進(jìn)行至少I秒。
[0047]可以使用長(zhǎng)期熱處理或者短期熱處理。
[0048]今天在工業(yè)規(guī)模上，通常優(yōu)選的是短期熱處理，如UHT樣的熱處理。該類型的熱處 理減少了細(xì)菌負(fù)荷，并且減少了加工時(shí)間，因此減少了營(yíng)養(yǎng)的破壞。
[0049]本發(fā)明人第一次證實(shí)經(jīng)高溫短時(shí)間熱處理的益生菌微生物顯示抗炎免疫譜而不 管它們起始的性質(zhì)如何。特別地，通過該熱處理發(fā)展了新的抗炎譜或增強(qiáng)了現(xiàn)存的抗炎譜。
[0050]因此通過使用對(duì)應(yīng)于通常工業(yè)可應(yīng)用的熱處理的特定的熱處理參數(shù)可能產(chǎn)生具 有抗炎免疫譜的非復(fù)制性益生菌微生物，即使該非復(fù)制性益生菌微生物的活的對(duì)應(yīng)物不是 抗炎菌株。
[0051]因此，例如熱處理可以是在約71.5-150° C下約1-120秒的高溫處理。高溫處理 可以是高溫/短時(shí)間(HTST)處理或者超高溫(UHT)處理。
[0052]益生菌微生物可以在約71.5-150° C下進(jìn)行約1-120秒的短期高溫處理。
[0053]更優(yōu)選地，微生物可以在約90-140° C，例如90° -120° C下進(jìn)行約1_30秒的短
期高溫處理。
[0054]這種高溫處理使微生物至少部分成為非復(fù)制性的。
[0055]高溫處理可以在正常大氣壓下進(jìn)行，但也可以在高壓下進(jìn)行。典型的壓力范圍是I 至50巴，優(yōu)選I至10巴，更優(yōu)選2至5巴。顯然，如果益生菌在液體或者固體培養(yǎng)基中進(jìn) 行熱處理，當(dāng)加熱時(shí)，壓力是優(yōu)選的。因此應(yīng)用的理想壓力將取決于提供微生物的組合物的 性質(zhì)和使用的溫度。
[0056]高溫處理可以在約71.5-150° C，優(yōu)選地約90-120 ° C，甚至更優(yōu)選地約120-140° C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0057]高溫處理可以在約1-120秒，優(yōu)選地約1-30秒，甚至更優(yōu)選地約5-15秒的短期 內(nèi)進(jìn)行。
[0058]該給定的時(shí)間范圍指的是益生菌微生物在給定的溫度下進(jìn)行的時(shí)間。注意取決于 提供微生物的組合物的性質(zhì)和量并且取決于使用的加熱設(shè)備的結(jié)構(gòu)，熱應(yīng)用的時(shí)間可以不 同。
[0059]然而，通常用高溫短時(shí)間(HTST)處理、巴氏瞬間滅菌法或者超高溫(UHT)處理處 理本發(fā)明的組合物和/或微生物。
[0060]UHT處理是超高溫處理或者超熱處理(都簡(jiǎn)寫為UHT)，所述UHT處理涉及在超 過135° C(275° F)的溫度下通過短時(shí)間約1-10秒的加熱使組合物至少部分滅菌，超過 135° C的溫度是滅活奶中細(xì)菌孢子需要的溫度。例如，用超過135° C的溫度的方式加工 奶允許在必要的保持時(shí)間(2-5秒)內(nèi)降低細(xì)菌負(fù)荷，使得能夠連續(xù)流動(dòng)操作。
[0061]有兩種主要類型的UHT系統(tǒng):直接和間接系統(tǒng)。在直接系統(tǒng)中，通過蒸汽注射或者 蒸汽注入處理產(chǎn)品，然而在間接系統(tǒng)中，使用板式熱交換器、管式熱交換器或者刮面式換熱 器對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行熱處理。UHT系統(tǒng)的組合可應(yīng)用于產(chǎn)品制備方法中的任一步驟或者多個(gè)步驟。
[0062]HTST處理定義如下(高溫/短時(shí)間):設(shè)計(jì)的巴氏消毒法實(shí)現(xiàn)了 5個(gè)數(shù)量級(jí)的減 少:滅活奶中存活微生物數(shù)目的99.9999%。認(rèn)為該處理足夠破壞幾乎全部的酵母、霉菌和 常見的腐敗細(xì)菌并且也保證足夠破壞常見致病性熱抗性生物。在HTST方法中將奶加熱到 71.7° C(161° F)持續(xù) 15-20 秒。
[0063]巴氏瞬間滅菌法是易腐飲料如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品的熱巴氏消毒法。它 在產(chǎn)品裝入容器之前進(jìn)行以殺死腐敗微生物從而使產(chǎn)品更安全并且延長(zhǎng)它們的貨架期。當(dāng) 液體在71.5° C(160° F)至74° C(165° F)的溫度下進(jìn)行約15至30秒的處理時(shí)，液體 在可控的持續(xù)流中移動(dòng)。
[0064]對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“短時(shí)間高溫處理”將包括例如高溫短時(shí)間(HTST)處理、 UHT處理、和巴氏瞬間滅菌法。
[0065]因?yàn)檫@樣的熱處理提供了具有改進(jìn)的抗炎譜的非復(fù)制性益生菌，本發(fā)明的組合物 可用于預(yù)防或治療炎癥病癥。
[0066]使用本發(fā)明的組合物可以治療或者預(yù)防的炎癥病癥不受特別的限制。例如，炎癥 病癥可以選自急性炎癥，如膿毒；燒傷；以及慢性炎癥如炎性腸病，例如克隆病、潰瘍性結(jié) 腸炎、隱窩炎、壞死性腸結(jié)腸炎；皮膚炎癥，如紫外線或者化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚炎癥、濕疹、反應(yīng) 性皮膚；易激腸綜合癥；眼炎癥；變態(tài)反應(yīng)；哮喘以及它們的組合。
[0067]如果使用長(zhǎng)期熱處理使益生菌微生物成為非復(fù)制微生物，這種熱處理可以在約 70-150° C的溫度范圍進(jìn)行約3分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選地在80-140° C的范圍進(jìn)行5分鐘-40 分鐘。
[0068]盡管本領(lǐng)域一般性教導(dǎo)了通過長(zhǎng)期熱處理成為非復(fù)制的細(xì)菌在發(fā)揮它們的益生 菌性質(zhì)方面一般沒有活細(xì)胞有效，但是本發(fā)明人能證實(shí)經(jīng)熱處理的益生菌比它們活的對(duì)應(yīng) 物更好地刺激免疫系統(tǒng)。
[0069]本發(fā)明也涉及包含益生菌微生物的組合物，所述益生菌微生物通過在至少約 70° C下至少約3分鐘的熱處理成為非復(fù)制的益生菌。[0070]通過體外免疫作圖證實(shí)非復(fù)制性益生菌的免疫增強(qiáng)效果。使用的體外模型使用來(lái)自人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的細(xì)胞因子作圖，并且在本領(lǐng)域中被接受為用于免疫調(diào)節(jié)化合物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)模型(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70，I 65-1 73;Tay 1r 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235;Kekkonen 等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203)。
[0071]一些作者/研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)使用了體外的PBMC測(cè)定，例如根據(jù)它們的免疫譜，即它們的抗-或者促-炎癥特征對(duì)益生菌分類(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203) ? 例如，在腸結(jié)腸炎的小鼠模型中已經(jīng)顯示該測(cè)定允許候選益生菌抗炎效應(yīng)的預(yù)測(cè)(Foligne，B.，等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在臨床試驗(yàn)中該測(cè)定通常用作讀出并且顯示得到與臨床結(jié)果一致的結(jié)果(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70, 165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy, 36，1227-1235)。
[0072]在過去的幾十年中變應(yīng)性疾病已經(jīng)逐步增加并且如今被WHO認(rèn)為是流行病。一般來(lái)說，認(rèn)為免疫系統(tǒng)的Thl和Th2反應(yīng)之間的不平衡導(dǎo)致對(duì)Th2介體產(chǎn)生的強(qiáng)烈的偏向， 引起變態(tài)反應(yīng)。因此，可通過恢復(fù)免疫系統(tǒng)的Thl和Th2臂之間適當(dāng)?shù)钠胶鉁p輕、下調(diào)或者預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。這暗示了減輕Th2反應(yīng)或者至少暫時(shí)地增強(qiáng)Thl反應(yīng)的必要性。后者將是免疫增強(qiáng)反應(yīng)的特征，常伴隨著例如IFNy，TNF-a和IL-12的更高水平(Kekkonen 等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203;Viljanen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。
[0073]因此，本發(fā)明的可勺性酸奶組合物允許治療或者預(yù)防涉及受損的免疫防御的病癥。
[0074]因此，通過使用本發(fā)明的組合物可以治療或者預(yù)防的與受損的免疫防御相關(guān)的病癥不受特別地限制。
[0075]例如，所述病癥可以選自感染，特別是細(xì)菌、病毒、真菌和/或寄生蟲的感染；吞噬細(xì)胞缺失；低到嚴(yán)重的免疫抑制水平，如通過應(yīng)激或者免疫抑制藥物、化學(xué)療法或者放射療法誘導(dǎo)的那些；免疫活性降低的免疫系統(tǒng)的天然狀態(tài)，如新生兒的免疫系統(tǒng)；變態(tài)反應(yīng)；以及它們的組合。
[0076]本發(fā)明描述的可勺性酸奶組合物允許增強(qiáng)幼兒對(duì)疫苗特別是口服疫苗的應(yīng)答。
[0077]非復(fù)制微生物的任何量將是有效的。然而，通常優(yōu)選地，至少90%，優(yōu)選地至少 95%，更優(yōu)選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非復(fù)制的。
[0078]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所有微生物是非復(fù)制的。
[0079]因此，在本發(fā)明的組合物中，至少90%，優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌可以是非復(fù)制的。
[0080]所有益生菌微生物可用于本發(fā)明的目的。
[0081]例如，益生菌微生物可以選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、丙酸桿菌屬或者它們的組合，例如長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilu)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、二丁酮乳 球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿 菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌 (Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌(Escherichia coli)和 / 或它們的混合物。
[0082]根據(jù)本發(fā)明的組合物可以例如包含益生菌微生物，所述益生菌微生物選自長(zhǎng)雙歧 桿菌NCC3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、約漢遜氏乳 桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、路氏乳桿菌DSM17938、路氏乳桿 菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌 NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC15、乳 乳球菌NCC2287或它們的組合。
[0083]所有這些菌株按照布達(dá)佩斯條約保藏和/或可以通過商業(yè)途徑得到。
[0084]按照布達(dá)佩斯條約已經(jīng)保藏的菌株如下:
[0085]長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001:ATCC BAA-999
[0086]雙歧桿菌NCC2705:CNCM 1-2618
[0087]短雙歧桿菌NCC2950:CNCM 1-3865
[0088]乳雙歧桿菌NCC2818:CNCM 1-3446
[0089]類干酪乳桿菌NCC2461: CNCM 1-2116
[0090]鼠李糖乳桿菌NCC4007: CGMCC1.3724
[0091]嗜熱鏈球菌NCC2019:CNCM 1-1422
[0092]嗜熱鏈球菌NCC2059:CNCM 1-4153
[0093]乳乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154
[0094]干酪乳桿菌NCC4006:CNCM 1-1518
[0095]干酪乳桿菌NCC1825:ACA-DC6002
[0096]嗜酸乳桿菌NCC3009:ATCC700396
[0097]保加利亞乳桿菌NCC15: CNCM 1-1198
[0098]約漢遜氏乳桿菌La1:CNCM 1-1225
[0099]路氏乳桿菌DSM17938:DSM17938
[0100]路氏乳桿菌ATCC55730: ATCC55730
[0101]大腸桿菌Nisslel917:DSM6601
[0102]命名為ATCC的菌株保藏在ATCC專利保藏中心(ATCC Patent Depository), 10801University Blvd., Manassas, VA20110,美國(guó)。
[0103]命名為CNCM的菌株保藏在國(guó)立微生物保藏中心(COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMESXCNCM),25rue du Docteur Roux，F(xiàn)-75724PARIS Cedexl5,法國(guó)。
[0104]命名為CGMCC的菌株保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center),微生物學(xué)研究所(Institute of Microbiology),中國(guó)科學(xué)院(Chinese Academy of Sciences),中關(guān)村(Zhongguancun)， P.0.Box2714，北京(Beijing) 100080，中國(guó)。
[0105]命名為ACA-DC的菌株保藏在希臘協(xié)調(diào)微生物保藏中心(GreekCoordinated Collections of Microorganisms),Dairy Laboratory, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens,75, Iera odos, Botanikos, Athens, 11855，希臘。
[0106]命名為DSM的菌株保藏在德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Inhoffenstr.7B',38124Braunschweig,德國(guó)。
[0107]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解他們可以自由組合本文描述的本發(fā)明的所有特征，而不 背離公開的本發(fā)明范圍。
[0108]本發(fā)明其他的優(yōu)點(diǎn)和特征從以下的實(shí)施例和附圖中是明顯的。
[0109]圖1A和B顯示用“短時(shí)間高溫”處理的益生菌的抗炎免疫譜的增強(qiáng)。
[0110]圖2顯示非抗炎益生菌菌株經(jīng)過“短時(shí)間高溫”處理后成為抗炎的益生菌菌株，即 在體外展示顯著的抗炎免疫譜。
[0111]圖3A和B顯示通過商業(yè)途徑可得到的產(chǎn)品中使用的益生菌菌株，其經(jīng)過“短時(shí)間 高溫”處理后在體外展示增強(qiáng)的或者新的抗炎免疫譜。
[0112]圖4A和B顯示乳品起始菌株(即Lcl起始菌株)，其經(jīng)過高溫?zé)崽幚砗笤隗w外展示 增強(qiáng)的或者新的抗炎免疫譜。
[0113]圖5顯示非抗炎益生菌菌株，其經(jīng)過HTST處理后在體外展示抗炎免疫譜。
[0114]圖6:PBMC 數(shù)據(jù)的主要成分分析(IL-12p40，IFN- y , TNF- a , IL-10)，所述 PBMC 數(shù) 據(jù)由活的和經(jīng)熱處理的(140° C15秒)益生菌和乳品起始菌株產(chǎn)生。每個(gè)點(diǎn)代表活的或經(jīng) 熱處理的一種菌株，所述菌株通過它的NCC號(hào)或者名稱鑒定。
[0115]圖7顯示活的和受熱處理的(85° C，20分鐘)菌株的IL-12p40/IL-10比例?？?的來(lái)說，在85° C20分鐘的熱處理導(dǎo)致IL-12p40/IL-10比例的增加，該結(jié)果與本發(fā)明的“短 時(shí)間高溫”處理的結(jié)果相反(圖1、2、3、4和5)。
[0116]圖8顯示體外細(xì)胞因子分泌的增強(qiáng)，該細(xì)胞因子分泌來(lái)自受熱處理的細(xì)菌刺激的 人 PBMCs。
[0117]圖9顯示在用鹽水攻擊的OVA敏化的小鼠(陰性對(duì)照)中，在用OVA攻擊的OVA敏 化的小鼠(陽(yáng)性對(duì)照)以及用OVA攻擊并且用進(jìn)行熱處理的或者活的短雙歧桿菌NCC2950 處理的OVA敏化小鼠中觀察的腹瀉強(qiáng)度的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示為腹瀉強(qiáng)度的百分?jǐn)?shù)(平均值 土SEM，從4次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)計(jì)算)，100%的腹瀉強(qiáng)度相應(yīng)于陽(yáng)性對(duì)照(敏化并且用變應(yīng)原攻擊 的)組中發(fā)生的癥狀。
[0118]實(shí)施例1:
[0119]方法學(xué)[0120]細(xì)菌制備:
[0121]活的益生菌在宿主免疫系統(tǒng)上傳遞的健康益處一般認(rèn)為是菌株特異性的。在體外 (PBMC測(cè)定)誘導(dǎo)高水平IL-10和/或誘導(dǎo)低水平促炎細(xì)胞因子的益生菌在體內(nèi)已經(jīng)顯示 是有效的抗炎菌株(Foligne, B.,等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0122]一些益生菌菌株用于研究受熱處理的益生菌的抗炎性質(zhì)。這些益生菌菌株是長(zhǎng)雙 歧桿菌NCC3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳 桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿 菌ACA-DC6002 (NCC1825)以及大腸桿菌Nissle。也測(cè)試了一些起始培養(yǎng)菌株，其包括商業(yè) 上用于生產(chǎn)雀巢LcI發(fā)酵產(chǎn)品的一些菌株:嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、保加 利亞乳桿菌NCC15和乳乳球菌NCC2287。
[0123]在5-15L生物反應(yīng)器中用為每種菌株優(yōu)化的條件培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞?？梢允褂盟谐?用的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知這些培養(yǎng)基。當(dāng)PH調(diào)節(jié)到5.5時(shí)，連續(xù)地加 入30%的堿溶液(NaOH或Ca (OH)2X適當(dāng)時(shí)，通過向頂空充入CO2維持厭氧條件。在標(biāo)準(zhǔn)的 厭氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌。
[0124]通過離心(5，OOOx g，4° C)收集細(xì)菌細(xì)胞并在適當(dāng)體積的磷酸緩沖鹽水(PBS)中 重懸浮以達(dá)到約109-101(lCfU/ml的終濃度。用15%的甘油將制備物的一部分冷凍于-80° C。 對(duì)細(xì)胞的另一部分通過如下條件進(jìn)行熱處理:
[0125]-超高溫:通過間接熱注射，在140°C持續(xù)15秒，
[0126]-高溫短時(shí)間(HTST):通過間接熱注射，在74°C，90° C和120° C分別持續(xù)15 秒，
[0127]-長(zhǎng)時(shí)間低溫(85°C，20分鐘)，在水浴中。
[0128]熱處理時(shí)，將樣品冷凍于-80° C直至使用。
[0129]細(xì)菌制備物的體外免疫作圖:
[0130]評(píng)估活的和受熱處理的細(xì)菌制備物的免疫譜(即體外誘導(dǎo)來(lái)自人血細(xì)胞的特定細(xì) 胞因子分泌的能力)。從血液濾器分離人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。用細(xì)胞密度梯度分離后， 收集單核細(xì)胞并且用Hanks平衡鹽溶液洗滌兩次。然后用補(bǔ)充10%胎牛血清(Bioconcept， 巴黎，法國(guó))、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma)以及0.1%慶大霉素 (Sigma)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM, Sigma)重懸浮細(xì)胞。然后在48孔 板中將PBMCs(7xl05細(xì)胞/孔)與活的以及經(jīng)熱處理的細(xì)菌(相當(dāng)于7xl06cfU/孔)共同 培養(yǎng)36小時(shí)。培養(yǎng)36小時(shí)后，在細(xì)胞因子測(cè)量之前將培養(yǎng)板冷凍并保存于-20° C。平行 地進(jìn)行(即對(duì)相同批次的PBMCs進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn))活的細(xì)菌和它們受熱處理的對(duì)應(yīng)物的細(xì)胞 因子作圖。
[0131]36小時(shí)的培育后，按照制造商的說明用ELISA(R&D DuoSet人IL-10，BD OptEIA 人IL12p40，BD OptEIA人TNF a，BD OptEIA人IFN- y)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì) 胞因子(IFN- y , IL-12p40, TNF-a 和 IL-10)水平。IFN-Y，IL_12p40 和 TNF-a 是促 炎細(xì)胞因子，而IL-10是有效的抗炎介體。結(jié)果表示成4個(gè)個(gè)體供體的平均值(pg/ ml)+/-SEM,并且代表每次實(shí)驗(yàn)用4個(gè)供體進(jìn)行的2次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。計(jì)算每種菌株 的IL-12p40/IL-10比例作為體內(nèi)抗炎效應(yīng)的預(yù)測(cè)值(Foligne1B.,等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。[0132]將通過ELISA (見上文)測(cè)定的每種菌株的數(shù)值細(xì)胞因子值傳送至BioNumerics v5.10軟件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利時(shí))。對(duì)該組數(shù)據(jù)進(jìn)行主要成分分 析(PCA，尺寸標(biāo)注技術(shù))。該分析包括減去這些特征上的均值以及除以這些特征上的方差。
[0133]結(jié)果
[0134]通過超高溫(UHT)/高溫短時(shí)間(HTST)樣的處理產(chǎn)生的抗炎譜
[0135]對(duì)研究的益生菌菌株進(jìn)行一系列的熱處理(超高溫(UHT)，高溫短時(shí)間(HTST) 以及85° C下20分鐘)并將它們的體外免疫譜與活細(xì)胞的免疫譜比較。當(dāng)與人PBMC溫 育時(shí)，活的微生物(益生菌和/或乳品起始培養(yǎng)物)誘導(dǎo)不同水平的細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖1， 2，3，4和5)。這些微生物的熱處理以溫度依賴的方式改變PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平。 “短時(shí)間高溫”處理(120° C或140° C15秒)產(chǎn)生具有抗炎免疫譜的非復(fù)制細(xì)菌(圖 1，2，3和4)。實(shí)際上，經(jīng)UHT樣處理的菌株(140° C，15秒)誘導(dǎo)更少的促炎細(xì)胞因子 (TNF-a，IFN-y, IL-12p40)而維持或者誘導(dǎo)額外的IL-10產(chǎn)生(與活的對(duì)應(yīng)物比較)。與活 細(xì)胞相比，任何經(jīng)UHT樣處理的菌株得到的IL-12p40/IL-10比例更低(圖1，2，3和4)。對(duì) 于經(jīng)HTST樣處理，S卩進(jìn)行120° C15秒(圖1，2，3和4)，或74。C和90。C15秒(圖5)熱 處理的細(xì)菌，該觀察結(jié)果也是有效的。熱處理(UHT樣或HTST樣處理)對(duì)益生菌菌株(圖1， 2，3和5)和乳品起始培養(yǎng)物(圖4)的體外免疫譜具有相似的效應(yīng)。PBMC數(shù)據(jù)的主要成分 分析揭示活的菌株全部沿著X軸散布，說明所述菌株在體外展示非常不同的免疫譜:促炎 細(xì)胞因子的從低(左側(cè))到高(右側(cè))的誘導(dǎo)物，所述PBMC數(shù)據(jù)由活的和經(jīng)熱處理(140° C， 15秒)的益生菌和乳品起始菌株產(chǎn)生。經(jīng)熱處理的菌株聚集在圖的左側(cè)，表明經(jīng)熱處理的 菌株誘導(dǎo)較少的促炎細(xì)胞因子(圖6)。相比，在85° C熱處理20分鐘的細(xì)菌比活細(xì)胞誘導(dǎo) 更多的促炎細(xì)胞因子和更少的IL-10，得到更高的IL-12p40/IL-10比例(圖7)。
[0136]UHT樣和HTST樣處理增強(qiáng)或者產(chǎn)生抗炎譜。
[0137]不管它們各自起始的免疫譜(活細(xì)胞)如何，經(jīng)UHT和HTST處理的菌株展示了抗 炎譜。已知體內(nèi)抗炎和體外展示抗炎譜的益生菌菌株(長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、長(zhǎng)雙歧桿菌 NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818)經(jīng)“短時(shí)間高溫”處理后在體外展示 增強(qiáng)的抗炎譜。如圖1顯示，經(jīng)UHT樣處理的雙歧桿菌菌株的IL-12p40/IL-10比例比活的 對(duì)應(yīng)物的IL-12p40/IL-10比例更低，因此經(jīng)UHT樣處理的樣品顯示改進(jìn)的抗炎譜。更顯 著地，為非抗炎活菌株也證實(shí)通過UHT樣或HTST樣處理產(chǎn)生抗炎譜?；畹氖罄钐侨闂U菌 NCC4007和類干酪乳桿菌NCC2461都在體外展示高的IL-12p40/IL_10比例(圖2和5)。顯 示這兩種活的菌株不能提供針對(duì)小鼠中TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的保護(hù)。經(jīng)“短時(shí)間高溫”處理 后(UHT或HTST)，鼠李糖乳桿菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC2461誘導(dǎo)的IL-12p40/IL_10 比例顯著地降低，達(dá)到低至用雙歧桿菌菌株得到的水平。這些低的IL-12p40/IL-10比例是 由于IL-12p40產(chǎn)生的低水平以及IL-10分泌沒有改變(鼠李糖乳桿菌NCC4007)或者受到 顯著誘導(dǎo)(類干酪乳桿菌NCC2461)(圖2)。
[0138]因此:
[0139]-通過UHT樣和HTST樣的熱處理可以增強(qiáng)活的微生物的抗炎譜(例如長(zhǎng)雙歧桿菌 NCC2705、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818)。
[0140]-通過UHT樣和HTST樣的熱處理可以從非抗炎的活的微生物(例如，鼠李糖乳桿菌 NCC4007、類干酪乳桿菌NCC2461、乳品起始株嗜熱鏈球菌NCC2019)產(chǎn)生抗炎譜。[0141]-證實(shí)從商業(yè)途徑可得到的產(chǎn)品中分離的菌株(圖3A&B)也具有抗炎譜，所述菌株 包括益生菌大腸桿菌菌株。
[0142]對(duì)于所有測(cè)試的益生菌和乳品起始菌株，例如乳桿菌、雙岐桿菌和鏈球菌，UHT樣 /HTST處理的影響是相似的。
[0143]將UHT樣/HTST處理應(yīng)用于體外展示不同的免疫譜的一些乳桿菌、雙岐桿菌和鏈 球菌。所有這些菌株經(jīng)過UHT樣/HTST處理后比它們活的對(duì)應(yīng)物(圖1，2，3，4、5和6)誘導(dǎo) 更少的促炎細(xì)胞因子，表明UHT樣/HTST處理對(duì)得到的非復(fù)制細(xì)菌的免疫性質(zhì)的影響可以 推廣至所有益生菌，特別是乳桿菌和雙岐桿菌以及特定的大腸桿菌菌株，并且推廣至所有 乳品起始培養(yǎng)物，特別是鏈球菌、乳球菌和乳桿菌。
[0144]實(shí)施例2:
[0145]方法學(xué)
[0146]細(xì)菌制備:
[0147]用五種益生菌菌株研究非復(fù)制性益生菌的免疫增強(qiáng)性質(zhì):3種雙岐桿菌(長(zhǎng)雙歧 桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2種乳桿菌(類干酪乳桿菌 NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。
[0148]細(xì)菌細(xì)胞在MRS上以批次發(fā)酵的形式在37° C生長(zhǎng)16_18小時(shí)，不控制pH。離 心細(xì)菌細(xì)胞(5，OOOx g，4° C)并且在用鹽水稀釋之前用磷酸緩沖鹽水重懸浮細(xì)菌細(xì)胞以 達(dá)到約10E10cfu/ml的終濃度。長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳桿菌 NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007在水浴中85° C下熱處理20分鐘。短雙歧桿菌NCC2950 在水浴中90° C下熱處理30分鐘。等分經(jīng)熱處理的細(xì)菌懸浮液，并且在使用之前將細(xì)菌懸 浮液冷凍保存于-80° C。活的細(xì)菌在使用之前在15%PBS-甘油中-80° C貯存。
[0149]細(xì)菌制備物的體外免疫作圖:
[0150]評(píng)估活的和受熱處理的細(xì)菌制備物的免疫譜(即體外誘導(dǎo)來(lái)自人血細(xì)胞的特異細(xì) 胞因子分泌的能力)。從血濾器中分離人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。用細(xì)胞密度梯度分離后， 收集單核細(xì)胞并且用Hanks平衡鹽溶液洗滌兩次。用補(bǔ)充10%胎牛血清(Bioconc印t，巴黎， 法國(guó))、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma)以及0.1%慶大霉素(Sigma) 的Iscove’ s改良的Dulbecco’ s培養(yǎng)基(MDM, Sigma)重懸細(xì)胞。然后在48孔板中將 PBMCs(7xl05細(xì)胞/孔)與活的以及經(jīng)熱處理的細(xì)菌(相當(dāng)于7xl06cfu/孔)共同培養(yǎng)36 小時(shí)。檢測(cè)活的和受熱處理的細(xì)菌對(duì)PBMCs的效應(yīng)，該P(yáng)BMCs來(lái)自分入2次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中的8 個(gè)個(gè)體供體。培養(yǎng)36小時(shí)后，在細(xì)胞因子測(cè)量之前將培養(yǎng)板冷凍并保持在-20° C。平行 進(jìn)行(即相同的實(shí)驗(yàn)中在相同批次的PBMCs上)活的細(xì)菌和它們受熱處理的對(duì)應(yīng)物的細(xì)胞因 子作圖。
[0151]按照制造商的說明，用ELISA(R&D DuoSet 人 IL-10, BD OptEIA 人 IL12p40, BD OptEIA人TNF a，BD OptEIA人IFN- y )測(cè)定培養(yǎng)36小時(shí)后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子 (IFN- y，IL-12p40, TNF- a 和 IL-10)水平。IFN- y，IL_12p40 和 TNF- a 是促炎細(xì)胞因子， 而IL-10是重要的抗炎介體。結(jié)果表示成4個(gè)個(gè)體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM，并且結(jié)果 代表2次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)(每次實(shí)驗(yàn)用4個(gè)供體進(jìn)行)。
[0152]活的和經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在變應(yīng)性腹瀉的預(yù)防中的體內(nèi)效應(yīng)
[0153]用變應(yīng)性腹瀉的小鼠模型檢測(cè)短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進(jìn)效應(yīng)(Brandt E.B等人，JCI2003; 112(11):1666-1667)。雄性Balb/c小鼠在致敏(以14天的間隔經(jīng)腹膜內(nèi)注射兩次卵白蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀；第0天和第14天)后受到6次OVA的經(jīng)口攻擊(第27 天、29天、32天、34天、36天、39天)，導(dǎo)致暫時(shí)的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數(shù)的改變(總的 IgE的血漿濃度，OVA特異的IgE，小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶1，即MMCP-1)。在OVA致敏之前4 天(第-3天、-2天、-1天、0天以及第11天、12天、13天和14天)以及在攻擊時(shí)期中(第23 天至39天)通過管飼法施用活的或者在90° C熱處理30分鐘的短雙歧桿菌NCC2950。使用約IO9菌落形成單位(cfu)或者當(dāng)量cfu/小鼠的每日細(xì)菌劑量。
[0154]
[0155]經(jīng)過熱處理后誘導(dǎo)‘促炎’細(xì)胞因子的分泌
[0156]體外評(píng)估了經(jīng)熱處理的細(xì)菌菌株刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的細(xì)胞因子分泌的能力。將經(jīng)熱處理的細(xì)菌刺激PBMCs時(shí)基于四種細(xì)胞因子的免疫譜與在相同的體外測(cè)定中活的細(xì)菌細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫譜比較。
[0157]平板接種經(jīng)熱處理的制備物并且用于評(píng)估任何活菌計(jì)數(shù)的缺失。經(jīng)熱處理的細(xì)菌制備物在平板接種后沒有產(chǎn)生任何菌落。
[0158]當(dāng)用PBMCs溫育時(shí)，活的益生菌誘導(dǎo)不同的和菌株依賴性的細(xì)胞因子產(chǎn)生水平 (圖8)。與益生菌活的對(duì)應(yīng)物比較，益生菌的熱處理改變了 PBMCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平。經(jīng)熱處理的細(xì)菌比它們活的對(duì)應(yīng)物誘導(dǎo)更多的促炎細(xì)胞因子(TNF- a，IFN- y，IL_12p40)。相 t匕，與活細(xì)胞比較，經(jīng)熱處理的細(xì)菌誘導(dǎo)相似或者更低量的IL-10 (圖8)。這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)熱處理的細(xì)菌比它們活的對(duì)應(yīng)物更能刺激免疫系統(tǒng)，并且因此更能加強(qiáng)弱化的免疫防御。 換句話說，體外數(shù)據(jù)說明受熱處理后細(xì)菌菌株的增強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。
[0159]為了說明經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (與活細(xì)胞相比)對(duì)免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)效應(yīng)，在變應(yīng)性腹瀉的動(dòng)物模型中測(cè)試了活的和經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (菌株A)。
[0160]與陽(yáng)性對(duì)照組比較，用經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后，腹瀉強(qiáng)度明顯地持續(xù)降低(41.1%±4.8)，然而用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后，腹瀉強(qiáng)度只降低 20±28.3%。這些結(jié)果表明經(jīng)熱處理的短雙歧桿菌NCC2950比它的活的對(duì)應(yīng)物展示針對(duì)變應(yīng)性腹瀉增強(qiáng)的保護(hù)效應(yīng)(圖9)。
[0161]其他實(shí)施例:
[0162]可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備待儲(chǔ)存在寒冷溫度(4_8°C)下的以下可勺性酸奶組合物:
[0163]
【權(quán)利要求】
1.可勺性酸奶組合物，其包含非復(fù)制性益生菌微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的可勺性酸奶組合物，其包含相當(dāng)于每份約IO6至IO12Cfu的量的非 復(fù)制性益生菌微生物。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其特征在于所述組合物待儲(chǔ)存在寒冷 溫度或者環(huán)境溫度下。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其進(jìn)一步包含益生元，例如低聚果糖 和菊粉。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其中所述益生菌微生物通過熱處理， 優(yōu)選地通過在至少71.5° C至少I秒的高溫處理成為非復(fù)制性微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求7的可勺性酸奶組合物，其中所述熱處理是在約71.5-150°C約 1-120秒的高溫處理，并且優(yōu)選地是高溫/短時(shí)間(HTST)處理或者超高溫(UHT)處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求8的可勺性酸奶組合物，其用于炎性病癥的預(yù)防或治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的可勺性酸奶組合物，其中所述熱處理在約70-150°C的溫度范圍 內(nèi)進(jìn)行約3分鐘至2小時(shí)，優(yōu)選地在約80-140° C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行5分鐘至40分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求10的可勺性酸奶組合物，其用于涉及受損的免疫防御的病癥的預(yù)防 或治療。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其中至少90%，優(yōu)選地至少95%，更優(yōu) 選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地99.9%，最理想的全部所述益生菌是非復(fù)制性的。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其中所述益生菌微生物選自雙歧桿 菌屬、乳桿菌屬、丙酸桿菌屬或者它們的組合，例如長(zhǎng)雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿 菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、唾 液乳桿菌、路氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、約漢遜氏乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、乳乳球 菌、嗜熱鏈球菌、乳乳球菌、二丁酮乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、德氏 乳桿菌、大腸桿菌和/或它們的混合物。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其中所述益生菌微生物選自長(zhǎng)雙歧 桿菌NCC3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、約漢遜氏乳 桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、路氏乳桿菌DSM17938、路氏乳桿 菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌 NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC15、乳 乳球菌NCC2287或它們的組合。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的可勺性酸奶組合物，其每日劑量含有約0.005mg -1OOOmg的非復(fù)制性微生物。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK103582423SQ201180062783
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月11日
【發(fā)明者】A·梅賽尼爾, G·普里烏特, S·努特恩 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司